Cistanchen glykosidien estrogeenin kaltainen mekanismi aineenvaihdunnan avulla

Johdanto

Estrogeenit ovat tärkeässä roolissa monissa kehitys-, fysiologisissa ja niihin liittyvissä prosesseissa, mukaan lukien kohdun kehitys.1–3 Estrogeenin pitkäaikaisella käytöllä voi kuitenkin olla monia sivuvaikutuksia, kuten rintasyövän, endometriumin syövän ja muiden gynekologisten kasvainten riskin lisääntyminen.4,5 Siksi tutkijat ovat sitoutuneet etsimään estrogeenin korvikkeita, jotka voisivat välttää nämä sivuvaikutukset, jotka tunnetaan selektiivisinä estrogeenireseptorin modulaattoreina, joista fytoestrogeenit muodostavat tärkeän luokan.6 Fytoestrogeeniyhdisteitä esiintyy luonnostaan ​​kasveissa, joilla on estrogeeniteho, ja ne voivat sitoutua estrogeenireseptoreihin aktivoidakseen toimintaansa. Siksi fytoestrogeenit voivat stimuloida kohdun kasvua yhdistämällä kohtuun runsaiden estrogeenireseptorien kanssa, mikä tarkoittaa, että uterotrofista määritystä voitaisiin käyttää alustavaan seulomiseen ja fytoestrogeenien arviointiin.

Cistanchedeserticola (CD), joka tunnetaan Kiinassa nimellä Rou Cong-Rong, väitetään olevan tehokas lisääntymis-, kehitys- ja hedelmällisyystoimintoihin, ja sitä on käytetty tonicina yli 1800 vuoden ajan.8,9 Äskettäin farmakologiset tutkimukset ovat osoittaneet, että tämä tonicilla on laajat lääketehtävät, kutenhormonien säätely, aperientti, immunomodulatorinen, antioksidantti, antiapoptoottinen, hermoja suojaava, antinosiseptiivinen, anti-inflammatorinen, väsymystä ja estrogeeninen vaikutus.10 CD:stä uutetut kistanglykosidit (GC:t) ovat tärkeimpiä aktiivisia komponentteja ja niillä on erilaisia ​​biologisia aktiivisuuksia.11 Vaikka CD:n aktiiviset aineosat on selvitetty aiemmin12, GC:iden estrogeenin kaltaista mekanismia ei ole koskaan tutkittu.

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA OSTEOPOROOSIN ESTÄMISEKSI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Tässä jatkuvassa tutkimuksessa pyrimme vahvistamaan GC:iden mahdollisen käytön fytoestrogeeneina ja suorittamaan metabolomiikkaanalyysin GC:iden estrogeenisen kaltaisen mekanismin tutkimiseksi. Ensin käytettiin uterotrofista määritystä ja histologista analyysiä GC:iden estrogeenisen aktiivisuuden vahvistamiseksi. Mikä tärkeintä, keskityimme metabolisiin muutoksiin rotan seerumissa ja virtsassa käyttämällä UPLC-MS/MS-pohjaista metabolomiikkaanalyysiä. Kohdistamattoman metabolomiikan puutteiden, kuten toistettavuuden ja monimutkaisen matriisin vaikutuksen vuoksi, aineenvaihduntatuotteiden ja indeksien (mukaan lukien energia-aineenvaihdunta, oksidatiivinen stressi, lipidimetabolia ja amino-aineenvaihdunta) tarkkailuun käytettiin MRM-moodiin perustuvaa pseudomenetelmää. liittyvät estrogeenisiin vaikutuksiin, kasvuun ja kehitykseen, valittiin biomarkkeriksi havaitsemista varten. Tuloksemme valaisevat GC:iden estrogeenin kaltaista mekanismia, joka auttaa GC:iden kehittämistä ja käyttöä.

Kokeellinen

Reagenssit

L-leusiini, L-kynureniini, L-tryptofaani, 5-HTP, kolihappo, Nfenyyliasetyyliglysiini, 5-HT, glutationi (GSH) ja 2,4-dinitrofenyylihydratsiini (99 dollaria.{{ 8}}%, HPLC) ostettiin Dalian Melone Biology Technology Co.:lta (Dalian, Kiina). N-etyylimaleimidi ($ 98 %, HPLC), L-glutationihapetettu (GSSG, $ 98 %, HPLC) ja 1,1,3,3-tetraetoksipropaani (TEP) ostettiin Sigmalta (Madrid, Espanja). L-fenyylialaniini (Ring-D5, 98 %, DLM-1258-5) ostettiin Cambridgen isotooppilaboratoriosta (MA, USA). MS-luokan metanoli ja asetonitriili ostettiin ACS:ltä (Houston, USA). Dietyylistilbestroli (puhtaus, 99 dollaria.{24}}%), muurahaishappo, jääetikkahappo sekä hematoksyliini ja eosiini (H&E) ostettiin Sigma-Aldrichilta (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA). Naringenin (puhtaus, $ 98 % (HPLC)) ostettiin Shanghai Jingchun Aladdin Reagent Co.:lta (Shanghai, Kiina). GC:t valmistettiin laboratoriossamme ja niiden puhtaudeksi määritettiin 60 % ultraviolettispektrofotometrialla käyttämällä akteosidia määritysmarkkerina.

GC:iden valmistus

Briey,cistanche jauhe(100 g) liotettiin 75-prosenttisessa etanolissa (1000 ml) 1 tunnin ajan, sitten uutettiin uudelleen 2,5 tuntia kolme kertaa. Supernatantti väkevöitiin tyhjössä, jolloin saatiincistanche-uute(23,3 g). Uute laimennettiin vedellä pitoisuuteen 0,5 g ml- 1 (liukoisuus määritetty raakalääkkeellä). 8 tunnin makrohuokoisen AB-8-hartsin adsorption jälkeen kolonni eluoitiin peräkkäin vedellä ja 85 % etanolilla. 85 % etanolieluentti konsentroitiin, jolloin saatiin etanoliuute (8,4 g). Etanoliuute (0.02 g) punnittiin tarkasti ja liuotettiin 50-prosenttiseen metanoliin (10 ml). 1 ml:n alikvootti liuosta laimennettiin 100 ml:ksi metanolilla tilavuusmittarissa. Lopuksi laimennettu liuos mitattiin 330 nm:ssä ultraviolettispektrofotometrialla. Ultraviolettiabsorptio oli 0,341, ja akteosidin lineaarinen suhde UV:llä oli y ¼ 24,905X + 0,0426 (R2 ¼ 0,9982). Kun se sisälsi 5,04 g GC:itä, puhdistusaste oli 60 % (akteosidia käytettiin markkerina GC-määritykseen). GC:iden sormenjälkien arviointi on esitetty ESI:n kuvassa S1.

Eläinkokeita ja näytteiden kerääminen

Naaraspuoliset SD-rotat, joilla oli sukupuolikypsiä (45–60 g) ja sukukypsiä (320–380 g), toimitti Harbinin lääketieteellisen yliopiston Animal Center, laboratorioeläinlupa, SCXK- (armeija): 2013-001. Eläimiä pidettiin SPF-laboratorio-olosuhteissa ja niille annettiin tavanomaista laboratorioruokavalioon muutettua vesijohtovettä ad libitum. Kaikki eläintoimenpiteet hyväksyttiin Heilongjiangin maakunnan eläinten hyvinvointia ja hoitoa koskevien ohjeiden mukaisesti, ja ne suoritettiin National Institute of Healthin eläinten hoidon periaatteita koskevien ohjeiden (2004) mukaisesti. Kaikki tässä kokeessa käytetyt rotat sopeutuivat yllä olevaan ympäristöön viikon ajan.

Seksuaalisesti epäkypsät SD-rotat jaettiin satunnaisesti kolmeen 10 rotan ryhmään: tyhjäryhmä, dietyylistilbestroliryhmä ja GC-ryhmä. Sillä välin 10 sukukypsää SD-rottaa valittiin kontrolliryhmäksi. Dietyylistilbestroliryhmälle annettiin dietyylistilbestrolia (0,35 mg kg- 1, 1 ml/100 g), GC-ryhmälle annettiin GC-liuosta (30 g kg- 1, 1 ml/100 g). ), ja nollaryhmä ja kontrolliryhmä saivat saman tilavuuden tislattua vettä kahdesti päivässä (aamulla ja illalla) 3 päivän ajan. Kolmantena päivänä rotat pidettiin metabolisissa häkeissä annon jälkeen, ja virtsanäytteitä kerättiin jatkuvasti 24 tunnin ajan. Rotat nukutettiin käyttäen pentobarbitaalia ja verinäytteet otettiin ja kerättiin vatsa-aortasta ja sentrifugoitiin 3000 x g:llä (15 min, 4 °C) seerumin saamiseksi. Kaikki näytteet säilytettiin osoitteessa - 20. C. Lisäksi kohtu erotettiin, punnittiin ja tutkittiin käyttämällä 10 % formaliinia.

Histologinen analyysi

Kohdusta leikattiin sarja 5 mm paksuisia kudoksia. Kudosleikkeet upotettiin sitten parafiiniin, värjättiin H&E:llä rutiinimenetelmiä käyttäen ja tarkkailtiin optisella mikroskoopilla (BZ-9000; Keyence, Osaka, Japani). Kohdun epiteelisolujen korkeus mitattiin mikrometrillä mikroskoopin alla.

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA RINNOJEN KASVUA EDISTÄMÄÄN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Aineenvaihdunta

Aktiivihiilellä kuoritun seerumin valmistus

Erityinen nollaseerumi valmistettiin rotan seerumista, josta oli poistettu endogeeniset materiaalit käyttämällä aktiivihiilijauhetta. Rotan seerumiin (100 ml) lisättiin aktiivihiilijauhetta (6 g), jota ravisteltiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa ja sentrifugoitiin 4 °C:ssa. C ja 13 500 rpm 20 minuutin ajan. Supernatanttia muutettiin käyttämällä Millipore express PES -kalvoja (Merck Millipore, Ltd.), jotka oli kiinnitetty 20 ml:n ruiskuun seuraavassa järjestyksessä: 5 mm, 1,2 mm ja 0,45 mm. "Huvitettu" seerumi vahvistettiin olevan vapaa biomarkkereista LC-MS/MS:llä.

Vakioliuosten valmistus

L-tryptofaani (Try), L-kynureniini (Kyn), GSSG, N-fenyyliasetyyliglysiini (N-Phe), 5- HTP, L-leusiini (Leu), 5-HT ja kolihappo ( CA) varastoliuokset (1 mg ml- 1 ) valmistettiin käyttämällä 100 % metanolia. GSH valmistettiin pitoisuutena 0,5 mg ml - 1 10 mM NEM PBS -puskurissa ja säilytettiin - 40. C ruskeissa pulloissa. Kalibraattorit luotiin käyttämällä yhdistettyjä L-tryptofaania, L-kynureniinia, GSSG:tä, N-fenyyliasetyyliglysiiniä, 5-HTP:tä, L-leusiinia, 5-HT:ta, koolihappoa ja GSH-NEM:ää, jotka sarjalaimennettiin tislatulla aineella. vettä. L-fenyylialaniini-d5:n (d5-Phe) IS-kantaliuos valmistettiin 100-prosenttiseen metanoliin ja d5-Phe:n (10 ng ml- 1) työliuos valmistettiin. 100 % metanolissa ja säilytetty - 40. C.

Analyysin aikana derivatisointivaihe oli välttämätön GSH:n hajoamisen välttämiseksi, mikä paransi GSH:n havaitsemisen ja kvantifioinnin stabiilisuutta. GSH määritettiin NEM:n kanssa reagoinnin jälkeen.15,16 Edellisen raportin mukaan GSH:lle valittiin 50 mM NEM.

näytteen valmistus

Seeruminäytteitä varten näytteeseen (200 ml) lisättiin 10 mM NEM:ää (200 ml), sen jälkeen metanolia (1000 ml, joka sisälsi IS Phe-d5:tä 10 ng ml:ssa- 1) ja inkuboitiin 20 minuuttia { {9}}. C. Kun oli sentrifugoitu 4 °C:ssa ja 12 000 rpm 10 minuutin ajan, supernatantit (1000 ml) siirrettiin 2 ml:n sentriputkiin ja haihdutettiin kuiviin. Kuivattu jäännös liuotettiin uudelleen tislattuun veteen (100 ml) sen jälkeen, kun sitä oli sentrifugoitu 15 minuuttia 4 °C:ssa. C ja 13 500 rpm, ja 10 ml:n alikvootti supernatanttia injektoitiin analyysiä varten.

Virtsanäytteitä varten 100 ml näytettä laitettiin 2 ml:n putkeen ja jokaiseen virtsanäytteeseen lisättiin 1 tilavuus PBS:ää (m/v), joka sisälsi 50 mM NEM:ää. Sitten lisättiin metanolia (1000 ml, joka sisälsi IS:ää pitoisuudessa 10 ng ml - 1) ja näytettä inkuboitiin lämpötilassa - 20. C 20 minuuttia ja sentrifugoitiin sitten 12 000 rpm 10 minuuttia 4 °C:ssa. C. Supernatantti (1 000 ml) haihdutettiin kuiviin kevyessä typpivirrassa huoneenlämpötilassa, ja sitten jäännös liuotettiin 60 ml:aan liikkuvaa faasia ja vorteksoitiin 1 minuutin ajan ennen sentrifugointia nopeudella 13 500 rpm ja 4 . C 15 min. 10 ml:n alikvootti supernatantti injektoitiin analyysiä varten.

Metodologian validointi

Määrityksen validointi suoritettiin "Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation" (Food and Drug Administration, syyskuu 2013) mukaisesti. Kalibraattorit luotiin käyttämällä korvikematriisia Trp:lle, Kyn:lle, GSH:lle, GSSG:lle, 5-HT:lle, 5-HTP:lle, N-Phe:lle ja CA:lle standardeista työliuoksista "kuvioidussa" seerumissa. Jokainen konsentraatiokalibraattori kopioitiin. Standardikäyrä laskettiin 1/X painotetulla pienimmän neliösumman lineaarisella regressiolla standardikäyrän kalibraattorikonsentraatioista ja analyytin ja IS:n huippupinta-alasuhteista.

Tarkkuus- ja tarkkuustesti

Yhdistettyjen QC-näytteiden ja käsittelemättömien rotan seerumi/virtsa-QC-näytteiden määritystarkkuudet arvioitiin käyttämällä yhtä päivän sisäistä ja kolmea päivien välistä analyysiajoa. Kolmen eri pitoisuuden QC-näytteet tuotettiin lisäämällä L-tryptofaania, L-kynureniinia, GSSG:tä, N-fenyyliasetyyliglysiiniä, 5-HTP:tä, L-leusiinia, 5-HT:ta, koolihappoa ja GSH-NEM:ää. standardiliuoksia "riisutettuun" seerumiin/PBS:ään, jotka sitten käsiteltiin samalla tavalla kuin in vivo -näytteet. Kokeile, Kyn, GSSG, N-Phe, 5-HTP, 5-HT, Leu ja CA standardikantaliuokset (1 mg ml- 1) valmistettiin 10 0 % metanolia, paitsi GSH:ta, joka valmistettiin pitoisuudella 0,5 mg ml - 1 10 mM NEM PBS -puskurissa. Standardikäyrät kahdeksalla eri pitoisuudella muodostettiin samalla tavalla kuin QC-näytteet ja analysoitiin 1/X painotetulla pienimmän neliösumman lineaarisella regressiolla. Menetelmän validointitutkimusta varten suoritettiin toinen laadunvalvontamenetelmä samanaikaisesti käyttämällä yhdistettyä seerumia/virtsaa (50 ml) jokaisesta kontrolli- tai malliryhmän näytteestä QC-näytteen saamiseksi ja prosessoitiin sitten in vivo -näytteinä. Jokaista 50 eläinnäytettä kohti ajettiin sarja QC-näytteitä ja standardikäyriä.

Matriisiefektit

Matriisivariaatio, joka määritellään vaihteluksi määrityksen tarkkuudessa eri matriisierien osalta, arvioitiin käyttämällä kuutta erilaista rotan seerumi/virtsakuvaajaa analysointia varten ja piikkien saannon arvioinnissa.17 Koko matriisivaikutuksen arviointi endogeenisen yhdisteen määrityksessä on haastavaa. . Yksi tapa testata, onko määrityksellä (kokonais) matriisivaikutusta, on arvioida piikittynyt saanto. Piikkisaantotesti sisältää analyytin lisäämisen esiuuttonäytteisiin, mikä eroaa matriisitekijöiden (MF) testistä, joka sisältää analyytin lisäämisen uuton jälkeisiin näytteisiin.18 MF laskettiin analyytin piikin pinta-alaksi biologisen matriisin läsnäolo verrattuna siihen, jossa biologista matriisia ei ole. Käytettiin IS-normalisoitua MF:ää: MF ¼ piikin pinta-ala/IS-suhde matriisin läsnä ollessa vs. piikin pinta-ala/IS-suhde matriisin puuttuessa.

UPLC-MS/MS-analyysi

LC-MS:ssä käytettiin Waters X BridgeTM BEH C18 -analyyttisellä kolonnilla XP (2,5 mm, 30 × 100 mm; Waters, Torrance, CA) varustettuja MS-laitteita. /MS-analyysi. Lineaarista Q-liikkuvaa gradienttifaasia, joka koostui 0,1 % muurahaishappovedestä (liuotin A) ja metanolista (liuotin B), käytettiin seuraavan gradienttiohjelman mukaisesti: 0–3.0 min (0–1 % B); 3.0–10.0 min (1–3 % B); 10.0–14.0 min (3–50% B); 14.{40}}–18,0 min (50–95 % B); 18,0–22,0 min (95–0 % B), pysäytysaika on 25 min. Injektiotilavuus oli 10 ml ja nopeus 0,6 ml min{42}}. Lopullisessa menetelmässä käytettiin seuraavia parametreja: skannaustyyppi, MRM; ionimoodi, sähkösumutusionisaatio (ESI) positiivisissa ja negatiivisissa ionimoodissa; ionisuihkujännite, ± 4500 V; verhokaasu, 20; lämpötila 450 °C; ionilähdekaasu 1, 40; ionilähdekaasu 2, 40. Kaikki UPLC-MS-tiedot saatiin käyttämällä AB Analyst -ohjelmistoa (versio 1.6.2) ja m/z 171,1–125,2 sisäiselle standardille d5-Phe (DP, 63 V; CE) 8 V; CXP, 21 V, 24 V) ja yksityiskohtaiset MS-olosuhteet on esitetty taulukossa S1.

Tilastollinen analyysi

Kaikki arvot ilmaistiin keskiarvona ± SD. Ryhmien välisten erojen merkitystä verrattiin yksisuuntaisella ANOVA-testillä, jota seurasi Dunnettin testi käyttäen Statistical Package for Social Sciences -ohjelmaa (SPSS 20.0, Chicago, IL, USA). Tässä testissä merkitsevyyskynnys asetettiin arvoon p < 0,05.

tulokset ja keskustelu

GC:n vaikutus kohtuun

Kohdun painoa ja histologista analyysiä käytettiin arvioimaan GC:iden vaikutus kohtuun. Kohdun paino kasvoi merkittävästi dietyylistilbestroli-, GC- ja kontrolliryhmissä verrattuna nollaryhmään (P < {0}},01). Nollaryhmässä kohdun limakalvon epiteeli oli matala pylväsmäinen, ja siinä oli pieniä rauhasia, kuutiomainen rauhasepiteeli ja ilman interstitiaalisia tulehdussoluja. Dietyylistilbestroliryhmässä rauhasepiteeli ja endometriumi olivat korkean pylväsmäisiä ja osoittivat hyperplasiaa, jossa oli paljon interstitiaalisia tulehdussoluja. GC-ryhmässä rauhasepiteeli ja endometriumi olivat erittäin pylväsmäisiä sahalaitaisia ​​ja osoittivat hyperplasiaa, jossa oli paljon interstitiaalisia tulehdussoluja ja sisäkalvon paksuuntumista. Kontrolliryhmässä kohdun limakalvo oli korkea pylväsmäinen ja rauhasepiteeli matala pylväsmäinen, ja siinä oli vähän interstitiaalisia tulehdussoluja. Verrattuna nollaryhmään kohdun epiteelisolujen korkeus nousi merkittävästi muissa ryhmissä (P < 0,01) (kuvio 1).

Havaitun biomarkkerin validointimenetelmä UPLC-MS/MS:llä

Lineaarisuus ja kalibrointialue

Jokaista mittausta varten muodostettiin lineaarinen kalibrointikäyrä, jonka painotuskerroin oli 1/X tutkitussa matriisissa. Seerumin analyysien kalibrointikäyrät analysoitiin eri päivinä. Analyysien kalibrointialueet jaettiin seitsemään kalibrointipisteeseen taulukon 1 mukaisesti.

Tarkkuus ja täsmällisyys. Menetelmä osoittautui tarkkuuden ja tarkkuuden suhteen sopivaksi sekä päivän- että päivän sisällä kaikille tutkituille näytteille. Näiden parametrien arvot olivat alle 5 % GSH:n, GSSG:n, Leun, Trp:n, Kynin, 5-HTP:n, koolihapon, 5-HT:n ja N-fenyyliasetyyliglysiinin asetetuilla pitoisuuksilla kolmella toistolla. jokaisesta analysoidusta pitoisuudesta. Päivien välisiä ja päivän sisäisiä tarkkuuden arvoja vastaavat tiedot on esitetty ESI-taulukossa S2.

Matriisiefektit

Kuten ESI-taulukosta S3 näkyy†, ylimääräiset saannot olivat 92,5–118,1 %, kun lisättiin 1000 ng ml- 1 GSH:ta, 2000 ng ml- 1 GSSG:tä ja 1000 ng ml- 1 Leua. , 6000 ng ml- 1 Trp:tä, 50 ng ml- 1 Kynia, 2 ng ml- 1 5-HTP:tä, 400 ng ml- 1 koolihappoa , 8 ng ml- 1 5-HT:a ja 2500 ng ml- 1 N-fenyyliasetyyliglysiiniä kolmeen eri rotan seerumikuvaajaan, ja kun lisätään 100 ng ml- 1 GSH, 200 ng ml- 1 GSSG:tä, 1000 ng ml- 1 Leua, 6000 ng ml- 1 Trp:tä, 50 ng ml- 1 Kyn:ää, 2 ng ml{ {37}} 5-HTP:tä, 400 ng ml- 1 koolihappoa, 8 ng ml- 1 5-HT:a, 2500 ng ml- 1 N -fenyyliasetyyliglysiini kolmeen eri kuvaajaan rotan virtsasta erilaisilla lähtötasoilla. Näistä eristä mitattujen Trp- ja Kyn-pitoisuuksien CV:t olivat #10 % (n ¼ 5). Nämä tulokset osoittivat, että erilaiset matriisit eivät merkittävästi vaikuttaneet määritykseen.

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA KOHTUSyövän estämiseen PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Metaboliitin profiloinnin analyysi pseudokohdennetulla menetelmällä

Pseudotahdettua menetelmää käytettiin seerumin ja virtsan metaboliitin MRM-prolingin tutkimiseen neljässä ryhmässä (nolla, dietyylistilbestroli, kontrolli ja GC).

Ensinnäkin PCA-malli rakennettiin osoittamaan neljän ryhmän metabolista eroa. Monimuuttuja-analyysin perusteella GC-ryhmien (mukaan lukien dietyylistilbestroli- ja kontrolliryhmät) ja nollaryhmän välillä oli ilmeisiä metabolisia eroja. QC-näytteet ryhmittyivät tiukasti yhteen PCA:n pisteytyskäyrään, mikä osoitti, että järjestelmän stabiilius oli mukautuva tähän metabolomiikkatutkimukseen (kuvio 2).

Sitten kriittiseksi P-arvoksi asetettiin 0,05 merkittävästi erilaisille metaboliiteille tässä tutkimuksessa. Sen mukaisesti, kuten taulukosta 2 käy ilmi, nollakoeryhmään verrattuna erilaiset metaboliitit tunnistettiin alustavasti seuraavasti: 17 seeruminäytteistä ja

12 virtsanäytteissä GC-ryhmässä, 15 seeruminäytteissä ja 9 virtsanäytteissä dietyylistilbestroliryhmässä, 12 seeruminäytteissä ja 11 virtsanäytteissä kontrolliryhmässä ja 11 seeruminäytteissä ja 7 virtsanäytteissä, jotka olivat samanaikaisesti läsnä GC-, dietyylistilbestroli- ja kontrolliryhmissä. Eri ryhmien välisten aineenvaihdunnan erojen ymmärtämiseksi paremmin luotiin klusteroituva lämpökartta kaikille erilaisille metaboliiteille, joka osoittaa suhteellisen lisääntymisen (punainen) tai laskun (vihreä) (kuva 3).

Kahdeksantoista erilaista metaboliittia, jotka olivat samanaikaisesti läsnä GC-, dietyylistilbestroli- ja kontrolliryhmissä, kuvattiin seuraavasti:

seuraavat: glukoosi, sitruunahappo, proliini, betaiini, ornitiini, N-fenyyliasetyyliglysiini, fenyylipyruviinihappo, inosiini, C16:0LPC, kreatiniini ja ksantosiini seerumissa sekä bentseeniasetyyliglysiini, pyroglutamiinihappo, asetyylikarnitiini ja N6-asetyylilysiinin havaittiin vähentyneen virtsassa merkittävästi (P ​​< 0.05); kun taas tauriinin, ornitiinin, a-ketoglutaarihapon ja spermidiinin määrä virtsassa lisääntyi merkittävästi (P ​​< 0.05). Lisäksi tauriini (seerumi) lisääntyi merkittävästi, kun taas a-ketoglutaarihappo (seerumi), C18:0LPC (seerumi) ja betaiini (virtsa) vähenivät merkittävästi dietyylistilbestroli- ja GC-ryhmissä (P < {{ 19}}.05); L-kynureniini (seerumi) oli säädelty ylöspäin dietyylistilbestroliryhmässä, mutta alasäädelty GC-ryhmässä (P < 0,05); pyroglutamiinihappo (seerumi) ja proliini (virtsa) vähenivät, ja sitruunahappo (virtsa) ja nikotiiniamidi (virtsa) lisääntyivät huomattavasti kontrolli- ja GC-ryhmässä (P < 0,05); ja fenyylialaniini oli alasäädelty GC-ryhmässä (P < 0,05).

Tässä tutkimuksessa tutkittiin GC:iden vaikutuksia kehittymättömien rottien kohtuun. Kohtu on herkin elin kemikaalien ER-riippuvaisten vaikutusten määrittämisessä.Herba Cistancheson raportoitu lisäävän kohdun painoa tehostamalla hypotalamuksen-aivolisäkkeen-munasarjojen lutropiinia vapauttavaa toimintaa20, mikä havaittiin myös GC:iden osalta tässä tutkimuksessa. Tämä osoitti, että GC:illä on estrogeenin kaltaista aktiivisuutta. Viime aikoina raportit ovat keskittyneet pääasiassa vallitsevaan mekanismiin, jolla estrogeeniset vaikutukset ilmenevät sitoutumalla ER:iin,21–23, mutta metabolista mekanismia ei ole tutkittu perusteellisesti. Tässä tutkimuksessa käytettiin pseudometabolomiikkamenetelmää GC:iden estrogeenisen kaltaisen mekanismin tutkimiseen.

Peräkkäisten reaktioiden sarjan metaboliset välituotteet muuttuivat selvemmin kuin entsymaattinen kinetiikka tai yksilöllistyvät.24 Seerumissa on 17 metaboliittia, mukaan lukien glukoosi, sitruunahappo, tauriini, proliini, betaiini, ornitiini, pyroglutamiinihappo, a-ketoglutaarihappo, N- fenyyliasetyyliglysiini, fenyylipyruvaattihappo, inosiini, C18:0LPC, C16:0LPC,

kreatiniini, fenyylialaniini, L-kynureniini ja ksantosiini sekä 12 metaboliittia virtsassa, mukaan lukien bentseeniasetyyliglysiini, betaiini, tauriini, sitruunahappo, ornitiini, pyroglutamiinihappo, asetyylikarnitiini, N6-asetyylilysiini, a-nikotiiniglutiini hapon, spermidiinin ja proliinin havaittiin osallistuvan GC:iden estrogeenin kaltaiseen mekanismiin. Useat muuttuneet metaboliitit olivat erityisen kiinnostavia, koska niitä oli sekä seerumissa että virtsassa. Esimerkiksi sitruunahappo, joka muodostuu asetyylikoentsyymi A:n ja oksaloetikkahapon kondensaatiosta ja jolla on tärkeä rooli energia-aineenvaihduntaan liittyvässä sitruunahappokierrossa,25 säädeltiin alas GC-ryhmän seerumissa, mutta lisääntyi virtsassa. . Lisäksi a-ketoglutaarihappo, jossa on glutamiinihiilirunko, joka voi ylläpitää kokonaistyppitasapainoa ja edistää proteiinisynteesiä ja on sitruunahappokierron keskeinen materiaali, säädeltiin alas GC-ryhmän seerumissa, mutta lisääntyi. virtsassa.26 Sitruunahappokierto ei ole vain kolmen tärkeimmän ravintoaineen (hiilihydraatit, lipidit ja aminohapot) lopullinen aineenvaihduntareitti, vaan myös linkki sokerin, lipidien ja aminohappojen aineenvaihdunnan välillä ja tärkein tapa saada energiaa elimistölle.27,28 Tämä osoitti, että GC:iden estrogeenin kaltainen mekanismi liittyi energia-aineenvaihduntaan, joka on sama kuin dietyylistilbestroli. Siksi oli selvä yhteys sitruunahapposyklin ja kohdun painon nousun välillä GC:illä käsitellyillä epäkypsillä rotilla. Tärkeänä metyyliluovuttajana betaiinilla on tärkeä rooli sikiön kasvussa ja kehityksessä, mikä osoittaa, että betaiini osallistuu kohdun painon nousuun.29 Mielenkiintoista on, että tauriini säätyi sekä seerumissa että virtsassa, mikä saattoi edistää lipidien sulamista ja imeytymistä. ja glukoosin soluunottoa ja käyttöä edistämällä glukoosin aineenvaihduntaa. Tauriinin puutteen on myös raportoitu johtavan painon laskuun nuorilla eläimillä, mikä viittaa siihen, että tauriinilla on tärkeä rooli kasvussa ja kehityksessä.30 Lisäksi GC:iden betaiinin ja tauriinin säätelyvaikutus seurasi samaa suuntausta käytettäessä dietyylistilbestrolia, mutta tehostettuna. verrattuna dietyylistilbestroliin.

Lisäksi monet aminohapot muuttuivat merkittävästi. Tuloksemme viittaavat siihen, että GC:t aiheuttivat aineenvaihdunnan poikkeavuuksia aminohapoissa. Aminohappometaboliaa voitaisiin käyttää spesifisten proteiinien, peptidien ja muiden typpipitoisten yhdisteiden synteesiin tai dekarboksylaatioon deaminaatiolla, transaminaatiolla, yhdistettynä ammoniakin hajotukseen tai energian vapauttamiseen sitruunahappokierron kautta.31,32 Siksi näiden muutokset yhdisteet voivat olla mukana tärkeissä signalointitapahtumissa, jotka laukaisevat kohdun painon nousun.

Lisäksi yksityiskohtaista reittianalyysiä varten erilaiset metaboliitit luokiteltiin useisiin pääreitteihin, mukaan lukien sitraattisykli (TCA-sykli), glutationin aineenvaihdunta,

arginiinin ja proliinin aineenvaihdunta, D-glutamiini- ja D-glutamaattiaineenvaihdunta, fenyylialaniinin, tyrosiinin ja tryptofaanin biosynteesi, fenyylialaniinin aineenvaihdunta ja muut reitit käyttämällä Pathway Analysis of MetaboAnalyst -ohjelmistoa (http://www.metaboanalyst.ca), kuten kuvassa. Kuvassa 4. Energia-aineenvaihduntaan liittyvä reitti, mukaan lukien TCA-sykli ja glutationin aineenvaihdunta (sekä seerumissa että virtsassa), oli yksi estrogeenisten vaikutusten pääkohteista. Estrogeenisten kemikaalien kriittisen roolin energia-aineenvaihdunnassa vahvistivat ER:t, jotka säätelevät mitokondrioiden toimintaan tarvittavia geenejä, TCA-sykliä ja paljon muuta aiempien tutkimusten mukaan.33,34 Voidaan päätellä, että GC:iden estrogeenin kaltainen mekanismi oli samanlainen. dietyylistilbestrolin vastaavaan, ja molemmat liittyvät jossain määrin TCA-kiertoon ja glutationin aineenvaihduntaan, mutta GC:t toimivat paremmin kuin dietyylistilbestroli.

Vaikka mahdollisia mekanismeja ei voitu selvittää tässä tutkimuksessa, valittiin joitain metaboliitteja, joita voitaisiin käyttää tulevaisuudessa kohdun GC:iden muiden estrogeenisten mekanismien tutkimiseen. Siksi mekanismin paremmin tutkimiseksi tulevassa tutkimuksessa sovelletaan muita teknologioita, kuten proteomiikkaa.

Johtopäätökset

Yhteenvetona voidaan todeta, että UPLC-QTRAP MS:ään perustuva seerumin ja virtsan pseudosäädetty metabolomiikkamenetelmä perustettiin GC:iden estrogeenisiä kaltaisia ​​mekanismeja varten, mikä antoi vankkoja ja luotettavia tuloksia. Käyttämällä vakiintunutta näennäiskohdistettua lähestymistapaa paljastettiin kokonaisvaltainen näkemys estrogeenisen kaltaisen mekanismin (GC) seerumin ja virtsan metabolomiikan muutoksista.

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA SEKSUAALISTEN TOIMINTOJEN PARANTAMISEEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%