Ihon ikääntyminen on monimutkainen biologinen ilmiö, joka johtuu fysiologisesta vähenemisestä

Ota yhteyttäoscar.xiao@wecistanche.comLisätietoja

Abstrakti:Tämän tutkimuksen tavoitteena oli testata Washingtonia filiferan hedelmäuutteiden estovaikutusta ihon ikääntymiseen liittyviin entsyymeihin. Massauutteet eivät saaneet aikaan merkittävää entsyymi-inhibitiota, kun taas W.filiferan siemenuutteet osoittavat elastaasi-, kollagenaasi- ja antityrosinaasiaktiivisuuksia. Tyrosinaasi estyi lievästi, kun taas vahvempi vaikutus havaittiin elastaasin ja kollagenaasin estämisen suhteen. Alkoholiuutteet tuottivat parempia tuloksia kuin vesiuutteet. Niistä metanoliuutteet osoittivat merkittäviä entsyymejä estäviä aktiivisuuksia, koska elastaasin ja kollagenaasin IC5o-arvo oli vertailukelpoinen ja jopa parempi kuin vertailuyhdiste. Aktiivisimpien uutteiden estotapaa tutkittiin Lineweaver-Burk-kuvaajaanalyysillä. W.filiferan siemenuutteita tutkittiin myös niiden valolta suojaavan vaikutuksen suhteen Mansur-yhtälön avulla, ja W.filifera-uutteen antioksidanttiaktiivisuus arvioitiin hapetusstressissä olevissa soluissa. Uutteen turvallisuuden arvioimiseksi analysoitiin vaikutus ihmisen keratinosyyttisolujen solujen elinkelpoisuuteen.kadonnut empire cistancheMetanoliuute esitti parhaan valolta suojaavan vaikutuksen ja antioksidanttiaktiivisuuden solujärjestelmässä ilman sytotoksista vaikutusta. Yleiset tulokset osoittavat, että W.filifera-uutteet ovat lupaavia bioaktiivisten yhdisteiden lähteitä, joita voitaisiin käyttää kosmeettisissa ja farmaseuttisissa valmistuksessa.

Avainsanat:entsyymin esto; kollagenaasi; elastaasi; tyrosinaasi; kasviuutteet; siemenet; ihon ikääntyminen; Washingtonia filifera

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja

1. Esittely

Ihon ikääntyminen on monimutkainen biologinen ilmiö, joka johtuu ihon toimintojen fysiologisesta heikkenemisestä ja useista ulkoisista ympäristötekijöistä, kuten UV-säteilystä, kemikaaleista ja reaktiivisista happilajeista (ROS). Iho on kehon suurin ja altistuin osa, ja auringon UV-säteilylle altistuminen on yksi merkittävimmistä ulkoisista stressiä aiheuttavista tekijöistä: valon aiheuttama ihon ikääntyminen, joka liittyy oksidatiiviseen stressiin. UV-säteilyn indusoima ROS voi käynnistää monimutkaisia ​​molekyylireittejä, mukaan lukien entsyymien aktivaatio, jotka hajottavat solunulkoisen matriisin (ECM) proteiineja dermiksessä, mikä muuttaa ihon eheyttä [1]. Yksi ihon ikääntymisen tärkeimmistä ominaisuuksista on todellakin ECM:n rakenteen menetys, joka sisältää lukuisia proteiineja, mukaan lukien kollageenin ja elastiinin, joilla kaikilla on tärkeä rooli ihon kimmoisuuden säilyttämisessä [2]. ECM:n hajoaminen johtuu pääasiassa proteolyyttisten entsyymien, kuten kollagenaasin ja elastaasin, lisääntyneestä aktiivisuudesta. Näiden entsymaattisten aktiivisuuksien estäminen luonnollisilla kasviyhdisteillä saattaa olla lupaava lähestymistapa ihon ikääntymisen estämiseen [3]. Kollagenaasi (EC 3.4.24.3) kuuluu matriksin metalloproteinaasien perheeseen ja se voi hajottaa kollageenin kolmikierteisen alueen fysiologisissa olosuhteissa.mikronisoitu puhdistettu flavonoidifraktio 1000 mg käyttötarkoituksiaKollageeni on ECM:n kuitukomponentti ja ihmisen ihon tärkein rakenneproteiini, joka tarjoaa rakenteellista tukea luille, jänteille, nivelsiteille ja verisuonille. Elastaasi (EC3.4.21.36) on proteolyyttinen entsyymi, joka osallistuu elastiinin, ihon kimmoisuudesta vastaavan ECM-proteiinin, fysiologiseen hajoamiseen. Elastaasiaktiivisuuden lisääntymistä on havaittu useissa sairauksissa, kuten psoriaasissa, ihotulehduksessa, tulehdusprosesseissa ja ihon ennenaikaisessa ikääntymisessä, jotka liittyvät läheisesti ryppyjen muodostumiseen[4].

Cistanche voi estää ikääntymistä

Lisäksi yksi suurimmista ryppyihin liittyvistä muutoksista vanhuksilla on hyperpigmentoituneiden täplien ilmaantuminen, joka tunnetaan myös nimellä seniili lentigo tai ikäpisteet. Ne liittyvät suoraan epätasaiseen pigmentaatioon, joka johtuu toisen ikääntymiseen liittyvän entsyymin, tyrosinaasin, aktiivisuudesta. Tyrosinaasi (EC 1.14.18.1) on melaniinin aineenvaihdunnan nopeutta rajoittava entsyymi. Se katalysoi L-tyrosiinin hydroksylaatiota 3,4-dihydroksifenyylialaniiniksi (L-DOPA), jota seuraa L-DOPA:n hapettuminen dopakinoniksi. Dopakinonijohdannaisten oksidatiivinen polymerointi tuottaa melaniinia [5]. Melaniinipigmenttien synteesi on fysiologinen prosessi, jolla on ratkaiseva rooli UV-säteilyn aiheuttamien ihovaurioiden estämisessä absorboimalla UV-auringonvaloa. Eduistaan ​​huolimatta melaniinin liiallinen tuotanto tai epänormaali kertyminen aiheuttaa iho-ongelmia, kuten tyypillisiä ikäpisteitä. Koska iho on kehon näkyvin elin, ennenaikainen ryppyjen ilmaantuminen ja hyperpigmentaatio voivat aiheuttaa myös henkistä kärsimystä joillekin ihmisille.

Siten kaikkien edellä kuvattujen entsyymien estäjät voivat edustaa yhä tärkeämpiä ainesosia kosmetiikassa ja lääkkeissä ihon ikääntymisen estämiseksi [6]. Luonnolliset kasvituotteet voisivat olla lupaava bioaktiivisten yhdisteiden lähde. Erityisen mielenkiintoisia ikääntymistä ehkäiseville sovelluksille uutteilla on useita hyödyllisiä toimintoja, kuten ikääntymiseen liittyvien entsyymien esto ja kyky poistaa vapaita radikaaleja.

Aiemmassa työssämme kuvailimme W.filifera-siemenuutteiden antioksidanttikapasiteettia ja useita biologisia aktiivisuuksia [7]. Washington filifera (Lindl.) H. Wendl., joka tunnetaan yleisesti nimellä Kalifornian viuhkapalmu tai aavikon viuhkapalmu, on ikivihreä palmu, joka on kotoisin Etelä-Kaliforniasta, Arizonasta, Meksikosta ja aavikkoalueista.oteflavonoidiTämä 15-20 m korkea palmu ei tuota taateleita, mutta sillä on makeita ja maukkaita syötäviä hedelmiä. Näissä marjoissa on erittäin suuri, ruskea siemen, jota ympäröi ohut hedelmäliha (kuva 1). W.filiferaa on tutkittu liittyen esimerkiksi sen käyttöön mahdollisena uusien selluloosakuitujen lähteenä [8] ja sen hedelmien ravintoarvoon [9]; myös ilmaosien fenolikoostumus ja antioksidanttiaktiivisuus ovat raportoineet [10]. Aiemmassa tutkimuksessamme raportoimme W:n hyvästä antioksidanttiaktiivisuudesta.puritaanit c-vitamiinifilifera-siemenuutteet, jotka näyttivät olevan fenoli- ja flavonoidimolekyylien lähde[7]. Samat uutteet vaikuttivat estävästi ksantiinioksidaasi- ja koliiniesteraasientsyymeihin, jotka edustavat avainentsyymejä kihdin ja Alzheimerin taudin hoidossa.

Tämän työn tavoitteena oli laajentaa tämän kasvin karakterisointia ja arvioida sen uutteiden mahdollista käyttöä ikääntymistä estävänä aineena. Massa- ja siemenuutteita tutkittiin siksi niiden elastaasi-, kollagenaasi- ja tyrosinaasiaktiivisuutta estävän vaikutuksen suhteen, koska ne edustavat keskeisiä kohdeentsyymejä ihon valovanhenemisen ehkäisyssä ja hoidossa; Lisäksi W.filifera-uutteet, jotka osoittavat parhaita lupaavia aktiivisuuksia, analysoitiin niiden in vitro sytotoksisuuden, solujen antioksidanttiaktiivisuuden ja valolta suojaavien vaikutusten suhteen.

2. Tulokset ja keskustelu

2.1. Entsyymin esto

W. filifera -massa- ja siemenuutteet testattiin ensin pitoisuudella 50 ug/ml.SistancheKaikki massauutteet eivät saaneet aikaan merkittävää entsyymi-inhibitiota (tuloksia ei ole esitetty). Siemenuutteiden entsyymejä estävät aktiivisuudet laskettiin ja ilmaistiin puolimaksimaalisena estävänä konsentraationa (myös). Taulukossa 1 esitetään siemenuutteista saadut ICso-arvot verrattuna standardiinhibiittorien arvoihin näytteiden estovoimakkuuden arvioimiseksi. Kuten havaittiin, kaikki uutteet inhiboivat heikosti tyrosinaasiaktiivisuutta, ja ICso-arvot ovat korkeammat kuin standardin, kojiinihapon. Parempi esto havaittiin elastaasi- ja kollagenaasiaktiivisuuksia vastaan, ja etanoli- (EEG ja EES) ja metanoliuutteet (MEG ja MES) vaikuttivat parhaiten. Näiden näytteiden estoaktiivisuus elastaasia vastaan ​​oli samanlainen; ICso-arvot vaihtelivat välillä 10,75 - 19,75 ug/ml ja olivat verrattavissa positiivisen kontrollin (oleanolihapon; ICso=11,75 ug/ml) arvoihin.

Sen sijaan uutteet estivät voimakkaasti kollagenaasiaktiivisuutta, joka osoitti korkeampaa tehoa kuin standardi epigallokatekiinigallaatti, jolloin ICso oli jopa kolminkertainen positiiviseen kontrolliin verrattuna. Ottaen huomioon, että uutteet olivat useiden yhdisteiden seos, yksittäisten aktiivisten molekyylien pitoisuus oli jopa pienempi kuin IC50-arvo, mikä teki uutteista entistä lupaavampia inhiboivien yhdisteiden lähteitä.

2.2. Lineweaver-Burk Plotin kineettinen analyysi

Keskitimme huomiomme etanoliin ja metanoliuutteisiin tutkiaksemme näiden entsyymien estotapaa, koska niillä oli parempi vaikutus elastaasi- ja kollagenaasiaktiivisuutta vastaan. Eston kinetiikka määritettiin Lineweaver-Burk-kaksoiskäänteiskaaviolla. Määritykset suoritettiin nostamalla vastaavan substraatin konsentraatiota eri pitoisuuksilla olevien uutteiden poissa ollessa ja läsnä ollessa.

Taulukko 2 osoittaa, että EEG ja EES toimivat epäkilpailukykyisinä elastaasi-inhibiittoreina. Itse asiassa näiden uutteiden kineettinen analyysi tuotti sarjan rinnakkaisia ​​viivoja uutepitoisuuksien lisäämiseksi (kuvio 2A, B). Tämä kireettinen analyysi osoittaa, että nämä uutteet voivat sitoutua entsyymi-substraattikompleksiin. Tasapainovakio (Krs) laskettiin leikkaamalla uudelleen leikkauspisteet (1/Vmax) inhibiittoripitoisuuden funktiona, mikä johti arvoihin 3,91 ja 8,89 ug/ml EEG:lle ja EES:lle, vastaavasti. Metanoliuutteiden estotapa todellakin paljasti, että nämä uutteet toimivat ei-kilpailevina inhibiittoreina. Itse asiassa uutteiden pitoisuutta lisäämällä löydettiin perhe suoria viivoja, joilla oli eri kaltevuus ja jotka kaikki leikkaavat abskissalla (kuvio 2C, D). Tämä analyysi osoittaa, että uutteet voivat sitoutua entsyymi-substraattikompleksin lisäksi myös vapaaseen entsyymiin. Tasapainovakiot sitoutumiselle vapaaseen entsyymiin (Kj) ja entsyymi-substraattikompleksiin (Kis) saatiin joko kulmakertoimesta (Km/Vmax) tai 1/Vmax-arvoista (y-leikkauspisteet), jotka on piirretty estäjäpitoisuuden funktiona, vastaavasti.Lopuksi kollagenaasin kineettinen käyttäytyminen eri uutteiden pitoisuuksilla on esitetty kuvioissa 3A-D. Kaikki uutteet toimivat kilpailemattomina inhibiittoreina Krs-arvoilla alueella 7.58-13.04 ug/ml (taulukko 2).

Aiemmassa työssämme analysoimme W. filifera -siementen alkoholiuutteita käyttämällä HPLC-DAD-ESI/MS:ää. Olemme korostaneet, että näiden uutteiden tärkeimmät fenoliyhdisteet koostuvat flavan-3-olista [7]. Niistä B-tyypin prosyanidiinit olivat pääyhdisteitä W.filifera-siemenuutteissa. Positiivinen suhde prosyanidiinin polymeroitumisasteen ja prosyanidiinien kyvyn inhiboida elastaasia välillä havaittiin edellisessä artikkelissa [11,12]. Lisäksi joidenkin prosyanidiiniyhdisteiden on raportoitu estävän elastaasia ja kollagenaasia vastaan ​​[13,14]. Näiden yhdisteiden synerginen vaikutus voisi osaltaan selittää W.filifera-metanoliuutteen merkittävän eston molempia entsyymejä vastaan.

2.3.Auringonsuojakerroin

Valonsuojaus on erittäin tärkeää yhdisteille, joita voi levittää iholle, joten määritimme uutteidemme aurinkosuojakertoimen (SP). SPF osoittaa aineen kyvyn absorboida UV-säteitä ja suojella ihoa tällaisen säteilyn aiheuttamilta myrkyllisiltä vaikutuksilta. Kasvipohjaisella kosmetiikalla on suuri potentiaali UV-säteilyn absorboinnissa, koska kasviuutteet sisältävät polyfenoleja, kuten flavonoideja tai karotenoideja. Nämä yhdisteet, joissa on aromaattisia renkaita, voivat absorboida UV-säteitä ja siten toimia auringonsuodattimena. Koska W.filiferan alkoholipitoiset siemenuutteet sisältävät fenoli- ja flavonoidiyhdisteitä [7], näiden uutteiden valolta suojaavat vaikutukset arvioitiin. Kuten taulukosta 3 esitetään, kaikki analysoidut uutteet pitoisuutena 100 ug/ml osoittivat SPF-arvoja välillä 1,52 - 3,35. Metanoliuutteilla paljastettiin olevan parhaat valolta suojaavat vaikutukset. UV-säteet ovat vastuussa ihosairauksista ja laukaisevat prosesseja, jotka johtavat ihon ikääntymiseen, oksidatiiviseen stressiin ja ryppyjen muodostumiseen. Siten tämän säteilyn absorption vähentäminen tehostaa epäsuorasti antioksidanttiaktiivisuutta ja ikääntymiseen liittyvien entsyymien estoa.

2.4. Solujen elinkelpoisuus ja solunsisäinen ROS-taso

Koska oksidatiivinen stressi on avaintekijä ikääntymisen ja ikääntymiseen liittyvien vaurioiden aiheuttamisessa, tutkimme myös, estivätkö W. filifera -uutteet HO2--indusoitua ROS-tuotantoa solujärjestelmässä. Aiemmassa artikkelissa kuvailimme siemenuutteiden antioksidanttiaktiivisuutta spektrofotometrisellä menetelmällä (ABTS-määritys)[7]. Näytteet paljastettiin olevan hyvä lähde fenoliyhdisteille, joilla on antioksidanttisia ominaisuuksia, ja MEG osoitti parasta aktiivisuutta. Koska tällä uutteella oli paras antioksidanttiaktiivisuus ja myös suuri potentiaali, ottaen huomioon testattua entsyymiä (koliiniesteraasi, ksantiinioksidaasi ja tässä esitellyt ikääntymisentsyymit) estävät vaikutukset, päätimme vahvistaa MEG:n antioksidanttikapasiteetin solumallissa.

Ensin W.filifera-uutteen vaikutuksia solujen elinkelpoisuuteen tutkittiin HaCaT-soluissa. Immortalisoitua ihmisen keratinosyyttien HaCaT-solulinjaa on käytetty laajasti mallina epidermaalisen homeostaasin tutkimiseen [15]. Tämän uutteen turvallisuuden määrittämiseksi soluja käsiteltiin eri konsentraatioilla näytettä 24 tunnin ajan ja niitä tutkittiin MTT-testillä. Tulokset osoittavat, että uute ei ollut sytotoksinen HaCaT-soluissa ja vain pieni lasku (elinkykyisyys 80 prosenttia) havaittiin pitoisuudella 100 ug/ml (kuvio 4). Koska elinkelpoisuuteen ei vaikuttanut ennen kuin arvo 50 ug/ml (elinkyky 96 prosenttia), päätimme suorittaa lisää solukokeita käyttämällä tätä uutepitoisuutta. Arvioimme ROS-tasot soluissa ennen oksidatiivista stressiä ja sen jälkeen sekä MEG-hoidon jälkeen. Tutkimus suoritettiin käyttämällä 21,7'-dikloorifluoreseiinidiasetaattia (DCFH-DA), joka diffundoituu helposti solukalvon läpi ja jonka endogeeniset esteraasit hydrolysoivat DCFH:ksi. DCF:n nopeat nousut osoittavat DCFH:n hapettumista solunsisäisen ROS:n, kuten esim. H2O2.Kuten kuvasta 5 näkyy, H2O2-inkubointi lisäsi merkittävästi ROS-muodostusta HaCaT-soluissa, mutta käsittely uutteella kykeni estämään H2O2--indusoitua ROS-tuotantoa annos-vaste-tavalla. Näin ollen nämä tulokset vahvistavat antioksidanttimääritykset ja viittaavat siihen, että MEG voi myös vähentää ROS:n muodostumista soluissa.

Tässä artikkelissa analysoitu metanoliuute osoitti korkeita antioksidanttisia ominaisuuksia. Tämän uutteen fenolikoostumus koostui flavan-3-olista, ja B-tyypin prosyanidiinit olivat tärkeimmät fenoliyhdisteet [7]. Prosyanidiinit, polyfenolibioflavonoidien ryhmä, on raportoitu omaavan laajan valikoiman biologisia, farmakologisia ja kemoprotektiivisia ominaisuuksia happivapaita radikaaleja vastaan[16,17]. Aikaisempi tutkimus on osoittanut, että prosyanidiinien radikaalivastainen aktiivisuus on voimakasta korkeilla pitoisuuksilla[18]. Lisäksi proantosyanidiiniuutteet ovat tehokkaampia superoksidiradikaalien poistajia kuin antioksidantti C-vitamiini ja Trolox [19].

3. Materiaalit ja menetelmät

3.1. Kemikaalit

Kaikki kemialliset reagenssit saatiin puhtaina kaupallisina tuotteina Sigma Chemical Co.:lta (St. Louis, MO, USA), ellei toisin mainita, ja niitä käytettiin ilman lisäpuhdistusta.

3.2. Kasvinäytteen valmistelu

W.filiferan hedelmät kerättiin Tunisiassa Gabesin (G) ja Soussen (S) alueilta ja kasvimateriaalit valmistettiin aiemmin kuvatun menettelyn mukaisesti [7]. Massa ja siemenet lyofilisoitiin erikseen ja sitten kasvimateriaaleja (25 g) uutettiin 100 ml:aan vettä (AE, vesipitoinen uute), etanoliin (E, etanoliuute) tai metanoliin (ME, metanoliuute) 72 tunnin ajan huoneessa. lämpötilassa jatkuvasti sekoittaen. Suodatuksen ja sentrifugoinnin 10, 000 rpm jälkeen vesipitoiset uutteet lyofilisoitiin, kun taas saadut etanoli- ja metanoliuutteet väkevöitiin tyhjössä käyttämällä pyöröhaihdutinta lisäanalyysiä varten. Kuivatut tehot (1 mg/ml) liuotettiin DMSO:hon ennen käyttöä.

3.3. Entsymaattinen esto

Kaikkien alla kuvattujen määritysten tulokset ilmaistiin prosentteina nollakontrollista. Uutteiden pitoisuudet, jotka johtivat entsyymiaktiivisuuden 50-prosenttiseen inhibitioon (ICso), määritettiin interpoloimalla annos-vaste-käyriä. Estomalli määritettiin suorittamalla määrityksiä erilaisilla substraattipitoisuuksilla ja uutteiden puuttumisella ja läsnäololla eri pitoisuuksilla. Kinetiikkatiedot analysoitiin käyttämällä Lineweaver-Burk-kaaviota. Tiedot aktiivisuusmäärityksistä tallennettiin Ultrospec 2100 spektrofotometrillä (Biochrom Ltd., Cambridge, UK).

3.3.1. Tyrosinaasin estomääritys

Tyrosinaasiaktiivisuuden esto W.filifera-uutteilla määritettiin käyttämällä 3,4-dihydroksifenyylialaniinia (L-DOPA) substraattina [20]. Reaktioseos sisälsi 25 mM fosfaattipuskuria (pH 6,8), sienityrosinaasia (100 U/ml, lopullinen konsentraatio) kasviuuteliuoksen kanssa tai ilman sitä. Sitten seokseen lisättiin L-DOPA:ta (0,5 mM) ja aktiivisuus määritettiin seuraamalla absorbanssin kasvua aallonpituudella 492 nm, joka johtui dopakromituotteen muodostumisesta. Sienityrosinaasin estomäärityksessä käytetyn uutteen pitoisuusalue oli 0-0,3 mg/ml. Ilman kasviuutteita suoritetuissa määrityksissä reaktioseokseen lisättiin DMSO:ta nollakontrollina. Kojihappoa käytettiin positiivisena kontrollina.

3.3.2.Elastaasi-inhibitiomääritys

Elastaasi-inhibitio määritettiin seuraamalla p-nitroaniliinin vapautumista substraatin N-sukk-(Ala)3-nitroanilidin (SANA) pilkkomisen aikana entsyymin vaikutuksesta kuvatulla menetelmällä [21]. pieniä muutoksia. Määritys suoritettiin 0,1 M Tris-HCl-puskurissa (pH8.{10}}). Sian haiman elastaasia (3,3 ug/ml) inkuboitiin uutteen kanssa tai ilman sitä 20 minuuttia ja inkuloinnin jälkeen lisättiin substraatti (1,6 mM) ja entsyymiaktiivisuutta tarkkailtiin aallonpituudella 410 nm. Kontrolli suoritettiin DMSO:lla, kun taas oleanolihappoa käytettiin positiivisena kontrollina.

3.3.3. Kollagenaasin estomääritys

Clostridium histolyticumista peräisin oleva kollagenaasi valmistettiin Tricine-puskurissa {{0}}.05 M, pH 7,5, sisältäen 0,4 M NaCl:a ja 0,01 M CaClz:a, ja inkuboitiin (1 U). /mL) testinäytteillä eri pitoisuuksilla 15 minuutin ajan. Synteettinen substraatti N-(3-[2-Fury]]-akryloyyli)-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA), joka oli valmistettu samassa puskuriliuoksessa, lisättiin sitten käynnistämään reaktio ( lopullisella konsentraatiolla 0,8 mM). Absorbanssia seurattiin 340 nm:ssä [21]. Kontrolli suoritettiin DMSO:lla, kun taas epigallokatekiinigallaattia käytettiin positiivisena kontrollina.

3.4. In vitro -auringonsuojakertoimen määritys

W. filifera -uutteiden aurinkosuojakerroin määritettiin käyttämällä UV-absorbanssimenetelmää Mansur et ai. (1986) [22]. Uutteiden absorbanssit (0,1 mg/ml) mitattiin alueella 290-320 nm, 5 nm:n välein, ja jokaisessa pisteessä tehtiin kolme määritystä. SPF laskettiin soveltamalla Mansur-yhtälöä: missä CF=korjauskerroin(10); EE(A)= säteilyn erytemogeeninen vaikutus, jonka aallonpituus on λ;I（）= auringon intensiteettispektri; Abs（λ= spektrofotometriset absorbanssiarvot aallonpituudella λ. EE(A） × I(A）) arvot ovat vakioita. Ne määrittivät Sayre et ai. (1979)[23] ja esitetään taulukossa 4.

3.5. Soluviljelmä ja solunsisäiset ROS-tasot

Ihmisen ihon keratinosyyttisolulinjaa HaCaT viljeltiin Dulbeccon Modified Eagle's Mediumissa (DMEM), joka sisälsi 10 prosenttia naudan sikiön seerumia (FBS, Gibco, NY, USA) ja 1 prosenttia penisilliiniä/streptomysiiniä 37 asteessa, kosteassa ilmakehässä, 5 prosentti CO2. Solujen elinkelpoisuus havaittiin kolorimetrisellä 3-(4)5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2.5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) -määrityksellä, kuten aiemmin kuvattu, pienin muutoksin [24]. 24 tunnin inkubaation jälkeen MEG:llä eri pitoisuuksilla (0-100 ug/ml) solut leimattiin MTT-liuoksella 3 tunnin ajan 37 asteessa. Tuloksena saadut violetit formatsaanisakkauma liuotettiin DMSO:hon ja kunkin kuopan absorbanssi määritettiin aallonpituudella 560 nm käyttämällä mikrolevylukijaa 630 nm:n referenssillä.

Solujen ROS-tasot määritettiin DCFH-DA-menetelmällä [25]. HaCaT-soluja käsiteltiin erilaisilla MEG-pitoisuuksilla (0-50 ug/ml) 24 tunnin ajan. Sitten soluja inkuboitiin DCFH-DA:n (10 uM) kanssa 37 asteessa 30 minuuttia. Inkuboinnin jälkeen kuoppiin lisättiin 1 mM Hz02:a ja DCF:n fluoresenssin intensiteetti mitattiin välittömästi käyttämällä fluoresoivaa levylukijaa viritysaallonpituudella 485 nm ja emissioaallonpituudella 530 nm, ottamalla lukemat 5 minuutin välein 50 min.

3.6.Tietojen analyysi

Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja tiedot ilmaistiin keskimääräisenä 士 standardipoikkeamana (SD). Tilastolliset erot arvioitiin GraphPad Prism -ohjelmiston versiolla 8 (San Diego, CA, USA). Ryhmien välinen vertailu suoritettiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA), jota seurasi Tukey Multiple Comparisons -testi. Ap-arvoa alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevänä.

4. Johtopäätökset

Lopuksi ilmoitamme ensimmäistä kertaa, että W.filiferan siemenuutteet estävät tehokkaasti ihon ikääntymiseen liittyviä keskeisiä entsyymejä. Luonnollinen tai "sisäinen" ikääntyminen on fysiologinen ilmiö, joka esiintyy kaikissa ihmiskudoksissa ajan kulumisen seurauksena. Iho altistuu kuitenkin myös ulkoisille stressiä aiheuttaville tekijöille, jotka ovat suuri syy ihon ennenaikaiseen ikääntymiseen. "Ulkoinen" ikääntyminen liittyy pääasiassa UV-säteilyn aiheuttamiin ihon sidekudoksen vaurioihin. UV-säteet aiheuttavat oksidatiivista stressiä, joka on vastuussa ECM:ää hajottavien entsyymien aktivoitumisesta sekä ryppyjen ja ikääntymispisteiden ilmaantumisesta. Tämä käsikirjoitus kertoo W.filiferan siementen merkityksestä tässä yhteydessä. Kuten kuvasta 6 näkyy, uutteet voisivat ehkäistä ennenaikaista ikääntymistä toimien samanaikaisesti usealla rintamalla.

Ensinnäkin uutteet voivat vaikuttaa prosessin alussa valolta suojaavien vaikutustensa kautta ja siten vähentää UV-säteilyn absorptiota. Sitten he osoittivat hyvän antioksidanttivaikutuksen metanoliuutteella, estäen ROS:n muodostumisen solujärjestelmässä ilman solumyrkyllisyyttä. Lopuksi kaikki uutteet, erityisesti metanolinäytteet, voivat estää kollagenaasia, elastaasia ja tyrosinaasia (jälkimmäistä vähäisessä määrin). Kaiken kaikkiaan saadut tulokset osoittavat, että W.filifera voisi olla bioaktiivisten molekyylien lähde ja rohkaista lisäkokeita varten yksittäisten aktiivisten komponenttien eristämiseksi, jotka ovat vastuussa havaituista toiminnoista.

Tämä artikkeli on poimittu julkaisusta Plants 2021, 10, 151. https://doi.org/10.3390/plants10010151 https://www.mdpi.com/journal/plants