Abstrakti
Tutkia synergistisiä estäviä vaikutuksiaCistanche DeserticolaFenyylietanoidiset glykosidit (PHG) ja glabridiinin (GLA) ihopigmentaatiossa, PHG: n optimaalinen massasuhde GLA: hen seulottiin alustavasti läpiin vitroTyrosinaasiaktiivisuuden estämismääritykset, 1, 1- difenyyli -2- picrylhydrazyl (dpph) radikaalin poistoa ja 2,2'-azino-bis (3- etyylbentsotiatsoliinia -6- sulfoninen happea) (abtshiatsoliini-koe. Lisäarvioinnit suoritettiin käyttämällä kolmea solumallia:

UVB: n indusoima B16F10-melanogeneesimalli melaniinisynteesin estämisen arvioimiseksi tyrosinaasiaktiivisuuden ja melaniinipitoisuuden kautta;

Lipopolysakkaridi (LPS) indusoima HACAT-tulehduksellinen malli anti-inflammatoristen vaikutusten arvioimiseksi mittaamalla interleukiini -6 (IL -6) ja tuumorinekroositekijä- (tnf-) tukahduttaminen;

AAPH (2,2'-azobis (2- amidinopropaani) dihydrokloridin aiheuttama HACAT-oksidatiivinen stressimalli antioksidanttisen aktiivisuuden määrittämiseksi superoksididismutaasin (SOD) ja katalaasin (CAT) parannuksen avulla.

Optimaalinen PHGS/GLA -massasuhde tunnistettiin näiden mallien kautta. Tulokset osoittivat, että PHGS/GLA-liuokset (valmistettu fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa, PBS, pH 6,8) massasuhteissa 1: 1, 5: 1 ja 10: 1 osoittivat merkittäviä tyrosinaasin esto- ja synergistisiä antioksidanttivaikutuksia. Tyrosinaasin estoasteet olivat vastaavasti 94,37%, 92,93%ja 88,06%; DPPH -radikaalien poistoasteet olivat 89,44%, 88,72%ja 88,10%; ABTS⁺: n poistoasteet olivat 100,13%, 100,01%ja 99,87%. 25 ug/ml DMEM: ssä PHGS/GLA (1: 1, 5: 1, 10: 1) ei osoittanut sytotoksisuutta kohti B16F10- tai HACAT -soluja. PHGS/GLA (1: 1) DMEM -liuosylivoimainen tyrosinaasin esto(23,80% jäännösaktiivisuus), merkittävästiVähentynyt melaniinipitoisuus(30,90%) ja ylitti muut suhteet ja monoterapiat tukahduttamalla IL -6/tnf-vapauttamista ja parantamalla SOD/CAT-aktiivisuutta. PHG: n ja GLA: n synergistinen yhdistelmä lievitettiin tehokkaastiKin hyperpigmentaatio estämällä melanogeneesiä, vähentää tulehduksia jaAntioksidanttikapasiteetin parantaminen.

Avainsanat
Karsintaautiomaassa fenyylietanoidiset glykosidit; glabridiini; synergistinen vaikutus; anti-melanogeneesi; antioksidantti; anti-inflammatorinen; farmaseuttiset raaka -aineet

 

 

 

Karsintaautiomaassa poimita jhkKorkean tasonfenyylietanoidiset glykosidit ihon valkaisuun

WhatsApp meille lisätietoja

 

Kokeellinen osa

1.1 Materiaalit, reagenssit ja instrumentit

Hiiren melanoomasolutB16F10 (LUKTON NO.: STCC20013G -1), Wuhan ServiceBio Technology Co., Ltd.

Ihmisen kuolemattomat keratinosyytitHacat (luettelonumero: ICell-H066), Icell Bioscience Inc., Shanghai, Kiina.

Cistanche -fenyylietanoidiglykosidit (PHG)jaGlabridin (GLA), Shaanxi Tianxingjian Biological Chemical Technology Co., Ltd.

Tyrosinaasi, Hefei Basf Biotechnology Co., Ltd.

Arbutin (ARB)jaL-tyrosiini, Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, Kiina.

1, 1- difenyyli -2- picrylhydrazyl (dpph), Tokyo Chemical Industry Co., Japani.

2,2'-azino-bis (3- etyylibentsotiatsoliini -6- sulfonihappo) Diammonium-suola (ABTS), Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.

Askorbiinihappo (VC), Tianjin Damao Chemical Reagent Factory.

Kaliumpersulfaattijavedetön etanoli, Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd.

Natriumhydroksidi, Chengdu Huayi Pharmaceutical Exicient Manufacturing Co., Ltd.

Dipotassumfosfaatti, Shanghai Sanpu Chemical Co., Ltd.

L-DOPA, Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.

Solujen laskentapaketti -8 (CCK8), Peking Sinoinvitrogen Biotechnology Co., Ltd.

Triton x -100, dimetyylisulfoksidi (DMSO), 2,2′-atsobis (2- metyylipropionamidiini) dihydrokloridi (AAPH)jalipopolysakkaridi (LPS), Peking Solarbio Science & Technology Co., Ltd.

DMEM High-glukoosiväliaine, Thermo Fisher Scientific (Kiina).

Naudan sikiön seerumi (FBS), Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.

Penisilliini-streptomysiiniliuos, Shanghai Dashier Bio-Technology Co., Ltd.

Human IL -6 Elisa Kit, ihmisen tnf-elisa -sarjajaIhmisen kissan Elisa Kit, Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.

Koko superoksididismutaasi (SOD) -määrityspakkaus, Nanjing Jiancheng Bio Engineering Institute. Kaikki reagenssit olivat analyyttistä luokkaa.

Käytetyt instrumentit:

Multiskan FC Full Wavength -mikrolevylukijajaHeracell 371 CO2 -inkubaattori, Thermo Fisher Scientific, USA.

KQ -200 vdb ultraäänipuhdistin, Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.

Dvkw-d -2 digitaalinen termostaattinen vesihaute, Peking YongGuangming Medical Instrument Factory.

DHG -9246 Sähköinen termostaattinen räjähdyskuivaus uuni, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.

KN4006B UVB Ultraviolet -säteilyinstrumentti(Säteilytyksen voimakkuus: 8 mW/cm²), Xuzhou Kenuo Medical Instrument Equipment Co., Ltd.

1.2 Menetelmät

Ensinnäkin PHG: t ja GLA liuotettiin joko fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS, PH =6.{{0}}. 0 0 1, 0. {{1 0}} 05, 0,025, 0,1, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6 ja 2,0 G/L. Sitten PHG: t ja GLA sekoitettiin suhteisiinM (PHGS): M (GLA)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20 ja 1:40, PHGS/GLA -liuoksien valmisteleminen kokonaismassapitoisuudella0.4 g/L, merkittyPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40), vastaavasti.

 

1.3 Biokemialliset kokeet

1.3.1 Tyrosinaasiaktiivisuuden estomääritys

96- kaivolevy,50 μl testinäyteasoluista, 50 μl PBS: tä (pH =6. 8)ja50 μl L-tyrosiiniliuosta (1 g/l)lisättiin peräkkäin. Levyä inkuboitiin 37 asteen vesihauteessa 10 minuutin ajan. Sitten,5 0 μl tyrosinaasiliuosta (0,4 g/l, vastaa 200 U/ml)lisättiin, ja levyä inkuboitiin uudelleen 37 asteen vesihauteessa vielä 10 minuutin ajan.

Arbutin (ARB)käytettiin positiivisena kontrollina jaPBS (pH =6. 8)käytettiin tyhjänä ohjauksena.

Liuoksen absorbanssi osoitteessa490 nmmitattiin käyttämällä mikrolevylukijaa, ja in vitro tyrosinaasin estämisnopeus (%) laskettiin yhtälöllä (1).

 

 

Kaavassa:

A _ reaktioon L-tyrosiiniliuoksen, PBS: n ja tyrosinaasiliuosta sisältävän näyteliuosta.

A _ Reaktion ohjauson L-tyrosiiniliuoksen ja PBS: n absorbanssi ilman tyrosinaasiliuosta.

A _ tyhjäon L-tyrosiiniliuoksen, PBS: n ja tyrosinaasiliuoksen sisältävän liuoksen absorbanssi ilman näytettä.

A _ tyhjä ohjauson L-tyrosiiniliuoksen ja PBS: n absorbanssi ilman näyte- ja tyrosinaasiliuosta.

1.3.2 DPPH: n vapaan radikaalin poistoaktiivisuuden määrittäminen

Ensinnäkin {{0}}. 0197 g (0,05 mmol) DPPH: ta punnittiin tarkasti ja liuotettiin 250 ml: aan vedettömää etanolia DPPH -työliuoksen valmistelemiseksi pitoisuudella pitoisuudella, pitoisuudella pitoisuudella, pitoisuudella pitoisuudella DPPH, tarkasti0. 2 mmol/l.

Sitten PHG: t ja GLA liuotettiin 50 -prosenttiseen etanoliin PHG: n ja GLA: n etanoliliuojen valmistelemiseksi massapitoisuuksilla{{0}}. 0 0 1, 0. {0 1, 0,1, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6 ja 2,0 g/l. VC: n etanoliliuokset valmistettiin samalla tavalla.

Myöhemmin PHG: n ja GLA: n etanoliliuokset sekoitettiin suhteisiinM (PHGS -ratkaisu): M (GLA -ratkaisu)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, 1:40Jotta saadaan 9 etanoliliuosta PHGS/GLA: sta eri massasuhteilla, merkittynäPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40).

Lopuksi,100 μl kutakin näyteliuostaja100 μl DPPH -työliuostalisättiin 96- kaivolevyyn, sekoitettiin tasaisesti ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa pimeässä 30 minuutin ajan. Absorbanssi517 nmmitattiin mikrolevylukijalla. VC: tä käytettiin positiivisena kontrollina, ja jokainen koe toistettiin kolme kertaa.

DPPH: n vapaan radikaalin poistoaste (%) laskettiin yhtälöllä (2).

 

Kaavassa:

A1on näyteliuoksen + DPPH -työliuoksen absorbanssi.

A2on 50 -prosenttinen etanolia + DPPH -työratkaisu.

A3on näytteen liuoksen absorbanssi + 50% etanolia.

 

1.3.3 ABTS⁺: n vapaan radikaalin poistoaktiivisuuden määrittäminen

Ensimmäinen,1 g (1,82 mmol) ABTS: täliuotettiin deionisoidussa vedessä ABTS -työliuosta valmistelemaan lopullinen pitoisuus7,4 mmol/l. 0. 5 g kaliumpersulfaattialiuotettiin deionisoidussa vedessä kaliumpersulfaatin työliuoksen valmistamiseksi lopullisella pitoisuudella2,6 mmol/l. ABTS: n työliuosta ja kaliumpersulfaattityöliuosta sekoitettiin yhtä suuret määrät ja annettiin reagoida pimeässä 12 tunnin ajan ABTS⁺: n työliuoksen valmistamiseksi.

Sitten PHGS: n, GLA: n ja VC: n etanoliliuokset sekä PHGS/GLA -etanoliliuokset suhteessaPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40), valmistettiin osassa 1.3.2 kuvatun menetelmän mukaisesti.

Lopuksi,40 μl kutakin näyteliuostaja160 μl ABTS⁺ -työliuostalisättiin 96- kaivolevyyn, sekoitettiin tasaisesti ja reagoitiin pimeässä huoneenlämpötilassa 6 minuutin ajan. Liuoksen absorbanssi osoitteessa734 nmmitattiin mikrolevylukijalla.

ABTS⁺ vapaan radikaalin poistoaste (%) laskettiin yhtälöllä (3).

 

 

Kaavassa:

A1on näyteliuoksen + ABTS⁺: n työratkaisun absorbanssi.

A2on deionisoidun veden + ABTS⁺: n työratkaisun absorbanssi.

A3on näyte liuoksen + deionisoidun veden absorbanssi.

1.4 Solukokeet

1.4.1 Soluviljelmä

B16F10- ja HACAT-solujen elvyttämisen jälkeen ne kylvettiin DMEM-korkean glukoosin väliaineeseen (joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliinihteptomysiiniliuosta) ja viljeltiin osoitteessa37 aste, 5% hiilidioksidija70% kosteusinkubaattorissa 24 tuntia. Solujen kasvutila havaittiin mikroskoopilla, ja keskisuuret muutokset tai passigs suoritettiin tarpeen mukaan solujen kasvuolosuhteiden perusteella.

1.4.2 Kokeellinen ryhmittely

Logaritminen-faasi B16F10- ja HACAT-solut kylvettiin 96- kaivolevyiksi sopivalla solutiheydellä ja viljeltiin 24 tunnin ajan solujen tarttumisen sallimiseksi. Näyte liuokset, joilla oli erilaiset pitoisuudet, valmistettiin käyttämällä DMEM -elatusainetta.

Koemisryhmät olivat seuraavat:

Normaali ryhmä

Malliryhmä

PHGS-pieniannoksinen ryhmä(125 ug/ml)

PHGS-keskiannoksinen ryhmä(250 ug/ml)

PHGS-suuriannoksinen ryhmä(500 ug/ml)

GLA-pieniannoksinen ryhmä(6,25 ug/ml)

GLA-keskiannosryhmä(12,5 ug/ml)

GLA: n suuriannoksinen ryhmä(25 ug/ml)

PHGS/GLA (1: 1) ryhmä(25 ug/ml)

PHGS/GLA (5: 1) ryhmä

PHGS/GLA (10: 1) ryhmä

SiihenUVB: n indusoima pigmentointimalli B16F10-soluissa, malliryhmäkennot käsiteltiin30 μl PBS: tä (pH =7. 4)ja säteilytetty UVB: n ultraviolettisäteilyinstrumentin alla3 cm laitteen alapuolellapuolesta110 sekuntia. Kokeelliset ryhmät esikäsiteltiin100 μl erilaisia ​​näytelatkaisuja1 tunnin ajan ennen lisäämistä30 μl PBS: täja säteilytetään UVB -laitteen alla 110 sekunnin ajan. Normaalia ryhmää käsiteltiin jatkuvasti korkean glukoosin DMEM-elatusaineella, ja tyhjä ryhmä ei sisältänyt soluja, mutta se korvattiin yhtä suurella määrällä väliainetta.

SiihenLPS: n indusoima tulehdusmalli HACAT-soluissa, malliryhmää käsiteltiin20 ug/ml LPS PBS -liuosta24 tunnin ajan. Kokeelliset ryhmät esikäsiteltiin100 μl erilaisia ​​näytelatkaisuja24 tuntia ennen lisäämistä20 ug/ml LPS -liuostavielä 24 tunnin ajan. Normaalia ryhmää käsiteltiin jatkuvasti korkean glukoosin DMEM-elatusaineella, ja tyhjä ryhmä ei sisältänyt soluja, mutta se korvattiin yhtä suurella määrällä väliainetta.

SiihenAAPH: n aiheuttama hapettumisstressimalli HACAT-soluissa, malliryhmää käsiteltiin25 mmol/l aaph -liuos24 tunnin ajan. Kokeelliset ryhmät esikäsiteltiin100 μl erilaisia ​​näytelatkaisuja24 tuntia ennen lisäämistä25 mmol/l aaph -liuosvielä 24 tunnin ajan. Normaalia ryhmää käsiteltiin jatkuvasti korkean glukoosin DMEM-elatusaineella, ja tyhjä ryhmä ei sisältänyt soluja, mutta se korvattiin yhtä suurella määrällä väliainetta.

Jokainen ryhmä oli asetettu3 toista kaivoaja viljelty37 aste, 5% hiilidioksidija70% kosteusinkubaattorissa.

1.4.3 sytotoksisuusmääritys

Sytotoksisuus mitattiin käyttämälläCCK8 -menetelmä. Logaritminen-faasi B16F10- ja HACAT-solut pilkottiin0. 25% trypsiini3 minuutin ajan. Kun ruuansula oli pysäytetty väliaineella, solut pipetoitiin toistuvasti solususpension valmistamiseksi tiheydellä1 × 10⁴ solut/ml. Solut kylvettiin tasaisesti 96- kaivolevyihin100 μl kuoppaa, ja PBS lisättiin ääreiskaivoihin. Solujen tarttumisen jälkeen lisättiin erilaisia ​​näytteen liuoksia koskevia pitoisuuksia3 toista kaivoa ryhmää kohtija soluja viljeltiin37 aste, 5% hiilidioksidija70% kosteuspuolesta24, 48 ja 72 tuntiaennen väliaineen hylkäämistä.

Kaikille ryhmille,100 μl CCK8 DMEM High-glukoosiväliainetta (joka sisältää 10% CCK8)lisättiin ja inkuboitiin60 minuuttia. Liuoksen absorbanssi osoitteessa450 nmmitattiin mikrolevylukijalla.

Solujen elinkyky (%) laskettiin yhtälöllä (4).

 

Kaavassa:

A _on kaivon sisältävien solujen absorbanssi, CCK8 -liuos ja näyteliuos.

A _ tyhjäon kaivoon sisältävän väliaine- ja CCK8 -liuoksen absorbanssi, mutta ilman soluja.

A0on kaivon sisältävien solujen ja CCK8 -liuoksen absorbanssi, mutta ilman näyteliuosta.

1.4.4 Tyrosinaasiaktiivisuusmääritys

L-DOPA-menetelmää käytettiin tyrosinaasiaktiivisuuden mittaamiseen. Solujen hoidon jälkeen48 tuntiaKuten osassa 1.4.2 on kuvattu, supernatantti heitettiin pois ja kaivot pestiin kahdesti PBS: llä (pH =7. 4). Sitten,50 μl 1% Triton X -100 -ratkaisualisättiin jokaiseen kaivoon ja sijoitettiin välittömästi –80 asteen pakastimeen30 minuuttia. Solut sulatettiin huoneenlämpötilassa hajottamiseksi.

Ennakkolämmityksen jälkeen37 astepuolesta5 minuuttia, 10 μl 10 mmol/L L-DOPA-liuostalisättiin jokaiseen kaivoon ja inkuboitiin37 astetta, 5% hiilidioksidia ja 70% kosteuttapuolesta1 tunti. Absorbanssi475 nmmitattiin mikrolevylukijalla. Jokainen koe toistettiinkolme kertaa, ja tyrosinaasiaktiivisuus (%) laskettiin yhtälöllä (5).

Kaavassa:

A _ kokeiluon kaivon sisältävien solujen absorbanssi ja näyteliuos UVB -säteilytyksessä.

A _ normaalion kaivon sisältävien solujen absorbanssi ja näyteliuos ilman UVB -säteilytystä.

A _ tyhjäon kaivon sisältävän väliaineen absorbanssi, mutta ilman soluja.

 

1.4.5 melaniinipitoisuuden mittaus

NaOH -hajotusmenetelmää käytettiin melaniinipitoisuuden mittaamiseen. Solujen hoidon jälkeen72 tuntiaKuten kohdassa 1.4.2 on kuvattu, supernatantti heitettiin pois ja kaivot pestiin kahdesti PBS: llä.100 μl NaOH -vesiliuosta, joka sisältää 10% DMSO: ta (1 mol/l)lisättiin jokaiseen kaivoon, ja levy asetettiin a90 asteen uunipuolesta1 tunti. Absorbanssi490 nmmitattiin mikrolevylukijalla. Jokainen koe toistettiinkolme kertaa, ja melaniinipitoisuus (%) laskettiin yhtälöllä (5).

 

1.5 Tulehduksellisten tekijöiden ja oksidatiivisten stressin indikaattorien mittaus

Solujen hoidon jälkeen48 tuntiaKuten osassa 1.4.2 on kuvattu,HACAT -solutJokaisesta ryhmästä kerättiin solujen kaavin avulla, sentrifugoitiin ja supernatantti kerättiin. IL -6 ja Tnf-pitoisuudet mitattiin ELISA-sarjojen ohjeiden mukaisesti.

Solujen hoidon jälkeen48 tuntia, HACAT12, 000 rpm 10 minuutin ajan 4 asteessa. Supernatantti kerättiin, ja toimintaMäntyja pitoisuudetKISSAmitattiin käyttämällä ELISA Kit -ohjeita.

 

1.6 Yhdistelmäindeksin mittaus

SeYhdistelmäindeksi (CI) -menetelmä[20] käytettiin arvioimaan, onko PHG: ien ja GLA: n yhdistelmä eri massasuhteissa synergistisiä vaikutuksia estämään tyrosinaasiaktiivisuutta ja antioksidaatiota. Yhdistelmäindeksi laskettiin yhtälöllä (6).

 

Kaavassa:

D1jaD2edustavat kahden lääkkeen vastaavia pitoisuuksia (g/l) yhdistelmähoidossa, jota tarvitaanx% aktiviteetti.

Dxedustaa kunkin yksittäisen aineen pitoisuutta (g/l), kun sitä käytetään yksinään saavuttamaanx% aktiviteetti.

SeCompuyn -ohjelmistokäytettiin laskelmiin:

CI> 1osoittaa antagonistisen vaikutuksen.

Ci=1ilmaisee lisäainehosteen.

CI <1osoittaa synergistisen vaikutuksen.

 

1.7 Tietoanalyysi

Kaikki tiedot ilmaistiin"Keskimääräinen ± keskihajonta (x̄ ± s)", ja keskustelut perustuivat keskiarvoihin.

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämälläGraphPad Prism 9.5. 0. Yhdensuuntaisen ANOVA: ta (varianssianalyysi) käytettiin vertailuihin useiden ryhmien välillä. EräsP-arvo <0. 05pidettiin tilastollisesti merkitsevänä.