Synnynnäisen sydänsairauden neuroprotektion nykyinen tila Osa 2

Mikroskooppiset kuvat suoritettiin sitten kuvalaskentaan käyttämällä ImageJ-ohjelmistoa (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Hsp60:n signaali kerrottiin "x:llä".

Hsp60 on tärkeä proteiinimolekyyli, jolla on tärkeä biologinen rooli ihmiskehossa. Viime vuosien tutkimukset ovat osoittaneet, että Hsp60:n esiintyminen liittyy läheisesti ihmisen muistiin.

Hsp60 on molekyylikaperoniproteiini, joka osallistuu pääasiassa proteiinin laskostumiseen, avautumiseen, stabilointiin ja hajoamiseen. Nämä prosessit ovat erittäin tärkeitä ihmiskehon normaalille aineenvaihdunnalle ja solutoiminnalle. Samaan aikaan Hsp60:llä on myös antioksidanttisia, anti-inflammatorisia ja immunomoduloivia vaikutuksia, ja sillä on suuri rooli ihmisten terveyden ja immuunijärjestelmän tasapainon ylläpitämisessä.

Tutkimukset ovat osoittaneet, että Hsp60:llä on ratkaiseva rooli muistin muodostumisessa ja ylläpidossa. Oppimis- ja muistiprosessin aikana aivosolut tuottavat suuren määrän Hsp60-molekyylejä. Nämä molekyylit voivat suojata soluja ulkoisen ympäristön häiriöiltä ja vaurioilta varmistaakseen oppimisen ja muistin sujuvan edistymisen. Lisäksi Hsp60 voi vaikuttaa myös ihmisen ajatteluun ja käyttäytymiseen muuttamalla aivosolujen signaalinsiirtoa ja hermosolujen kehitystä ja sillä on positiivinen vaikutus kognitioon ja stressinsietokykyyn.

Vaikka Hsp60:n rooli on osoittanut myönteisiä vaikutuksia ihmiskehoon, ihmisten on myös ymmärrettävä, että sekä Hsp60:n liiallisella että puutteella voi olla kielteisiä vaikutuksia ihmisten terveyteen. Siksi meidän tulisi aktiivisesti tutkia ja tutkia Hsp60:n mekanismia erilaisissa ihmiskehon fysiologisissa ja patologisissa olosuhteissa ymmärtääksemme paremmin Hsp60:n asemaa ja roolia ihmisten terveydessä. Voidaan nähdä, että meidän on parannettava muistia, ja Cistanche deserticola voi parantaa muistia merkittävästi, koska Cistanche deserticolalla on antioksidanttisia, tulehdusta ja ikääntymistä estäviä vaikutuksia, jotka voivat auttaa vähentämään hapettumista ja tulehdusreaktioita aivoissa ja siten suojelemaan hermoston terveyttä. Lisäksi Cistanche deserticola voi myös edistää hermosolujen kasvua ja korjausta, mikä parantaa hermoverkkojen yhteyksiä ja toimintaa. Nämä vaikutukset voivat auttaa parantamaan muistia, oppimiskykyä ja ajattelunopeutta ja voivat myös estää kognitiivisten toimintahäiriöiden ja hermoston rappeutumissairauksien kehittymistä.

Napsauta Know-painiketta parantaaksesi lyhytaikaista muistia

"x"-arvo määritettiin seuraavasti: "x"-laskostetun Hsp60-signaalin vähentäminen mitokondrion DNA-signaalista kontrolliryhmässä teki mitokondrion DNA-arvon pienemmäksi tai yhtä suureksi kuin nolla. Histonin H2B signaali kerrottiin "y:llä".

"Y"-arvo määritettiin seuraavasti: "y"-laskostetun histoni-H2B-signaalin vähentäminen tuma-DNA-signaalista kontrolliryhmässä teki tuma-DNA-arvon pienemmäksi kuin nolla. Jos taustasignaali nousee kertomisesta korkeaksi, kerrotun kuvan kontrastia voidaan säätää samoihin olosuhteisiin kaikissa näytteissä.

Kuvaa dsDNA-värjäytymisestä, josta oli vähennetty kerrotun Hsp60:n ja histonin H2B:n korjattu kuva, käytettiin myöhempään analyysiin. Käyttämällä "Adjust-Threshold" -toimintoa nämä kuvat binaarisoitiin. Valitsimme dsDNA-pisteitä, joiden koko vaihteli välillä 2-20 µm2 (ympyrämäisyys 0,1-1,0), ja ne laskettiin käyttämällä "Analysoi-analysoi hiukkasia" -toimintoa.

2.3. Elektronimikroskopia

Yksi päivä ennen transfektiota HeLa-solut maljattiin tiheydellä 600 solua/µl. Kiinnostuksen kohteena olevien geenien ilmentyminen hiljennettiin HeLa-soluissa käyttämällä Stealth RNAi siRNA:ta (Thermo Fisher Scientific) Lipofectamine RNAiMAX -transfektioreagenssissa (ThermoFisher Scientific) valmistajan ohjeiden mukaisesti (lopullinen RNA-pitoisuus 10 nM).

Neljä päivää siRNA-poiston jälkeen solut kiinnitettiin. Soluviljelmänäytteet kiinnitettiin 2 % PFA:lla ja 2 % glutaraldehydillä 0.1 M fosfaattipuskurissa, pH 7,4, 37 ◦C:ssa, minkä jälkeen ne asetettiin 4 °C:seen. ◦C jääkaapissa 30 min. Näytteet kiinnitettiin 2 % glutaraldehydissä 0,1 M fosfaattipuskurissa yön yli 4 ◦C:ssa. Näytteet pestiin kolme kertaa 0,1 M fosfaattipuskurilla 30 minuutin ajan ja jälkikiinnitettiin 2 % osmiumtetroksidilla 0,1 M fosfaattipuskurissa 4 ◦C:ssa 1 tunnin ajan.

Näytteet kuivattiin ingradoiduiksi etanoliliuoksiksi, siirrettiin hartsiin (Quetol-812, Nisshin EM Co., Tokio, Japani) ja polymeroitiin 60 ◦C:ssa 48 tuntia. Polymeroidut hartsit leikattiin ultraohuiksi 70-nm-leikkauksiksi timanttiveitsellä käyttämällä ultramikrotomia (Ultracut UCT, Leica Microsystems, Wetzlar, Saksa) ja kiinnitettiin sitten kupariritiloihin.

Leikkeet värjättiin 2-prosenttisella uranyyliasetaatilla huoneenlämpötilassa 15 minuutin ajan ja pestiin tislatulla vedellä, mitä seurasi toissijainen värjäys lyijyvärjäysliuoksella (Sigma-Aldrich, Tokio, Japani) huoneenlämpötilassa 3 minuutin ajan.

Verkot tarkkailtiin transmissioelektronimikroskoopilla (JEM-1400Plus, JEOL Ltd., Tokio, Japani) 80 kV (seeprakalan aivot) tai 100 kV (solu) kiihdytysjännitteellä ja kuvat tallennettiin latauskytketyn laitteen (CCD) kameralla (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.) .

2.4. Immunoelektronimikroskooppi

Kultalevyillä olevat näytteet jäädytettiin nestemäisessä propaanissa -175 ◦C:ssa. Kun näytteet oli jäädytetty, ne pakastesubstituoitiin 1 % tanniinihapolla etanolissa ja 2 % tislatulla vedellä -80 ◦C 24 tunnin ajan.

Näytteitä pidettiin sitten -20 ◦C:ssa 4 tuntia, minkä jälkeen niitä inkuboitiin 4 ◦C:ssa 1 tunnin ajan. Seuraavaksi näytteet kuivattiin vedettömässä etanolissa 3 kertaa 30 minuutin ajan. joka kerta, minkä jälkeen suodatetaan 50:50 etanoli-hartsin seoksella (LR valkoinen: London Resin Co. Ltd., Berkshire, UK) 4 °C:ssa 1 tunnin ajan. Näytteet siirrettiin tuoreeseen 100 % hartsiin ja inkuboitiin 4 ◦C:ssa 30 minuuttia, ja tämä prosessi toistettiin kolme kertaa.

Näytteet siirrettiin tuoreeseen 100 % hartsiin ja polymeroitiin 50°CO/N:ssä. Polymeroidut hartsit leikattiin ultraohuiksi leikkeiksi 90 nm:ssä timanttiveitsellä käyttämällä ultramikrotomia (Ultracut UCT; Leica), ja osat asetettiin nikkeliritileille. Ristikot inkuboitiin anti-dsDNA-vasta-aineen (35I9 DNA) (1/800, Abcam, luettelonro ab27156, RRID: AB_470907) kanssa 1 % BSA/PBS:ssä 4 ◦CO/N, minkä jälkeen huuhdeltiin kolmesti 1 % BSA/PBS 1 minuutin ajan.

Myöhemmin niitä inkuboitiin näiden vasta-aineiden kanssa, jotka oli konjugoitu {{0}}nm kultapartikkeleihin (vuohen anti-hiiri-IgG-polyklonalantiaine) 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. PBS:llä huuhtelun jälkeen ristikot asetettiin 2-prosenttiseen glutaraldehydeiiniin 0,1 M kakodylaattipuskuriin.

Sen jälkeen ristikot kuivattiin ja värjättiin sitten 2-prosenttisella uranyyliasetaatilla 15 minuutin ajan ja lyijyväriliuoksella (Sigma-Aldrich) huoneenlämpötilassa 3 minuutin ajan. Ristikkoja tarkkailtiin transmissioelektronimikroskoopilla (JEM-1400). plus; JEOLLtd.) 100 kV:n kiihdytysjännitteellä. Digitaaliset kuvat saatiin CCD-kameralla (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.).

3. Tulokset

3.1. Vähentynyt TFAM tai GBA aiheuttaa ektooppisen mitokondrion DNA:n lisääntymisen

Ensinnäkin näytimme esimerkin mitokondrioista peräisin olevan sytoplasmisen DNA:n havaitsemisesta HeLa-soluissa, joissa siRNA kaatoi TFAM-proteiinin (kuva 1A). TFAM on keskeinen mitokondrioiden transkriptiotekijä ja se toimii myös mitokondrioiden DNA:n replikaatiossa ja korjaamisessa [20]. .

Tämän geenin sekvenssipolymorfismien on raportoitu liittyvän Parkinsonin tautiin [21,22]. Kolmen päivän TFAM-proteiinin kaatumisen jälkeen HeLa-solujen sytoplasmassa havaittiin paljon kaksijuosteisia DNA-pisteitä.

Histonit ovat positiivisia markkereita tumasta peräisin olevalle DNA:lle sytoplasmassa ja negatiivisia markkereita mitokondrio-DNA:lle ja mitokondriaalista alkuperää olevalle DNA:lle sytoplasmassa [23]. Nämä pisteet eivät lokalisoituneet histonien kanssa, mikä viittaa siihen, että ne eivät olleet tumasta peräisin olevaa DNA:ta. Lisäksi jotkin näistä sytoplasmisista, ektooppisista DNA-pisteistä eivät lokalisoituneet Hsp60:n, mitokondriomatriisin markkerin, kanssa, mikä osoittaa, että ne sijaitsivat mitokondrioiden ulkopuolella (kuvio 1B, C).

Elektronimikroskopia osoitti myös, että kohdunulkoinen DNA vuoti mitokondrioista (kuvio 2A, B). Yhteenvetona voidaan todeta, että ektooppisten DNA-pisteiden lisääntyminen sytoplasmassa TFAM:n tuhoamisen seurauksena johtui mitokondrioiden DNA:n vuotamisesta mitokondrioista. Toiseksi osoitimme toisen esimerkin mitokondrioista peräisin olevan sytoplasmisen DNA:n havaitsemisesta HeLa-soluissa, joissa siRNA kaatoi GBA-proteiinin. (Kuva 1A).

GBA on Gaucherin taudin aiheuttaja, mutta GBA:n heterotsygoottinen mutaatio on myös Parkinsonin taudin riskitekijä [24]. HeLa-solujen sytoplasmassa havaittiin paljon kaksijuosteisia DNA-pisteitä 3 päivän GBA-proteiinin kaatumisen jälkeen. Jotkut DNA-pisteet lokalisoitiin histonien kanssa, mikä viittaa siihen, että ne olivat tumaperäistä DNA:ta.

Muita DNA-pisteitä ei lokalisoitu histonien kanssa, mikä viittaa siihen, että ne eivät olleet tumaperäistä DNA:ta vaan mitokondrioista peräisin olevaa DNA:ta (kuva 1D). Yhteenvetona voidaan todeta, että ektooppisten DNA-pisteiden lisääntyminen sytoplasmassa GBA-knockdownin vaikutuksesta johtui ainakin osittain mitokondrioiden DNA-vuotamisesta mitokondrioista.

For more information:1950477648nn@gmail.com