Synergistinen immuniteetti ja suoja hiirillä yhteisimmunisoinnilla DNA-rokotteilla, jotka koodaavat piikkiproteiinia ja muita SARS-CoV:n rakenneproteiineja-2

Abstrakti:Vaikean akuutin hengitystieoireyhtymän koronavirus 2:n (SARS CoV-2) uusien muunnelmien ilmaantuminen on aiheuttanut toistuvia maailmanlaajuisia infektioepidemia. Nämä erittäin mutatoidut variantit vähentävät nykyisten koronavirustauti 2019 (COVID-19) -rokotteiden tehokkuutta. Rokotteet on suunniteltu kohdistamaan vain alkuperäisen viruksen piikki (S) -proteiini. SARS-CoV-2:n S:tä lukuun ottamatta muiden rakenneproteiinien (nukleokapsidi, N; vaippa, E; kalvo, M) immunosuojaava potentiaali rokotteen kohdeantigeeneinä on edelleen epäselvä ja tutkimuksen arvoinen. Tässä tutkimuksessa kehitettiin synteettisiä DNA-rokotteita, jotka koodaavat neljää SARS-CoV-2 -rakenneproteiinia (pS, pN, pE ja pM), ja hiiret immunisoitiin kolmella annoksella lihaksensisäisellä injektiolla ja elektroporaatiolla. Erityisesti yhteisimmunisointi kahdella S- ja N-proteiineja ilmentävillä DNA-rokotteilla indusoi korkeampia neutraloivia vasta-aineita ja oli tehokkaampi SARS-CoV-2-viruskuorman vähentämisessä kuin pelkkä S-proteiini hiirillä. Lisäksi pS-koimmunisaatio joko pN:llä tai pE + pM:llä indusoi korkeamman S-proteiinispesifisen soluimmuniteetin kolmen immunisoinnin jälkeen ja aiheutti lievempiä histopatologisia muutoksia kuin pS yksin altistuksen jälkeen. SARS-CoV-2:n konservoituneiden rakenneproteiinien, mukaan lukien N/E/M-proteiinit, roolia tulisi tutkia tarkemmin niiden käyttöä varten rokotesuunnittelussa, kuten mRNA-rokotteet.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Avainsanat: COVID-19; SARS-CoV-2}}; yhteisimmunisointi; DNA-rokote; piikki proteiini; rakenteellinen proteiini

1. Esittely

Vaikea akuutti hengitystieoireyhtymä koronavirus 2 (SARS-CoV-2) on syynä vuoden 2019 koronavirustautiin (COVID-19), joka on aiheuttanut miljoonia infektioita ja kuolemantapauksia maailmanlaajuisesti ja vaarantanut ihmisten terveyden ja maailmantalouden . Vaikka tehokkaita terapeuttisia lähestymistapoja ei ole vielä saatavilla, ne ovat kehittyneet nopeasti, mukaan lukien CAR-T-soluterapian ja nanoteknologian soveltaminen [1,2]. Rokottaminen on tehokas tapa hallita pandemiaa, ja useat rokotteet ovat hyväksyneet käytettäväksi useiden terveysviranomaisten [3,4]. Koronaviruksen genomi koodaa neljää päärakenneproteiinia, nimittäin piikki (S), nukleokapsidi (N), kalvo (M) ja vaippa (E) proteiineja, jotka ovat vastuussa virionin kokoamisesta ja isännän immuunivasteen suppressiosta [5 ]. S-proteiini koostuu 1273 aminohappotähteestä, jotka sisältävät kaksi alayksikköä, nimittäin S1 ja S2. Se välittää viruksen sisäänpääsyä ja on pääkohde koronavirusrokotteiden kehittämisessä [6–11]. SARS-CoV-2 S-proteiinilla on kuitenkin korkea mutaatiotaajuus. Ei ole yllättävää, että SARS-CoV-2, RNA-virus, mutaatio on jatkuva ja väistämätön. Syyskuun 2020 jälkeen on ilmaantunut viisi SARS-CoV{21}} -varianttia (VOC), mukaan lukien B.1.1.7 (Yhdistynyt kuningaskunta, Alpha), B.1.351 (Etelä-Afrikka, Beta), P.1 (Brasilia, Gamma), B.1.617.2 (Intia, Delta) ja B.1.1.529 (Etelä-Afrikka, Omicron) (Andreano ja Rappuoli, 2021; Gupta, 2021). Heillä kaikilla on useita mutaatioita piikkiproteiinissa [12]. Nämä muunnelmat uhkaavat nykyisten COVID-19-rokotteiden tehokkuutta. Rokotteet on suunniteltu kohdistumaan vain piikkiproteiiniin.

SARS-CoV-2:n N-proteiini sitoutuu viruksen RNA:han 140-aminohapon pituisen RNA:ta sitovan domeenin kautta niiden ytimessä "helminauhassa" -tavalla. Se on erittäin konservoitunut koronavirusten joukossa ja jakaa ~90 % sekvenssi-identtisyyden SARS-CoV:n kanssa, ja se on myös ainoa rakenteellinen proteiini virionin sisällä [13]. Lisäksi sillä on tärkeä rooli virus-RNA:n pakkaamisessa ribonukleokapsidikompleksiin ja se on välttämätön viruksen RNA:n replikaatiolle, virionin kokoamiselle ja vapautumiselle isäntäsoluista [14]. Koronavirusten N-proteiinin suuren sekvenssin samankaltaisuuden perusteella sitä voidaan ehdottaa ristiinsuojaavan rokotteen kohteeksi. Olemme aiemmin havainneet, että yhteisimmunisointi kahdella E- ja M-proteiineja ekspressoivalla DNA-rokotteella tarjoaa osittaisen suojan SARS-CoV-virusta vastaan-2, ja tätä menetelmää tulisi harkita rokotteen kehittämisessä [15]. WHO:n maisemaasiakirjasta riippuen SARS-CoV-2-rokoteehdokkaille on yleensä seitsemän strategiaa, jotka voidaan jakaa edelleen kolmeen luokkaan: ensinnäkin proteiinipohjaiset rokotteet, mukaan lukien inaktivoidut virusrokotteet, viruksen kaltaiset rokotteet. hiukkaset ja proteiinialayksikkörokotteet; toiseksi geenipohjaiset rokotteet, mukaan lukien virusvektorirokotteet, DNA-rokotteet ja mRNA-rokotteet; kolmanneksi yhdistelmä sekä proteiinipohjaisia ​​että geenipohjaisia ​​lähestymistapoja, kuten eläviä heikennettyjä virusrokotteita. DNA-tekniikat uusina geenipohjaisina rokotestrategioina voivat nopeasti verrata useita rokoteehdokkaita ja -strategioita prekliinisen testauksen aikana [16,17]. Teoreettisesti lähes kaikki virusproteiinit ovat mahdollisia immunogeenejä ja rokotekohteita. Tietojemme mukaan synteettisten DNA-rokotteiden immunogeenisyyttä ja suojaavaa potentiaalia SARS-CoV-2 S-proteiineja ja muita rakenneproteiineja koodaavien proteiinien ja muiden rakenteellisten proteiinien osalta ei kuitenkaan ole vielä raportoitu järjestelmällisesti. Neljän SARS-CoV-2 S-, N-, E- ja Ml-proteiineja ilmentävän DNA-rokotteen immunogeenisyys ja suojaava tehokkuus hiirillä arvioitiin S:n immunologisten vaikutusten tutkimiseksi yhdessä muiden rakenneproteiinien kanssa.

2. Materiaalit ja metodit

2.1. Solut

Huh7.5-soluja ja ihmisen alkion munuaisen 293T-soluja viljeltiin 37 ◦C:ssa kosteassa ilmakehässä 5 % CO2:ssa koko tutkimuksen ajan. Soluja viljeltiin DMEM-elatusaineessa (HyClone, Logan, UT, USA), jota oli täydennetty 10 % FBS:llä (GEMINI Co., Shanghai, Kiina) ja 1 % penisilliini-streptomysiinillä (Gibco, New York, NY, USA). Kaikki solulinjat vahvistettiin negatiivisiksi mykoplasmakontaminaation suhteen.

2.2. SARS-CoV-2 S/N/E/M koodaavien DNA-rokotteiden rakentaminen

SARS-CoV-2 S/N-proteiinia koodaava geeni, joka sisältää N-terminaalisen Kozak-sekvenssin (GCCACC) ja sen jälkeen aloituskodonin (ATG), syntetisoitiin käyttämällä nisäkäsoptimoitua kodonia (GenScript Co., Nanjing). , Kiina). Sitten se kloonattiin ekspressiovektoriin pcDNA3.1 (+) EcoRI- ja Xbal-digestiolla ja nimettiin pS/pN (DNA-rokotteet) (kuvio 1A). pE/PM-proteiini rakennettiin ja tunnistettiin, kuten aiemmin on kuvattu [15]. Rokotteet valmistettiin käyttämällä endotoksiinivapaita Maxiprep-pakkauksia (Qiagen, Peking, Kiina), ja sekvenssit varmistettiin käyttämällä Sangerin DNA-sekvensointia. S/N-proteiinin ilmentyminen varmistettiin käyttämällä Western blot -menetelmää ja anti-S (Sino Biological, Beijing, Kiina)/anti-N-vasta-aineita laimennettuina 1:1000. Nämä kokeet suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla [15,18].

Kuva 1. Rekombinantti-DNA-pohjaisten SARS-CoV-2 S/N-proteiinirokotekonstruktien suunnittelu ja ilmentäminen. (A) Kaavio yhdistelmä-DNA-pohjaisista rokotteista, jotka koodaavat SARS-CoV-2-piikkiä (PS), nukleokapsidi (pN), vaippa (pE) ja/tai kalvo (PM) proteiineja. (B) Kohdeproteiinin ilmentyminen DNA-rokotteissa validoitiin pS/pN/pE/pM-plasmideilla transfektoitujen 293T-solujen Western blot -analyysillä.

2.3. Rokotus ja haaste

Naaraspuolisia BALB/c-hiiriä (Charles River Laboratories, Ranska) 6 viikon ikäisinä pidettiin National Institute of Occupational Health and Poison Controlissa 21 °C:ssa ja kosteuskontrolloidussa ympäristössä 12 tunnin valo/pimeys-jaksoilla. Sillä välin ruokaa ja vettä annettiin ad libitum, ja Kiinan tautien valvonta- ja ehkäisykeskuksen (China CDC) eläinkokeiden etiikkakomitea hyväksyi kaikki eläinkokeet. Tutkimus noudatti asiaankuuluvia eettisiä määräyksiä.

Hiiret jaettiin satunnaisesti viiteen ryhmään ja immunisoitiin pelkällä pS/pN:llä tai yhteisimmunisoitiin pS + pN:llä tai pS + pE + PM:llä päivinä 0, 21 ja 42 lihaksensisäisellä injektiolla plus elektroporaatiolla (35 mg/50). ml) (kuvio 2) [19,20]. Lyhyesti sanottuna DNA-rokotteet injektoitiin tibialis anterior (TA) -lihakseen ja pulssittiin välittömästi sähköllä käyttämällä 5 mm:n etäisyydellä toisistaan ​​olevaa kaksineulasta elektrodia (ECM830; BTX) neuloilla. Seerumit hiiristä kerättiin humoraalista immuunivasteanalyysiä varten, ja hiiren pernat käsiteltiin soluimmuunivasteen mittaamiseksi (kuvio 2).

Kuva 2. Kaavio immunisoinnista ja SARS-CoV-2-altistuksesta. Rokotuksen, haastamisen ja veri-/kudosnäytteenoton aika. BALB/C-hiiret jaettiin satunnaisesti ryhmiin.

SARS-CoV-2-altistuskokeet suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla [15,21]. Lyhyesti sanottuna hiiret nukutettiin ja transdusoitiin sitten intranasaalisesti 2,5 × 108 PFU:lla Ad5-hACE2:ta kokonaistilavuudessa 45 µl. Viisi päivää transduktion jälkeen hiiret nukutettiin ja altistettiin nenänsisäisesti 1 × 105 TCID50 SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC HB-02/2019) kokonaistilavuudessa 50 µl suolaliuosta. puskuri. Kaikki työ elävän SARS-CoV-2 kanssa hiirimalleissa tehtiin Animal Biosafety Level 3 (ABSL-3) -laboratorioissa.

2.4. Entsyymi-immunosorbenttimääritys

Entsyymi-immunosorbenttimääritykset (ELISA) suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla [15]. Lyhyesti sanottuna S (ostettu Sino Biologicallta)/N-proteiinit (lahja Songilta) laimennettuina karbonaattipuskuriin (0,1 M, pH 9,6) päällystettiin 96-kuoppa EIA/RIA-levyille (Thermo). Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) yön yli 4 ◦C:ssa. Levyt suojattiin 200 ul:lla 10-prosenttista vuohen seerumia PBS:ssä 37 °C:ssa 2 tunnin ajan, minkä jälkeen ne pestiin viisi kertaa PBST:llä. Sitten lisättiin seeruminäytteet, jotka oli sarjalaimennettu 2-prosenttiseen vuohen seerumiin PBS:ssä, ja inkuboitiin 2 tuntia 37 °C:ssa, mitä seurasi viisi pesua PBST:llä. HRP-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG Ab:ta (1:5000) lisättiin 37 °C:ssa 1 tunnin ajaksi. Yhteensä 100 ui TMB-substraattia lisättiin kuhunkin kuoppaan ja sammutettiin 50 ul:lla 2 M H2S04:a. Absorbanssi luettiin aallonpituudella 450 nm käyttämällä SPECTR Ostar Nanoa (BIO-GENE, Hong Kong, Kiina).

cistanche-kasveja lisäävä immuunijärjestelmä

Napsauta tästä nähdäksesi Cistanche Enhance Immunity -tuotteet

【Kysy lisää】 Sähköposti:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.5. Pseudovirusinfektio- ja neutralointikokeet

Pseudoviruksen neutralointimääritys suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla [21,22]. Plasmidi, joka ekspressoi esi-isän viruksen S-proteiinia, rakennettiin aiemmin [22]. Omicron-variantti SARS-CoV-2-piikkiproteiinigeeni (GISAID: EPI_ISL_6590782.2) syntetisoitiin (lahja Vazyme Biotech Co., Ltd.:ltä, Nanjing, Kiina) käyttäen nisäkäsoptimoitua kodonia ja kloonattu pcDNA3.1-vektoriin, kuten aiemmin on kuvattu [22]. Lyhyesti sanottuna lusiferaasireportteria ilmentävät plasmidit ja S-proteiinia ekspressoivat plasmidit kotransfektoitiin HEK 293T-soluihin käyttämällä X-treme GENE HP DNA -transfektioreagenssia. Soluviljelmä päivitettiin 6 tuntia transfektion jälkeen, ja pseudovirusta sisältävä supernatantti kerättiin 48 tunnin kuluttua ja säilytettiin -70 ◦C:ssa. Pseudoviruksen neutralointimäärityksessä samansuuruista seerumi-virusseosta inkuboitiin sitten 37 tilavuudessa pseudovirusta sisältävää supernatanttia ja lisättiin sitten laimennettuun seerumiin. ◦C 1 tunnin ajan. Huh7.5-soluviljelyalustat korvattiin sitten 100 µl:lla seerumi-virusseosta ja inkuboitiin 37 ◦C:ssa 12 tuntia. Vain SARS-CoV-2-pseudoviruksilla viljellyt solut ajettiin rinnakkain. Väliaine korvattiin sitten DMEM:llä (2 % FBS) ja inkubaatiota inkuboitiin 37 °C:ssa 48 tuntia. Sitten lusiferaasisignaali mitattiin käyttämällä Bright-Glo Firefly lusiferaasisarjaa (Promega).

2.6. SARS-CoV-2 Neutralization Assay

Tässä kokeessa käytettiin SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC-HB-02/2019). Lyhyesti sanottuna seerumit laimennettiin kaksinkertaiseksi aloituslaimennuksesta 1:10, sekoitettiin yhtä suureen tilavuuteen (10–15 pfu/kuoppa) elävää SARS-CoV-2 ja inkuboitiin 1 tunti 37 ◦C:ssa, minkä jälkeen ne lisättiin ympättyihin Vero-soluihin. 37 °C:ssa 48 tunnin inkubaation jälkeen havaittiin sytopaattinen vaikutus (CPE), ja 100 ui viljelmän supernatanttia kerättiin nukleiinihappouuttoa ja reaaliaikaista fluoresenssikäänteistranskriptio-PCR:ää (RT-PCR) varten. Mediaani neutralointiannos (ND50) laskettiin Reed-Munchin menetelmällä [15].

2.7. IFN-ELISpot Assay

Scilight Biotechnology, LLC syntetisoi peptidipoolit, jotka kattavat koko S/N/E/M-proteiinin peräkkäisinä 15-meereinä yli 10 aminohapon verran. Noin 2,5 mg kutakin peptidipoolissa olevaa puhdistettua peptidiä oli läsnä pullossa. Koe suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla [18]. Lyhyesti sanottuna 96-kuoppalevyt (BD ELISPOT Set, USA) päällystettiin anti-IFN-kaappaus Ab:lla ja inkuboitiin yön yli 4 ◦C:ssa. Levyt suojattiin täydellisellä viljelyväliaineella kolmen pesun jälkeen. Splenosyytit kerättiin sen jälkeen, kun hiiret oli lopetettu 35. päivänä ja 120. Tuoreet yksisolususpensiot kustakin ryhmästä maljattiin 5 x 106 per kuoppa, ja peptidejä lisättiin. Levyjä inkuboitiin sitten 37 °C:ssa 5 % C02:ssa 22 tuntia ja havaittiin käyttämällä ELISpot-levylukijaa (Biosys, So. Pasadena, CA, USA). Spot-forming unit (SFU) edustaa T-soluja erittävää IFN-.

2.8. Suojauksen arviointi hiirillä SARS-CoV--2-haasteen jälkeen

Kokeet suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla [15,21]. Lyhyesti sanottuna keuhkot kerättiin sen jälkeen, kun hiiret oli lopetettu. Puolet kudoksista käytettiin nukleiinihappouuttoon, reaaliaikaiseen fluoresenssi-RT-PCR:ään ja TCID50:een. Toinen puoli lähetettiin Kiinan maatalousyliopiston eläinlääketieteen korkeakouluun patologista arviointia varten.

2.9. Tilastollinen analyysi

Parittomat t-testit, kaksisuuntaiset ANOVA-testit ja Dunnettin useiden vertailujen testi suoritettiin GraphPad Prism 7:llä.0 (GraphPad Software LLC). p-arvoja < 0.05 pidettiin tilastollisesti merkitsevänä (* p < 0.05; ** p < 0.01; * ** p < 0,001; **** p < 0,0001).

3. Tulokset

3.1. DNA-rokotteiden karakterisointi

E- ja M-proteiinitasot havaittiin käyttämällä Western blot -menetelmää. Mittasimme SARS-CoV-2:n koodaamien S/N/E/M-proteiinien ilmentymisen pS/pN/pE/pM-plasmideilla transfektoiduissa HEK-293T-soluissa Western blot -analyysillä käyttämällä anti- -S/anti-N-vasta-aineet ja anti-6 x His-vasta-aine solulysaateissa. Nauhat vastasivat S (140–142 kDa), N (45 kDa), E (10 kDa) ja M (22–25 kDa) proteiinien ennustettua molekyylipainoa (kuva 1B).

3.2. pS:n ja/tai pN DNA:n indusoima vahva ja jatkuva anti-S- ja/tai anti-N IgG-tuotanto

Rokotteet Seerumi kerättiin BALB/c-hiiristä 35, 56, 96 ja 120 päivän kohdalla (kuvio 2). Anti S/anti-N IgG-tasot havaittiin käyttämällä ELISA:ta. pS:n tai pN:n indusoiman S- tai N-spesifisen IgG-vasteen suuruus lisääntyi seerumissa ensimmäisen ja toisen tehosteen jälkeen. Anti-S- ja anti-N IgG-tiitterit olivat korkeammat pS + pN -ryhmässä kuin muissa ryhmissä; ero ei kuitenkaan ollut tilastollisesti merkitsevä (kuvio 3A, B). Mitään vankkoja E/M-proteiinispesifisiä vasta-ainevasteita ei havaittu, mikä on yhdenmukaista aiemman tutkimuksen tulosten kanssa (tietoja ei esitetä) [15].

Kuva 3. B-soluvasteet SARS-CoV-2:lle BALB/c-hiirissä. (A) Seerumin IgG-sitoutumispäätepistetiitterit SARS-CoV-2 S (A)- ja N-proteiineille (B). (C) Neutralointitiitterit määritettiin SARS-CoV-2-pseudotyyppisen virusjärjestelmän perusteella. (D) Anti-SARS-CoV{11}}-neutralointitiitterit määritettiin käyttämällä SARS-CoV-2-virusta. (E) Neutralointimääritys, joka perustuu SARS-CoV-2 Omicronin pseudotyyppiseen virusjärjestelmään. Näytetään estosuhteet valeryhmien (sininen), pS (punainen), pS + pN (vihreä), pS + pE + pM (vaaleanpunainen) ja pN (oranssi) seerumeille. Virhepalkit edustavat SEM:ää, ja p-arvot laskettiin käyttämällä kaksisuuntaista ANOVAa ja Sidakin post hoc -analyysiä, jossa * p < 0.05

3.3. pS- ja pN-rokotteiden yhteisimmunisoinnin aiheuttamat korkeat tasot neutraloivia vasta-aineita

Sarjalaimennettujen seeruminäytteiden neutraloivat tiitterit määritettiin käyttämällä pseudotyyppistä SARS-CoV-2-virusta. Korkeimmat neutraloivien vasta-aineiden (nAb:t) tasot havaittiin pS + pN -ryhmässä, ja käänteiset EC50 geometriset keskiarvotiitterit saavuttivat 2988 (päivänä 35) ja 3578 (päivänä 56) (kuvio 3C). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin käyttämällä elävän viruksen mikroneutralisointitestiä (MN), jossa pS + pN -ryhmän nAb-tasot olivat korkeammat kuin S-ryhmässä päivinä 56 ja 96 (p < 0,05; kuva). 3D). Lisäksi nAb-tasot pS + pN -ryhmässä päivänä 56 (toinen tehoste) olivat merkittävästi korkeammat kuin päivänä 35 (p < 0,05; kuvio 3D).

Kunkin rokoteohjelman neutraloiva vaikutus SARS-CoV-2 Omicron-varianttia vastaan ​​määritettiin edelleen käyttämällä pseudotyyppistä alustaa ja seeruminäytteitä. Neutralointiprofiili Omicron-virusta vastaan ​​päivinä 35 ja 56 oli samanlainen kuin esi-isien virusta vastaan ​​(kuvio 3E), mikä viittaa siihen, että PS + pN -käsittelyllä oli ristiin neutraloiva teho.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

3.4. DNA-rokotteen aiheuttamat T-soluvasteet

Kuten aiemmin on kuvattu, T-soluvasteet SARS-CoV-2 S/N/E/M-antigeenejä vastaan ​​arvioitiin käyttämällä IFN-ELISpotia, kuten aiemmin on kuvattu [15]. Kuten odotettiin, sekä PS + pN- että pS + pE + pM -ohjelmat indusoivat merkittävästi korkeampia S-proteiinille spesifisiä IFN + T-soluja päivänä 120 kuin päivänä 35 (p < 0). 05; kuva 4A). Lisäksi N-proteiinille spesifisten IFN+T-solujen lukumäärä päivänä 120 (toinen tehostus) oli merkitsevästi suurempi kuin päivänä 35 pS + pN -ryhmässä (p < 0,05; kuvio 4B). Lopuksi, M-proteiinille spesifisten IFN + T-solujen lukumäärä päivänä 120 (toinen tehoste) oli merkittävästi suurempi kuin päivänä 35 molemmissa ryhmissä (p < 0,05; kuvio 4D).

Kuva 4. T-soluvasteet SARS-CoV-2 yksittäisille rakenneproteiineille BALB/c-hiirissä. (A) T-soluvasteet mitattiin käyttämällä IFN-ELISpotia splenosyyteissä, joita stimuloitiin 20 tuntia päällekkäisillä peptidipoolilla, jotka kattavat SARS-CoV-2 S, (B) N, (C) E, ja (D) M-proteiinit. Palkit edustavat keskiarvoa ± SD. Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttämällä kaksisuuntaista ANOVAa ja Sidakin post hoc -testiä, jossa * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,01 ja **** p < 0,0001.

3.5. Synergistinen suoja, jonka indusoi yhteisimmunisaatio pS/pN:llä tai pS/pE/pM:llä

Arvioimme sitten DNA-rokotteiden suojaavan tehokkuuden käyttämällä hACE2-hiiriä, jotka oli immunisoitu altistuksen jälkeen esivanhemmalla SARS-CoV-2-viruksella. Haasteen jälkeen valeryhmän hiiret osoittivat asteittaista painonpudotusta. Sitä vastoin joko pS:llä tai pS+:lla immunisoidut hiiret osoittivat lievää painon laskua välittömästi infektion jälkeen, mitä seurasi toipuminen (kuvio 5A). Elävää virusta ei havaittu hiirissä, jotka oli rokotettu pS:llä, pS + pN:llä tai pS + pE + pM:llä. Lisäksi pS + pN -rokotus vähensi merkittävästi viruksen RNA:n kopiolukuja verrattuna niihin, jotka saatiin pelkällä pS-rokotuksella (p=0.0228; kuvio 5B). Lisäksi keuhkojen histopatologia osoitti, että hiirillä sekä vale- että pN-ryhmissä oli tulehduspisteitä, keuhkopussin invaginaatio, alveolaarinen romahdus, korkea tulehdussolujen infiltraatio ja verenvuotoalueita. Vertailun vuoksi joko pS + pN:llä tai pS + pE + pM:llä käsitellyillä hiirillä oli lievempiä histopatologisia muutoksia ja alhaisemmat INHAND-pisteet altistuksen jälkeen kuin toisessa ryhmässä (kuvio 5C).

Kuva 5. Immunisaation suojaava tehokkuus elävällä SARS-CoV-2-viruksella altistuksen jälkeen. (A) Hiiret punnittiin päivittäin (keskiarvo ± keskiarvon standardivirhe (SEM), n=4) kolmen päivän ajan altistuksen jälkeen. (B) Infektoiva SARS-CoV-2-tiitteri keuhkohomogenaateissa kolmantena päivänä altistuksen jälkeen, määritettynä TCID5{{10}}-määrityksellä ja RNA-kopionumerolla. Tilastollisesti merkitsevät erot ryhmien välillä määritettiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVAa, jota seurasi Dunnettin moninkertainen vertailukorjaus (* p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 ja **** p < 0,0001). (C) Keuhkojen histopatologinen analyysi käyttäen H&E-värjäystä.

4. Keskustelu

Tässä tutkimuksessa yhteisimmunisointi kahdella S- ja N-proteiineja ilmentävillä DNA-rokotteilla indusoi korkeita nAb-tasoja ja oli erittäin tehokas SARS-CoV-2-viruskuorman vähentämisessä hiirillä. S-proteiinia ilmentävät DNA-rokotteet indusoivat kohonneita S-proteiinispesifisiä soluimmuniteettitasoja kolmen immunisoinnin jälkeen, kun hiiret immunisoitiin yhdessä N/E- ja M-proteiineilla, ja ne lievittivät altistuksen jälkeisiä histopatologisia muutoksia. Tietojemme mukaan tämä on ensimmäinen raportti, joka paljastaa immuniteetin ja suojan synergistisen vahvistumisen hiirillä käyttämällä S-proteiinia koodaavaa DNA-rokottetta, kun ne on yhteisimmunisoitu SARS-CoV:n muita rakenneproteiineja koodaavien DNA-rokotteiden kanssa. }}.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Immunodominantteja B-soluepitooppeja N-antigeenialueilla on havaittu useissa tutkimuksissa. N-pohjaiset rokotteet eivät yleensä voi indusoida nAb:ita, todennäköisesti koska N-proteiinia ei näy viruksen pinnalla. Erityisesti yhteisimmunisaatio S- ja N-proteiinien kanssa indusoi korkeampia nAb-tasoja esi- ja Omicron SARS-CoV-2 -virusta vastaan ​​kuin muut ryhmät. Lisääntynyt nAb-vaste liittyy parempaan viruksen puhdistumaan ja suojaavaan tehokkuuteen. Tuloksemme osoittivat, että pS+pN-hoito oli tehokkaampi kuin pelkkä pS-hoito vähentämään SARS-CoV-2-viruskuormaa altistuksen jälkeen. Aiemmassa tutkimuksessa kerrottiin, että hamsterit, jotka oli immunisoitu rokotteella, joka ekspressoi samanaikaisesti M- ja N-proteiineja, suojautuivat vakavalta painonpudotukselta ja keuhkojen patologialta, ja heillä oli merkittävästi alentuneet virustiitterit suunnielun ja keuhkojen alueella SARS-CoV{12}}-altistuksen jälkeen. mikä on yhdenmukainen tulostemme kanssa [23]. Valitettavasti virustiitterien laskua ei voida spesifisesti katsoa johtuvan M- tai N-proteiinista, eikä nAb-tasoja arvioitu tässä tutkimuksessa. Eräässä SARS-CoV-2-mRNA-rokotetutkimuksessa raportoitiin, että S + N -yhteisimmunisaatio indusoi lisääntyneen S-spesifisen CD8+ T-soluvasteen ja neutraloivan vasta-ainetoiminnan, mikä tarjosi keuhkoissa paremman suojan deltaa vastaan. variantti verrattuna pelkkään S:ään, mikä on yhdenmukainen tämän tutkimuksen tulosten kanssa [24]. Toisessa tutkimuksessa raportoitiin, että tarttuvan gastroenteriittikoronaviruksen N-proteiini edisti neutraloivien vasta-aineiden synteesiä, kun sian TGEV-IMMUNE-soluja stimuloitiin S- ja N-proteiinien yhdistelmällä in vitro, ja tämä vaikutus saattaa selittyä auttaja-T-lymfosyyttien vasteella. N-proteiini [25].

Immunodominantteja CD{0}}/CD8+ T-soluepitooppeja N-antigeenialueilla on tunnistettu aiemmin. Useat tutkimukset ovat raportoineet, että SARS-CoV-2 N-proteiiniin perustuvat rokotteet indusoivat tehokkaasti solujen immuunivasteita. S + N -ryhmä osoitti kohonneita S-proteiinispesifisiä soluimmuniteettitasoja kolmen immunisoinnin jälkeen. Yksi SARS-CoV-2 mRNA-rokotetutkimus raportoi, että kombinatorinen S + N indusoi lisääntyneen S-spesifisen CD8+ T-soluvasteen verrattuna pelkkään S:ään, mikä on yhdenmukainen tulostemme kanssa [24]. Toisessa tutkimuksessa raportoitiin, että T-soluvasteet S- ja N-antigeeneille pelkän kaksoisantigeenin hAd5 S + N -prime-rokotuksen jälkeen olivat samanlaisia ​​kuin aiemmin SARS-CoV{20}}-tartunnan saaneilla potilailla, ja T-solujen in silico -ennustemallit. epitooppi HLA:n sitoutuminen viittasi siihen, että T-soluvasteet hAd5 S+N -rokotteelle säilyttävät tehokkuutensa B.1.351-varianttia vastaan. Lisäksi aiemmin SARS-CoV-2-infektoituneiden potilaiden plasma osoitti korkeampaa sitoutumisaffiniteettia soluihin, jotka ilmensivät kaksoisantigeenin S-Fusion + N-ETSD -konstruktia kuin pelkkään hAd5 S-Fusion -rakenteeseen, mikä viittaa edelleen siihen, että solujen immunogeenisyys. S+N-kaksoisantigeenirokote on parempi kuin yksiantigeeninen S-rokote [26].

Elävää virusta ei havaittu keuhkoista, ja altistuksen jälkeinen painonlasku lieventyi pS-, pS + pN- ja pS + pE + pM-ryhmissä, kun taas pN-käsittely ei vähentänyt tehokkaasti virustiitteriä. Nämä havainnot korostavat S-proteiinin välttämättömyyttä ja tehokkuutta rokotteen kohteena. Erityisesti yhteisimmunisaatiolla pS:n ja pN:n kanssa oli paremmat vaikutukset viruksen puhdistumaan kuin joko pS:llä tai pN:llä. Ryhmä pS + pE + pM osoitti vähemmän histopatologisia muutoksia keuhkoissa, mikä on yhdenmukainen edellisen tutkimuksemme [15] tulosten kanssa. S + N -ryhmällä oli vähän viruksen RNA-kopioita keuhkoissa, vähentynyt painonlasku ja nopea toipumisaika SARS-CoV{11}}-altistuksen jälkeen verrattuna ryhmään, joka oli immunisoitu pelkällä S/N:llä, mikä oli yhdenmukainen tämän tutkimuksen tuloksista. Mikään ryhmistä ei kuitenkaan havainnut neutraloivien vasta-aineiden tiittereitä, mikä saattaa johtua eroista rokotelajikkeissa ja koe-eläimissä [26]. Eräässä SARS-CoV-2-adenovirusvektorirokotetutkimuksessa raportoitiin, että S-rokote tarjosi akuutin aivosuojan vain, kun se immunisoitiin samanaikaisesti N-rokotteen kanssa [27]. Toisessa tutkimuksessa kehitettiin Tri: ChAd-, Bi: ChAd- ja Mono: ChAd-rokotteet, jotka ilmensivät S1/N/RdRp-, N/RdRp- ja S1-proteiineja, vastaavasti, ja testattiin niitä B.1.351-eläinmallissa. Laaja karkea patologia havaittiin Mono: ChAdlungs -keuhkoissa, kun taas Bi: ChAd- ja Tri: ChAd -keuhkot näyttivät lähes vapailta tästä patologiasta [28].

Lisäksi rokottamattomilla eläimillä oli korkea keuhkojen viruskuormitus, kun taas Tri: ChAd -hoito vähensi viruskuormia merkittävästi 3,5 logilla. Vertailun vuoksi sekä Bi: ChAd- että Mono: ChAd -rokotteet vähensivät vain kohtalaisesti viruskuormaa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että S/N-kaksoisantigeenirokotteen suojaava vaikutus variantteja vastaan ​​voi olla parempi kuin S-yksiantigeenirokotteen, mikä on tulostemme mukaista [28]. Muutamat tutkimukset ovat raportoineet, että N-proteiinilla immunisoidut hiiret kehittävät vakavan keuhkotulehduksen SARS-CoV-infektion jälkeen [29–31]. Aiemmat tutkimukset ovat myös raportoineet, että immunisointi adenovirusvektorirokotteella, joka ilmentää hiiren hepatiittiviruksen N-proteiinia, suojaa hiiriä tappavalta infektiolta, mikä osoittaa, että N-proteiini voi tuottaa suojaavan vaikutuksen [32]. Lisäksi CRT/N-DNA-rokotteella immunisoidulla ryhmällä oli merkittävästi alentunut virustiitteri altistuksen jälkeen, kun vaccinia-virus ekspressoi SARS-CoV N -proteiinia [33].

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Yksi S-proteiinia koskeva tutkimus osoitti, että yhdistetty DNA/proteiinirokote indusoi sekä humoraalista että sellulaarista immuniteettia paremmin kuin DNA/proteiinirokote yksinään [8]. Vain S-proteiiniin kohdistetut rokotteet ovat osoittaneet heikentyneen suojan kehittyvien muunnelmien aiheuttamaa lievää tai kohtalaista COVID-tautia{3}} vastaan. Konservoituneiden SARS-CoV-2-rakenneproteiinien, mukaan lukien N/E/M-proteiinit, roolit ovat huomionarvoisia rokotteiden suunnittelussa ja sovelluksissa, koska rokotteen aiheuttamiin T-soluvasteisiin konservoituneita epitooppeja vastaan ​​ei yleensä vaikuta mutaatiot . Eräässä tutkimuksessa raportoitiin, että SARS-potilailla (n=23) oli edelleen pitkäkestoisia muisti-T-soluja, jotka reagoivat SARS-CoV N -proteiiniin 17 vuotta vuoden 2003 taudinpurkauksen jälkeen, mikä osoitti vahvaa ristireaktiivisuutta SARS CoV:n kanssa. {15}} N-proteiini, mikä vahvistaa edelleen N-proteiinin käyttöä ristiinsuojaavana rokotekohteena [34]. Tämä tutkimus osoitti, että pS/pN-yhteisimmunisaatio liittyi korkeampiin nAb-vasteisiin, parempaan viruksen puhdistumaan ja parantuneisiin solujen immuunivasteisiin ja saattaa tarjota paremman suojan SARS-CoV-2-altistuksen jälkeen verrattuna pelkkään pS:ään. Lisäksi SARS-CoV-2-muunnelmien on osoitettu tartuttavan monia eläinlajeja, ja ihmisestä eläimeen on havaittu tartunnan joissakin villieläimissä ja lemmikkieläimissä [7]. Joten eläinlääkinnällinen SARS-CoV-2-rokote tarvitsee enemmän huomiota. Lisäksi nanoteknologia voi olla tehokas työkalu rokotteiden optimoinnissa, ja se ansaitsee enemmän huomiota [2].

Tällä tutkimuksella on useita rajoituksia. Ensinnäkin havaitsimme vain DNA-rokotestrategiaa BALB/c-hiirillä, ja tulevissa tutkimuksissa tulisi arvioida näiden rokoteohjelmien immunogeeniset vaikutukset muissa eläinmalleissa. Toiseksi tarvitaan lisätutkimusta, jotta voidaan täysin ymmärtää molekyylimekanismit, jotka ovat S- ja N-proteiineja käyttävän yhteisimmunisoinnin indusoimien lisättyjen nAb- ja S-spesifisten CD8-T-soluvasteiden taustalla, ja hyödyntää tätä tietämystä COVID-taudin optimoimiseksi-19 rokotteen suunnittelu. Lopuksi N-proteiinispesifisten vasta-aineiden toiminta ansaitsee lisätutkimuksen.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Yhteenvetona voidaan todeta, että tässä tutkimuksessa arvioitiin SARS-CoV-2 S-, N-, E- ja M-proteiinien kanssa yhteisimmunisaation immuunisuojauspotentiaali. Useilla vain S-proteiiniin kohdistetuilla rokotteilla on heikentynyt suojaava vaikutus nouseviin varianttikantoihin. Tuloksemme luovat pohjan ristiinreaktiivisen COVID{5}}-rokotteen kehittämiselle nykyisten ja uusien SARS-CoV-2-muunnelmien hallitsemiseksi ja mahdollisten koronaviruksen pandemioiden ehkäisemiseksi.

Viitteet

1. Zmievskaya, E.; Valiullina, A.; Ganeeva, I.; Petukhov, A.; Rizvanov, A.; Bulatov, E. CAR-T-soluterapian soveltaminen onkologian ulkopuolella: autoimmuunisairaudet ja virusinfektiot. Biomedicines 2021, 9, 59. [CrossRef] [PubMed]

2. Rashidzadeh, H.; Danafar, H.; Rahimi, H.; Mozafari, F.; Salehiabar, M.; Rahati, MA; Rahamooz-Haghighi, S.; Mousazadeh, N.; Mohammadi, A.; Ertas, YN; et ai. Nanoteknologia uutta koronavirusta (vakava akuutti hengitystieoireyhtymä coronavirus 2) vastaan: diagnoosi, hoito, hoito ja tulevaisuuden näkymät. Nanomedicine 2021, 16, 497–516. [CrossRef]

3. Fontanet, A.; Cauchemez, S. COVID-19 lauman immuniteetti: missä olemme? Nat. Rev. Immunol. 2020, 20, 583–584. [CrossRef] [PubMed]

4. Jeyanathan, M.; Afkhami, S.; Smaill, F.; Miller, MS; Lichty, BD; Xing, Z. Immunologisia näkökohtia COVID-19-rokotestrategioissa. Nat. Rev. Immunol. 2020, 20, 615–632. [CrossRef] [PubMed]

5. Vandelli, A.; Monti, M.; Milanetti, E.; Armaos, A.; Rupert, J.; Zacco, E.; Bechara, E.; Delli Ponti, R.; Tartaglia, GG SARS-CoV-2-genomin rakenneanalyysi ja ihmisen interaktomin ennusteet. Nucleic Acids Res. 2020, 48, 11270–11283. [CrossRef] [PubMed]

6. Jackson, CB; Farzan, M.; Chen, B.; Choe, H. SARS-CoV-2 soluihin pääsyn mekanismit. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2022, 23, 3–20. [CrossRef]

7. Conforti, A.; Sanchez, E.; Salvatori, E.; Lione, L.; Compagnone, M.; Pinto, E.; Palombo, F.; D'Acunto, E.; Muzi, A.; Roscilli, G.; et ai. Lineaarinen DNA-rokoteehdokas, joka koodaa SARS-CoV-2-reseptoriin sitoutuvaa domeenia, saa aikaan tehokkaan immuunivasteen ja neutraloivia vasta-aineita kotikissoissa. Mol. Siellä. Methods Clin. Dev. 2023. [CrossRef]

8. Borgoyakova, MB; Karpenko, LI; Merkulyeva, IA; Shcherbakov, DN; Rudometov, AP; Starostina, EV; Shanshin, DV; Isaeva, AA; Nesmeyanova, VS; Volkova, NV; et ai. DNA/proteiini-yhdistelmärokotteen immunogeenisyys COVIDia vastaan-19. Sonni. Exp. Biol. Med. 2023, 1–4. [CrossRef]

9. Qu, L.; Yi, Z.; Shen, Y.; Lin, L.; Chen, F.; Xu, Y.; Wu, Z.; Tang, H.; Zhang, X.; Tian, ​​F.; et ai. Sirkulaariset RNA-rokotteet SARS-CoV-2-virusta ja uusia muunnelmia vastaan. Cell 2022, 185, 1728–1744.e16. [CrossRef]

10. Corbett, KS; Edwards, DK; Leist, SR; Abiona, OM; Boyoglu-Barnum, S.; Gillespie, RA; Himansu, S.; Schäfer, A.; Ziwawo, CT; DiPiazza, AT; et ai. SARS-CoV-2-mRNA-rokotteen suunnittelu mahdollistaa patogeenien prototyyppivalmiuden. Luonto 2020, 586, 567–571. [CrossRef]

11. Tian, ​​JH; Patel, N.; Haupt, R.; Zhou, H.; Weston, S.; Hammond, H.; Logue, J.; Portnoff, A.; Norton, J.; Guebre-Xabier, M.; et ai. SARS-CoV-2 piikkiglykoproteiinirokoteehdokas NVX-CoV2373 immunogeenisyys paviaaneissa ja suoja hiirillä. Nat. Commun. 2021, 12, 372. [CrossRef] [PubMed]

12. Andreano, E.; Paciello, I.; Piccini, G.; Manganaro, N.; Pileri, P.; Hyseni, I.; Leonardi, M.; Pantano, E.; Abdiento, V.; Benincasa, L.; et ai. Hybridiimmuniteetti parantaa B-soluja ja vasta-aineita SARS-CoV-2-variantteja vastaan. Luonto 2021, 600, 530–535. [CrossRef]

13. Naqvi, AAT; Fatima, K.; Mohammad, T.; Fatima, U.; Singh, IK; Singh, A.; Atif, SM; Hariprasad, G.; Hasan, GM; Hassan, MI Näkemyksiä SARS-CoV-2-genomista, rakenteesta, evoluutiosta, patogeneesistä ja hoidoista: rakennegenomiikan lähestymistapa. Biochim. Biophys. Acta Mol. Perusta. Dis. 2020, 1866, 165878. [CrossRef] [PubMed]

14. Abbasi, J. Intian uusi COVID{1}}-DNA-rokote nuorille ja aikuisille on ensimmäinen. JAMA 2021, 326, 1365. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, J.; Deng, Y.; Huang, B.; Han, D.; Wang, W.; Huang, M.; Zhai, C.; Zhao, Z.; Yang, R.; Zhao, Y.; et ai. DNA-rokotteet, jotka ilmentävät kuorta ja kalvoproteiineja, tarjoavat osittaisen suojan SARS-CoV-2 -tartuntaa vastaan ​​hiirillä. Edessä. Immunol. 2022, 13, 827605. [CrossRef]

16. Tebas, P.; Kraynyak, KA; Patel, A.; Maslow, JN; Morrow, kansanedustaja; Sylvester, AJ; Knoblock, D.; Gillespie, E.; Amante, D.; Racine, T.; et ai. Intradermaalinen SynCon®Ebola GP DNA -rokote on lämpötilavakaa ja se osoittaa turvallisesti solu- ja humoraalisen immunogeenisyyden edut terveissä vapaaehtoisissa. J. Infect. Dis. 2019, 220, 400–410. [CrossRef]

17. Smith, TRF; Patel, A.; Ramos, S.; Elwood, D.; Zhu, X.; Yan, J.; Gary, EN; Walker, SN; Schultheis, K.; Purwar, M.; et ai. DNA-rokoteehdokkaan immunogeenisyys COVID-tautiin-19. Nat. Commun. 2020, 11, 2601. [CrossRef]

18. Zhao, Z.; Deng, Y.; Niu, P.; Song, J.; Wang, W.; Du, Y.; Huang, B.; Wang, W.; Zhang, L.; Zhao, P.; et ai. Yhteisimmunisaatio CHIKV VLP- ja DNA-rokotteilla indusoi lupaavan humoraalisen vasteen hiirillä. Front Immunol. 2021, 12, 655743. [CrossRef]

19. Guan, J.; Deng, Y.; Chen, H.; Yin, X.; Yang, Y.; Tan, W. Pohjustus kahdella DNA-rokotteella, jotka ilmentävät hepatiitti C -viruksen NS3-proteiinia, joka kohdistuu dendriittisoluihin, saa aikaan erinomaisen heterologisen suojapotentiaalin hiirissä. Kaari. Virol. 2015, 160, 2517–2524. [CrossRef]

20. Chen, H.; Wen, B.; Deng, Y.; Wang, W.; Yin, X.; Guan, J.; Ruan, L.; Tan, W. DNA-immunisaation ja in vivo elektroporaation tehostettu vaikutus hepatiitti B -viruksen ydin-PreS1- ja S-PreS1-plasmidien yhdistelmällä. Clin. Vaccine Immunol. 2011, 18, 1789–1795. [CrossRef]

21. Yang, R.; Deng, Y.; Huang, B.; Huang, L.; Lin, A.; Li, Y.; Wang, W.; Liu, J.; Lu, S.; Zhan, Z.; et ai. Ydinkuorirakenteinen COVID-19-mRNA-rokote, jolla on suotuisa biologinen jakautumismalli ja lupaava immuniteetti. Signaalin siirto. Target Ther. 2021, 6, 213. [CrossRef] [PubMed]

22. Yang, R.; Huang, B.; A, R.; Li, W.; Wang, W.; Deng, Y.; Tan, W. Pseudotyyppisen SARS-CoV-2-järjestelmän kehitys ja tehokkuus määritettynä neutralointitehokkuudella ja sisäänpääsyn estotestillä in vitro. Biosaf. Terveys 2020, 2, 226–231. [CrossRef] [PubMed]

23. Jia, Q.; Bielefeldt-Ohmann, H.; Maison, RM; Masleša-Gali´c, S.; Cooper, SK; Bowen, RA; Horwitz, MRA Replikoituva bakteerivektorirokote, joka ekspressoi SARS-CoV-2-kalvo- ja nukleokapsidiproteiineja, suojaa hamstereiden vakavalta COVID{5}}-taudilta. NPJ Vaccines 2021, 6, 47. [CrossRef] [PubMed]

24. Hajnik, RL; Plante, JA; Liang, Y.; Alameh, M.-G.; Tang, J.; Zhong, C.; Adam, A.; Scharton, D.; Rafael, GH; Liu, Y.; et ai. Kombinatorinen mRNA-rokotus parantaa suojaa SARS-CoV-2-deltavarianttia vastaan. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Antón, IM; González, S.; Bullido, MJ; Corsín, M.; Risco, C.; Langeveld, JP; Enjuanes, L. Transmissible gastroenteritis coronavirus (TGEV) -rakenneproteiinien välinen yhteistyö virusspesifisten vasta-aineiden induktiossa in vitro. Virus Res. 1996, 46, 111–124. [CrossRef]

26. Deschambault, Y.; Lynch, J.; Warner, B.; Tierney, K.; Huynh, D.; Vendramelli, R.; Tailor, N.; Frost, K.; Booth, S.; Sajesh, B.; et ai. Yksittäinen immunisaatio rekombinantti ACAM2000 vaccinia-viruksilla, jotka ilmentävät piikki- ja nukleokapsidiproteiineja, suojaa hamstereita SARS-CoV-2--aiheuttamalta kliiniseltä taudilta. bioRxiv 2021. [CrossRef]

27. Penaloza-MacMaster, P.; Class, J.; Hemmetti.; Richner, JM A SARS CoV-2 -nukleokapsidirokote suojaa distaalista viruksen leviämistä vastaan. bioRxiv 2021.

28. Afkhami, S.; D'Agostino, MR; Zhang, A.; Stacey, HD; Marzok, A.; Kang, A.; Singh, R.; Bavananthasivam, J.; Joo, G.; Luo, X.; et ai. Seuraavan sukupolven COVID-19-rokotteen antaminen hengitysteiden limakalvoille tarjoaa vankan suojan sekä SARS-CoV-2 -kanta- että muunnelmakantoja vastaan. Cell 2022, 185, 896–915.e19. [CrossRef]

29. Zheng, N.; Xia, R.; Yang, C.; Yin, B.; Li, Y.; Duan, C.; Liang, L.; Guo, H.; Xie, Q. SARS-CoV-nukleokapsidiproteiinin tehostettu ilmentyminen tupakassa ja sen immunogeenisyys hiirissä. Rokote 2009, 27, 5001–5007. [CrossRef]

30. Yasui, F.; Kai, C.; Kitabatake, M.; Inoue, S.; Yoneda, M.; Yokochi, S.; Kase, R.; Sekiguchi, S.; Morita, K.; Hishima, T.; et ai. Aiempi immunisointi vakavaan akuuttiin hengitystieoireyhtymään (SARS) liittyvällä koronaviruksen (SARS-CoV) nukleokapsidiproteiinilla aiheuttaa vakavan keuhkokuumeen SARS-CoV-tartunnan saaneilla hiirillä. J. Immunol. 2008, 181, 6337–6348. [CrossRef]

31. Deming, D.; Sheahan, T.; Heise, M.; Yount, B.; Davis, N.; Sims, A.; Suthar, M.; Harkema, J.; Whitmore, A.; Pickles, R.; et ai. Rokotteen teho ikääntyville hiirille, jotka on altistettu rekombinantti SARS-CoV -tartunnan saaneille epidemia- ja zoonoosipiikkivarianteille. PLoS Med. 2006, 3, e525. [CrossRef] [PubMed]

32. Wesseling, JG; Godeke, GJ; Schijns, VE; Prevec, L.; Graham, F.; Horzinek, MC; Rottier, PJ Mouse hepatiittiviruksen piikki ja adenovirusvektoreiden ekspressoimat nukleokapsidiproteiinit suojaavat hiiriä tappavalta infektiolta. J. Gen. Virol. 1993, 74, 2061–2069. [CrossRef] [PubMed]

33. Kim, TW; Lee, JH; ripustettu, CF; Peng, S.; Roden, R.; Wang, MC; Viscidi, R.; Tsai, YC; Hän, L.; Chen, PJ; et ai. Vaikean akuutin hengitystieoireyhtymän koronaviruksen nukleokapsidiproteiiniin kohdistuvien DNA-rokotteiden luominen ja karakterisointi. J. Virol. 2004, 78, 4638–4645. [CrossRef] [PubMed]

34. Le Bert, N.; Tan, AT; Kunasegaran, K.; Tham, CYL; Hafezi, M.; Chia, A.; Chng, MHY; Lin, M.; Tan, N.; Linster, M.; et ai. SARS-CoV-2-spesifinen T-soluimmuniteetti COVID-19- ja SARS-tapauksissa sekä tartunnan saamattomat kontrollit. Luonto 2020, 584, 457–462. [CrossRef]