Pienet mutta mahtavat – eksosomit, uudet solujenväliset sanansaattajat neurodegeneraatiossa, osa 1

Yksinkertainen yhteenveto:

Eksosomit ovat biologisia nanopartikkeleita, jotka on äskettäin tunnistettu solujenvälisiksi lähettiläiksi. Ne sisältävät runsaasti lipidejä, proteiineja ja RNA:ta. Ne voivat siirtää sisältönsä paitsi lähistöllä oleviin soluihin myös etäällä oleviin soluihin.

Eksosomit ovat äskettäin löydetty solujen välinen viestintäväline, joka voi vapauttaa pieniä ja herkkiä rakkuloita ympäröiviin soluihin ja kuljettaa joitain proteiineja, signaaliaineita ja muita aineita ympäröiviin soluihin. Nämä aineet voivat auttaa soluja muuttamaan tilaansa ja jopa vaikuttaa muiden solujen kasvuun, kehitykseen, aineenvaihduntaan ja muihin näkökohtiin. Viime vuosina tutkimukset ovat osoittaneet, että eksosomeilla on tärkeä rooli ihmisen aivojen toiminnassa, erityisesti muistin ylläpitämisessä ja parantamisessa.

Ensinnäkin eksosomit voivat edistää signaalin siirtoa hermosolujen välillä. Hermosolujen välinen tiedonsiirto on yksi hermoston normaalin toiminnan välttämättömistä edellytyksistä, ja eksosomit toimivat sanansaattajina, mikä voi tehdä tiedonsiirrosta hermosolujen välillä sujuvampaa ja siten parantaa aivojen kognitiota ja muistia.

Toiseksi, eksosomit voivat myös säädellä neuronien aineenvaihduntaa. Eksosomeja tuottavien ja vapauttavien neuronien prosessissa on mukana suuri määrä aineenvaihduntaprosesseja, mikä edistää solujen aineenvaihdunnan tasapainoa ja säätelyä. Nämä prosessit voivat paitsi parantaa neuronien kykyä auttaa myös poistamaan aineenvaihduntajätteitä ja haitallisia molekyylejä ja pitämään aivosolut terveinä.

Lopuksi, eksosomit voivat myös auttaa hermosoluja korjaamaan vaurioita. Monet eksosomien kuljettamat proteiinit ja nukleiinihapot ovat hyödyllisiä solujen kasvulle, korjaamiselle ja uusiutumiselle, ja ne voivat edistää hermosolujen korjausta ja uusiutumista, mikä parantaa aivosolujen selviytymiskykyä ja vahvistaa muistikeskuksia ja kognitiivisia kykyjä.

Yhteenvetona voidaan todeta, että eksosomien ja muistin välillä on läheinen suhde. Voimme muuttaa lasten muistia aloittamalla ruokavaliosta. Lasten ruokavalion rakenteen aktiivinen ohjaaminen ja enemmän hyödyllisiä ainesosia, kuten rasvahappoja, proteiineja ja vitamiineja sisältävien elintarvikkeiden syöminen voi edistää eksosomien tuotantoa ja vapautumista, mikä auttaa lapsia parantamaan oppimis- ja muistikykyään. Lapsille voidaan myös tarjota aivoharjoittelupelejä ja harjoituksia, jotka haastavat ja harjoittelevat heidän ajatteluaan, stimuloivat eksosomien potentiaalia ja näyttelevät paremman roolin. Voidaan nähdä, että meidän on parannettava muistia, ja Cistanche voi parantaa muistia merkittävästi, koska Cistanche on perinteinen kiinalainen lääkeaine, jolla on monia ainutlaatuisia vaikutuksia, joista yksi on parantaa muistia. Cistanchen teho perustuu sen sisältämiin erilaisiin vaikuttaviin ainesosiin, mukaan lukien tanniinihappo, polysakkaridit, flavonoidiglykosidit jne. Nämä ainesosat voivat edistää aivojen terveyttä monin tavoin.

Napsauta Know-painiketta parantaaksesi lyhytaikaista muistia

Tämä ainutlaatuinen kyky antaa heille mahdollisuuden muokata vastaanottajasolujen fysiologiaa. Aivoissa eksosomeilla on rooli neurodegeneratiivisissa sairauksissa, kuten Alzheimerin taudissa, Parkinsonin taudissa ja amyotrofisessa lateraaliskleroosissa.

Abstrakti:

Endosomaalista alkuperää olevat eksosomit ovat yksi ekstrasellulaaristen rakkuloiden luokka, jotka ovat tärkeitä solujen välisessä kommunikaatiossa. Kaikki kehomme solut vapauttavat eksosomeja, ja niiden lipideistä, proteiineista ja nukleiinihapoista koostuvalla kuormalla on jalanjälki, joka heijastaa niiden vanhempien alkuperää.

Eksosomaalisella lastilla on kyky moduloida vastaanottajasolujen fysiologiaa vapauttavien solujen tai solujen läheisyydessä. Eksosomien potentiaalin hyödyntäminen riippuu eksosomien valmistuksen puhtaudesta.

Tästä syystä on kehitetty monia eristysmenetelmiä, ja tarjoamme tiiviin yhteenvedon useista menetelmistä. Huolimatta veri-aivoesteen aiheuttamasta eristäytymisestä, keskushermoston solut eivät ole immuuneja eksosomaalisille tunkeutuville vaikutuksille. Sekä neuronit että gliarvapauttuvat eksosomeja, usein aktiivisuudesta riippuvaisella tavalla.

Tarjotaan lyhyt kuvaus aivojen eri solujen vapauttamista eksosomeista ja niiden roolista keskushermoston homeostaasin ylläpitämisessä. Useiden neurodegeneratiivisten sairauksien tunnusmerkki on proteiiniaggregaattien kerääntyminen. Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat eksosomien solujen väliseen kommunikaattorirooliin väärin laskostuneiden proteiinien leviämisessä, mikä viittaa patologian leviämiseen.

Tässä katsauksessa keskustelemme eksosomien mahdollisista vaikutuksista Alzheimerin taudin, Parkinsonin taudin ja amyotrofisen lateraaliskleroosin etenemiseen.

Eksosomien panoksen ymmärtäminen neurodegeneraation patogeneesissä avaa kentän eksosomien käyttämiselle terapeuttisina aineina lääkkeiden toimittamiseen aivoihin, koska eksosomit ylittävät veri-aivoesteen.

Avainsanat: eksosomit; neuronit; gliasolut; keskushermosto (CNS); neurodegeneratiiviset sairaudet;Alzheimerin tauti; Parkinsonin tauti; amyotrofinen lateraaliskleroosi.

1. Johdanto ja historiallinen näkökulma

Solujen välinen viestintä on erittäin kiinnostavaa alkion kehityksen, epiteelin regeneraation/korvauksen, gametogeneesin ja homeostaasin ylläpitämisen kannalta.

Useita solujen välisiä kommunikaatiomekanismeja, kuten endosytoosi/eksosytoosi ja ulkonevien sytoplasmisten rakkuloiden nielaiseminen, tunnistettiin käyttämällä ultrarakenne- ja biokemiallisia tutkimuksia [1–3]. Toinen pelaaja, solunulkoiset rakkulat, tunnistettiin, mutta niiden roolia solujen välisessä viestinnässä ei arvostettu heti [4].

Solunulkoisia rakkuloita löydettiin satunnaisesti, kun tutkittiin plasmakalvoon liittyvien entsyymien, ekto-ATPaasin ja ekto-50-nukleotidaasin vapautumista soluviljelyalustaan. Vuonna 1981 Tramsandin työtoverit viljelivät normaaleja ja neoplastisia hiiristä ja ihmisistä peräisin olevia solulinjoja seerumittomassa alustassa, koska seerumin tiedettiin olevan ATPaasin ja 50-nukleotidaasin katalyyttinen aktiivisuus.

Kelluvien solujen ja roskien poistamisen jälkeen käsiteltyä väliainetta sentrifugoitiin nopeudella 310,000 × g 90 minuuttia Spinco Ti-70 -roottorissa ja pelletit tutkittiin elektronimikroskoopilla. Kaksi ekstrasellulaaristen kalvovaipallisten vesikkeleiden populaatiota löydettiin, toisen, jonka keskimääräinen halkaisija oli 500 - 1000 nm, ja toisen, pienemmän populaation, jonka halkaisija oli ~ 40 nm.

Nämä rakkulat, joita kirjoittajat kuvasivat alun perin "kuoriutuneiksi vesikkeleiksi", sisälsivät sekä 50-50-nukleotidaasi- että ATPaasientsymaattista aktiivisuutta. Lisäksi kuoritut vesikkelit sisälsivät RNA:ta ja fosfolipidejä, jotka erosivat alkuperäisestä solusta ja vastaavasti alkuperäisestä plasmakalvosta.

C6-glioomasoluista kuoriutuneiden rakkuloiden inkubointi 32P-esileimattujen neuroblastoomasolujen kanssa stimuloi neuroblastoomaproteiinien defosforylaatiota ja samalla vapaan radioleimatun fosforin (32P) vapautumista.

Nämä tiedot osoittivat, että kuoritut rakkulat eivät olleet vain solujätteen (entsyymien) kantajia, vaan niillä oli fysiologinen tehtävä. Tram ja kollegat loivat termin eksosomit kuvaamaan "kuoriutuneita rakkuloita" [5] (katso solunulkoisten rakkuloiden historiaa käsittelevä artikkeli [6] ennen vuotta 1981). Muutama vuosi myöhemmin kaksi tutkimusryhmää tutki itsenäisesti transferriinireseptorin kohtaloa retikulosyyteissä elektronimikroskopialla [7–9].

Kypsyvät retikulosyytit eivät vaadi transferriiniä, joten ne menettävät transferriinireseptoreita. Molemmat ryhmät havaitsivat, että viljellyt retikulosyytit vapauttivat pieniä rakkuloita, joiden halkaisija oli ~ 50 nm, solunulkoiseen tilaan.

Nämä pienet rakkulat sisälsivät hajoamattomia transferriinireseptoreita. Vuonna 1987 Johnston ja työtoverit käyttivät termiä eksosomit kuvaamaan pieniä rakkuloita, jotka sisälsivät transferriinireseptoreita [10]. Näiden alkuvuosien jälkeen eksosomien potentiaali toteutui uusina solujenvälisinä lähettiinä, jotka voivat muuttaa kohdesolujen fysiologiaa.

Mielenkiintoista on, että eksosomien synty alkaa endosytoosilla (prosessi tunnistettiin vuonna 1883; tarkasteli [3]) ja eksosomien vapautuminen solunsisäiseen tilaan käyttää eksosytoosiprosessia. Niiden alkuperäisen löydön jälkeen tiedämme, että eksosomit ovat solunulkoisten rakkuloiden alatyyppiä. endosyyttistä alkuperää, joiden halkaisija on 40–160 nm [11].

Merkkiainetutkimukset osoittivat, että makromolekyylit endosytooituvat harjaspäällysteisissä (eli klatriinilla päällystetyissä) invaginaatioissa tai kuoppissa solun pinnalla. Nämä invaginaatiot eroavat lopulta plasmakalvosta ja havaitaan sytoplasmassa.

Harjasten (eli klatriinin) menettämisen jälkeen endosytosoidut päällystetyt vesikkelit muuttuvat sileiksi ja fuusioituvat varhaisten endosomien kanssa joko kierrättääkseen nopeasti takaisin solun pintaan (kierrättää endosomeja kuvassa 1) [12] tai kypsyäkseen myöhäisten endosomien muodostamiseksi.

Varhaiset ja myöhäiset endosomit toimivat "lajittelukeskittyminä" ohjaamaan sisältöään asianmukaisesti: (i) retrogradiseen kuljetukseen trans-Golgi-verkkoon (eli endosomista TGN:ään hakemiseen) [13,14]; (ii) lysosomeihin makromolekyylien hajottamiseksi yksinkertaisiksi tuotteiksi uudelleenkäytettäväksi solussa [15,16]; ja/tai (iii) kierrätettäväksi solun pinnalle monivesikulaaristen kappaleiden kautta [17].

Varhaisten endosomien kypsyessä endosomeihin sisäinen endosomin kalvo invaginoituu, mikä johtaa intraluminaalisten rakkuloiden muodostumiseen (nykyisin nimitetään eksosomeiksi). Spesifiset makromolekyylit, kuten sytosoliset proteiinit, nukleiinihapot ja lipidit, lajitellaan kehittyviin eksosomeihin.

Myöhäiset endosomit, jotka ovat täynnä eksosomeja, tunnistetaan monivesikulaariseksi kappaleeksi, joka kulkeutuu kohti plasmakalvoa. Fuusiossa plasmakalvon kanssa multivesikulaariset kappaleet vapauttavat eksosomeja solunulkoiseen tilaan eksosytoosiprosessin kautta (kuva 1) [18,19]. Suuri osa proteiineista, jotka rekrytoidaan peräkkäin, on ratkaisevassa prosessissa endosytoosissa varhaisiin endosomeihin, endosomien kypsymiseen myöhäisiin endosomeihin ja niiden myöhempään solunsisäiseen kohtaloon (tarkastelu [17, 18, 20]).

Näiden proteiinien tärkeyttä korostaa niiden menetys ja/tai mutaatio(t), jotka aiheuttavat erilaisia ​​sairauksia. Esimerkiksi Strumpellin- ja SWIP-proteiinit ovat osa WASH-kompleksia, joka osallistuu aktiinin polymerointiin sekä endosomien fissioon ja lajitteluun. Strumpellin-geenin mutaatiot aiheuttavat perinnöllistä spastista paraplegiaa, jolle on ominaista motoristen hermosolujen rappeutuminen [21].

Yksittäinen pistemutaatio (Pro1019Arg) SWIP-proteiinissa destabiloi WASH-kompleksin. Destabiloitu WASH-kompleksi estää endolysosomaalista ihmiskauppaa aiheuttaen endosomien paakkuuntumista. Viallinen endosomaalinen liikenne vaikuttaa kognitioon ja motoristen neuronien toimintaan, ja oireita kuvataan ei-syndroomaksi henkiseksi jälkeenjääneeksi [22,23].

Sytoplasmassa eksosomit ovat peräisin endosomeista, jotka käyttävät kuljetukseen tarvittavia endosomaalisia lajittelukomplekseja (ESCRT), joka tunnetaan myös ESCRT-riippuvaisena eksosomien biogeneesin mekanismina (tarkastelu [18,20]).

Kaksi ryhmää ilmoitti itsenäisesti lipidivälitteisestä eksosomien biogeneesistä, joka on ESCRT-riippumaton mekanismi. Kaksi näissä tutkimuksissa tunnistettua lipidiä olivat bis(monoasyyliglysero)fosfaatti/lysobisfosfatidihappo (BMP/LBPA) ja keramidi [29,30].

Rab31 on toinen ESCRT-riippumaton mekanismi eksosomien biogeneesille sytoplasmassa. Rab31:n aktivaatio stimuloi intraluminaalisten vesikkeleiden muodostumista [31]. On toinenkin mekanismi, josta ei ole tällä hetkellä keskusteltu ja jota ei ole tutkittu.

Tämä mekanismi perustuu 1950-luvun lopulla - 1970-luvulla tehtyihin ultrarakenteisiin havaintoihin, jotka osoittivat, että soluytimet voivat olla pienillä vesikkeleillä täynnä olevien monivesikulaaristen kappaleiden alkuperäpaikka. Näissä tutkimuksissa kuvatut pienet rakkulat olivat ehkä eksosomeja, mutta termiä eksosomi ei tuolloin keksitty. Kilarski ja Jasinski havainnoivat prosessia, jota kutsutaan nukleaariseksi blebbingiksi tai ydinpursotukseksi ahvenkalan Perca fluviatilis L.:n uimarakon soluissa (kuva 2a) [24], jonka sisältö on samanlainen kuin nucleolarkaryoplasma [32].

Nämä kirjoittajat huomauttivat, että ytimen verenvuotoa voidaan stimuloida poistamalla kaasua ahvenen kalojen uimarakosta [24]. Tuman blobbing-prosessilla näyttää olevan ansioita nukleiinihapoilla ja/tai ribonukleoproteiinilla rikastettujen eksosomien alkuperäpaikkana.

Tumarakkulat täytettiin pienillä vesikkeleillä, jotka syntyivät ydinrakkuloiden sisäisen kalvon yksittäislaskostuksista (kuva 2b), prosessi, joka muistuttaa intraluminaalisten rakkuloiden muodostumista endosomeissa. "Pienillä vesikkeleillä" täytetyt ydinrakkulat erottuivat lopulta ytimistä tullakseen osaksi sytoplasmaa (kuva 2c).

Kilarski ja Jasinski viittasivat ydinrakkuloihin käsikirjoituksessaan multivesikulaarisina kappaleina paremman terminologian puutteen vuoksi. Epähuomiossa nämä kirjoittajat saattoivat olla oikeassa, koska myöhemmät tutkimukset raportoivat multivesikulaaristen kappaleiden esiintymisestä solujen ytimissä [33]. Pienillä vesikkeleillä täytetyillä tumarakkuloilla on morfologia, joka on samanlainen kuin sytoplasman endosomeista peräisin olevilla multivesikulaarisilla kappaleilla (kuvat 1 ja 2).

Koska nukleaariset multivesikulaariset kappaleet ovat samankaltaisia ​​viruksen nukleokapsidin kanssa, tutkijat kiinnittivät huomionsa virologiaan, ja tuman blobbing-ilmiö ja sen solutoiminto jäivät tutkimatta [34].

Biogeneesin tavasta riippumatta eksosomit koostuvat alipidikaksoiskerroksesta ja sisältävät makromolekyylisisältöä, joka koostuu lipideistä, proteiineista ja nukleiinihapoista.

Jotkut makromolekyyleistä ovat yhteisiä kaikista soluista peräisin oleville eksosomeille, ja siksi ne luokitellaan eksosomimarkkereiksi ja niitä käytetään varmistustyökaluna erottamaan eksosomit muista solunulkoisista rakkuloista. Ainutlaatuiset makromolekyylit, joita esiintyy eksosomissa, heijastavat niiden vanhempia, ja siksi ne todennäköisesti nimetään biomarkkeriksi.

Kaikki solut vapauttavat eksosomeja solunulkoiseen tilaan. Eksosomit löytävät tiensä solunulkoisesta tilasta erilaisiin biologisiin nesteisiin ja saavuttavat solut paikallisesti ja etäältä. In vitro viljellyt solut vapauttavat eksosominsa viljelyalustaan. Eksosomien jatkuva vapautuminen solunulkoiseen tilaan tekee elatusaineesta ja biologisista nesteistä rikkaan lähteen eksosomien eristämiseen.

Eksosomit sisältävät huomattavan määrän koodaavia ja ei-koodaavia RNA:ita, kaksijuosteisia genomisia DNA-fragmentteja ja mitokondrio-DNA:ta. Trams ja kollegat olivat ensimmäisiä, jotka kuvasivat RNA:n esiintymistä "kuoriutuneissa vesikkeleissä", eksosomien ja mikrovesikkelien sekoituksessa.

He selvittivät, että "kuoritut vesikkelit tai eksosomit" sisältävät 5 % RNA:ta [5]. Valadi ja kollegat olivat ensimmäisiä, jotka analysoivat systemaattisesti RNA-pakattuja ineksosomeja. Eksosomaaliset RNA:t sisälsivät translatoituvia mRNA:ita ja mikroRNA:ita (miR) [35].

MikroRNA:t ovat luokka ei-koodaavia RNA:ita (ncRNA). Ne ovat pituudeltaan ~22 nukleotidia ja säätelevät geenin ilmentymistä transkription jälkeisellä tasolla sitoutumalla 30-transloitumattomiin alueisiinsa kohdelähetti-RNA:issaan [36]. Mielenkiintoista on, että joitain eksosomeilla rikastettuja miRNA:ita ei havaita emosoluissa, mikä viittaa selektiiviseen RNA:n lajittelu-/pakkausjärjestelmään eksosomien biogeneesin aikana [35,37].

Toisin kuin solut, eksosomit sisältävät vähän tai ei ollenkaan ribosomaalista RNA:ta, mutta sisältävät tRNA-fragmentteja [38]. RNA:n lajittelu eksosomeihin riippuu (1) RNA-indusoidusta vaimennuskompleksiin (RISC) liittyvästä proteiinista, (2) RNA-sekvenssimotiiveista ja ohjausproteiineista, (3) nukleotidilisäyksistä miRNA:iden 30. päässä, (4) miRNA:iden saatavuudesta soluihin ja (5) keramidi [39,40].

Uskomme, että tuman blebbing on toinen soluprosessi, joka mahdollistaa RNA:n, RNA-proteiinikompleksien ja genomisen DNA:n differentiaalisen lajittelun eksosomeiksi. Tälle näkemykselle on useita syitä: (1) "intraluminaalisten vesikkelien" sisältö oli samanlainen kuin nukleolaarisessa karyoplasmassa [32]. "vesikkelit" ydinmultivesikulaarisissa kappaleissa (MVB II) rikastuivat RNA:lla, happamilla ja emäksisillä proteiineilla, ja siksi kirjoittajat katsoivat " intraluminaaliset vesikkelit" RNA-synteesikohtana tonucleoluksen lisäksi [41].

Proteins present in the vesicles may have been RNA-binding proteins and Dicer1 that were detected in exosomes [42] (unpublished data, Kumari Lab, Kansas State University, Manhattan, KS, USA). (2) Considering the nucleus as a site of exosome biogenesis can explain the presence of RNAs including precursor miRNAs (unpublished data, Kumari Lab) and double-stranded genomic DNA fragments ranging from 100 bp to >10 kbin:n eksosomit [43–47].

Muuten, genominen DNA havaittiin vain syöpäsolulinjoista johdetuista eksosomeista, ei normaaleista soluista [47]. Syöpäsoluissa on epänormaalia kromatiinia, joka johtuu kromatiinin uudelleenjärjestelystä/translokaatiosta ja ehkä ploidisuudesta [48], joka voi aiheuttaa genomisen DNA:n fragmentoitumista syöpäsolujen ytimissä. Nämä DNA-fragmentit voidaan helposti liittää ytimissä kehittyviin MVB-tyypin II (ja eksosomeihin). (3) Kilarskin ja Jasinskin [24] kuvaama "pienten vesikkeleiden" biogeneesi tumarakkuloissa on samanlainen kuin intraluminaalisten vesikkelien muodostuminen sytoplasman myöhäisissä endosomeissa.

Uskomme vahvasti, että genomisen DNA:n esiintyminen eksosomeissa on patologista, ja siksi sen läsnäoloa eksosomeissa voidaan käyttää diagnostisena työkaluna epänormaalien (tai syöpä) solujen kehittymiseen kehossa. (4) Solujen vapauttamien eksosomien lukumäärän aktiivisuusriippuvainen lisääntyminen [49] on verrattavissa kaasusoluihin, jotka osoittivat lisääntynyttä tuman kuplimista, kun kaasua poistettiin ahvenen kalojen uimarakosta [24].

Viime aikoina mitokondrioproteiineja ja DNA:ta havaittiin joidenkin syöpäpotilaiden plasman eksosomeista, ja niiden esiintyminen liittyy syövän aggressiivisuuteen [50,51].

Mitokondrioiden hajoamista havaitaan usein rappeutuvissa soluissa [52,53]. Degeneroituvista mitokondrioista vapautuneet mitokondriaaliset kristallit voivat sisältyä monivesikulaarisiin kappaleisiin, ja ne ovat lopulta pakattuja ineksosomeja.

Tätä käsitystä tukevat ultrarakenteelliset kuvat ihmisen lymfoblastoidisoluista ja paviaanin eturauhasen acinin luumenista, joissa oli mitokondrioiden kidesolujen hajoamisesta johtuvia "mikrovesikkeleitä" (tai eksosomeja) [54].

Yllä olevan keskustelun ja sitä tukevan kokeellisen näytön perusteella ehdotamme, että eksosomien heterogeeninen luonne on peräisin multivesikulaaristen kappaleiden ja niihin liittyvien eksosomien biogeneesistä eri subsellulaarisissa paikoissa, eikä täysin sytoplasmassa nykyisen uskomme mukaan. Ehdotuksemme voi selittää eksosomien heterogeenisyyden. samoin kuin yhteensopimattomuus teoreettisten laskelmien ja kokeellisten tietojen välillä pienten RNA:iden tai proteiinimolekyylien lukumäärästä, jotka sisältyvät yhteen seerumista puhdistettuun eksosomiin [55].

Perustuen teoreettisiin laskelmiin, joissa käytettiin keskimääräistä eksosomin kokoa, Li ja kollegat ennustivat jokaisen eksosomin sisältävän noin 70–25 000 pientä RNA- tai proteiinimolekyyliä.

Heidän kokeelliset tiedot osoittivat kuitenkin yhden RNA-molekyylin läsnäolon eksosomipuhdistettua seerumia kohden [55]. Hypoteesimme vaatii lisätutkimusta nukleaaristen rakkuloiden, ydinmultivesikulaaristen kappaleiden ja RNA/ribonukleoproteiinia sisältävien eksosomien biogeneesin ydinmultivesikulaarisista kappaleista. Lipidit ovat tärkeä osa eksosomien kalvoja ja ne jakautuvat epäsymmetrisesti kahden eksosomin kalvolehden välillä. Lipidikoostumus eroaa emosolukalvon ja eksosomikalvon välillä.

Yleensä eksosomimembraaneihin rikastuneita lipidejä ovat sfingomyeliini, keramidi, kolesteroli- ja kolesterolirikkaat lipidilauttamikrodomeenit, gangliosidi GM3, desaturoituneet lipidit ja fosfatidyyliseriini [56–58]. Eksosomaaliset proteiinit koostuvat niistä, jotka ovat yhteisiä useimpien eksosproomien lisäksi ainutlaatuisina. tiettyyn emosoluun.

Kaikkien eksosomien proteiinipitoisuus on yleensä rikastettu kohdistus- ja fuusioproteiineja, kuten tetraspaniineja, integriineja, chaperoniproteiineja, esim. lämpösokkiproteiineja (Hsp60, Hsp70 ja Hsp90), pieniä HSP-membraaneja kuljettavia proteiineja, Rab-proteiineja, ARF GTPaaseja, anneksiineja ja proteiinit, jotka osallistuvat monivesikulaaristen kappaleiden muodostumiseen, kuten ALIX ja TSG101 [59].

Uusimmat tutkimukset viittaavat RNA:ta sitovien proteiinien esiintymiseen, jotka muodostavat RNA-proteiinikomplekseja eksosomeissa [38]. Useita soluprosesseja, jotka varmistavat proteiinien lataamisen eksosomeareihin, ovat (1) ESCRT-mekanismit proteiineille, joilla on tietyt translaation jälkeiset modifikaatiot, kuten ubikvitinaatio, Wnt-stimuloitu arginiinimetylaatio, hapetus, fosforylaatio, glykosylaatio ja sitrullinaatio; (2) chaperoni-välitteinen autofagia (CMA), joka perustuu lämpöshokin 71 kDa:n proteiinin (HSC70) ja KFERQ-motiivin omaavien proteiinien väliseen vuorovaikutukseen.

Kun HSC70 on sitoutunut proteiineihin KFERQ-motiivilla, proteiinit kohdistetaan multivesikulaarisiin kappaleisiin. Chaperoni-välitteinen autofagia toimii normaalisti lysosomien proteiinien hajottamiseksi. Uusimmat tiedot viittaavat siihen, että CMA:lla on rooli eksosomien vapautumisessa ja proteiiniaggregaattien eksosomivälitteisessä leviämisessä joissakin hermoston rappeutumissairauksissa [60–63].

Eksosomitutkimus on lisääntynyt eksponentiaalisesti 1990-luvulta lähtien, ja eksosomaalisista lastista on saatu paljon tietoa. Tietokannat on luotu tarjoamaan kokoelma eksosomaalista lastia, ennen kuin suurten tietokokonaisuuksien hallinta on liian vaikeaa.

Eksosomeista julkaistujen tietojen toistettavuus on toinen syy, koska useimmat laboratoriot käyttävät eri menetelmien muunnelmia, jotka on kehitetty eksosomien eristämiseen. Esimerkiksi Vesiclepediais on manuaalisesti kuratoitu kokoelma molekyylilastista (lipidit, RNA:t ja proteiinit), jotka tunnistetaan solunulkoisten rakkuloiden eri luokissa [64]. Vesiclepedia on arvokas resurssi tutkijoille.

Vesiclepedia-tietokanta on julkisesti saatavilla ja sen avulla käyttäjät voivat hakea ja ladata eksosomia lastitietoja käyttäjän syöttämien hakukriteerien perusteella. EV pedia, Exocarta, ExoRbase ja EV miRNA ovat lisätietokantoja, jotka luetteloivat eksosomaalisia proteiineja ja RNA:ta [64].

Tietokantoja ohjaavat yhteisön huomautukset. Näissä tietokannoissa kuratoidut tiedot saadaan eristämällä eksosomeja käyttämällä erilaisia ​​​​erotustekniikoita, jotka eivät sisälly tietokantaan.

Eksosomaalinen lastipitoisuus voi siis vaihdella käytetyn eristysmenetelmän mukaan, mikä aiheuttaa raportoitujen tulosten epäselvyyttä. Kokeellisen toistettavuuden ja läpinäkyvyyden parantamiseksi kehitettiin avoimen lähdekoodin tietokannan EV-TRACK-työkalusarja. EV-TRACK sisältää tiedot eksosomien valmistelusta ja eksosomien karakterisoinnista [65].

EV-TRACKin keskeinen ominaisuus on EV-METRIC, joka esittää kokeellisten parametrien raportoinnin prosentteina yhdeksän listan täytetyistä komponenteista [66]. EVTRACK-konsortio päätti näistä komponenteista, ja ne katsottiin tarpeellisiksi tiedon yksiselitteiseen tulkintaan ja kokeellisten tietojen kopioimiseen. Siksi EV-METRIC on suunniteltu auttamaan tutkijoita ja arvioijia tarjoamaan kattavan yleiskuvan tiedoista.

2. Nykyiset menetelmät eksosomin eristykseen

Eksosomit tarjoavat rikkaan resurssin biomarkkerien löytämiseen ja uusiin terapeuttisiin strategioihin, mukaan lukien regeneratiivinen lääketiede. Näiden tavoitteiden onnistumisen kannalta tärkeintä on puhtaiden eksosomien eristäminen toistettavalla menetelmällä.

Toiminnallisesti pätevien eksosomien eristäminen on erityisen kriittistä mahdollisille terapeuttisille sovelluksille. Eksosomit on puhdistettu erilaisista biologisista nesteistä, kuten verestä, plasmasta, aivo-selkäydinnesteestä, syljestä, virtsasta ja maidosta. Jokaisella biologisella nesteellä on erilaiset fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet, jotka on otettava huomioon ennen eksosomin eristämistä.

Joissakin tapauksissa erityiset varotoimenpiteet voivat olla tarpeen eksosomin eristämiseksi. Puhdistettujen eksosomien loppukäyttö on toinen determinantti, joka vaikuttaa eksosomien eristysmenetelmään.

Tähän mennessä on kehitetty useita eksosomien eristysmenetelmiä ja osa niistä perustuu eksosomien ominaisuuksiin, kuten niiden kokoon, tiheyteen, pintavaraukseen ja proteiineihin, jotka liittyvät eksosomin pintaan (kuva 3) [67].

Jotkut tällä hetkellä käytetyistä eksosomin eristysmenetelmistä on lueteltu taulukossa 1. Useimmat niistä eivät ole itsenäisiä menetelmiä ja vaativat aiempia näytteenoton jälkeisiä käsittelyvaiheita. Keskeisiä menetelmiä käsitellään lyhyesti alla.

Kuva 3. Yleisesti käytetyt menetelmät eksosomien eristämiseen ja niiden myöhempään sovellukseen. Useat tähän mennessä kehitetyt menetelmät eksosomien eristämiseen perustuvat niiden kelluvuustiheyteen, Kaavio 1, 13 ja 1,19 g/ml, ultrasentrifugointimenetelmää (UC) jalostettiin edelleen. eristää puhtaita eksosomien valmisteita niiden kelluvan tiheyden perusteella isopyknisellä ultrasentrifugoinnilla ylisukroosi- tai jodiksanolitiheysgradientilla (DG).

Korkean proteiinipitoisuuden poistamiseksi proteinurioissa ultrasentrifugointimenetelmä yhdistettiin kokoekskluusiokromatografiaan (SEC). Ultrasentrifugointimenetelmään liittyvät aikarajoitukset johtivat suodatusmenetelmän (UF) kehittämiseen.

Laimennettujen näytteiden, kuten elatusaineen ja virtsan, kuljettaminen nano- tai mikromembraanikonsentraattorin läpi mahdollisti eksosomien puhdistuksen. Kalvon tukkeutuminen ja huono eksosomaalisen proteiinin talteenotto teki tästä menetelmästä epäsuositun jatkosovelluksissa, kuten RNA:n eristämisessä ja suuritehoisissa sovelluksissa.

Toinen menetelmä, joka on kehitetty eksosomien eristämiseen erittäin laimeasta biologisesta nesteestä johtuvasta hydrostaattisesta suodatusdialyysistä (HFD*) yhdistettynä sentrifugointiin. HFD-menetelmässä näyte dialysoidaan dialyysikalvon läpi, jonka molekyylipainon raja on 1000 kDa, hydrostaattisessa paineessa, jolloin ei-toivotut makromolekyylit voidaan poistaa näytteestä ja eksosomit otetaan talteen sentrifugoimalla.

Liukoisuuteen tai dispergoituvuuteen ja aggregaatioon perustuva eksosomisaostusmenetelmä kehitettiin useiden näytteiden käsittelemiseksi samanaikaisesti. Tähän strategiaan perustuvat kaupalliset eksosomien puhdistussarjat.

Tässä menetelmässä virtsan oraskites sekoitetaan polyetyleeniglykolin (PEG) 6000 kanssa tai yhdessä protamiinin kanssa (plus PEG35 000) ja inkuboidaan joko yön yli tai 1 tunti jäillä.

Tuloksena oleva samea seos sentrifugoidaan eksosomien talteen ottamiseksi, joita käytetään alavirran RNA- ja proteiinianalyyseihin. Muita eksosomien saostukseen käytettyjä reagensseja ovat (1) 0,1 M natriumasetaatti pH 4,75 (suolausmenetelmä) (NaAc), (2) 4-kertainen tilavuus kylmää asetonia (−20 ◦C) ( PROtein Organic Solvent Precipitation ja lyhennettynä PROSPR), (3) ja PEG:n ja dekstraaniliuoksen seos (jopa 1,5 %) (kaksivaiheinen menetelmä, joka mahdollistaa proteiinien erottamisen eksosomeista).

Eksosomaalisten pintaproteiinien tunnistaminen johti immunoaffiniteetin sieppauspohjaisten menetelmien kehittämiseen, joissa käytettiin vasta-aineita eksosomien pintaproteiineille, kuten Tim4, anneksiini, EpCAM, yhteinen eksosomin pintaproteiini, CD63 ja lämpösokkiproteiinit (affiniteettivuorovaikutus). Affiniteettia lektiiniin (joka sitoutuu eksosomien pinnalla oleviin glykoproteiineihin) ja hepariiniin (joka sitoutuu heparaanisulfaattiproteoglykaaneihin eksosomin pinnalla) käytettiin hyväksi kehitettäessä eksosomin eristysmenetelmiä.

Affiniteettipohjaisiin eksosomien puhdistusmenetelmiin käytettiin useita alustoja, kuten magneettihelmiä, erittäin huokoisia monoliittisia piidioksidimikrokärkiä, muovilevyjen pintaa, selluloosasuodattimia, kalvoaffiniteettisuodattimia, agarosesorbenttia ja mikrofluidilaitteita, ja niillä on erilaisia ​​ansioita käytettäessä diagnostiset, prognostiset, kuten lääkkeiden jakelujärjestelmät, sekä foreksosomaaliset lastin havaitseminen ja analyysit.

Mukautettu Konoshenko MY:n, Lekchnov EA:n, Vlassov AV:n, Laktionov PP:n luvalla. Solunulkoisten rakkuloiden eristäminen: Yleiset menetelmät ja viimeisimmät suuntaukset. Biomed Res Int. 2018 30. tammikuuta; 2018: 8545347. doi: 10.1155/2018/8545347. PMID: 29662902; PMCID:PMC5831698; Copyright © 2022 Maria Yu. Konoshenko et ai.

Tämä on avoimen pääsyn artikkeli, jota jaetaan Creative Commons Attribution License -lisenssillä, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja jäljentämisen missä tahansa välineessä edellyttäen, että alkuperäiseen teokseen viitataan asianmukaisesti [67].

For more information:1950477648nn@gmail.com