Tutkimus käpyrauhasen glykosidin ja ergosterolin glykosidipitoisuuden määritysmenetelmästä Cistanche Tubulosassa

Cistanche tubulosa on kuiva, mehevä varsi, jossa on hilseileviä lehtiä, joka kuuluu Ledaceae-heimon Cistanche-sukuun. Se on luonteeltaan lämmin, maultaan makea ja suolainen ja kuuluu munuaisten ja paksusuolen meridiaaneihin. Sillä on perinteisiä vaikutuksia, kuten virkistävä munuaisten yang, ravitseva esanssi ja verta, kostuttaa suolistoa ja edistää suolen toimintaa sekä hidastaa ikääntymistä. Se tunnetaan nimellä "Desert Ginseng". Kiinan kansantasavallan farmakopean 2010 painoksesta lähtien Cistanche tubulosa (Schrenk) R. Wight on lisätty yhdeksi Cistanchen lakisääteisistä peruskasveista ja listattu C. deserticolan rinnalle.

Cistanche tubulosaa tuotetaan pääasiassa Tarimin altaan eteläreunalla Xinjiangin Uygurin autonomisella alueella, ja se kasvaa loismuodossa Tamarix-kasvien juurissa. Se on tällä hetkellä Cistanche tubulosa -lääkemateriaalien ensisijainen lähde Kiinan markkinoilla, ja sen vuosituotannon osuus on yli 60 %. Villivarojen lisääntyvän niukkuuden vuoksi se on listattu toisen luokan suojelluksi kasviksi National Key Protected Wild Plant List -luetteloon (2021).

Nykyaikainen farmakologinen tutkimus on osoittanut, että Cistanche tubulosan farmakologinen ydinaine perustuu fenyylietanoidiglykosideihin (PhG), joista ekinakosidilla (C35H46O20) ja akteosidilla/verbaskosidilla (C29H36O15) on korkein pitoisuus ja vahvin aktiivisuus tubulosan lääkkeiden laadunvalvontaan, ja ne ovat nimenomaisesti suunniteltuja tubulosia. Kiinan farmakopeaa. Kiinan farmakopean vuoden 2020 painoksen mukaan ekinakrosidin ja verbaskosidin kokonaismäärä kuivatussa Cistanche tubulosa -tuotteessa ei saisi olla alle 1,5 %, mikä on paljon korkeampi kuin aavikon Cistanche tubulosan standardi 0,30 %. Siksi tarkkojen, tehokkaiden ja toistettavien sisällön määritysmenetelmien luominen on erittäin tärkeää Cistanche tubulosa -lääkemateriaalien laadunvalvonnan, alkuperän arvioinnin, istutuksen optimoinnin ja tuotekehityksen kannalta.

Ekinosidi, Cistanche tubulosan tärkein kemiallinen komponentti

Akteosidi, Cistanche tubulosan tärkein kemiallinen komponentti

Männynkäpykrysanteemiglykosidin ja ergotamiiniglykosidin kemialliset ominaisuudet

kemiallinen rakenne

Männynkäpyglykosidi ja ergosterolin glykosidi ovat molemmat fenyylietanoidiglykosideja, joiden perusrunko koostuu fenyylietanoidiytimästä, joka on liitetty glykosidisilla sidoksilla sokeriryhmiin (yleensä glukoosi ja ramnoosi), ja substituoituja ryhmiä, kuten kofeoyyliryhmiä, lisätään fenolihydroksyyliasemaan. Ekinakosidin molekyylikaava on C35H46O20, jonka suhteellinen molekyylipaino on 786,72. Sen rakenne sisältää yhden kofeoyyliryhmän, yhden glukoosiryhmän ja yhden ramnoosiryhmän. Ergosteroliglykosidin (verbaskosidin) molekyylikaava on C29H36O15, jonka suhteellinen molekyylipaino on 624,59. Sen rakenne on samanlainen kuin pinealosidin, mutta siitä puuttuu ramnoosi ja joitain kofeoyylisubstituutioita. Molemmat liukenevat helposti polaarisiin liuottimiin, kuten metanoliin, etanoliin ja veteen, ja niillä on tyypillinen absorptio ultraviolettialueella (maksimiabsorption aallonpituus noin 330 nm), mikä tarjoaa teoreettisen perustan HPLC-UV-detektiolle.

Farmakologinen aktiivisuus

Männykrysanteemiglykosidilla ja ergosteroliglykosidilla on laaja valikoima farmakologisia vaikutuksia: (1) antioksidanttivaikutus - puhdistamalla superoksidianioneja (O2 · -), hydroksyyliradikaaleja (· OH) ja vetyperoksidia (H2O2), aktivoimalla Nrf2/ARE-entsyymiä ja GSH-entsyymien signaalinvälitysreittiä, kuten SOD:n aktiivisuutta, ja antioksidanttina; (2) Neuroprotektiivinen vaikutus - edistää neurotrofisten tekijöiden, kuten GDNF:n, ilmentymistä, jolla on parantava vaikutus Alzheimerin taudin ja Parkinsonin taudin malleihin; (3) Hormonin kaltaiset vaikutukset - edistävät testosteronin synteesiin liittyvien entsyymien ilmentymistä ja parantavat lisääntymistoimintoa; (4) Maksaa suojaava vaikutus - vähentää alkoholin aiheuttamaa maksavauriota ja oksidatiivista stressiä; (5) Antituumorivaikutus - indusoi ruokatorven syöpäsolujen apoptoosia mitokondrioippuvaisten reittien kautta. Yllä olevat toimet tekevät niistä korvaamattomia indikaattorikomponentteja Cistanche tubulosan laadun arvioinnissa.

Cistanche-antituumorin vaikutukset

Yleiskatsaus sisällön määritysmenetelmiin

Tällä hetkellä Cistanche tubulosan käpymäisen glykosidin ja ergosterolin glykosidin pitoisuuden määritysmenetelmiä ovat pääasiassa korkean erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC), ultra-korkea erotuskyky nestekromatografia (UPLC), ohutkerroskromatografiakuvadigitointi (TLC ImageJ) ja nestekromatografia MS-massaspektrometria LC-massaspektrometria. Niistä HPLC-menetelmä on hyväksytty Kiinan farmakopean lailliseksi määritysmenetelmäksi sen suuren laitteiden suosion, yksinkertaisen toiminnan ja hyvän toistettavuuden vuoksi, ja se on tällä hetkellä kirjallisuudessa laajimmin raportoitu menetelmä. Seuraavassa keskitytään HPLC-menetelmän järjestelmän perustamiseen ja optimointiin.

Eri alkuperän ja isäntien vaikutus sisältöön

Erot alkuperässä

Useat tutkimukset ovat johdonmukaisesti osoittaneet, että eri alueiden ekinakrosidin ja ergosterolin pitoisuudessa on merkittäviä eroja Cistanche tubulosassa. Xinjiangin esimerkkinä voidaan mainita, että esimerkiksi Hetian Moyu Countyn, Kashgar Jiashin piirikunnan ja Alar Cityn kaltaisten näytteiden kahden komponentin sisällön ero voi olla 2-5-kertainen. Yleisesti ottaen Hotanin alueella (erityisesti Moyu Countyssa, Minfeng Countyssa ja Yutian Countyssa) tuotetun Cistanche tubulosan fenyylietanoidiglykosidien kokonaismäärä on suhteellisen korkea, ja joissakin korkealaatuisissa näytteissä fenyylietanoidiglykosidien pitoisuus voi nousta 2,5-5,0 %:iin, mikä ylittää selvästi pharmacopoeia-standardin 1,5 %.

Erilaiset isäntävaikutteet

Cistanche tubulosa loistaa Tamarix-suvun eri kasvien juurissa, ja isäntälajilla on merkittävä vaikutus lääkeaineiden laatuun. Chen et ai. (2005) raportoivat, että fenyylietanolihapon pitoisuus T. talama kanensis -bakteerilla loistetuissa näytteissä oli yleensä korkeampi kuin T. ramosissimalla loissyötetyissä näytteissä. Lisäksi luonnonvaraisten ja viljeltyjen tuotteiden välillä on eroja. Yleensä kahden komponentin pitoisuus luonnonvaraisissa tuotteissa on korkeampi kuin viljelytuotteissa, mutta korkealaatuisilla viljelytuotteilla voidaan saavuttaa korkeampiakin tasoja istutusolosuhteita optimoimalla.

Erot erittelyissä ja osissa

Myös Cistanche tubulosan ominaisuudet (halkaisija, pituus) ja lääkeosat vaikuttavat sen sisältöön. Tutkimukset ovat osoittaneet, että ohuemmissa, mehevissä varsissa ekinakosidin ja ergosterolin pitoisuus on usein korkeampi kuin paksummissa varsissa; Varren yläosan sisältö (lähellä kukinnan päätä) on yleensä suurempi kuin tyvessä. Tämä sääntö antaa viittauksen osien valintaan lääkeyrttien sadonkorjuun ja käsittelyn aikana.

Johdatus muihin mittausmenetelmiin

Ultra-korkean suorituskyvyn nestekromatografia (UPLC)

Cistanche tubulosa -koe

Napsauta tästä nähdäksesi Cistanche Tubulosa Extract Natural Supplement Powder

【Kysy lisää】 Sähköposti:cindy.xue@wecistanche.com / WhatsApp: 0086 18599088692 / WeChat: 18599088692

UPLC-menetelmässä käytetään kromatografiakolonnia, jonka hiukkaskoko on pienempi (esim. Waters HSS T3, 1,8 μm, 100 × 2,1 mm), virtausnopeus 0,3 ml/min, injektiotilavuus vain 1 μL ja analyysiaika voidaan lyhentää 10-15 minuuttiin, herkkyys vaatii paremman HPLC:n ja 0 min erotuksen (perinteisellä erotuksella 30-5). Liang Jiansong et ai. (2021) perustivat kuuden fenyylietanoliglykosidin samanaikaiseen määritykseen UPLC-menetelmän, jolla on laaja lineaarinen alue ja korkea talteenottonopeus ja joka soveltuu suurten näytemäärien nopeaan seulomiseen.

LC-MS/MS-menetelmä

Nestekromatografinen tandemmassaspektrometriamenetelmä on erittäin herkkä ja pystyy samanaikaisesti määrittämään kymmeniä komponentteja Cistanche tubulosasta, mukaan lukien ekinakosidi, ergosteroliglykosidi, isoergosteroliglykosidi ja guanosiini A. Se soveltuu metabolomiikan tutkimukseen ja kattavaan laadunarviointiin. Yhdistetty RPLC-HILIC-tekniikka pystyy mittaamaan jopa 23 polaarista ja ei-polaarista komponenttia kerralla ja kattaa 5 suuruusluokan sisältöalueen.

Online paineistettu liuotinmikrouuttopyörrevirtakromatografia HPLC-menetelmä

Tämä menetelmä yhdistää näytteen uuttamisen, puhdistuksen ja kromatografisen erotuksen verkossa, mikä vähentää merkittävästi orgaanisten liuottimien kulutusta ja näytteen käyttöä. Kolmen fenyylietanoliglykosidin LOQ-arvot ovat 0,50 mg/l (ekinakosidi), 0,25 mg/l (ergosteroliglykosidi) ja 0,38 mg/l (isoergosteroliglykosidi), jotka soveltuvat arvokkaiden näytteiden nopeaan analysointiin.

TLC-kuvan digitalisointimenetelmä

cistanche-uutejauhe

Ohutkerroskromatografiatäplien harmaa-arvoille suoritettiin ImageJ-ohjelmiston perusteella kvantitatiivinen analyysi. Käpykrysanteemiglykosidin, guanosiini A:n, ergosterolin glykosidin ja isoergosteroliglykosidin korrelaatiokertoimet r olivat 0,9974, 0,9931, 0,9923 ja 0,9890, jotka olivat yhdenmukaisia ​​HPLC-menetelmän kanssa. Tämä menetelmä on edullinen, helppokäyttöinen ja soveltuu nopeaan seulontaan ruohonjuuritason yksiköissä ja pellolla.

keskustelua

Keskeisiä kysymyksiä kromatografisten olosuhteiden optimoinnissa

Liikkuvan faasin valinta on ratkaisevan tärkeää HPLC-menetelmien kehittämisessä. Kirjallisuuden vertailu osoittaa, että: (1) vesiasetonitriilijärjestelmä on taipuvainen aiheuttamaan fenyylietanoliglykosidipiikin pyrstöä, ja 0,1 % muurahaishapon tai 1 % etikkahapon lisääminen voi merkittävästi parantaa piikin muotoa; (2) Metanolin asetonitriilietikkahappokolmiosysteemin erotustehokkuus on parempi kuin puhtaan metanolin tai puhtaan asetonitriilin binäärisysteemin; (3) Havaitsemisaallonpituuden valinta 330-334 nm voi tasapainottaa molempien komponenttien absorptiointensiteetin, jolloin vaste on hieman suurempi 334 nm:ssä ja vähemmän ergosterolin aiheuttamaa häiriötä 330 nm:ssä. Kolonnin lämpötilalla on vaikutusta retentioaikaan, mutta se ei muuta erotusastetta merkittävästi, kohtuullisella alueella 30-35 astetta.

Uuttomenetelmien optimointi

Liuotinpitoisuus, kiintoaine-nestesuhde, ultraäänilämpötila ja aika vaikuttavat uuttotehokkuuteen. Tutkimus on osoittanut, että: (1) 50-80-prosenttisella metanolilla tai etanolilla voidaan tehokkaasti uuttaa molemmat glykosidikomponentit, hieman korkeammalla, 60-80-prosenttisella etanolilla; (2) Kiinteän ja nesteen suhde 1:30-1:50 (g/ml) on riittävä perusteelliseen uuttoon; (3) Optimaalinen yhdistelmä on ultraäänilämpötila 50-60 astetta ja aika 40 minuuttia; (4) Ultraääniuutto on parempi kuin palautusjäähdytysuutto, koska jälkimmäinen voi helposti johtaa lämpöherkkien fenyylietanoliglykosidien hajoamiseen.

Keskustelu farmakopean standardien rationaalisuudesta

Nykyisessä farmakopeassa määrätään, että paeonifloriinin ja ergosterolin glykosidien kokonaismäärän Cistanche tubulosassa on oltava suurempi tai yhtä suuri kuin 1,5 %. Tämä standardi on suhteellisen löysä - Xinjiangin korkealaatuiset näytteet saavuttavat yleensä 3–5 prosenttia, ja vain muutama huonolaatuinen näyte lähestyy alarajaa. Jotkut tutkijat ehdottavat standardin nostamista 2,0–2,5 prosenttiin lääkemateriaalien laadun varmistamiseksi. Lisäksi farmakopeassa käytetään vain kahta komponenttia indikaattoreina, kun taas Cistanche tubulosa sisältää myös erilaisia ​​aktiivisia fenyylietanoliglykosideja, kuten guanosiini A:ta, isoergosteroliglykosideja ja hesperidiiniä. Moniindikaattorien kattava arviointi on tulevaisuuden kehityssuunta.

Ehdotuksia menetelmän valintaan

Yleisten lääkemateriaalien laaduntarkastuksessa ja päivittäisessä tuotannon laadunvalvonnassa on suositeltavaa käyttää farmakopean HPLC-menetelmää. Menetelmä on kypsä, laitevaatimukset ovat alhaiset ja tulokset ovat erittäin vertailukelpoisia. Laajamittainen näytteiden seulonnassa tai arvokkaiden näytteiden analysoinnissa UPLC- tai online-PLME-TFC-HPLC-menetelmät ovat tehokkaampia. LC-MS/MS-luokitusmenetelmä on suositeltava menetelmä syvälliseen laadun arviointiin ja lajikkeiden tunnistamiseen. TLC-kuvamenetelmä soveltuu nopeaan alkuseulontaan ruohonjuuritasolla. Tutkijoiden tulee tehdä järkeviä valintoja todellisten tarpeiden perusteella.

cistanche-uutejauhe

Johtopäätös

Tässä artikkelissa käsitellään systemaattisesti HPLC-menetelmää ekinakosidin ja ergosterolin pitoisuuden määrittämiseksi Cistanche tubulosasta. Tämä menetelmä on validoitu moniulotteisella menetelmällä, ja sillä on laaja lineaarinen alue (r suurempi tai yhtä suuri kuin 0,999), hyvä tarkkuus (RSD)<3%), high accuracy (recovery rate 95.7%~100.7%), and easy operation, fully meeting the quality control requirements of the Chinese Pharmacopoeia for Cistanche tubulosa.

Kattava analyysi osoittaa, että: (1) Cistanche tubulosan käpymäisen glykosidin pitoisuus on yleensä 3-8 kertaa ergosteroliglykosidin pitoisuus, ja näiden kahden kokonaismäärä vaihtelee riippuen alkuperäpaikasta, isännästä, koosta ja sijainnista; (2) Fenyylietanolihapon kokonaismäärä korkealaatuisissa näytteissä Hotanista, Xinjiangista, voi olla 2-3 kertaa tai enemmän kuin farmakopean standardi; (3) Uudet tekniikat, kuten UPLC ja LC-MS/MS, tarjoavat tehokkaita työkaluja monikomponenttiseen synkroniseen määritykseen ja syvälliseen laadun arviointiin.

Tulevassa tutkimuksessa tulisi keskittyä seuraaviin aihepiireihin: (1) moniindeksien laadunarviointijärjestelmän perustaminen, joka kattaa enemmän fenyylietanoidiglykosideja; (2) tutkitaan perusteellisesti istutusympäristön, isännän sadonkorjuujakson ja käsittelymenetelmän kokonaisvaikutus sisältöön; (3) edistää Guanhua Cistanchen koko teollisuusketjun standardointia lääkeyrteistä terveysruokiin ja kosmeettisiin raaka-aineisiin.

Viitteet

[1] Keittosammaleen HPLC-menetelmä ekinakosidin ja ergotamiinin pitoisuuden määrittämiseksi Guanhua Roucong Kuissa [J]. Chinese Pharmacist, 2009, 12 (8): 1061-1063

[2] Chen M, Xiao SP, Cui GH, et ai. Ekinakosidin ja akteosidin määritys Cistanche tubulosa[J] -yrteistä. China Journal of Chinese Materia Medica, 2005, 30(11): 839-841.

[3] Baoshan, Ju Aihua, Xiao Zhibin. Ekinakosidin ja ergotamiinin pitoisuuden määritys Guanhua Roucong Kuissa [J]. Chinese Medicine Review, 2017, 23 (19): 39-40, 44

[4] Liang Jiansong, Xue Cuili, Wu Menghua jne. UPLC-pitoisuuden määritys ja kemometrinen arviointi kuudelle fenyylietanoidiglykosidille Roucong Kuissa ja Shacong Kuissa [J]. Journal of Pharmaceutical Analysis, 2021, 41 (2): 226-235

[5] Kiinan kansantasavallan farmakopeakomitea Kiinan kansantasavallan farmakopea (vuoden 2020 painos, osa 1) [S]. Peking: China Medical Science and Technology Press, 2020: 148-149

[6] Zhang Leihong, Du Niansheng, Wang Qing jne. Roucongkui-kokonaisglykosidikapseleiden ekinoklooripitoisuuden määritys HPLC:llä [J]. Northwest Pharmaceutical Journal, 2002, 17 (1): 3-4

[7] Ju Aihua, Ao Geriletu, Zhou Kai Ekinakosidi- ja ergotamiinipitoisuuden määrittäminen suolatussa lihassa ja auringonkukassa Sisä-Mongoliasta [J]. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine, 2011, 26 (1): 178-180

[8] Song Peng, Tu Pengfei. Tutkimuksen edistyminen perinteisen kiinalaisen lääketieteen laadunvalvonnassa ja arvioinnissa Roucongkui [J]. Northern Pharmacy, 2011, 8 (2): 45-47

[9] Guo Dingyu, Xiao Jinglei. Progress in Quality Control and Biological Activity Research of Functional Components in Roucongkui [J]. Jilinin perinteinen kiinalainen lääketiede, 2023, 43 (7): 856-860

[10] Lu Yinghui, Pi Wenmin, Zhang Yue jne. Roucong Kuin ja Guanhua Roucong Kuin vertaileva tutkimus ja markkinatilanteen analyysi [J]. Moderni kiinalainen lääketiede, 2019, 21 (8): 1105-1110

[11] National Pharmacopoeia Committee Standard for formula granules of Roucongkui (Guanhua Roucongkui) [S]. Beijing: China Medical Science and Technology Press, 2021

[12] Fu C, Li J, Airire A, et ai. Cistanche tubulosa fenyylietanoidiglykosidit indusoivat apoptoosia Eca-109-soluissa mitokondrioista riippuvan reitin kautta [J]. Oncology Letters, 2019, 17(2): 1883-1892.

[13] Xu Mingjun, Wait Quality Analysis and Comprehensive Evaluation of Desert Meat Auringonflower Kiinan eri alueilta [J]. Elintarviketeollisuuden tiede ja teknologia, 2022, 43 (15): 312-320

[14] Sisar Hao, Chen Sumei, Yan Donghai jne. Tutkimuksen edistyminen Roucongkuin soveltamisessa kosmetiikassa [J]. Journal of Daily Chemical Science, 2021, 44 (9): 28-33

[15] Hou Ji, Wang Bo, Li Guanghui jne. Tutkimuksen edistyminen ja Roucongkuin teollistumisen asema [J]. Shandong Agricultural Science, 2020, 52 (12): 147-154