Jatkuva paikallinen trombiinin esto säilyttää munuaisten mikroarkkitehtuurin ja toiminnan akuutin munuaisvaurion alkamisen jälkeen

Yhteystiedot: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Ian Vargas et ai

Abstrakti

Akuutti munuaisvaurio(AKI) hallinta on edelleen pääasiassa tukevaa, koska mitkään spesifiset terapeuttiset aineet, jotka olisi suunnattu yksittäisiin signalointireitteihin, eivät ole onnistuneet kliinisissä tutkimuksissa. Tässä raportoimme, että trombiinin aiheuttaman hyytymisen ja tulehduksellisen signaloinnin estäminen käyttämällä paikallisesti vaikuttavia trombiiniin kohdistettuja perfluorihiilinanohiukkasia (PFC NP) suojaa munuaisten verisuonia ja moduloi laajasti erilaisia ​​tulehdusprosesseja, jotka aiheuttavat munuaisiskemia-reperfuusiovaurioita. Jokainen PFC NP kompleksoitiin noin 13 650 suoran trombiini-inhibiittorin PPACK:n (proliini-fenyylialaniini-arginiini-kloorimetyyliketoni) kanssa. Hiirillä, joita hoidettiin AKI-taudin alkamisen jälkeen PPACK PFC NP:llä, ilmeni alentuneita VCAM-1-, ICAM-1-, PGD2-prostanoid-, M-CSF-, IL-6- ja syöttösoluinfiltraatteja. Mikrovaskulaarinen arkkitehtuuri, putkimaiset pohjakalvot ja harjan reunakomponentit säilyivät paremmin. Ei-reperfuusio väheni, kuten vähentynyt punasolujen vangitseminen ja ei-heemi rauta osoittavat.Munuainentoiminta ja tubulusnekroosi paranivat 24 tunnissa verrattuna käsittelemättömään kontrolliryhmään, mikä viittaa siihen, että PPACK PFC NP:llä on kaksinkertainen tromboosin ja tulehduksen esto.

Avainsanat: Akuutti munuaisvaurio; Tromboosi; Tulehdus; perfluorihiilihiukkaset; Aluksen vauriot

Cistanche tubulosa ehkäisee munuaissairauksia, napsauta tästä saadaksesi näytteen

Akuutti munuaisvaurio(AKI) on yleinen kliininen ongelma sekä nuorilla että vanhoilla, ja sen esiintyvyys lisääntyy ja kuolleisuus on kohtuuttoman korkea. Kuolleisuus ei ole merkittävästi parantunut vuosikymmeniin.1,2 Oireyhtymä kehittyy tyypillisesti äkillisen ja ohimenevän verenkierron äkillisen tai alueellisen laskun seurauksena. themunuainenseurauksena useista loukkauksista, mukaan lukien hypotensio, sepsis, toksiinit jne.3 AKI herättää monimutkaisen joukon patofysiologisia molekyylitoimijoita ja signaalitapahtumia sairausprosessissa, joka kehittyy ajan myötä vaiheittain.3–6 Selektiivinen ja spesifinen molekyyliin kohdennettu lääketiede. AKI:n hoitoja ei vielä ole olemassa, huolimatta kiireellisestä lääketieteellisestä tarpeesta.7 Itse asiassa vuosia kestäneen prekliinisen ja kliinisen tutkimuksen jälkeen nykyiset hoidot ovat edelleen olennaisesti tukevia.

Tässä oletamme, että nanopartikkeleihin perustuvat terapeuttiset interventiot, jotka kohdistuvat trombiiniin, jotka voivat ylläpitää mikrovaskulaarista eheyttä ja estetoimintoa ja samanaikaisesti vähentää tulehduksellista signalointia, hyödyttävät AKI-tuloksia. Trombiini on tärkein aterogeeninen ja haavaa parantava molekyyli, joka ohjaa monia muita tulehduksellisia molekyylejä, jotka osallistuvat endoteelin aktivaatioon vaurion jälkeen, kuten NF-κB,8 NADPH oksidaasi,⁹

ja muut proteaasiaktivoitujen reseptorien (PAR-1) kautta sekä endoteelissä että makrofageissa.10,11 Kaikki solutyypitmunuainenkokenut geenin ilmentymismallin muutoksia, joihin sisältyy vauriomarkkerien ja kehitysgeenien lisääntynyt ilmentyminen, kuten Rudman-Melnick et al osoittivat aikakulun yksisolusekvensointitutkimuksessa yksipuolisesta iskemia-reperfuusiostamunuainenvaurio.12 Lisäksi jyrsijätutkimus yhden ytimen RNA-sekvensoinnista kahdenvälisessä iskemia-reperfuusio-munuaisvauriossa13 identifioi spesifisen proksimaalisen tubulussolupopulaation, joka yli-ilmentää proinflammaatio- ja profibroottisia geenejä lämpimän iskemia-reperfuusiovaurion jälkeen. Nämä tulokset osoittavat, että tulehduksen tulisi edustaa hyödyllistä terapeuttista kohdetta. Vaikka kiinteiden intravaskulaaristen hyytymien muodostuminen näyttää harvinaiselta AKI:ssa, oletimme lisäksi, että mikrovaskulaarisen prokoagulanttiaktiivisuuden lieventäminen paikallisesti vaikuttavilla tehokkailla antitrombiinin nanohiukkasantagonisteilla14–17 saattaa parantaa verenkiertoa, vähentää "ei-reflow" ja heikentää tulehdussignaalia säilyttääkseen munuaisten toiminta.

Kriittisiä seikkoja, jotka estävät suorien trombiinin estäjien käyttöä munuaisten iskemia-reperfuusiovaurion (IRI) estämiseksi, ovat niiden mahdolliset toksiset sivuvaikutukset ja systeeminen verenvuotoriski. Mitä tulee tromboosiin, tavanomaiset antikoagulanttilääkkeet eivät ole olleet erityisen onnistuneita, vaikka liukoinen trombomoduliini saattaakin vaikuttaa kudossuojaukseen18,19 ja se voi aktivoida proteiinia C,20,21 ja antitrombiini III,22, vaikkakin liiallisen verenvuodon mahdollisilla komplikaatioilla.21 Lisäksi sekä varfariini että dabigatraanin käyttöön on liittynyt munuaistoksisuutta.^23,24Se tosiasia, että nämä antikoagulanttimenetelmät eivät kuitenkaan ole vielä onnistuneet kliinisesti, ei vähennä trombiinin mahdollista arvoa kohteena, koska sillä on kaksi tehtävää sekä koagulaatiossa että tulehduksessa. Vaikka AKI:n VEGF-hoidosta ei ole olemassa kliinistä tutkimusta, prekliininen tutkimus on osoittanut, että VEGF on tärkeä välittäjä renoprotektiossa AKI:n aikana,25 mikä tukee edelleen ehdottamaamme hypoteettista terapeuttista mekanismia munuaissuonien säilymisestä munuaistoiminnan suojaamisessa AKI:n aikana.

Olemme kehittäneet vakaan, biologisesti yhteensopivan ja ei-nefrotoksisen perfluorihiilinanohiukkasalustan (PFC NP), joka estää trombiinin proteaasiaktiivisuutta aiheuttamatta verenvuotodiateesia.14,15 Natiivit PFC NP:t ovat FDA:n hyväksymiä verenkorvikkeiksi26 ja sisältävät nestemäistä perfluorihiilivetyä. ydin ja ulompi fosfolipidi-pinta-aktiivinen kuori ja joiden halkaisija vaihtelee välillä ~160-250 nm. Äskettäisissä alustavissa AKI-tutkimuksissa annoimme anti-trombiinia PFC NP:tä esihoitona varmistaaksemme, että trombiini on arvokas kohde munuaistoiminnan palautumisen nopeuttamiseksi osittain säilyttämällä mikrovaskulaarista eheyttä ja vähentämällä IRI:n ei-reperfuusiota, kun sitä annettiin ennen iskemia-reperfuusiota. 16 Anti-trombiinin PFC NPS suojaa myös munuaisten allografteja IRI:ltä ja vähentää merkittävästi parenkymaalisen tubulusnekroosin prosenttiosuutta, joka liittyy munuaisten pidempään elinikään siirron jälkeen.27 Ei kuitenkaan ole selvää, onko tämä tromboosia estävä nanopartikkeli edelleen tehokas AKI:n alkamisen jälkeen, joka edustaa täysin erilaista potilaspopulaatioita.

Tämän mukaisesti pyrimme tässä työssä laajentamaan tämän lähestymistavan käyttöä vakiintuneeseen AKI:hen IRI:n jälkeen selvittääksemme sen potentiaalin kliiniseen translaatioon. Käytämme PPACK:ia (Phe[D]-Pro-Arg-kloorimetyyliketonia) antitrombiiniosana konjugoimaan PFC NP:hen, jonka olemme osoittaneet estävän trombiinin signalointia ja mikrovaskulaarista tromboosia ateroskleroosin ja akuutin munuaisvaurion malleissa ( AKI).14-17 PPACK itsessään on hyvin tunnettu suora ja irreversiibeli trombiinin estäjä, joka vapaassa muodossa puhdistuu liian nopeasti munuaisten toimesta ollakseen arvokas terapeuttisena aineena.14,15 Tässä selvitetään varhaisia ​​patofysiologisia vasteita PPACK PFC NP -hoito, joka rajoittaa tulehduksellisia signalointitapahtumia sekä munuaisissa että systeemisesti, säilyttää munuaisten mikroarkkitehtuuria ja vaimentaa verisuonivaurioita. Nämä tiedot viittaavat siihen, että tämä nanopartikkeleihin perustuva terapeuttinen lähestymistapa meneillään olevaan AKI: hen voisi asettaa vaiheen antitrombiiniaineen kliiniselle kehittämiselle, jolla on paikallisesti rajoitettuja pleiotrooppisia vaikutuksia ja jota voidaan antaa turvallisesti AKI:n varhaisissa vaiheissa.

menetelmät

Nanohiukkaskoostumus

Perfluorihiilinanohiukkaset formuloitiin aiemmin kuvatulla tavalla.14 Lyhyesti sanottuna lipidiseos, jossa on 98,5 mooliprosenttia muna-L- --fosfatidyylikoliinia ja 1,5 mooliprosenttia 1,2-distearoyylisnglysero- 3-fosfoetanoliamiini-N-[- karboksi(polyetyleeniglykoli)-2000] (natriumsuola) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) valmistettiin kloroformissa:metanolissa (3:1), ennen kuin se kuivattiin lipidikalvon muodostamiseksi tyhjössä. Lipidikalvo (2 % (paino/tilavuus)) yhdistettiin sitten PFOB:iin (20 % (tilavuus/tilavuus)) (Exfluor Research Corp.) (glyseriini 1,7 % (paino/tilavuus)) (Sigma, St. Louis, MO ) ja MilliQ-vedellä, ennen kuin emulgoitiin (Microfluidics Inc) jäillä 4 minuutin ajan 20, 000 psi:ssä. Nanohiukkasen funktionalisoimiseksi PPACK-konjugaatiolla käytimme amiini-karboksyylikytkentämenetelmää. Nanohiukkasia (1 ml) sekoitettiin ensin 2 mg:aan EDCI-1-[3-(dimetyyliamino)propyyli]-3-etyylikarbodi-imidimetiodidia (Sigma, St. Louis, MO) 1 tunnin ajan. , ennen kuin lisättiin 12,5 mg PPACK:ia (BACHEM, Torrance, CA) orbitaaliravistelijassa huoneenlämpötilassa yön yli. Dialyysi molekyylipainorajalla 3000-5000 g/mol (Fisher Scientific, Waltham, MA) suoritettiin ylimääräisen EDCI:n ja PPACK:n poistamiseksi. Yksityiskohtainen formulointimenetelmä sisällytettiin lisämateriaaleihin.

Akuutin munuaisvaurion malli

Aikuisille C57BL/6-hiirille (n=22) tehtiin molemminpuolinen munuaisten lämmin iskemia-reperfuusio akuutin munuaisvaurion aiheuttamiseksi. Eläimet nukutettiin ketamiinilla (85 mg/kg) ja ksylatsiinilla (13 mg/kg) ennen laparotomiaa 17 minuutin lämpimän iskemian tuottamiseksi. Keskiviivan vatsan viilto tehtiin paljastamaan sekä munuaisvaltimo että laskimo. Munuaisiskemia indusoitiin tukkivilla puristimilla sekä valtimoon että laskimoon verenvirtauksen rajoittamiseksi munuaiseen. Munuaisten verenkierron onnistunut lopettaminen vahvistettiin visuaalisesti munuaisten värin muutoksella vaaleanpunaisesta tumman violetiksi. Hiirten ruumiinlämpö pidettiin 37 asteessa käyttämällä pieneläinlämmitysjärjestelmää. Puristimet vapautettiin 17 minuutin kuluttua munuaisten verenkierron palauttamiseksi, mikä vahvistettiin munuaisten värin muuttuessa vaaleanpunaiseksi. Leikkaushaava suljettiin sitten kerroksittain ja eläimiä tarkkailtiin ja palautettiin häkkiin vapaan liikkumisen jälkeen. 2 tunnin reperfuusion jälkeen yksi annos PPACKia

PFC NP:tä ({{0}},5 ml/kg PFC NP; 0,05 mg/kg PPACK) tai tavallista (kontrolli) PFC NP:tä annettiin suonensisäisesti häntälaskimoinjektiolla. Koska edellinen tutkimuksemme osoitti, että yhdellä ennaltaehkäisevällä PPACK PFC NP:n annoksella oli munuaisia ​​suojaavia vaikutuksia16, käytimme tässä kerta-annoshoitoa AKI:n alkamisen jälkeen arvioidaksemme sen munuaista suojaavaa vaikutusta. Etelä-Floridan yliopiston Institutional Animal Care and Use Committee hyväksyi menettelyt ja protokollat.

Kudosten kerääminen ja säilytys 24 tuntia nanopartikkelien antamisen jälkeen hiiret lopetettiin ja munuaiset uutettiin analysointia varten. Ennen munuaisten poistoa histologisia ja molekyylitason arviointeja varten veri kerättiin sydänpunktiolla myöhempää seerumianalyysiä varten, ja sitten jokainen hiiri perfusoitiin systeemisesti normaalilla suolaliuoksella (Cat #: 23-535435, Fisher Scientific, Waltham, MA), kunnes se oli jäljellä. verta huuhdeltu munuaisista. Seerumin keräämiseksi kokoverta hyytyttiin huoneenlämmössä 30 minuutin ajan, ennen kuin sitä sentrifugoitiin 2000 x g 10 minuuttia 4 asteessa. Kerätty seerumi säilytettiin -80 asteessa ennen veren ureatypen ja sytokiinien arviointia. Histologista analyysiä varten leikatut munuaiset kiinnitettiin 10-prosenttiseen formaliiniin ennen kudoskäsittelyä, upottamista parafiiniin ja leikkausta. Eikosanoidien arviointia varten leikatut munuaiset leikattiin edelleen aivokuoren ja ydinosan erottamiseksi, ennen kuin ne pakastettiin nestetypessä ja säilytettiin -80 asteessa analyysiä varten.

Histologia

Yksityiskohtaiset histologiset värjäys- ja data-analyysimenetelmät sisällytettiin lisämateriaaleihin. Objektilasit deparafiini ja rehydratoitiin ennen hematoksyliini- ja eosiinivärjäystä, Periodic Acid Schiff (PAS) -värjäystä (Cat#: ab150680, Abcam, Cambridge, MA), Preussian Blue Iron värjäystä, immunohistokemiallista värjäystä CD31, VCAM,{201} visualisoimiseksi. ja ICAM-1-ekspressio ja syöttösolu-eosinofiilivärjäys (Cat #: 150665, Abcam, Cambridge, MA). Kanin IgG-isotyyppikontrollivärjäystiedot on esitetty lisäkuvissa 2 ja 3 osoittamaan immunohistokemiallisten värjäystulosten spesifisyyttä. Kaikki mikroskooppiset kuvat otettiin samoilla tehoasetuksilla ja digitointiparametreilla. Mikroskooppiset arvioinnit suoritettiin Olympus-kirkaskenttämikroskoopilla, joka oli varustettu DP27-digitaalikameralla, jotta voidaan tallentaa kuvia patologisista osista 20- tai 40-kertaisella suurennuksella. Kaikille kuville tehtiin kaksoissokkotietoanalyysi.

Veren ureatyppi (BUN)

BUN-mittaukset suoritettiin Urea Nitrogen (BUN) -kolorimetrisellä tunnistussarjalla (Cat #: K024-H5, Arbor Assays, Ann Arbor, MI) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Eikosanoidien valmistus ja analyysi

Eikosanoidit uutettiin modifioidulla uuttoprosessilla ja analysoitiin UPLC ESI-MS/MS:llä, kuten aiemmin on kuvattu.28 Tässä tutkimuksessa käytetyt yksityiskohtaiset menetelmät sisällytettiin lisämateriaaleihin.

Seerumin sytokiinien arviointi

Räätälöity sytokiiniryhmä ostettiin R&D Systemsiltä (Minneapolis, MN) ja arvioitiin Luminex 200:lla (Northbrook, IL) käyttäjän käsikirjan ohjeiden mukaisesti.

Tilastot

Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskiarvon standardivirhe (SEM). Kunkin kokeen tilastollinen analyysi on yhteenveto lisätaulukossa 1. Käytettiin kaksipuolista t-testausta tai yksisuuntaista ANOVAa Scheffen testillä. Valituille metriikkapareille suoritettiin korrelaatioanalyysit Pearsonin r-arvon laskemiseksi. Erojen tilastollinen merkitsevyys laskettiin P <>

Tulokset

PPACK PFC NP -hoito parantaa munuaisten toimintaa taudin alkamisen jälkeenakuutti munuaisvaurio.

Munuaisten yleisen ulkonäön mikroskooppinen tutkimus 24 tuntia reperfuusion jälkeisen anti-trombiinin (PPACK) PFC NP -hoidon jälkeen osoitti vaurion paranemisen vakiintuneessa AKI:ssa (kuvio 1, AB). Vamma 24 tunnin kohdalla sijaitsi pääasiassa munuaisen kortikomedullaarisessa liitoksessa ja proksimaaliset tubulukset olivat ensisijaisesti vaurioituneet. Vamman malli oli koagulatiivisen tyypin nekroosi. Pieni tulehduksellinen infiltraatti havaittiin 24-tunnin ajankohdassa. Tubulusvaurion kvantifiointi H&E-värjätyissä leikkeissä (kuva 1, C) paljasti, että PPACK PFC NP:llä käsitellyt hiiret vähensivät akuuttia tubulaarista nekroosia (ATN) 33,95 prosenttia verrattuna NP:llä käsiteltyihin kontrollihiiriin (24,44 ± 1,76 prosenttia vs 37). 16}} ± 4,96 prosenttia; P=0,035). Kuva 1, D osoittaa, että hoitoa saaneet hiiret vähensivät BUN-arvoa 44,03 prosenttia 24 tunnissa (110,96 ± 6,21 mg/dL vs. 62,10 ± 8,71 mg/dl kontrolli-NP vs. PPACK PFC NP; P=0,0002) . Nämä varhaiset hyödylliset tulokset heijastavat suojausta, jota havaitsimme aiemmin esikäsittelyssä antitrombiinihoito-ohjelmissa 24 tunnin kohdalla,16 mikä viittaa siihen, että trombiinilla on edelleen ratkaiseva rooli AKI:n kehityksessä alkuperäisen iskeemisen vamman jälkeen.

Kuvio 2 havainnollistaa tyvikalvon ja harjan reunarakenteiden alueellisia vasteita antitrombiinikäsittelylle, joka perustuu PAS-värjäyksen puolikvantitointiin. Kuva 2, AC osoittaa, että hoito lisäsi eheillä tyvikalvoilla olevien glomerulusten prosenttiosuutta 51,43 prosentista ± 2,61 prosentista 70.{10}} prosenttiin ± 3,09 prosenttiin (P=0,00033). Kuva 2, DF havainnollistaa putkimaisten harjan reunojen kärsimiä syvällisempiä vaurioita, joissa vain vähemmistö säilytti täysin ehjät harjan reunat 24 tunnin kohdalla. Siitä huolimatta käsittely paransi harjan reunan eheyttä 50,79 prosenttia (P=0.015). Hoito vähensi proteiiniaggregaattien kokonaismäärää 54,09 prosentilla (P=0.032) (Kuva 2, GI), minkä voidaan olettaa estävän tubulaarista tukkoisuutta munuaisten toiminnan ylläpitämiseksi.

PPACK PFC NP -hoito säilytti verisuonten eheyden IRI:n alkamisen jälkeen

Jotta voitaisiin kvantifioida PPACK PFC NP:n potentiaali suojella verisuonielementtejä, munuaisleikkeet värjättiin CD31:n suhteen.

Kuvio 3 havainnollistaa CD31-värjäytymisen suurempaa esiintyvyyttä 24 tunnin kohdalla PPACK NP:llä käsiteltyjen hiirten aivokuoressa ja ytimessä verrattuna kontrolli-NP:hen (kuvio 3, A ja D vastaan ​​B ja E). Kortikaalisilla alueilla CD31-värjäytyminen käsitti 4,28 prosenttia ± 0,62 prosenttia hoidetuista verrattuna 1,75 prosenttia ± 0,34 prosenttia kontrollieläimiin (P=0).0{{ 25}}18) tai suhteellinen 144,57 prosentin lisäys (kuva 3, C). Medullaarisilla alueilla CD31-värjäytyminen oli 3,24 prosenttia ± 0,38 prosenttia PPACK NP:llä hoidetuilla eläimillä verrattuna 1,91 prosenttia ± 0,29 prosenttiin kontrolli-NP-käsitellyillä eläimillä (P=0,0073) tai suhteellinen 88,81 prosentin lisäys (kuva 3, F). . Verisuonten eheyden mikroskooppinen arviointi ei paljastanut havaittavaa valtimonekroosia 24-tunnin ajankohdassa.

Punaisten verisolujen (RBC) ulkonäkö mikroskooppisissa kuvissa erosi PPACK NP:n ja kontrolli-NP-käsiteltyjen hiirten välillä 24 tunnin kohdalla (kuvio 4). Koska hiiriä perfusoitiin systeemisesti veren huuhtelemiseksi pois perfusoitavilla munuaisalueilla, punasolujen läsnäolo osoitti joko aggregaatiota huonosti perfusoiduissa mikrovaskulaarisissa putkissa tai interstitiaalista ekstravasaatiota tai mahdollisesti molempia. Munakeräsissä (kuvio 4, AB) punasoluja havaittiin verisuonikimppuissa, mutta harvoin Bowmanin kapselissa 24 tunnin kohdalla. Hoito vähensi glomerulaaristen punasolujen esiintyvyyttä 40,78 prosenttia (P=0,007) (Kuva 3, C). Ytimessä (kuva 4, DE) punasoluille ei voitu määrittää lopullista sijaintia H&E-värjäytysten perusteella, mutta hoito vähensi punasolujen yleistä esiintyvyyttä 34,92 prosenttia (P=0.049) (Kuva 4, F) .

Punasolujen kerääntymisen ja vangitsemisen seurausten kuvaamiseksi tarkemmin suoritettiin ei-hemi-rautavärjäys Preussian Bluella. Rautavärit olivat positiivisia sekä glomerulaarisissa että tubulaarisissa solurakenteissa. Hoito vähensi raudan esiintyvyyttä sekä aivokuoressa (44,23 prosentin lasku; P=0.022) (kuva 5, AC) että ydin (50,50 prosentin lasku; P=0.006) (Kuva 5, DF ) 24 tunnin kohdalla, mikä vastaa antitrombiinihoidon vaikutusta punasolujen vangitsemiseen.

PPACK PFC NP -hoito vähensi paikallista ja systeemistä tulehdusta AKI:n puhkeamisen jälkeen

Selvittääksemme trombiinin roolia endoteelin aktivaation ja paikallisen tulehduksen ylläpitämisessä munuaisissa määritimme sekä ICAM-1 että VCAM-1. PPACK-käsittely ei muuttanut VCAM-1-ilmentymistä aivokuoressa (kuvio 6, AC). VCAM- 1:n ilmentyminen ydinytimessä kuitenkin väheni huomattavasti 65,25 prosenttia (P=0.011) hoidon jälkeen (kuvio 6, DF). Endoteeli-ICAM-1:n lisääntynyt ilmentyminen havaittiin sekä aivokuoressa että ydinosassa NP-käsitellyillä kontrollihiirillä (kuvio 7, B ja E). Hoito alensi ICAM-1-arvoa 36,89 prosenttia (P=0.0083) aivokuoressa (kuva 7, AC) ja 31,17 prosenttia (P=0.030) ydinytimessä (kuva 7). , DF).

Rajataksemme trombiinin roolia tulehduksellisten bioaktiivisten lipidien säätelyssä AKI:n varhaisessa evoluutiossa, suoritimme lipidomisia määrityksiä kudoksille, jotka oli uutettu erikseen aivokuoresta ja medullasta 24 tunnin kuluttua. Täydentävät taulukot 2 ja 3 luetellaan spesifiset molekyylimääritykset, munuaisalue ja kohdetyypit (käsitelty AKI, hoitamaton AKI tai normaali ilman AKI:ta). Täydentävä taulukko 4 luettelee keskimääräisen prosentuaalisen muutoksen terveestä normaalista lähtötasosta kunkin lipidin osalta aivokuoressa ja ydinytimessä. Yleisesti ottaen sekä aivokuoren että medullaarisilla alueilla ilmeni lähes kaikkien bioaktiivisten lipidien poikkeavaa ekspressiota verrattuna normaaleihin munuaisiin (lisätaulukot 2 ja 3), ja lähes kaikilla signalointilipideillä oli suuntaus siirtyä kohti normaaleja tasoja antitrombiinihoidon jälkeen. Yksinkertaistettuna mittarina alueelliselle tulehdukselle (lisätaulukko 4), kaikkien lipidien keskimääräinen prosenttimuutos oli 65,13 prosenttia ja 38,60 prosenttia aivokuoren osalta ja 136,42 prosenttia ja 90,76 prosenttia medullassa kontrolli-NP- ja PPACK NP -ryhmissä, mikä osoittaa, että tulehdus medulla ylitti aivokuoren lipidomisten määritysten mukaan.

Vaikka paranemissuuntaukset olivat ilmeisiä hoidon jälkeen lähes kaikilla lipidilajilla, useimmat eivät vastanneet tilastollista merkitsevyyttä. Näissä määrityksissä huomattava oli kuitenkin PDG2:n merkittävä vaste, joka väheni 47,62 prosenttia aivokuoressa (Kuva 8, A) (P=0.012) ja 50,21 prosenttia ydinytimessä (Kuva 8, B) ( P=0.0249), vastaavasti. Tämän havainnon perusteella määritimme tunkeutuvien syöttösolujen esiintyvyyden, sillä ne ovat tunnettu merkittävä tulehduksellisen PGD2:n lähde. Kuvio 8, CE osoittaa, että antitrombiinihoito vähensi syöttösolujen määrää koko munuaisosassa 54,27 prosenttia (P=0,002) 24 tunnin kohdalla. Tämä on yhdenmukainen havaittujen VCAM-1- ja ICAM-1-vähennysten kanssa (kuvat 6 ja 7) aktivoituina syöttösoluina, jotka ilmentävät LFA-1-proteiinia (lymfosyyttitoimintoihin liittyvä antigeeni 1) ja VLA (erittäin myöhään) antigeeni) ligatoi kudosspesifisiä adheesiomolekyylejä tulehtuneisiin kudoksiin siirtymistä varten.29,30 Lisäksi syöttösoluihin liittyvät kemokiinit/sytokiinit, kuten M-CSF ja IL-6, vähensivät samanaikaisesti antitrombiinin nanopartikkeleita. PPACK NP -hoidon jälkeen seerumin M-CSF ja IL-6 laskivat 36,60 prosenttia (P=0,0448) ja 27,44 prosenttia (P=0,0454) verrattuna hoitoon. käsittelemätön kontrolliryhmä (kuvio 8, F).

Tietojoukosta ilmeni useita mielenkiintoisia korrelaatioita, jotka liittyvät syöttösolujen infiltraatioon, verisuonivaurioihin ja munuaisten toimintaan hoidettujen ja hoitamattomien eläinten yhdistetyissä ryhmissä sekä aivokuoren että ydinosan alueilla. BUN:n ja CD31:n välillä oli epäsuora suhde (r=0.75, P=0.000009), mikä osoitti, että munuaisten vajaatoiminnan paheneminen liittyi suurempiin verisuonivaurioihin (täydentävä kuva 1, A). Mastosolujen lukumäärän ja BUN:n välillä oli suora yhteys (r=0.71, P=0.004), mikä osoittaa progressiivisen pienenemisen

munuaisten toiminnasta syöttösolujen infiltraation yhteydessä (lisäkuva 1, B). Syötösolujen määrän ja CD31:n välillä havaittiin epäsuora yhteys (r=0.59, P=0.002), mikä osoittaa, että verisuonivauriot pahenivat syöttösolujen lisääntyneen infiltraation myötä (täydentävä kuva 1, C). Lopuksi havaittiin suora yhteys syöttösolujen määrän ja globaalin ICAM-1-ilmentymisen välillä (r=0.54, P=0.008), mikä on yhdenmukainen sen odotuksen kanssa, että lisääntyneesti säädellyt vaskulaariset adheesiomolekyylit edistää syöttösolujen kohdistumista vaurioituneisiin kudoksiin (täydentävä kuva 1, D). Vielä läheisempi suora yhteys koski ydin-VCAM-ilmentymistä ja syöttösolujen määrää (r=0.69, P=0.009; tietoja ei näytetä).

Keskustelu

Huolimatta vuosikymmenten ponnisteluista tehokkaan hallinnan etsimiseksiakuutti munuaisvaurio, current treatments remain essentially supportive. Failure of single agents tested in numerous AKI clinical trials now prompts a renewed search for agents that might exert more pleiotropic or broad-spectrum therapeutic actions for preserving renal function.3–7 The present data indicate that targeting thrombin with locally acting nanoparticle agents represents one such approach to accelerating functional recovery, preserving vascular and tubular integrity, and modulating inflammation. The exceptional local potency of PPACK PFC NP against thrombin with normal bleeding times and clotting parameters by 30-60 min after injection14,15 is due to the fact that each nanoparticle situates >104 antitrombiiniosaa mikrovaskulaarisen tromboosin ja PAR-1-aktivaation kohdissa (lisäkuvaus lisämateriaaleissa), amplifikaatiostrategia, jota ei voida saavuttaa 1:1 stokiometrialla tavanomaisista vapaista aineista, jotka estävät trombiinia, mukaan lukien PPACK.

Tämä tietosarja osoittaa, että akuutti munuaisiskemia-reperfuusiovaurio ei ole täydellinen 2 tunnin kuluessa reperfuusion jälkeen ja trombiini on edelleen arvokas kohde vaurioituneissa kudoksissa reperfuusion jälkeen. Molitorisin työtovereiden ja muiden aiemmat ponnistelut tukevat jatkuvaa pyrkimystä suunnitella turvallisia menetelmiä trombiinin estämiseksi suoraan AKI:ssa.^18,31–33Aikaisemmasta työstämme AKI:n esikäsittelyssä PPACK PFC NP:llä tiedämme, että antitrombiinin nanohiukkaset tarjoavat jatkuvan valvonnan paikallisesti aktivoitua trombiinia vastaan, joka säilyttää verisuonten eheyden, heikentää merkittävästi no-reflow-ilmiötä ~50 prosentilla ja kumoaa nopeasti munuaisten toimintahäiriön 24 prosentilla. 16. Yhdessä nykyisten tietojen kanssa on selvää, että antitrombiinin nanopartikkelit pääsevät edelleen vaurioituneisiin, mutta elinkelpoisiin munuaiskudosiin reperfuusion jälkeen, jotta voidaan välttää lisäverisuoni- ja tubulusvauriot. Aiemmat raportit, joiden mukaan PAR-1-poistohiiret kärsivät vähentyneestä munuaisiskemia-reperfuusiovauriosta, ovat myös sopusoinnussa strategiamme kanssa, joka koskee PAR-1-aktivaation voimakasta ja jatkuvaa farmakologista estämistä AKI:ssa trombiinin eston kautta.³⁴

Antitrombiini PFC NP:n tarjoama munuaisten verisuonirakenteiden (kuva 3), harjan reunan ja tyvikalvon (kuva 2) suojaaminen yhdessä aikaisempien tietojemme kanssa, jotka osoittavat, että antitrombiinihoito saa aikaan 2-kertaisen parannuksen perfuusion kortikomedullaarisilla alueilla AKI,16 vahvistaa munuaisten mikroangiopatian parantamisen ilmeisen hyödyn. Vaikka peritubulaaristen hiussuonten ja laskimolaskimoiden vaurion tarkkaa luonnetta ei ole täysin selvitetty näinä aikaisina ajankohtina reperfuusion jälkeen, suonen läpäisevyyden paranemista ja endoteelin proapoptoottisen kaspaasin -3 aktivaatiota kuvataan sekä signaalin heikkenemistä. CD31:lle (PECAM),35, joka säätelee endoteeliliitoksen eheyttä.36 CD31:n synteesiä ja ilmentymistä soluliitoskohdissa säätelevät alaspäin tulehdussytokiinit, joita ekspressoivat aktivoidut syöttösolut (TNF- ja IFN-), jotka lisäävät verisuonten läpäisevyyttä.^37,38Lisäksi CD31 säätelee trombiinin aiheuttamaa kudostekijän induktiota PAR-1-aktivaation kautta, ja CD31-poistohiirillä on lisääntynyt tubulaarinen epiteelin ja endoteelin apoptoosi, lisääntynyt fibriinin kerrostuminen ja kudostekijän ilmentyminen.³⁹Näin ollen PPACK PFC NP:n kyky säilyttää CD31:n ilmentyminen voi olla elintärkeää hyytymiskaskadin jatkuvan aktivaation rajoittamiseksi ja endoteelin eheyden ylläpitämiseksi.

Tulehduksen ja koagulaation välillä on paikallinen yhteys AKI:n laajenemisvaiheessa, mikä rajoittaa ulomman ydinkapillaarin perfuusiota aiheuttaen pitkittynyttä alueellista iskemiaa/hypoksiaa, mikä sitten heikentää tubulussolujen korjausta ja regeneraatiota.4 Mikrosuonten määrän jatkuva väheneminen sisemmässä raidassa ulomman ydin AKI:ssa osoittaa, että suonivauriot jatkuvat ja VEGF-signalointi on tukahdutettu.^40–42Lisäksi on runsaasti todisteita siitä, että verisuonten harvinaisuus saa aikaan kroonisen hypoksian, joka johtaa etenevään tubulointerstitiaaliseen fibroosiin.⁴³Akuutin rotan iskemian/vaurion mallissa proksimaaliset tubulukset ovat erityisen herkkiä hypoksialle, joka ilmenee tubulussolujen irtoamisena ja jopa täydellisenä hajoamisena, mikä aiheuttaa liiallista kuolleisuutta.44,45 Humphreyn ryhmä on todellakin osoittanut, että munuaisten mikrovaskulaarinen karsiminen on ennakkoedustaja krooninen munuaissairaus.⁴⁶

Tietomme vahvistavat myös, että verisuonivauriot edistävät punasolujen vangitsemista ja ei-heemin kertymistä (kuvat 4 ja 5), ​​mikä voi pahentaa kroonista munuaissairautta,⁴⁷mutta joka soveltuu antitrombiinihoitoon. Kudosten raudan lähde sekä munuaiskeräs- että tubulussoluissa (kuvio 5) oli epäilemättä peräisin punasolujen hajoamisesta näillä alueilla verenvuodon ja/tai mikrovaskulaarisen tromboosin seurauksena, mikä on yhdenmukainen kuvan kanssa verisuonikompromissista, jota antitrombiinihoito lieventää. Vastaavasti lähestymistavat, jotka säilyttävät verisuonten eheyden, voivat edustaa kriittistä ensimmäistä askelta kohti ravintoainesubstraattien syöttölinjojen ylläpitämistä, mikä helpottaa vaurioituneiden putkimaisten rakenteiden nopeampaa paranemista.

Mielenkiintoista on, että PPACK PFC NP näyttää tarjoavan varhaisen suojan verisuonirakenteille ja heikentävän erilaisia ​​tulehdusmarkkereita (kuvat 6 ja 7; lisätaulukot 2-4) sekä aivokuoressa että ydinosassa. Perinteisissä AKI:n kokeellisissa tutkimuksissa aivokuoren oletetaan olevan vastustuskykyisempi vaurioille kuin ydin, johtuen alhaisemmasta aineenvaihduntatarpeesta, mutta endoteelin aktivaatio ja patofysiologinen tulehdus näyttävät olevan laajalle levinneitä, kuten lipidomiset ja histokemialliset analyysimme osoittavat. Lisäksi ei-heemin raudan laaja kerrostuminen sivutuotteena vangittujen punasolujen hajoamisesta sekä aivokuoressa että ydinosassa – ja sen lieventäminen antitrombiinin nanopartikkeleilla – on sopusoinnussa yleisen tulehduksen ja vaurion mallin kanssa, vaikka aivokuori voisi osoittautua enemmän. taudin aikana ohimenevästi ja lievästi vaikuttaa kuin ydin.

Yllättävä varhainen syöttösolujen tunkeutumisen vaste 24 tunnin sisällä (kuvio 8) viittaa muiden kuin perinteisten toimijoiden, kuten neutrofiilien ja makrofagien, tärkeän rooliin. Syötösoluja pidetään tyypillisesti allergisten vasteiden välittäjinä, mutta niiden patofysiologisista vaikutuksista akuuttiin ja krooniseen munuaisvaurioon on olemassa joukko kirjallisuutta.^48–52 Vaikka neutrofiilit reagoivat varhain kudosvaurioon, makrofagit tulevat kuvaan vasta myöhemmin tulehdusprosessissa, mikä viittaa siihen, että syöttösoluilla on tärkeä rooli AKI:n varhaisessa vaiheessa. Danelli ym. ovat todellakin osoittaneet, että syöttösolujen degranulaatio tapahtuu varhain AKI:ssa ja että syöttösolujen ehtyminen AKI-induktion aikana, mutta ei 48 tuntia myöhemmin, antaa pitkäaikaisen hyödyllisen vaikutuksen munuaisten toimintaan, atrofiaan ja fibroosiin.⁵³Tong ym. tekivät samanlaisia ​​johtopäätöksiä kromolynilla stabiloiduissa syöttösolumenetelmissä, jotka suoritettiin ennen reperfuusiota.54 Summers on osoittanut, että syöttösolupuutteiset hiiret (KitW-sh/W-sh) kärsivät vähemmän iskeemisistä vaurioista kuin villit tyypit ja että ne kehittävät alentuneita leukosyyttikemoattraktanttien tasoja.⁵⁵

Syötösolut ekspressoivat proteaasiaktivoituja reseptoreita Syötösolut ekspressoivat proteaasiaktivoituja reseptoreita (PAR), jotka trombiini voi aktivoida degranuloimaan ja vapauttamaan joukon ennalta muodostuneita kemokiineja, sytokiinejä ja bioaktiivisia lipidejä.56–58 Trombiini aiheuttaa myös syöttösolujen tarttumista matriisiin. proteiinit (esim. fibronektiini) ja interleukiinin ilmentyminen (esim. IL-6) PAR- 1-vuorovaikutusten kautta.⁵⁹Trombiinin estämisen jälkeen havaitsimme alentuneita PGD2-tasoja, jotka ovat yhdenmukaisia ​​syöttösolujen suhteellisen ehtymisen kanssa, koska PGD2 on pääasiallinen bioaktiivinen eikosanoidi, jota syöttösolut erittävät allergisen tyyppisissä reaktioissa.60 Lisäksi ICAM:n-1 heikkeneminen ja VCAM-1 antitrombiinin nanohiukkaskäsittelyn jälkeen on sopusoinnussa vähentyneen syöttösolujen infiltraation kanssa, koska ne ilmentävät LFA-1- ja VLA:ta ja käyttävät adheesimolekyylejä päästäkseen sisään kudoksiin.^29,30

Tiedossamme ei ole tähän mennessä kuvattu PGD2:n spesifistä patogeenistä roolia munuaisten IRI:n kehittymisessä, mutta se toimii selkeänä biomarkkerina syöttösolujen aktivoitumiseen.⁵²Keuhkotulehduksessa PDG2:n on osoitettu lisäävän makrofagien proinflammatorista sytokiinien ilmentymistä reseptoriensa (DP1 ja DP2) kautta, jotka sitten aktivoivat neutrofiilien sisäänvirtauksen.61 Havaintomme lisääntyneestä M-CSF:stä ja IL-6:stä (kuva 8) AKI:ssa joita PPACK PFC NP säätelee alas syöttösolusuppression kautta, olisi yhdenmukainen tällaisen oletetun mekanismin kanssa. Koska syöttösolujen tiedetään kuitenkin vapauttavan monia munuaisten toiminnalle mahdollisesti haitallisia tekijöitä51,52, mikä tahansa määrä vastuullisia determinantteja saattaa olla tulevien tutkimusten kohteena trombiinin estämisellä tai muilla molekulaarisesti kohdistetuilla aineilla. Sen mukaisesti interventiot, jotka hidastavat varhaista syöttösolujen vetovoimaa ja degranulaatiota, voisivat olla erittäin suojaavia verisuonten eheydeltä ja munuaisten toiminnalta, mikä ilmenee paikallisena trombiinin estona esillä olevissa tiedoissa.

Rajoitukset

Näitä tutkimuksia ei suunniteltu selventämään trombiinin eston pysyviä etuja, koska AKI-malli keskittyy varhaiseen suojaukseen IRI:tä ja siihen liittyviä mekanismeja vastaan. Se, voisivatko yhden annoksen antitrombiinin nanopartikkeleita saada pitkän aikavälin hyödyt rajoittaa kroonisen munuaissairauden etenemistä, ei kuulu tämän raportin piiriin ja vaatisi toisenlaisen kokeellisen mallin ja hypoteesin. Lisäksi ajallista mahdollisuutta saavuttaa toiminnallinen palautuminen estämällä trombiinia AKI:n laajennusvaiheessa ei käsitellä tässä, mutta se on kiinnostava aihe tulevia tutkimuksia varten. Se, missä määrin paikallisen trombiinin eston pääasialliset hyödylliset vaikutukset AKI:ssa johtuvat syöttösoluaktivaation suppressiosta, jää arveluksi, mutta se olisi testattavissa myöhemmissä yksityiskohtaisissa mekanistisissa tutkimuksissa. Vaikka merkittävät lineaariset korrelaatiot syöttösolujen lukumäärän, CD31:n ja BUN:n välillä eivät välttämättä vahvista syytä ja seurausta, niiden yhteensopivuus tukee vahvaa yhteyttä syöttösolujen ja verisuonivaurioiden välillä munuaisten IRI:n varhaisissa vaiheissa. Lopuksi, PPACK:n käyttö antitrombiiniosana on vain yksi esimerkki konjugoitavasta terapeuttisesta ainesosasta, joka voidaan kuljettaa turvallisesti ja paikallisesti nanorakenteessa trombiinin signaloinnin hillitsemiseksi.

1. Benoit SW, Devarajan P. Akuutti munuaisvaurio: uusia farmakoterapioita nykyisissä kliinisissä tutkimuksissa. Pediatr Nephrol 2018;33:779-87.

2. Chen H, Busse LW. Uudet hoidot akuuttiin munuaisvaurioon. Kidney Int Rep 2017;2:785-99.

3. Bonventre JV, Yang L. Iskeemisen akuutin munuaisvaurion solupatofysiologia. J Clin Invest 2011;121:4210-21.

4. Sharfuddin AA, Molitoris BA. Iskeemisen akuutin munuaisvaurion patofysiologia. Nat Rev Nephrol 2011;7:189-200.

5. Bonventre JV. AKI:n patofysiologia: vamma ja normaali ja epänormaali korjaus. Contrib Nephrol 2010;165:9-17.

6. Zuk A, Palevsky PM, Fried L, Harrell Jr FE, Khan S, McKay DB, et ai. Translaatioesteiden voittaminen akuutissa munuaisvauriossa: raportti NIDDK-työpajasta. Clin J Am Soc Nephrol 2018;13:1113-23.

7. Zuk A, Bonventre JV. Viimeaikaiset edistysaskeleet akuutissa munuaisvauriossa ja sen seurauksissa ja vaikutuksissa krooniseen munuaissairauteen. Curr Opin Nephrol Hypertens 2019;28:397-405.

8. Rahman A, Fazal F. NF-kappaB:n estäminen: tulehdusongelma. Proc Am Thorac Soc 2011;8:497-503.

9. Jagadeesha DK, Takapoo M, Banfi B, Bhalla RC, Miller Jr FJ. Epidermaalisen kasvutekijäreseptorin Nox1-transaktivaatio edistää N-kadheriinin irtoamista ja sileän lihaksen solujen migraatiota. Cardiovasc Res 2012;93:406-13.

10. Lopez ML, Bruges G, Crespo G, Salazar V, Deglesne PA, Schneider H, et ai. Trombiini indusoi selektiivisesti geenien transkriptiota ihmisen monosyyteissä, jotka osallistuvat tulehdukseen ja haavan paranemiseen. Thromb Haemost 2014;112:992-1001.

11. Borissoff JI, Spronk HM, Heeneman S, kymmenen Cate H. Onko trombiini avaintekijä "koagulaatio-aterogeneesin" labyrintissä? Cardiovasc Res 2009;82:392-403.

12. Rudman-Melnick V, Adam M, Potter A, Chokshi SM, Ma Q, Drake KA, et ai. AKI:n yksisoluinen profilointi hiiren mallissa paljastaa uudet transkription allekirjoitukset, profibroottisen fenotyypin ja epiteelin ja stroman välisen ylikuulumisen. Journal of the American Society of Nephrology: JASN 2020;31:2793-814.

13. Kirita Y, Wu H, Uchimura K, Wilson PC, Humphreys BD. Hiiren akuutin munuaisvaurion soluprofilointi paljastaa konservoituneita soluvasteita vauriolle. Proc Natl Acad Sci USA 2020;117:15874-83.

14. Myerson J, He L, Lanza G, Tollefsen D, Wickline S. Trombiinia estävät perfluorihiilinanohiukkaset tarjoavat uuden strategian akuutin tromboosin hoitoon ja magneettikuvaukseen. Lehti tromboosista ja hemostaasista: JTH 2011;9:1292-300.

15. Myerson JW, He L, Allen JS, Williams T, Lanza G, Tollefsen D, et ai. Trombiinia estävät nanopartikkelit muodostavat nopeasti monipuolisia ja havaittavissa olevia hyytymistä estäviä pintoja. Nanoteknologia 2014;25:395101.

16. Chen J, Vemuri C, Palekar RU, Gaut JP, Goette M, Hu L, et ai. Antitrombiinin nanohiukkaset parantavat munuaisten reperfuusiota ja suojaavat munuaisten toimintaa iskemia-reperfuusiovaurion jälkeen. Am J Physiol Renal Physiol 2015;308:F765-73