Laminaria Japonica Fucoidanin ja Cistanche Tubulosa -uutteen synergistiset tulehdusta estävät vaikutukset

Immuunivasteena vieraita antigeenejä vastaan ​​makrofagit vapauttavat tulehdusta edistäviä sytokiineja, kuten tuumorinekroositekijä- (TNF-), interleukiini-1 (IL- 1), IL-6 ja muita. Tällaiset sytokiinit indusoivat granulosyyttien, monosyyttien, lymfosyyttien ja syöttösolujen kemotaktisen virtauksen vaurioituneeseen kudokseen, mikä edistää antigeenin poistoa ja kudoksen palautumista. Solujen liiallinen tunkeutuminen ja aktivoituminen kuitenkin pahentaa kudosvaurioita, mikä johtaa turvotukseen (verisuonieritykseen) ja kipuun, jotka ovat hyvin tunnettuja tulehdusilmiöitä.

TNF- on tärkeä tekijä typpioksidisyntaasi (iNOS) -geenin ilmentymisen indusoimiseksi useissa solulinjoissa. iNOS-aktivaatio johtaa typpioksidin (NO) tuotantoon, joka ei ainoastaan ​​moduloi useita fysiologisia toimintoja, kuten bakteereja tappavaa ja verisuonia laajentavaa, vaan myös aiheuttaa tulehdusta. Kudosvaurion jälkeen solukalvon fosfolipidien fosfolipaasien aiheuttama hajoaminen tuottaa arakidonihappoa. Syklo-oksigenaasi (COX) hajottaa arakidonihapon edelleen prostaglandiineiksi (PG:t). Liiallinen määrä COX-II:n muodostamaa PGE2:ta indusoi useita sytokiinejä tulehdukselle. Koska sekä NO että PGE2 toimivat päätekijöinä tulehduksen ja kivun induktiossa, TNF- –NO- ja COX-II-PGE2-reitit ovat tulehdusprosessin päävirrat, joita kortikosteroidit ja ei-steroidit estävät.tulehduskipulääkkeet(NSAID:t).

Vaikka on olemassa useita steroideja ja tulehduskipulääkkeitätulehdussairauksien hoitoon, nämä lääkkeet voivat aiheuttaa haitallisia vaikutuksia immuunijärjestelmään, maha-suolikanavaan, munuaisiin, maksaan, keskushermostoon, verenpaineeseen ja sydän- ja verisuonijärjestelmään. Siksi on välttämätöntä minimoida kemiallisten terapeuttisten aineiden haittavaikutukset korvaamalla ne tai käyttämällä niitä yhdessä luonnontuotteiden kanssa.

Fucoidania, sulfaattipolysakkaridikompleksia merilevistä, kuten Laminaria japonica ja Cladosiphon okamuranus, joka on laajalti levinnyt monissa maissa, on käytetty itämaisen lääketieteen terapeuttisena aineena pitkään. Aiemmissa tutkimuksissa on osoitettu, että fukoidaanilla on antioksidanttia, antikoagulaatiota, syöpää jaanti-inflammatoriset toimet. Näin ollen fukoidaanin edulliset vaikutukset tulehdussairauksiin, iskemiaan, immuunijärjestelmän toimintahäiriöihin ja kasvaimiin kiinnittävät tutkijoiden huomion. Toisaalta,Cistanche tubulosa(CT) on myös laajalti käytetty perinteisenä lääkkeenä Kiinassa. On raportoitu, että CT-uutteet alentavat TNF-a:n ja IL- 4:n tuotantoa, jotka ovat tärkeimpiä tekijöitä NO-tuotannossa tulehdusreiteissä [19].

Tällaiset aiemmat havainnot saivat meidät tutkimaan fukoidaanin ja CT-uutteen yhdistelmätehoa tulehduksen kahdella pääreitillä. Vaikutusmekanismin selvittämiseksi analysoimme karrageenin aiheuttaman ilmapussitulehduksen eritteistä NO:ta ja PGE2:ta.

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA ESTÄMISEENTulehdukselliset toiminnotPHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

CT:n puolipuhdistettu fukoidaani ja vesiuute saatiin Misuba RTech Co., Ltd.:ltä (Asan, Korea). Fukoidaania ja CT-uutetta pidettiin 4 asteessa, sekoitettiin (1:3) liuotettuna puhdistettuun veteen ennen käyttöä ja annettiin suun kautta 5 ml/kg:n tilavuudessa.

Soluviljelmä ja NO:n kvantifiointi

Hiiren makrofagi RAW 264.7 -solulinja ostettiin American Type Culture Collectionista (Manassas, USA) ja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle's -elatusaineessa (Sigma, St. Louis, USA), joka sisälsi 10 % naudan sikiön seerumia ja antibiootteja [100 U/ml penisilliiniä (Sigma) ja 100 ug/ml streptomysiiniä (Sigma)]. Soluja inkuboitiin kostutetussa 5 % C02-atmosfäärissä 37 °C:ssa.

Fukoidaanin ja CT-uutteen vaikutusten arvioimiseksi NO:n eritykseen RAW 264.7 -soluja (1 × 106 solua/ml) inkuboitiin fukoidaanin tai CT-uutteen (1–320 µg/ml) kanssa 5 minuutin ajan. ja sen jälkeen interferoni- (IFN-, 10 U/ml) ja lipopolysakkaridi (LPS, 10 ug/ml) 24 tunnin ajan. Alustavissa tutkimuksissamme vahvistettiin, että käsittely IFN- plus LPS:llä RAW 264.7 -solujen aktivoimiseksi ei vaikuttanut solujen elinkykyyn 24 tuntiin asti ja että fukoidaani ja CT-uute eivät olleet sytotoksisia 1 mg/ml asti. NO:n hapettuneen tuotteen nitriitin (NO2 – ) pitoisuus mitattiin NO:n indikaattorina. Viljelyväliaine sekoitettiin yhtä suuren tilavuuden kanssa Griess-reagenssia (1 % sulfanilamidia, 0,1 % naftyylietyleenidiamiinia 2,5 % fosforihapossa) [21] ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa 10 minuuttia. Nitriittikonsentraatio analysoitiin aallonpituudella 540 nm, jossa NaNO2:ta käytettiin luomaan standardikäyrä.

Eläimet ja hoito

Urospuoliset ICR-hiiret (7 viikkoa vanhat) ostettiin Daehan Biolinkiltä (Eumseong, Korea) ja pidettiin huoneessa, jossa ympäristöolosuhteet olivat vakiot (22±2ºC; suhteellinen kosteus 40-70 %; 12-tunnin valo -tumma sykli; 150-300 lux kirkkaus). Pellettirehua ja puhdistettua vettä oli saatavilla ad libitum. Kaikki eläinkokeet hyväksyi Korean Chungbukin kansallisen yliopiston (CBNU) Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), ja ne suoritettiin CBNU:n laboratorioeläintutkimuskeskuksen (SOP) standardien mukaisesti.

Hiiriä (n=8/ryhmä) hoidettiin suun kautta fukoidaanilla (18 tai 54 mg/kg), CT-uutteella (54 tai 162 mg/kg) tai niiden seoksella (18+54, {{6). }} tai 90+270 mg/kg) kerran päivässä 7 päivän ajan. Pienet annokset fukoidaania (18 mg/kg) ja CT-uutetta (54 mg/kg) olivat peräisin arvioiduista ihmisannoksista 100 mg/keho (70 kg) ja 300 mg/ruumis ruumiinpainon pinta-alan translaation jälkeen (Km{14). }} ihmiselle/km=3 hiirelle). Fukoidaanin ja CT-uutteen suuret annokset asetettiin 3-kertaisiksi, yksin tai seoksena, ja suurimman annoksen seos kiinnitettiin 5-kertaiseksi maksimaalisten synergististen vaikutusten arvioimiseksi.

Fukoidaani- ja CT-uutteen käsittelyn ensimmäisenä päivänä hiirille injektoitiin ihonalaisesti 10 ml steriiliä ilmaa takapuolelle pussin muodostamiseksi [22,23]. 2 ja 5 päivän kuluttua pussiin injektoitiin uudelleen 5 ml ilmaa. Yksi tunti viimeisen käsittelyn jälkeen pussiin injektoitiin 1 ml karrageenia (1 % suolaliuoksessa; Sigma) tai sen vehikkeliä (suolaliuos).

Eritteiden analyysit

Ilmapussi pestiin 1 ml:lla kylmää suolaliuosta 6 tuntia karrageeniruiskeen jälkeen, ja huuhtelunesteen nettotilavuus kirjattiin. Tulehdussolujen, neutrofiilien, monosyyttien ja lymfosyyttien kokonaismäärät määritettiin käyttämällä Coulter-laskuria. NO:n ja PGE2:n konsentraatiot määritettiin Griess-reagenssilla (Sigma) ja entsyymi-immunomäärityksellä (EIA) käyttäen Correlate-EIA-kittiä (Assay Designs, Ann Arbor, Ann ArboUSA), vastaavasti.

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA TULUKSELLISEN SOLUJEN KEMOTAKSIIN VAIKUTUKSEN ESTÄMISEEN PHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %

Histopatologinen tutkimus

Pussin vuorauskudos poistettiin ja kiinnitettiin neutraaliin formaliiniliuokseen. Parafiiniin upotetut kudoslevyt värjättiin hematoksyliini-eosiinilla ja niitä tutkittiin valomikroskoopilla tulehdusleesioiden varalta.

Tilastollinen analyysi

Tulokset esitetään keskiarvona ± SE. Kokeelliset ryhmävertailut tehtiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä, jota seurasi Tukeyn testikorjaus. AP arvo<0.05 was considered statistically significant.

Tulokset

In vitro RAW 264.7 -soluviljelmä, IFN- ja LPS-käsittely lisäsivät suuresti NO-tuotantoa (kuvio 1). Esikäsittely fukoidaanilla (1–320 µg/ml) ei vaikuttanut NO:n vapautumiseen makrofagisolulinjasta (kuva 1A). Vertailun vuoksi CT-uute (32–320 µg/ml) tukahdutti merkittävästi NO:n tuotantoa, mikä osoittaa tulehdusta ehkäisevää aktiivisuutta (kuva 1B).

Karrageenin injektio hiiren ilmapussiin lisäsi merkittävästi eritetilavuutta pussissa (kuvio 2). Tällainen lisääntynyt erittyminen vaimensi käsittely fukoidaanilla (18 mg/kg) ja CT-uutteella (54 ja 162 mg/kg). Erityisesti fukoidaanin ja CT-uutteen yhdistelmähoito vähensi eritteiden määrää entisestään yksittäisiin vaikutuksiin verrattuna, vaikka suuremmat annokset (54+162 mg/kg ja 90+270 mg/kg) eivät lisänneet tehoa. pienimpään annosyhdistelmään (18+54 mg/kg) (kuva 2A). N-asteinen pitoisuus pussissa kasvoi myös dramaattisesti karrageeniruiskeen jälkeen (kuva 2B). Verrattuna fukoidaanin mietoon vaikutukseen, CT-uute alensi N-asteen pitoisuutta huomattavasti. Fukoidaanin ja CT-uutteen yhdistelmähoito alensi edelleen NO-tasoa annoksesta riippuvaisella tavalla. Vastaavasti lisääntynyt PGE2-pitoisuus tukahdutettiin synergistisesti fukoidaanin ja CT-uutteen yhdistelmähoidolla (kuvio 2C).

Samanaikaisesti pussissa olevien tulehdusvälittäjien kanssa tulehdussolujen lukumäärä kasvoi dramaattisesti karrageeniruiskeella: neutrofiilien, monosyyttien ja lymfosyyttien kontrollitasot olivat 37,8-, 4,8- ja 24,1-kertaisia ​​(taulukko 1). Fukoidaani ja CT-uute vähensivät kuitenkin merkittävästi tulehdussolujen infiltraatiota, jossa fukoidaani oli jonkin verran parempi kuin CT-uute. Yllättäen ei saavutettu synergististä vaikutusta tulehduksellisten solujen infiltraatioon antamalla samanaikaisesti fukoidaania ja CT-uutetta.

Kuten tulehduksellisten solujen infiltraatiosta eritteissä pääteltiin, ilmapusseja ympäröivässä ihonalaisessa kudoksessa ilmeni vakavia tulehduksellisia leesioita (kuvio 3). Karrageenille altistetussa paksuuntuneessa ihonalaisessa kudoksessa havaittiin valtavasti soluja (kuvio 3B) verrattuna verrokkieläinten lähes normaaleihin piirteisiin (kuvio 3A). Tällaiset tulehdukselliset leesiot vaimenivat huomattavasti fukoidaanikäsittelyllä (kuvat 3C ja 3D) tai CT-uutteella (kuvat 3E ja 3F).

Erityisesti korkeammat anti-inflammatoriset vaikutukset saavutettiin yhdistelmähoidolla fukoidaanin ja CT-uutteen kanssa (kuvat 3G-3I).

Keskustelu

Käyttämällä in viv -asteen arragenaanin aiheuttamaa ilmapussitulehdusmallia, ilman ruiskuttaminen jyrsijöiden selkään saa aikaan solujen lisääntymisen, jotka kerrostuvat onkalon pinnalle muodostaen nivelkalvon kaltaisen rakenteen. Tässä mallissa karrageenin indusoiman tulehduksellisen soluinfiltraation injektio lisäsi eritteitä, mikä on osoitus verisuonivuodosta. Ilmapussi toimii tulehdussolujen ja välittäjien säiliönä, joka voidaan helposti mitata paikallisesti kerääntyvästä nesteestä.

Erilaisten tulehdusvälittäjien joukossa, jotka voivat indusoida verisuonten läpäisevyyttä, tiedetään hyvin, että NO ja PGE2 ovat tärkeimpiä tekijöitä, jotka osallistuvat monien tulehdussairauksien patogeneesiin. Ne tunnetaan myös kivun induktion ja havainnon välittäjinä. iNOS, joka ilmentyy ja aktivoituu erilaisissa solutyypeissä TNF- ja/tai LPS-stimulaatiolla tulehduksen aikana, tuottaa korkeita, pysyviä NO:n pitoisuuksia. NO on tärkeä säätelymolekyyli erilaisissa fysiologisissa toiminnoissa, kuten verisuonten laajenemisessa, mikä johtaa verisuonivuotoon. PGE2, jota syntyy arakidonihaposta COX:ien kautta, edistää monien tulehdussairauksien kehittymistä, ja PGE2:n ylituotanto vasteena erilaisille tulehdusstimulaatioille liittyy COX-II-tasojen säätelyyn ja tulehduksen etenemiseen. Siksi TNF- - NO- ja COX-II-PGE2-reittejä on pidetty tulehdusprosessien kahtena päävirtana, jotka estävät iNOS:n (kortikosteroidit) ja COX:n (NSAID:t) estäjät.

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA TULEKSUTTAUTEIDEN ESTÄMISEEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Tässä tutkimuksessa fukoidaanin ja CT-uutteen samanaikainen anto vähensi eritetilavuutta pussissa, mikä viittaa siihen, että niillä on estävää vaikutusta verisuonten vuotoa vastaan ​​(kuva 2A). Verrattuna kunkin fukoidaani- ja CT-uutteen yksittäisiin vaikutuksiin yhdistelmähoito lisääntyi entisestään, mikä merkitsi sitä, että kahden asteen yhdisteet toimivat synergistisesti. Tällaisia ​​synergistisiä vaikutuksia fukoidaanin ja CT-uutteen välillä tuki niiden aktiivisuus eritteiden NO- ja PGE2-tasoissa (kuviot 3B ja 2C).

Mielenkiintoista kuitenkin varmistettiin, että fukoidaani ei estä suoraan makrofagien aktivaatiota in vitro -testissä (kuvio 1A). Samoin fukoidaanin inhiboiva potentiaali NO- ja PGE2-akkumulaatiolle in vivo -määrityksessä oli suhteellisen alempi kuin CT-uutteen (kuvat 2B ja 2C). Tällainen fukoidaanin toimintamekanismi eroaa solujen suorasta inaktivoinnista CT-uutteella (kuvio 1B). Vertailun vuoksi fukoidaani osoitti suurta tehoa tulehdussolujen infiltraation estämisessä pusseissa (taulukko 1). Fukoidaani oli parempi kuin CT-uute estäessään neutrofiilien, monosyyttien ja lymfosyyttien kulkeutumisen karrageenin aiheuttamiin kudosvauriokohtiin. Mielenkiintoista on, että fukoidanin ja CT-uutteen välisistä erilaisista toimintamekanismeista ei löytynyt synergististä vaellusta estävää vaikutusta: eli fukoidaani estää tulehdussolujen tunkeutumisen, kun taas CT-uute estää solujen aktivoitumista.

Polymorfonukleaariset solut, erityisesti neutrofiilit, ovat tärkeimpiä solukomponentteja, jotka värvätään karrageenin indusoimiin akuutteihin tulehduskohtiin. Lisäksi seuranneilla tulehdussoluilla, kuten makrofageilla ja lymfosyytillä, on myös keskeinen rooli tulehdusprosessissa erittämällä sytokiinejä. Kun niitä esikäsiteltiin fukoidaanilla tai CT-uutteella, karrageenilla injektoituihin ilmapusseihin siirtyneiden valkosolujen määrä väheni huomattavasti. Tämä tulos vastasi vaikutusta, joka saataisiin kortikosteroideilla, kuten deksametasonilla, mutta ei tulehduskipulääkkeillä, mukaan lukien indometasiini. Siksi oletetaan, että fukoidaanilla ja CT-uutteella on osittain steroideja.

Tulehduksellisten solujen kemotaksista estävän vaikutuksen lisäksi CT-uute näytti tukahduttavan makrofagien aktivaatiota. Tämän vahvistivat sen estävät vaikutukset NO:ta kohtaan in vitro ja in vivo, joka on tärkein makrofagien tuottama tulehdusvälittäjä. Siten CT-uutteen vaikutus makrofageihin saattaa johtua mRNA:n ilmentymisen suppressiosta ja/tai iNOS-aktiivisuuden suorasta estämisestä näissä soluissa.

PGE2 on myös yksi tärkeimmistä tulehduksen välittäjistä. Se lisääntyy samanaikaisesti kudosturvotuksen kanssa, jota tulehduskipulääkkeet, COX-estäjät, tukahduttavat. Karrageeni voi lisätä PGE2-tuotantoa indusoimalla COX-II-mRNA:ta ja COX-II-proteiinia pussieritteessä. Tässä mallissa karrageeni lisäsi merkittävästi PGE2:n määrää ja CT-uute tukahdutti sen oleellisesti. On mielenkiintoista huomata, että tämä tulos oli yhdenmukainen vaikutuksen kanssa, joka saavutettaisiin NSAID-indometasiinilla. Siksi tuloksista päätellään, että TT-uutteella on muita NSAID-lääkkeitä koskevia ominaisuuksia. Kaiken kaikkiaan uskotaan, että CT-uute vaikutti sekä kortikosteroideihin että tulehduskipulääkkeiden kaltaisiin vaikutuksiin karrageenin aiheuttamassa tulehdusmallissa ja että fukoidaani tehostiCT-uutteen anti-inflammatoriset vaikutuksetestämällä tulehdussolujen infiltraatiota.

Vaikka tarkan vaikutusmekanismin määrittäminen vaatii lisätutkimuksia, fukoidaanin ja CT-uutteen seos heikensi merkittävästi tulehdusoireita estämällä TNF- –NO- ja COX-II-PGE2-reitit karrageenin aiheuttamassa ilmapussitulehduksessa. Nämä havainnot osoittavat, että fukoidaanin ja CT-uutteen yhdistelmähoito saattaa olla lupaava ehdokas erilaisten kortikosteroidien tai tulehduskipulääkkeiden käyttöön reagoivien tulehduksien lievittämiseen.

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA TULEKSUTTAUTEIDEN ESTÄMISEEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%