Abstrakti:Ikääntymisen aikana esiintyvälle sarkopenialle on ominaista luuston lihasmassan ja toiminnan asteittainen menetys, mikä johtaa fyysisten kykyjen toiminnalliseen heikkenemiseen. Sarkopenian puhkeamiseen vaikuttavat useat tekijät, mukaan lukien vähentynyt regeneratiivisuus, krooninen matala-asteinen tulehdus, mitokondrioiden toimintahäiriö ja lisääntynyt oksidatiivinen stressi, mikä johtaa katabolisten reittien aktivoitumiseen. Fyysistä aktiivisuutta ja riittävää proteiinin saantia pidetään tehokkaina strategioina, jotka pystyvät vähentämään sarkopenian esiintyvyyttä ja vakavuutta parantamalla lihasten anabolista vastetta ikääntymisen aikana. Tauriini on ei-välttämätön aminohappo, joka ilmentyy voimakkaasti nisäkkään kudoksissa ja erityisesti luurankolihaksissa, missä se osallistuu biologisten prosessien säätelyyn ja toimii antioksidanttina ja anti-inflammatorisena tekijänä. Tässä arvioimme, estääkö tauriinin antaminen vanhoilla hiirillä luurankolihasten ikääntymisen fysiopatologisia vaikutuksia. Osoitimme, että vammautuneissa lihaksissa tauriini tehostaa regeneratiivista prosessia alentamalla tulehdusvastetta ja säilyttämällä lihaskuitujen eheyden. Lisäksi tauriini heikentää ROS-tuotantoa ikääntyneissä lihaksissa ylläpitämällä oikeaa solujen redox-tasapainoa, toimien antioksidanttimolekyylinä. Vaikka lisätutkimuksia tarvitaan selventääkseen paremmin molekyylimekanismeja, jotka ovat vastuussa tauriinin suotuisasta vaikutuksesta luurankolihasten homeostaasiin, nämä tiedot osoittavat, että tauriinin antaminen parantaa mikroympäristöä mahdollistaen tehokkaan regeneratiivisen prosessin ja sarkopenian alkamiseen liittyvien katabolisten reittien vaimentamisen.

Cistanchen glykosidi voi myös lisätä SOD:n aktiivisuutta sydämen ja maksan kudoksissa ja vähentää merkittävästi lipofussiinin ja MDA:n pitoisuutta kussakin kudoksessa, poistaen tehokkaasti erilaisia ​​reaktiivisia happiradikaaleja (OH-, H₂O₂ jne.) ja suojaamalla DNA-vaurioilta. OH-radikaalien toimesta. Cistanche-fenyylietanoidiglykosideilla on vahva vapaita radikaaleja poistava kyky, suurempi pelkistyskyky kuin C-vitamiini, ne parantavat SOD:n aktiivisuutta siittiösuspensiossa, vähentävät MDA-pitoisuutta ja niillä on tietty suojaava vaikutus siittiöiden kalvon toimintaan. Cistanche-polysakkaridit voivat lisätä SOD:n ja GSH-Px:n aktiivisuutta D-galaktoosin aiheuttamien kokeellisesti vanhenevien hiirten punasoluissa ja keuhkokudoksissa sekä vähentää MDA- ja kollageenipitoisuutta keuhkoissa ja plasmassa sekä lisätä elastiinipitoisuutta. hyvä huuhteluvaikutus DPPH:lle, pidentää hypoksian aikaa vanhenevilla hiirillä, parantaa SOD:n aktiivisuutta seerumissa ja viivyttää keuhkojen fysiologista rappeutumista kokeellisesti vanhenevilla hiirillä Solumorfologisen rappeutumisen yhteydessä kokeet ovat osoittaneet, että Cistanchella on hyvä antioksidanttikyky ja sillä on potentiaalia olla lääke ihon ikääntymisen sairauksien ehkäisyyn ja hoitoon. Samaan aikaan Cistanchen ekinakosidilla on merkittävä kyky poistaa DPPH-vapaita radikaaleja ja kyky poistaa reaktiivisia happilajeja ja estää vapaiden radikaalien aiheuttamaa kollageenin hajoamista, ja sillä on myös hyvä korjaava vaikutus tymiinin vapaiden radikaalien anionien vaurioihin.

Napsauta Cistanche Tubulosaa

【Lisätietoja:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

1. Esittely

Ikääntymiselle on ominaista elinten ja kudosten pääasiallisten fysiologisten ja biokemiallisten toimintojen asteittainen heikkeneminen, ja siihen liittyy usein luuston lihasmassan ja -voiman asteittaista menetystä, joka tunnetaan sarkopeniana [1]. Sarkopenian aiheuttamia mekanismeja ei täysin ymmärretä; Siitä huolimatta se on todennäköisesti seurausta monitekijäisistä tapahtumista, mukaan lukien heikentynyt regeneraatiokyky [2,3], krooninen tulehdus [4,5], lisääntynyt oksidatiivisen stressin taso [5,6] ja mitokondrioiden toimintahäiriöt [7].

Lihasten regeneraatio on koordinoitu prosessi, jossa satelliittisolut, luurankolihasten kantasoluosasto, aktivoituvat ylläpitämään ja säilyttämään kudoksen rakennetta ja toimintaa vaurion sattuessa [8].

Regeneratiivisen prosessin ensimmäiselle vaiheelle on tunnusomaista myofibrinekroosi, joka johtuu solunulkoisen kalsiumin virtauksesta, joka johtaa myofibrillien proteolyysiin [9,10]. Tämä tapahtuma johtaa spesifisen tulehdusvasteen aktivoitumiseen, joka johtaa eri tulehduksellisten solupopulaatioiden peräkkäiseen tunkeutumiseen lihakseen [11]. Tulehdusvastetta seuraa satelliittisoluaktivaatio ja regeneroituvien säikeiden muodostuminen, jotka ovat morfologisesti erotettavissa tyypillisistä keskittyneistä ytimistä [12,13]. Ikääntyminen tai patologiset tilat voivat kuitenkin vaikuttaa vakavasti tehokkaaseen regeneratiiviseen ohjelmaan, ja laajentuneen fibroottisen kudoksen muodostuminen voi myötävaikuttaa toiminnan heikkenemiseen [14,15]. Lisäksi muutokset tulehduksellisissa sytokiineissa, kasvutekijöissä ja metabolisissa signaaleissa ikääntyneessä luustolihasympäristössä voivat vaikuttaa satelliittisolujen lisääntymiseen ja/tai aktivaatioon myofiber-vaurion yhteydessä [16]. Tiedetään todellakin, että ikääntyminen liittyy matala-asteiseen tulehdustilaan, tilaan, joka tunnetaan nimellä "tulehdus", jolle on tunnusomaista hieman kohonneet pro-inflammatoristen välittäjien, kuten tuumorinekroositekijän (TNF) ja interleukiini 6 ( IL-6), ja siitä johtuva NF-κB-reitin aktivaatio [13]. Mielenkiintoista on, että NF-KB-proteiinipitoisuuksien havaittiin olevan nelinkertaisia ​​iäkkäiden ihmisten lihaksissa verrattuna nuorten lihaksiin; tähän lisääntyneeseen keskittymiseen liittyy anabolisen signaalin puutteita, mikä johtaa ikääntyneiden lihasten tuhlaukseen [17].

Tulehduksen lisääntyminen liittyy läheisesti oksidatiivisiin vaurioihin, ja molemmat osallistuvat ikääntymiseen liittyvään lihasmassan ja -voiman vähenemiseen. Oksidatiiviselle stressille on ominaista korkea reaktiivisten happilajien (ROS) ja/tai reaktiivisten typpiyhdisteiden (RNS) taso. Se voi johtua heikentyneestä antioksidanttikapasiteetista johtuen heikentyneestä antioksidanttientsyymiaktiivisuudesta ja/tai lisääntyneestä ROS-tuotannosta [18]. Lisäksi kohonneet ROS- ja RNS-tasot voivat johtua myös mitokondrioiden toimintahäiriöistä, jotka johtuvat ikään liittyvistä mitokondrioiden DNA-mutaatioista, deleetioista ja vaurioista [19–21]. ROS näyttää toimivan toissijaisena TNF-lähettinä luurankolihaksessa aktivoiden NF-κB:tä joko suoraan tai epäsuorasti [14].

Luustolihaksissa transkription koaktivaattori, peroksisomiproliferaattorin aktivoima reseptori-gamma-koaktivaattori-1 (PGC-1) on yksi tärkeimmistä molekyyleistä, jotka osallistuvat mitokondrioiden biogeneesin stimulaatioon, solujen hapettimien ja antioksidanttien homeostaasin säätelyyn. , kroonisen tulehduksen ja lihaskatabolismin tukahduttamiseen [22]. PGC-1 on vuorovaikutuksessa tumareseptorien ja transkriptiotekijöiden kanssa aktivoidakseen niiden kohdegeenien transkription, ja sen aktiivisuus reagoi useisiin ärsykkeisiin, mukaan lukien kalsiumionit, ROS, insuliini, kilpirauhas- ja estrogeenihormonit, hypoksia, ATP-tarve ja sytokiinit [ 23]. Erityisesti mitokondrioiden biogeneesin PGC-1-säätely sisältää sen vuorovaikutuksen useiden ydintranskriptiotekijöiden kanssa, mukaan lukien PPAR-perheen jäsenet, ydinhengitystekijä (NRF)-1 ja NRF-2, myosyyttien tehostajatekijä{ {10}} (MEF2) ja forkhead box -proteiini O (FOXO) 1 [24,25]. NRF-1, 2:n PGC-1-aktivaatio edistää lukuisten tuman koodaamien mitokondrioproteiinien ilmentymistä, mikä stimuloi suoraan mitokondrion DNA:n replikaatiota ja transkriptiota [23,26,27]. Lisäksi PGC-1 voi yhteistyössä MEF2C-transkriptiotekijän kanssa vaikuttaa myös myofiber-fenotyyppiprofiileihin suosien siirtymistä nopeasta MHC:stä vastustuskykyisempään hitaan MHC:hen ikääntymisen aikana [28,29].

Viimeisen vuosikymmenen aikana useita strategioita, kuten fyysistä aktiivisuutta ja ravintoa, on ehdotettu mahdollisesti vähentämään luustolihasten heikkenemistä ikääntymisen aikana. Fyysisen harjoittelun onkin raportoitu vähentävän sarkopeniaa ja estävän kehon rasvan kertymistä ja tulehdusta [30–32]. Lisäksi proteiinien tai antioksidanttien saantiin kohdistuvilla ruokavaliotoimenpiteillä voi olla positiivinen vaikutus lihasmassan ja -voiman lisäämiseen [33]. Tiedetään, että vanhuksilla esiintyvä lihasmassan ja toiminnan menetys liittyy vähentyneeseen ravinnonsaantiin, mikä johtaa lihasproteiinisynteesin heikkenemiseen verrattuna nuorempiin ihmisiin [34]. Näin ollen ravitsemus, erityisesti aminohappojen lisäravinteet, voi olla tärkeä tapa parantaa lihaksen anabolista vastetta ikääntymisen aikana [35–39].

Tauriini on kysteiinistä peräisin oleva puolivälttämätön aminohappo, joka ilmentyy voimakkaasti nisäkkään kudoksissa. Luustolihaksissa, joissa sen tasot laskevat ikääntymisen myötä, sillä on tärkeä rooli antioksidanttina ja anti-inflammatorisena molekyylinä [40,41]. Koska tauriinipuutteisen luurankolihaksen morfologiassa ja toiminnassa on useita poikkeavuuksia, jotka muistuttavat ikääntymisen aikana ilmeneviä poikkeavuuksia [42], tauriinilisä voi edustaa lupaavaa strategiaa ikääntymisen negatiivisten vaikutusten torjumiseksi luustolihaksissa.

Tässä osoitamme, että vatsaontelonsisäinen tauriinin anto estää ikääntymiseen liittyvää luustolihasten regeneraatiota vähentämällä tulehdusta. Lisäksi tulokset tukevat tauriinin roolia antioksidanttimolekyylinä, joka pystyy parantamaan lihasten mikroympäristöä, torjumaan rappeuttavia prosesseja ja edistämään kudosten homeostaasia ikääntymisen aikana.

2. Materiaalit ja metodit

2.1. Eläimet ja hoidot

Nuoria (8–10 viikkoa) ja iäkkäitä (18–20 kuukautta) urospuolisia C57BL6J-hiiriä pidettiin tilassa, jossa valo/pimeysjakso oli 12 tuntia vakiolämpötilassa ja kosteudessa. Hiirten annettiin ruokkia ja juoda ad libitum. Hiiret käsiteltiin Rooman pyhän sydämen katolisen yliopiston eettisen komitean ohjeiden mukaisesti (lupa nro 150/2017-PR Italian terveysministeriö) käytettyjen eläinten suojelua koskevien kansallisten määräysten mukaisesti. tieteellisiin tarkoituksiin (Italian asetus nro 26, päivätty 4. maaliskuuta 2014, jossa tunnustetaan EU:n direktiivi 2010/63/EU). Tauriini valmistettiin suolaliuokseen ja annettiin intraperitoneaalisilla injektioilla annoksina 100 mg/kg/vrk viiden peräkkäisen viikon ajan [43–45] (kaavio 1). Tämä annos valittiin julkaistujen tietojen perusteella, jotka osoittavat antioksidanttisia vaikutuksia in vivo -hiirimalleissa [46,47]. Kontrollihiiret saivat vain suolaliuosta. Ennen TA-vaurion indusoimista kardiotoksiini- (CTX)-injektioilla eläimet nukutettiin vatsaontelonsisäisellä injektiolla ketamiinia 70 mg/kg ja medetomidiinia 1 mg/kg laimennettuna fysiologiseen liuokseen. Kontrolli- ja tauriinilla käsiteltyjen hiirten vasemman puolen tibialis anterior (TA) -lihasten vaurio tehtiin lihaksen koko pituudelta neljällä CTX-injektiolla (5 µl 10 µM CTX per kohta) [48, 49]. Oikeanpuoleista TA:ta käytettiin ohjausvastineena. Eläimet lopetettiin kohdunkaulan dislokaatiolla nukutuksen jälkeen, kuten edellä on kuvattu. Histologisia analyyseja varten TA-lihakset upotettiin OCT-yhdisteeseen (Miles, Elkhart, IN, USA) ja jäädytettiin välittömästi isopentaaniin -80 asteessa.

2.2. Histologinen ja histokemiallinen analyysi

Vanhojen hiirten TA-lihakset leikattiin 10 um:n paksuudella Leica-kryostaatilla. Histologista analyysiä varten leikkeet värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H&E) käyttäen standardimenetelmiä [50]. Esteraasivärjäys suoritettiin käyttämällä epäspesifistä esteraasivärjäyssarjaa (Bio-Optica, Milano, Italia) noudattaen valmistajan ohjeita.

2.3. Morfometrinen analyysi

Hematoksyliini- ja eosiini- ja esteraasivärjäys suoritettiin TA-näytteiden osille. Säikeiden koon morfometristä arviointia varten analyysi suoritettiin neljällä satunnaisesti valitulla kentällä, joissa oli suuri suurennos kuvia koko lihasten poikkileikkauksista kullekin tilalle. Tutkittujen eläinten lukumäärä oli 3-4 kutakin hoitoa kohden. Kuitujen mikrovalokuvat analysoitiin ImageJ:llä, Scion Image -ohjelmistolla (versio beta 4.0.2; Scion Corporation, Frederick, MD, USA, käytetty 2. toukokuuta 2022) kuitujen poikkileikkausalan arvioimiseksi. . Regeneroituvat kuidut korostuivat keskusytimien läsnäololla.

2.4. Immunofluoresenssianalyysi

Pakastetut leikkeet kiinnitettiin 4-prosenttisessa paraformaldehydissä 1 0 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, pestiin PBS:llä ja läpäistiin liuoksella, joka sisälsi 1 % naudan seerumialbumiinia (BSA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) , #A9418), 0,2 % Triton-X fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) 30 minuuttia huoneenlämmössä ja estetty 10 % aasin seerumilla (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, # D9663) 1 h huoneenlämmössä. Leikkeitä inkuboitiin yön yli 4 °C:ssa primääristen vasta-aineiden kanssa sopivassa laimennoksessa. Käytettiin seuraavia vasta-aineita: hidas MHC (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, #M8421, 1:500) ja 4-HNE (Alpha Diagnostics International, San Antonio, TX, #HNE{20) }}S, 1:500). Sen jälkeen kun leikkeitä oli pesty kolme kertaa PBS:ssä, niitä inkuboitiin sitten 60 minuuttia huoneenlämpötilassa spesifisten sekundaaristen vasta-aineiden kanssa. Erityisesti käytettiin seuraavia: AlexaFluor{24}}konjugoitu anti-hiiri 1:1000 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA, #A21203) ja AlexaFluor{29}}konjugoitu anti-kani 1:1000 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA, #A21206) PBS:ssä, joka sisältää 1,5 prosenttia aasin seerumia. Leikkeet asennettiin ProLong™ Gold Antifade Mountant -kiinnitysaineella DAPI:lla (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA, #P36935) ja tutkittiin Leica SP5 Laser -konfokaalilla. 4-HNE-signaalin muutosten kvantifiointi koeryhmissä suoritettiin densitometrisilla analyyseillä. Taustavähennyksen jälkeen 4-HNE-kuituihin liittyvät signaalit määritettiin hahmottelemalla manuaalisesti yksittäiset kuidut ja mittaamalla kuituihin liittyvä fluoresenssin intensiteetti ImageJ-ohjelmistolla. F/A-suhde määrittää yksittäisten kuitujen keskimääräisen fluoresenssin (F) normalisoituna kuidun kokonaispoikkileikkausalaan (A). Kvantitointi suoritettiin 50 kuidulle ryhmää kohden (n=3 hiirtä ryhmää kohden).

2.5. Proteiiniuutto ja Western blot -analyysi

Hiiristä saadut TA-lihakset leikattiin, jauhettiin ja homogenisoitiin lyysipuskurilla (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA, #9803), joka sisälsi fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA, #8553) ja täydellinen proteaasi-inhibiittoricocktail (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA, #5872). Käytettiin Bradford Protein Assayta (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) ja Varioskan™ LUX:ia, jota ohjaa Thermo Scientific™ SkanIt™, mikrolevylukijoihin (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA, ohjelmistoversio 4.1). määrittää yhtä suuri määrä proteiineja valmistajan ohjeiden mukaan. Proteiinit erotettiin SDS/PAGE:lla (Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Protein Gels tai Mini-PROTEAN TGX tahrattomat esivalmistetut PAGE-geelit; Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle ( Trans-Blot® Turbo™ Mini Nitrocellulose Transfer Packs #1704158; Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA). Epäspesifinen sitoutuminen estettiin Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS) (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA), jota oli täydennetty 0,1 prosentilla Tween-20 ja joka sisälsi 5 prosenttia rasvatonta kuivamaitoa (Bio-Rad Laboratories Inc. , Hercules, CA, USA #1706404) 1 tunnin ajan huoneenlämmössä. Ensisijaiset käytetyt vasta-aineet olivat: hiiren monoklonaalinen anti-SOD-1 (1:500, Santa Cruz Biotechnology Dallas, Texas 75220, USA, sc-17767); kanin monoklonaalinen anti-fosfo-mTOR (1:1000, #2971, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA); kanin monoklonaalinen anti-mTOR (1:1000, #2972, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA); hiiren monoklonaalinen anti-hidas-MHC (1:500, Sigma-Aldrich, #M8421); hiiren monoklonaalinen anti-myosiini (Skeletal, Fast) (1:500, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, #M4276); kanin monoklonaalinen anti-fosfo-NF-KB p65 (Ser468) (1:1000, #3039, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA); kanin monoklonaalinen anti-NF-KB p65 (1:250, #3034, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA); hiiren monoklonaalinen anti-G6PD (1:300, Santa Cruz Biotechnology Dallas, Texas 75220 USA, sc-373887) ja hiiren monoklonaalinen anti-GP91[phox]. Sitten blotteja inkuboitiin seuraavien Bio-Rad Laboratoriesin sekundaaristen vasta-aineiden kanssa: Goat anti-Rabbit IgG (1:3000, HRP-konjugaatti, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA, #1706515) ja Goat anti-Mouse IgG (1:3000, HRP-konjugaatti, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA, #1706516) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Signaalit sieppasi ChemiDoc™ Imaging System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) käyttämällä parannettua kemiluminesenssijärjestelmää (SuperSignal Chemoluminescent Substrate, Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, MA, USA). Densitometriset analyysit suoritettiin käyttämällä Image Lab™ Touchia, ohjelmistoversiota 5.2.1 (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA).

2.6. Reaaliaikainen PCR-analyysi

Hiiristä saadut TA-lihakset leikattiin ja RNA:n kokonaisuutto suoritettiin kudoslysaattorilla (QIAGEN) TriReagentissa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaksijuosteinen cDNA syntetisoitiin QuantiTect Reverse Transcription -pakkauksella (QIAGEN Srl, Milano, Italia). Messenger-RNA-analyysit suoritettiin ABI PRISM 7500 SDS:llä (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) käyttämällä spesifisiä TaqMan-määrityksiä (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA). Erityisesti käytettiin seuraavia määrityksiä: GPX1: mm_00656767_g1; MEF2C: mm{7}}m1; PGC1- : mm_01280835_m1; SOD1: mm{13}}m1; ja CAT: mm{15}}m1. Suhteellinen kvantifiointi suoritettiin käyttämällä endogeenistä kontrollia Hprt1 (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA). Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttämällä RNA-valmisteita kolmesta viiteen eri eläimestä kullekin ryhmälle, kuten kuvioissa on määritelty. Suhteellinen lauseke laskettiin 2−∆∆Ct-menetelmällä.

2.7. Tilastollinen analyysi

Useita tilastollisia vertailuja ryhmien välillä suoritettiin yksisuuntaisella ANOVA:lla. Kun selitteissä mainittiin, käytettiin Mann-Whitney rank-sum testiä tai paritonta Studentin t-testiä. Jokainen pylväs edustaa keskiarvoa ± SEM (keskiarvon standardivirhe).

3. Tulokset

3.1. Tauriinin antaminen ehkäisee ikääntymiseen liittyviä luuston lihasten uusiutumisen häiriöitä

Tutkiaksemme tauriinin antamisen vaikutusta luurankolihasten regeneraatioon aiheutimme vaurioita CTX-injektioilla kontrolli- (vehikkeli) ja tauriinilla käsiteltyjen vanhojen hiirten TA-lihaksissa. Morfologiset ja morfometriset analyysit paljastivat, että vaurion puuttuessa (kuvio 1A, B: paneelit a, b ja kuva 1C) tauriinilla käsiteltyjen hiirten lihassäikeillä oli hieman suurempi poikkileikkausala verrattuna kontrolleihin. Koska proteiinin homeostaasi luurankolihaksessa perustuu proteiinisynteesin ja proteiinien hajoamisen väliseen tasapainoon, analysoimme sitten sekä fosfo-mTOR:n, joka on proteiinisynteesin pääsäätelijä, että Atroginin-1, joka on yksi tärkeimmistä säätelijöistä, tasot. osallistuu proteiinien kataboliaan ubikvitiini-proteasomijärjestelmän kautta [40]. Tuloksemme osoittivat, että fosfo-mTOR-tasot kohosivat merkittävästi tauriinilla käsiteltyjen hiirten lihasuutteissa, kun taas Atrogin{10}} (FBXO32) -proteiinin merkittävää modulaatiota ei havaittu tässä tilassa (kuva 1D–F). Nämä tiedot osoittavat mTOR-riippuvaisen reitin osallistumisen tauriinin vaikutukseen havaittuun luustolihaskuitujen CSA:n lisääntymiseen. Lisäksi yhden viikon lihasvaurion jälkeen kuitujen poikkileikkaus vehikkelillä käsitellyissä hiirissä (CTX) paljasti rappeutumisen, johon liittyi akuutti tulehdus ja nekroosi, sekä pieniä regeneroituvia kuituja, jotka tunnistettiin keskusytimillä ( Kuvio 1G, H: paneeli c). Toisaalta suurempia regeneroituvia lihaskuituja ja vähemmän nekroottisia kuituja (kuvio 1G, H: paneeli d) ilmestyi tauriinilla käsiteltyjen vanhojen hiirten vaurioituneisiin lihaksiin sekä vähemmän infiltraatteja. Näiden tulosten analyysi, joka on esitetty kuvion 1I kaavioissa, paljasti, että tauriinin antaminen vaikutti kuidun kokojakaumaan suosimalla suurempien regeneroituvien kuitujen kerääntymistä verrattuna vaurioituneeseen kontrollilihakseen. Yhteenvetona voidaan todeta, että nämä tulokset viittaavat siihen, että tauriini voi stimuloida regeneratiivista prosessia antamalla suojaavan roolin luurankolihaskuitujen eheyden ylläpitämisessä ja edistämällä uusien lihaskuitujen muodostumisen kiihtymistä.

3.2. Tauriinilisäaine moduloi ikääntyneiden lihasten tulehdusvastetta

Ikääntymiseen liittyy krooninen matala-asteinen systeeminen tulehdustila [51], joka voi olla vastuussa luurankolihasten heikentyneestä regeneratiivisesta kapasiteetista [52]. Varmistaaksemme, liittyikö tauriinilla käsiteltyjen hiirten loukkaantuneissa lihaksissa havaittu tehostunut regeneratiivinen vaste tulehdusprosessin modulaatioon, tutkimme makrofagien läsnäoloa esteraasivärjäyksellä. Kuviot 2A, B osoittavat, että CTX-injektioiden seurauksena kaikissa lihasosissa oli lisääntynyt määrä yksitumaisia ​​tulehdussoluja verrattuna vahingoittumattomiin vastineisiin; kuitenkin vanhoissa vaurioituneissa lihaksissa (kuvio 2A: paneeli c ja kuvio 2B) läsnä olevien esteraasipositiivisten makrofagien suuri määrä heikkeni merkittävästi tauriinilisän läsnä ollessa (kuvio 2A: paneeli d ja kuvio 2B). Tauriinin vaikutusta tulehduksen laajuuden vähentämiseen regeneratiivisen prosessin aikana arvioitiin myös analysoimalla transkriptiotekijän NF-kB fosforyloituneen isoformin tasoja, koska tiedetään, että sen aktivaatio luurankolihaksessa johtaa tiettyjen lihasproteiinien hajoamiseen. , indusoi tulehdusta ja fibroosia ja estää myofiberien uusiutumisen vamman jälkeen [53–55]. Kuten kuvasta 2C, D näkyy, fosfo-NF-kB oli havaittavissa erittäin alhaisina tasoina sekä kontrolli- että tauriinilla hoidetuissa vahingoittumattomissa lihaksissa, kun taas korkeat fosfo-NF-kB:n tasot, jotka havaittiin CTX-vaurioituneissa lihaksissa, vähenivät dramaattisesti tauriinilla käsiteltyjen vanhojen hiirten lihakset. NF-kB:n kokonaistasot ja fosfo-NF-kB:n ja NF-kB:n välinen suhde analysoitiin ja niiden osoitettiin lisääntyneen, joskaan ei merkittävästi, CTX:n aiheuttaman vaurion vuoksi, kun taas tauriini esti tämän vaikutuksen (kuvio 2C, E, F) . Nämä tulokset osoittavat, että tauriini heikentää vaurioituneen lihaksen tulehdustilaa alentamalla sekä kokonais-NF-kB- että fosfo-NF-kB-tasoja.

3.3. Tauriini moduloi PGC1-- ja MEF2C-ilmentymistä ikääntyneiden hiirten TA-lihaksissa

Tutkiaksemme paremmin molekyylimekanismeja, jotka liittyvät tauriinin positiiviseen vaikutukseen luurankolihasten homeostaasiin, arvioimme transkription koaktivaattorin PGC-1 roolia. PGC-1 on tärkeä tekijä tulehdusta estävän ympäristön edistämisessä lihaksissa. Lisäksi on raportoitu, että PGC-1 voi parantaa lihasten toiminnan lisäksi myös lihaskudoksen morfologiaa ja eheyttä, mikä viittaa PGC-1:n mahdolliseen rooliin kuitujen korjaamisessa ja regeneraatiossa. Yhteistyössä MEF2C-transkriptiotekijän kanssa PGC-1:n on osoitettu säätelevän luustolihaskuitutyypin määritystä edistäen siirtymistä glykolyyttisistä kuiduista vastustuskykyisempiin oksidatiivisiin [56,57].

Näin ollen arvioimme RT-PCR-analyysin avulla PGC-1:n ja MEF2C:n mRNA:n ilmentymistasoja nuorten, vanhojen ja vanhojen tauriinilla käsiteltyjen hiirten TA-uutteissa määrittääksemme, aiheuttiko tauriinin antaminen edellä mainittujen transkription muutoksia. tekijät verrattuna siihen, mitä havaittiin sen puuttuessa. Terveissä olosuhteissa olevia nuoria hiiriä käytettiin näiden tekijöiden ilmentymistasojen arvioimiseen. Kuten kuviosta 3A, B näkyy, tauriinin puuttuessa vanhojen hiirten uutteissa ei havaittu muutoksia PGC-1-tasoissa ja vain lievä lasku MEF2C-tasoissa verrattuna nuoriin, kun taas mRNA-tasot molemmista molekyyleistä säädeltiin merkittävästi vanhoissa hiirissä, joille annettiin intraperitoneaaliset tauriiniinjektiot. On osoitettu, että tyypin I hitaasti nykivät oksidatiiviset kuidut (ilmentävät myosiinin raskaan ketjun hidasta isoformia, hidasta MHC:tä) kestävät paremmin vaurioita ja erilaisia ​​atrofisia olosuhteita kuin tyypin IIb nopeasti nykivät glykolyyttiset kuidut [29]. Useissa lihaspatologioissa, mukaan lukien sarkopeniassa, nopein lihasfenotyyppi on vakavammin vaarantunut verrattuna hitaisiin lihaksiin, ja tyypin IIb säikeiden suurempi herkkyys saattaa johtua niiden alhaisemmasta PGC-pitoisuudesta-1 verrattuna siihen. hapettavia kuituja [58,59]. Tässä osoitimme Western blot -analyysillä, että vanhojen hiirten TA-lihakset ilmensivät hyvin alhaisia ​​tasoja hitaan MHC-isoformia verrattuna nuorista peräisin oleviin lihasuutteisiin; kuitenkin hidas-MHC-ekspressio lisääntyi tauriinilla käsiteltyjen hiirten lihasuutteissa (kuvio 3C, D). Lisäksi nopean MHC-isoformin Western blot -analyysi paljasti, että tauriinin läsnä ollessa sen ilmentyminen oli merkittävästi voimistunut verrattuna siihen, mitä havaittiin vanhoista hiiristä saaduissa TA-uutteissa, jotka eivät saaneet tauriinia (kuva 3F). . Johdonmukaisesti vanhojen hiirten lihasuutteissa havaitut MHC:n (MF20) alentuneet tasot nuorten hiirten tasoihin verrattuna lisääntyivät tauriinin antamisen myötä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että tauriinin positiivinen vaikutus ikääntyneiden hiirten luustolihasten homeostaasiin saattaa johtua PGC1- /MEF2C-reitin stimulaatiosta, mikä edistää myofiberien mahdollista metabolista siirtymistä kohti oksidatiivista fenotyyppiä ja säilyttää herkkiä glykolyyttisiä kuituja.

【Lisätietoja:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】