Dieselin pakokaasujen altistuminen muuttaa seeprakalan aivojen neurodegeneraatioon liittyvien verkkojen ilmenemistä, osa 2

Proteiininäytteen valmistus

Proteiininäytteiden valmistamista varten 80 - 100 nukutetun toukkapäät (5 pdf) eristettiin huolellisesti ja pestiin PBS:llä ennen siirtämistä lyysipuskuriin, joka koostui 15 % esijäähdytetystä TCA:sta/asetonista, joka sisälsi 0,07 % beeta-merkaptoetanolia (ME). ) ja proteaasi-inhibiittoricocktail (vaatii valmistajan) kokonaistilavuudessa 500 ul.

Viime vuosina on ollut huomattavaa kiinnostusta proteiininäytteiden vaikutuksista muistiin. Yhä useammat ihmiset alkavat ymmärtää ruokavalion merkityksen terveydelle, erityisesti proteiinin tärkeän roolin ihmiskehossa.

Proteiinit ovat ihmiskehon perusrakennusaineita ja niillä on tärkeä rooli ihmiskehossa. Tämän vuoksi proteiininäytteistä on tullut tärkeä kanava monille ihmisten terveyden ja kauneuden tavoittelussa. Lihaksen rakentamisen ja kehon muotoilemisen lisäksi proteiininäytteet voivat myös parantaa ihmisen muistia.

Jotkut tutkijat ovat tutkineet proteiinien ja muistin välistä suhdetta. He havaitsivat, että riittävän proteiinin pitkäaikainen saanti on hyödyllistä kaikille fyysisen terveyden, erityisesti muistin, kannalta. On yhä enemmän todisteita siitä, että ravinnon proteiinin saannilla on tärkeä vaikutus aivojen toimintaan ja muistiin.

Proteiini on tärkeä osa ihmisen aivojen hermosoluja, joten päivittäinen proteiinin saanti vaikuttaa merkittävästi ihmisten muistiin ja ajattelukykyyn. Pitkäaikainen proteiinin saanti ei ainoastaan ​​täytä kehon proteiinitarpeita, vaan myös auttaa aivoja pysymään aktiivisina ja terveinä.

Lisäksi proteiini voi myös auttaa kehoa ylläpitämään verensokeritasapainoa ja ylläpitämään vakaata mielialaa. Tämä on erittäin tärkeää muistin ja ajattelutaitojen ylläpitämiselle. Siksi kohtuullinen proteiinin saanti voi auttaa parantamaan ihmiskehon erilaisia ​​kognitiivisia toimintoja ja tunnetiloja.

Kaiken kaikkiaan proteiininäytteiden ja muistin välillä on vahva yhteys. Proteiinin saannin lisääminen auttaa pitämään aivot ja kehon terveinä, parantaen ajattelutaitoja ja muistia. Ihmisille, jotka haluavat parantaa muistiaan, on erittäin tärkeää kuluttaa sopiva määrä proteiinia. Meidän tulee syödä proteiinipitoisia ruokia asianmukaisesti ja kiinnittää huomiota kohtuullisiin aterioihin säilyttääksemme terveen kehon ja terävän mielen. Voidaan nähdä, että meidän on parannettava muistia, ja Cistanche deserticola voi parantaa muistia merkittävästi, koska Cistanche deserticolalla on antioksidanttisia, tulehdusta ja ikääntymistä estäviä vaikutuksia, jotka voivat auttaa vähentämään hapettumista ja tulehdusreaktioita aivoissa ja siten suojelemaan hermoston terveyttä. Lisäksi Cistanche deserticola voi myös edistää hermosolujen kasvua ja korjausta, mikä parantaa hermoverkkojen yhteyttä ja toimintaa. Nämä vaikutukset voivat auttaa parantamaan muistia, oppimista ja ajattelunopeutta ja voivat myös estää kognitiivisten toimintahäiriöiden ja hermostoa rappeuttavien sairauksien kehittymistä.

Napsauta Know-lisäaineita lisätäksesi muistia

Lyhyen homogenoinnin jälkeen proteiineja saostettiin 12 tuntia 20 asteessa, mitä seurasi sentrifugointi 12, 000 rpm 5 minuutin ajan 4 asteessa. Supernatantti poistettiin ja proteiinipelletti pestiin kahdesti kylmällä asetonilla (sisältää 0.07 % ME ja proteaasi-inhibiittoricocktaileja). Lopullinen proteiinipelletti liuotettiin lyysipuskuriin, joka sisälsi 7,0 M ureaa, ja 2,0 M tioureaa sonikaatiolla jäillä.

Liuotettuja proteiininäytteitä sentrifugoitiin 15, 000 rpm 10 minuuttia 4 asteessa liukenemattomien hiukkasten saostamiseksi, ja lopullisten proteiininäytteiden pitoisuus mitattiin käyttämällä Bradford-menetelmää.

TMT-pohjainen korkean suorituskyvyn proteomiikkaanalyysi

Näytteet pelkistettiin, alkyloitiin ja pilkottiin lisäämällä peräkkäin trypsiiniä ja lys-C-proteaaseja. Peptidit leimattiin sitten käyttämällä 10-plexTMT-isobarisia tunnisteita valmistajan ohjeiden mukaisesti. Leimatut näytteet sekoitettiin ja fraktioitiin sitten hienoksi käyttämällä korkean pH:n käänteisfaasikromatografiaa.

Yksittäiset fraktiot analysoitiin sitten LC-MS/MS:llä käyttämällä online-käänteisfaasikromatografiaa ja tandemmassaspektrometriaa Thermofsher Fusion Lumos -massaspektrometrillä. Tiedot saatiin käyttämällä synkroniseen esiastevalintaan perustuvaa MS3-menetelmää, kuten aiemmin on kuvattu (McAlister et al. 2014). Tietokantahaku ja TMT-reportteri-ionitietojen purkaminen suoritettiin MaxQuant-ohjelmistoalustalla (Cox ja Mann 2008).

TMT-tietojen vertailu näytteiden välillä tehtiin käyttämällä MSStatsia (Choiet al. 2014). Transkriptominen analyysi Noin 80–100 päätä eristettiin nukutetuista alkioista (120 tuntia), pestiin PBS:llä ja niille tehtiin kokonais-RNA-uutto Trizolilla (Sigma Aldrich, Saint Louis). , USA) reagenssi valmistajan ohjeiden mukaisesti.

RNA:n laatu ja määrä arvioitiin käyttämällä NanoDrop2000-spektrofotometriä (Thermo Scientific, MA) ja lisäksi Agilent 2100 Bioanalyzer -laitteella, jotta varmistettiin vähimmäispitoisuus 50 ng/ul ja RNA-eheysluku (RIN) 8. Tämän jälkeen kirjaston valmistelu suoritettiin käyttämällä Illumina HiSeq4000according4000according4000 -laitetta. protokolla: "TruSeqStranded Total RNA Library Prep workflow with Ribo-Zero Gold", ja näytteet sekvensoitiin seuraavilla ehdoilla: "Paritettu loppuajo, R1=75 jaksoa (antisense-juoste), Index=8 jaksoa, R2=75 sykliä (aistijuoste)."

Tietojen analysointi

Sekä proteomisen että transkriptomiikan tutkimusaineistot ladattiin ja analysoitiin samanaikaisesti verkkotyökalulla Metascape, joka mahdollistaa geenimerkintöjen tekemisen eri lajeille, mukaan lukien Danio rerio (Zhou et al. 2019). Joko proteomin tai transkription profiilin muutosreittien vaikutuksen arvioimiseksi tietoja kerättiin. analysoitu Ingenuity Pathways Analysis (IPA) -ohjelmiston avulla (Krämer et al. 2014).

Geeni- tai proteiinitunnisteita ja vastaavia ilmentymisarvoja sisältävät tietojoukot ladattiin sovellukseen. Jokainen tunniste kartoitettiin sitä vastaavaan objektiin Ingenuityn tietokannassa.

Ilmentymisen muutosraja 1.{1}}-kertainen määritettiin tunnistamaan molekyylit, joiden ilmentymistä säädettiin eri tavalla. Funktionaalinen analyysi tunnisti biologiset toiminnot ja/tai sairaudet, jotka olivat tietojoukon kannalta merkittävimpiä. Aineistosta peräisin olevat molekyylit, jotka täyttivät raja-arvon ja liittyivät biologisiin toimintoihin, otettiin huomioon analyysissä. Right-tailedFisherin tarkkaa testiä käytettiin laskemaan p-arvo, joka määrittää todennäköisyyden, että kukin kyseiselle tietojoukolle määritetty biologinen toiminto ja/tai sairaus johtuu pelkästään sattumasta.

Reittianalyysi

Molemmat aineistot ladattiin IPA-ohjelmistoon (Krämer et al. 2014), jotta voidaan arvioida joko proteomin tai transkription profiilin muutosten vaikutusta tietyissä reiteissä. Merkittävimmät muuttuneet kanoniset reitit arvioitiin sitten edelleen ja tulkittiin käyttämällä PCR:ää ja Western blot -testiä alla kuvatulla tavalla.

Western blottaus

Yhteensä 25 µg proteiineja ladattiin 12 % NuPAGE:lle (Novex, CA) ja siirrettiin PVDF-kalvoille (Novex, CA) kuvatulla tavalla (MahmoudianSani et al. 2017; Rafee et al. 2019). Kalvot estettiin 5-prosenttisella rasvattomalla maidolla Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa ja 0,01-prosenttisella Tween 20:lla (TBST-puskuri) 30 min huoneenlämpötilassa ja inkuboitiin sitten yön yli 4 asteessa joko kanin polyklonaalisella anti-Cyp1A1:llä (Abcam, CA) tai hiiren monoklonaalisella anti-GA-PDH:lla. Abcam, CA), laimennettuna TBST-puskuriin, joka sisältää 1 % rasvatonta maitoa.

TBST:ssä pesun jälkeen blotteja inkuboitiin sekundaaristen aasin anti-kani-HRP (Abcam, CA) tai vuohen anti-hiiri-HRP (Santa Cruz, CA) vasta-aineiden kanssa 2 tuntia, minkä jälkeen niitä kehitettiin Pierce™ ECL Plus Western blotting -substraatilla ( Thermo Fisher Scientific, USA). Juovat visualisoitiin kuvaamalla käyttämällä LI-COR-skanneria ja analysoitiin densitometrisesti (LI_COR Biosciences, NE).

Reaaliaikainen PCR

Kokonais-RNA eristettiin päistä käyttämällä TRIzol-reagenssia (Sigma Aldrich, Saint Louis, USA) noudattaen valmistajan ohjeita ja mitattiin sitten käyttämällä NanoDrop 2000 spektrofotometriä (Thermo Scientific, MA). 1 ug kutakin RNA-näytettä käänteistranskriptoitiin käyttämällä iScript™-käänteistranskription supermixiä (Bio-Rad, CA), ja reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttämällä SsoAdvancedUniversal SYBR Green supermixiä (Bio-Rad, CA), ja alukkeet on lueteltu. Täydentävässä taulukossa 1. Suhteelliset ilmentymistasot laskettiin käyttämällä 2-ΔΔCT-menetelmää ja tilastollista T-testiä käytettiin merkitsevien erojen arvioimiseen.

tulokset ja keskustelu

Proteominen ja transkriptominen analyysit ovat kaksi tärkeintä työkalua taudin taustalla olevien molekyylimekanismien ymmärtämiseen ja ympäristön ärsykkeisiin reagoimiseen (Duan ym. 2017; García-Estrada ym. 2013; Jami ym. 2014a, b, 2015; Kosalková et al. 2012). . Täällä suoritimme syvän ilmentymisen analyyseja sekä transkriptoimis- että proteomisista tasoista DEPe:lle altistuneiden seeprakalan alkioiden päissä.

Pääosin aivokudoksesta koostuvat päät eristettiin muiden kudosten ilmentymisprofiilien eliminoimiseksi, koska olemme kiinnostuneita keskushermoston sisäisten patologisten reittien määrittämisestä.

Seeprakalojen päiden ilmeprofiili

Profiilianalyysi tuotti 11 172 havaittua proteiinia ja 14 748 mRNA-kohdetta yli 26:sta 000 koodaavasta geenistä (Howe et al. 2013). Niistä 11 172 proteiinista, jotka tunnistettiin TMT-leimatuista näytteistä (lisätaulukko 2), 141 proteiinia oli säädellyt merkittävästi ylösalaisin ja 607 oli alasäädelty (lisätaulukko 3 ja kuva 1a). Samoin 367 transkriptiä säädeltiin ylös ja 149 oli alasäädelty RNA-seq-analyysissä havaituista 14 748 transkriptista (lisätaulukko 4) (kuva 1b ja täydentävä taulukko 5).
Useimmissa tapauksissa tehostettujen proteomisten ja transkriptomisten analyysien tulokset olivat johdonmukaisia. Esimerkiksi korkeasti säädeltyjä proteiineja ovat sytokromi P450 Cyp1a, Cyp1c1, guaninennukleotideja sitova proteiinialayksikkö gamma, anneksiini, Plexin B2b lyhyt isoformi, dehydrogenaasin/reduktaasin (SDR-perhe) jäsen 13-kuten 1, S-antigeeni gretiini/pineaalinen (arrestiini) b ja sulfotransferaasi6B1.

Samoin geenejä, joilla on korkein transkription säätely, ovat sytokromi P450 (Cyp1a), kemokiini (C-C-motiivi) ligandi 27a, aryylihiilireseptorirepressori A, sytokromi P450 (Cyp1b), jaRh-perheen C glykoproteiini. Alassäädellyt proteiinit eivät aina olleet kovin korreloituneita.

Esimerkiksi Complexin 2, Spectriin alfa, sydämen myosiinin kevytketju-1, SEC23-vuorovaikutteinen proteiini, ATP-syntaasin kalvoalayksikkö EA, sytokromi b ja NAD-riippuvainen proteiinideasetylaasi ovat yksi erittäin huonosti säädellyistä proteiineista, kun taas verkkokalvon ulkosegmentin kalvoproteiini 1a , liuenneen aineen kantajaperhe 5 (jodidin kuljettaja), FBJ-hiiren osteosarkooman viruksen onkogeenihomologi B, kompleksiini 4c, FOS-tyyppinen antigeeni 1a, opsiini 1 ja v-fos osoittavat korkeimman transkription alentumisen (taulukot 1 ja 2).

Seeprakalan proteiineja tunnistavia vasta-aineita on rajoitetusti, mutta vahvistimme näytteen näistä muutoksista Western blot -analyysillä. Cyp1A-proteiinin ylös- ja alasäätely Complexin 2:n (CPLX2) varmistettiin käyttämällä GAPDH:ta latauskontrollina (kuvio 2a). Korkeammat TAT- ja UGT1B1-transkriptiotasot ja alhaisemmat CHNRB- ja TH2-tasot vahvistettiin myös qPCR:llä käyttämällä Elf-alfaa sisäisenä kontrollina (kuva 2b).

Geenimerkintä

On olemassa useita online-bioinformaattisia työkaluja ja ohjelmistoja, jotka voivat tarjota hyödyllistä tietoa geneettisissä huomautuksissa. Niistä tässä työssä käytettiin Metascapea, jolla on kyky tehdä geenimerkintöjä Danio reriolle (Zhouet al. 2019).

Sekä proteomisten että transkriptomisten tutkimusten tietojoukot ladattiin ja analysoitiin samanaikaisesti tämän online-työkalun avulla. Sen jälkeen kun ohjelmistossa oli yhdistetty sekä proteomisten että transkriptomisten muutosten tulos, useita prosesseja, kuten vaste ksenobioottisille ärsykkeille, ksenobioottien aineenvaihdunta sytokromi P450:n vaikutuksesta ja circadiaanisäätely havaittiin indusoituneen DEPe-käsittelyn jälkeen (kuvio 3a).

Tämä analyysi viittasi myös biologisten prosessien, kuten "Visuaalisen havainnoinnin", "Phototransduktion" ja "G-proteiiniin kytketyn reseptorin internalisoinnin" tukahdutettuihin tasoihin. Muutokset näköön liittyvissä ilmentymisprofiileissa eivät olleet odottamattomia, koska DEPe-hoito johti varhaisen kehityksen aikana pienempiin silmiin (tietoja ei näytetä).

Ksenobioottinen aineenvaihdunnan signalointi

Ksenobiootit, jotka ovat vieraita luonnollisia tai synteettisiä kemiallisia yhdisteitä, voivat laukaista solujen stressivasteen, mikä johtaa erilaistumiseen, proliferaatioon, apoptoosiin tai nekroosiin. Elimistön on todellakin suojauduttava aktiivisesti ksenobioteilta ja myös myrkyllisiltä endogeenisiltä yhdisteiltä ja niiden metaboliiteilta niiden eliminaatioon ja myrkyttömiin osallistuvien entsyymien ja kuljettajien ilmentymisen kautta.

Nämä entsyymit luokitellaan kolmeen ryhmään: PhaseI-entsyymit (CYP, ALDH, FMO), jotka tuovat polaarisuutta ksenobiootteihin; Vaiheen II entsyymit (UGT, GST, SULT), jotka tuovat hydrofiilisyyttä konjugoimalla hydrofiilisiä molekyylejä, kuten sulfaattia, glukuronihappoa ja glutationia ksenobiootteihin; ja faasin III entsyymit (MDR1, OATP2, MRP), jotka kuljettavat ksenobiootteja tai vaiheen II aikana muodostuneita konjugaatteja solunulkoiselle alueelle.

Nämä entsyymit indusoidaan signalointikaskadien kautta, joihin liittyy spesifisiä reseptoreita (CAR, PXR, AHR) ja MAPK-välitteistä transkriptiotekijöiden aktivaatiota (NRF2, MAF) (Omiecinski et al. 2011).

Aktivaattoreiden puuttuessa konstitutiivisesti aktiivinen reseptori (CAR) sijaitsee sytoplasmassa kompleksina CCRP:n ja HSP90:n kanssa. Mutta kun aktivaattori on läsnä, CAR siirtyy ytimeen ja sitoutuu RXR:ään muodostaen heterodimeerin ja sitoutuu lisäksi useisiin toistomotiivin muunnelmiin, kuten DR3, DR4, ER6 ja ER8, ja myötävaikuttaa geeniekspression säätelyyn (täydentävä taulukko 2).

Proteomiikkaanalyysimme paljasti ksenobioottisen aineenvaihdunnan aktivoitumisen. Itse asiassa CYP1A1:n, CYP3A7:n, HMOX1:n (hemi oksigenaasi 1), CAT:n (katalaasi) ja CES1:n (karboksyyliesteraasi 1) selkeä ylössäätely osoittaa I-vaiheen aineenvaihdunnan induktion, kun taas UGT1A1:n (UDP-glukuronosyylitransferaasiperheen 1 jäsen A1) ja GSTP1:n lisääntyneen ilmentymisen. glutationiS-transferaasi pi 1) osoittaa PhaseII-metabolian aktivoitumisen.

Mielenkiintoista on, että sulfaattitransferaasien, kuten SULT1A1 (sulfotransferaasiperheen 1A jäsen 1), SULT1C2 (sulfotransferaasiperheen 1C jäsen 2) ja SULT2B1 (sulfotransferaasiperheen 2B jäsen 1) alentuminen viittaa siihen, että hydrofiilisyyden lisääntyminen faasin II glukonihappometabolian kautta pyrkii mieluiten glukoosihappometaboliaan. , mutta ei sulfaattikonjugaatiota (kuvio 4).

Transkriptomisen tutkimuksen tulokset ovat melko johdonmukaisia, koska CYP1A, CYP1B, CYP3A7, GSTO1, GSTP1 ja UGT1A1 ovat kaikki ylössäädeltyjä RNA-tasoilla. SULT2B1 osoittaa kuitenkin noususäätelyä RNA-tasolla (kun taas aliedustettuna proteiinitasoilla).

Tämä voi johtua muiden mekanismien osallisuudesta, jotka indusoivat sulfaattitransferaasientsyymien hajoamista tai inaktivoitumista DEPe-käsittelyn jälkeen. Erityisen yllättävää on, että nämä muutokset ksenobioottisessa aineenvaihdunnassa tapahtuivat kalojen päissä (oletettavasti aivoissa). Ksenobioottisten geenien ilmentymistä on kuvattu nisäkkäiden hermostossa, mutta tämä on ensimmäinen raportti niistä seeprakalan aivoissa (McMillan ja Tyndale 2018).

Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​Shankarin ja työtovereiden suorittaman samankaltaisen tutkimuksen kanssa, joka testasi ympäristön polysyklisten aromaattisten hiilivetyjen (PAH) eri ryhmien vaikutuksia alkioiden kehitykseen ja arvioi kunkin hoito-ohjelman vaikutusta transkriptioprofiiliin.

He osoittivat Cyp1a:n noususäätelyn sekä transkriptiotasolla että proteiinitasolla koko kehossa 48 hpost-fertilization (hpf) -alkion varhaisena luotettavana biomarkkerina ksenobioottisen AHR-aktivaation ja transkriptomisten muutosten myötä (Shankar et al. 2019).

NRF{0}}välitteinen oksidatiivinen stressivaste

Oksidatiivinen stressi voi laukaista apoptoosin ja nekroosin, ja sen uskotaan osallistuvan hermoston rappeutumiseen (Ahmadinejad et al. 2017; Jami ym. 2014b, 2015). Suurin solujen puolustusreaktio oksidatiiviselle stressille on antioksidanttien ja myrkkyjä poistavien entsyymien induktio.

Ydintekijä-erytroidiin 2- liittyvä tekijä 2 (Nrf2) sitoutuu promoottorin antioksidanttivasteelementteihin (ARE) ja aktivoi niiden transkription. Inaktiivinen Nrf2 liittyy aktiinia sitovaan proteiiniin Keap1 ja säilyy sytoplasmassa.

Oksidatiivisen stressin laukaisemana Nrf2 fosforyloituu vasteena proteiinikinaasi C-, fosfatidyyli-inositoli-3--kinaasi- ja MAP-kinaasireiteille. Fosforyloitu Nrf2 voi sitten siirtyä ytimeen ja sitoa AREn transaktivoimaan myrkkyjä poistavia ja antioksidanttisia entsyymejä (lisätaulukko 3) (Ma 2013).

For more information:1950477648nn@gmail.com