RNAi-pohjainen antiviraalinen luontainen immuniteetti kasveissa Osa 1

Abstrakti:

Useita antiviraalisia immuniteettia kehitettiin suojaamaan isäntien virusinfektioita vastaan. RNA-interferenssiin (RNAi) perustuva antiviraalinen synnynnäinen immuniteetti on evoluutionaalisesti säilynyt eukaryooteissa ja sillä on elintärkeä rooli kaikentyyppisiä viruksia vastaan. Isännän ja viruksen välisen asekilpailun aikana monet virukset kehittävät virussuppressoreita RNA:n hiljentämisestä (VSR) estääkseen antiviraalista luontaista immuniteettia. Tässä tarkastelimme kasvien RNAi-pohjaisen antiviraalisen luontaisen immuniteetin eri vaiheissa mekanismia ja eri VSR:ien vastavaikutuksia, pääasiassa RNA-virusten tartunnan yhteydessä Arabidopsis-mallikasvissa. Myös joitain kriittisiä haasteita alalla ehdotettiin, ja uskomme, että konservoituneen antiviraalisen synnynnäisen immuniteetin selvittäminen voi tarjota laajan kirjon antiviraalisia strategioita virussairauksien ehkäisemiseksi tulevaisuudessa.

Antiviraalisen immuniteetin ja immuniteetin välillä on läheinen yhteys.

1. Immuniteetti on avain viruksia vastaan: Immuunijärjestelmä on yksi kehon tärkeimmistä puolustusmekanismeista. Immuunijärjestelmä suojaa kehoa taudeilta tuhoamalla, hallitsemalla ja estämällä viruksia pääsemästä kehoon. Jos sinulla on vahva immuunijärjestelmä, sinulla on parempi antiviraalinen immuunivaste ja parempi kyky taistella virusinfektioita vastaan.

2. Antiviraalinen immuniteetti on avain immuniteetille: antiviraalinen immuunivaste viittaa immuunijärjestelmän immuunivasteeseen viruksen tunkeutumiseen kehoon. Prosessissa elimistö tuottaa vasta-aineita ja immuunisoluja, jotka tunnistavat ja poistavat viruksen. Nämä vasta-aineet ja immuunisolut liittyvät läheisesti immuniteettiin, mikä tehostaa immuunijärjestelmän toimintaa ja parantaa kehon kykyä torjua viruksia.

3. Immuniteetti ja antiviraalinen immuniteetti ovat toisistaan ​​riippuvaisia: Immuniteetti ja antiviraalinen immuniteetti ovat toisistaan ​​riippuvaisia. Ihmisillä, joilla on heikko immuniteetti, on heikentynyt vastustuskyky virukselle ja he ovat alttiita tulehduksille ja vakaville seurauksille, kun taas ihmiset, joilla on heikko antiviraalinen immuunivaste, ovat alttiita virusinfektioille, mikä vaikuttaa immuunijärjestelmän toimintaan.

Siksi hyvän immuniteetin ylläpitäminen voi parantaa antiviraalista immuunivastetta ja ehkäistä virusinfektiota. Sillä välin joidenkin tiettyjen virusten, kuten koronavirusten, osalta rokotteita voidaan käyttää myös immuunijärjestelmän antiviraalisen immuunivasteen aktivoimiseen ja vahvistamiseen. Siksi meidän tulee kiinnittää huomiota koskemattomuuden edistämiseen. Cistanche voi parantaa immuniteettia, ja lihaseos sisältää runsaasti erilaisia ​​antioksidantteja, kuten C-vitamiinia, karotenoideja jne., jotka voivat puhdistaa vapaita radikaaleja, vähentää oksidatiivista stressiä ja parantaa immuunijärjestelmän vastustuskykyä.

Click cistanche tubulosa -uutejauhe

Avainsanat:

virus; antiviraalinen luontainen immuniteetti; RNAi; pieni RNA; VSR.

1. Esittely

RNA:n vaimennuksen ilmiö havaittiin ensimmäisen kerran kasveissa vuonna 1990, kun kalkonisyntaasisiirtogeenin tuominen petuniaan johti endogeenisten homologisten geenien tukahduttamiseen [1,2]. Vuonna 1998 Andrew Fire ja Craig Mello havaitsivat, että kaksijuosteiset RNA:t (dsRNA) aiheuttivat voimakasta ja spesifistä häiriötä Caenorhabditis elegantissa [3] ja kutsuivat ilmiötä RNA-häiriöksi (RNAi), joka voitti Nobelin fysiologian ja lääketieteen palkinnon vuonna 2006 ja avasi vallankumouksen biologian alalla [3,4]. Lukuisat tutkimukset osoittivat, että RNAi oli evoluutionaalisesti konservoitunut eukaryooteissa ja se sääteli kaikkia biologisten tapahtumien näkökohtia [5,6]. RNAi-signalointi perustettiin tunnistamalla jotkin reitin avainkomponentit.

Havaittiin, että koodaamaton pieni RNA laukaisee joko itsestään komplementaarisen tai kaksijuosteisen RNA:n (dsRNA) ja toimii geenin vaimentamisen todellisena signaalin ja spesifisyyden determinanttina. Primaarinen duplex-pieni RNA tuotetaan vastaavasti prosessoimalla hiusneula-RNA tai dsRNA mikro-RNA:ksi tai siRNA:ksi käyttämällä erityistä Dicer-laitetta [7]. Lisäksi sekundaarista pientä RNA:ta on tavallisesti tuotettava monistamalla RNA-riippuvaisella RNA-polymeraasilla (RdRP), jotta geenien hiljentäminen olisi tehokasta. Duplex pieni RNA voidaan sitten metyloida HEN1:llä stabiilisuuden lisäämiseksi, ja se ladataan efektoriargonaute (AGO) -proteiineihin [8]. AGO:t hajottavat duplex-pienen RNA:n läpikulkujuosteen, ja ohjattu juoste jää muodostamaan RNA-indusoidun vaimennuskompleksin (RISC) [9]. RISC kohdistaa sitten komplementaarisen RNA:n muodostamalla emäsparin välittääkseen hajoamista tai translaation estoa transkription jälkeisessä geenin vaimentamisessa (PTGS) tai indusoimassa transkriptiogeenin vaimentamista (TGS).

Kasveissa on kaksi pääluokkaa endogeenisiä pieniä RNA:ita: mikroRNA:t (miRNA:t) ja siRNA:t [10]. miRNA:ta ja siRNA:ta tuotetaan vastaavasti spesifisen Dicerin prosessoimalla hiusneula-RNA:ta tai dsRNA:ta. MiRNA:ta, joka on yleensä 21 nt pitkä, tuottaa Dicer-like 1 (DCL1) Arabidopsiksessa. Endogeeniset miRNA:t välittävät yleensä PTGS:ää ja niillä on olennainen rooli kaikissa kasvien kehitysprosessien näkökohdissa.

Lisäksi 21, 22 ja 24 nt siRNA:ita tuottavat vastaavasti DCL4, DCL2 tai DCL3 Arabidopsisissa, ja ne säätelevät myös erilaisia ​​​​biologisia prosesseja. Kun 21 ja 22 nt endogeeniset siRNA:t yleensä välittävät PTGS:ää, kuten 21 nt tasiRNA, joka osallistuu lehtien morfogeneesiin, 24 nt endogeeniset siRNA:t välittävät pääasiassa TGS:ää DNA-metylaation kautta.

Patogeenin infektion yhteydessä tuotetaan myös erikokoisia patogeenin RNA:sta peräisin olevia siRNA:ita indusoimaan RNAi-pohjaista antimikrobista immuniteettia isäntäresistenssin aikaansaamiseksi [10,11]. RNAi-pohjainen antiviraalinen puolustus löydettiin ensimmäisen kerran kasveista [12,13]. Sillä havaittiin sitten olevan tärkeä rooli selkärangattomien [14] ja nisäkkäiden antiviraalisessa immuniteetissa [15,16]. Siirtogeenien vaimentamisesta ja endogeenisten geenien hiljentämisestä saatujen löydösten perusteella karakterisoitiin DCL:iden, AGO:iden ja RDR:ien (RNA-riippuvaiset RNA-polymeraasit) toiminta virusten vastaisessa immuniteetissa.

Nyt tiedetään, että RNAi-pohjainen antiviraalinen luontainen immuniteetti indusoidaan kaikenlaisten RNA- tai DNA-virusten aggression estämiseksi lähes kaikissa eukaryooteissa (kuva 1). Toisaalta monet virukset, erityisesti patogeeniset virukset, kehittyvät koodaamaan VSR:itä hyökkäämään RNAi-pohjaisen antiviraalisen reitin eri vaiheisiin (kuva 1). VSR:n esiintyvyys edistää virusepidemioita; se myös sokaisee näkemyksemme RNAi-pohjaisesta antiviraalisesta luontaisesta immuniteetista. Lisäksi VSR esti meitä käyttämästä klassista geneettistä seulontaa uusien antiviraalisen reitin säätelijöiden tunnistamiseen vuosikymmeniä, kunnes viime aikoihin kehitettiin tehokas geneettinen menetelmä esteen ohittamiseksi [17,18].

Tässä tarkastellaan viruksen RNA:n havaitsemista ja RNAi-pohjaisen antiviraalisen puolustuksen käynnistymistä, viruksen siRNA:n (siRNA) tuotantoa ja monistumista sekä antiviraalisen RNAi-efektori Argonautes -toimintoja painottaen alan viimeaikaista edistystä, haastaa olemassa olevat kysymykset mallikasvista Arabidopsis. Jotkin kasvivirusten ja niiden toimintojen VSR:t tehtiin myös yhteenvedon avulla, jotta kasviisäntien ja virusten välinen kilpavarustelu voitaisiin ymmärtää paremmin. Pahoittelemme, että osa alan tutkimusten edistymisestä ei välttämättä sisälly.

2. Viruksen RNA:n havaitseminen ja RNAi-pohjaisen antiviraalisen puolustuksen aloitus

Virukset ovat lähes pienimpiä organismeja maan päällä, ja niillä on klassinen rakenne, jossa geneettinen materiaali, RNA tai DNA, on pakattu kuoriproteiiniin. Virukset on lamaannettava isännässä ja levitettävä käyttämällä isännän materiaaleja ja energiaa. Toisin kuin muut mikrobipatogeenit, kuviontunnistusreseptorien (PRR:t) ei havaita havaitsevan viruksia isännän solukalvolla. Kun virus saapuu isäntäsoluun, kaksijuosteisia virus-RNA:ita tuotetaan viruksen replikaation aikana virusreplikaattien kautta. Isäntä Dicer -proteiinit havaitsevat ja pilkovat kaksijuosteiset virus-RNA:t tuottaen 21–24 nt pituista siRNA:ta. Siten Dicer-proteiinia voidaan pitää viruksen PRR:nä, jota käytetään RNAi-pohjaisen antiviraalisen reitin käynnistämiseen.

Dicer kuuluu RNaasiIII:n kaltaiseen perheeseen ja sillä on erittäin konservoitunut endonukleaasi eukaryooteissa [19]. Arabidopsiksessa on neljä Dicer-like proteiinia (DCL): DCL1, DCL2, DCL3 ja DCL4. Ne kaikki sisältävät viisi domeenia, jotka ovat DExD-helikaasi, helikaasi-C, tuntemattoman funktion 283 domeeni (DUF283), Piwi/Argonaute/Zwille (PAZ) -domeeni, kaksi tandem RNaasi III -domeenia ja yksi tai kaksi dsRNA:ta sitovaa domeenia ( dsRBD:t) N-päästä C-päähän [20] (kuva 2). DCL3:lla ei ole helicase-C-aluetta. Yleensä helikaasidomeeni hyödyntää ATP-hydrolyysiä helpottaakseen dsRNA:n purkamista [19,21].

DUF283-domeenin kuvattiin äskettäin helpottavan RNA-RNA-emäspariutumista ja RNA:n sitoutumista [22,23]. PAZ- ja RNaasi III -domeenit ovat elintärkeitä dsRNA:n katkaisulle, PAZ-domeeni tunnistaa dsRNA- ja RNaasi III -domeenien pään ja katkaisee yhden dsRNA-säikeistä, ja PAZ-domeenin ja RNaasi III -domeenien välinen etäisyys määräytyy pituuden mukaan. tuotteista [22,24]. dsRBD-domeeni helpottaa dsRNA:n sitoutumista ja toimii myös ei-klassisena tuman lokalisointisignaalina [23].

DCL1 osallistuu pääasiassa 21 nt:n mikro-RNA:iden (miRNA:iden) biogeneesireitille, joilla on olennainen rooli kaikissa kasvien kehityksen näkökohdissa ja kasvien reaktioissa ympäristön ärsykkeisiin [25]. DCL1, DsRNA:ta sitova proteiini 1 (DRB1) (tunnetaan myös nimellä HYPONASTIC LEAVES 1, HYL1) ja SERRATE (SE) muodostavat tuman kuutioivia kappaleita tunnistamaan pri-miRNA:n hiusneularakenteen ja leikkaamaan pri-miRNA:n peräkkäin prekursori-miRNA:ksi (prekursori). -miRNA) ja esi-miRNA kypsäksi miRNA:ksi [21,26]. Äskettäin raportoitiin, että SE:n faasien erottaminen ajaa kuutioimaan rungon kokoamista ja edistää miRNA:n prosessointia DCL1:n avulla Arabidopsiksessa [27]; SE-assosioitunut proteiini 1 edistää myös miRNA:n biogeneesiä moduloimalla pri-miRNA:n silmukointia, prosessointia ja stabiilisuutta [28].

Siksi toimintakyvyttömät DCL1-mutantit, alkion tappava ja jopa hypomorfinen mutantti DCL1 osoittivat myös pleiotrooppisia kehitysvirheitä, jotka johtuivat häiriintyneestä miRNA-biogeneesistä [29]. DCL1 voi epäsuorasti toimia RNAi-pohjaisessa antiviraalisessa synnynnäisessä immuniteetissa säätelemällä joidenkin miRNA:iden biogeneesiä. Raportoitiin, että miR168 säätelee negatiivisesti AGO1:n kertymistä kasveissa [30], ja miR482 tai miR6019/miR6020, vastaavasti, vähentää R-geenien virusresistenssiä tomaateissa tai tupakassa [31,32]. DCL1 voisi myös edistää siRNA:n muiden DCL-välitteistä biogeneesiä [33,34].

DCL2 vastaa eksogeenisten kaksijuosteisten RNA- (dsRNA) molekyylien tai luonnollisten antisense-siRNA:iden prosessoinnista 22-nt siRNA:iksi Arabidopsiksessa [35,36]. DCL2 kuitenkin korvaa vain RNAi-pohjaisen antiviraalisen synnynnäisen immuniteetin käynnistämisen Arabidopsiksessa, kun DCL4:n toiminta kumotaan [37,38]. Mielenkiintoista on, että viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että massiivisia endogeenisiä 22 nt siRNA:ita voidaan kerääntyä, kun sytoplasminen RNA:n hajoamisreitti ja DCL4:n toiminta ovat viallisia; nämä siRNA:t voivat laukaista geenispesifisen ja globaalin translaation repression ja johtaa pleiotrooppisiin kasvuhäiriöihin [39]. Useita DCL2:n ortologeja on kuitenkin muissa kasveissa ja ne voivat kehittyä omaamaan toimintoja. Esimerkiksi tutkimus osoitti, että DCL2b, joka on yksi DCL2-homologi tomaateissa neljästä, näytteli elintärkeää roolia tomaattimosaiikkivirus (ToMV) -infektiota vastaan ​​tuottamalla 22 nt siRNA:ta tomaateissa [40].

DCL3 tuottaa 24 nt siRNA:ita säätelemään RNA-riippuvaista DNA:n metylaatiota (RdDM) Arabidopsiksen transkriptionaalisessa geenin vaimentamisessa (TGS) [41]. Äskettäin DCL3-pre-siRNA-rakenne paljasti, että DCL3 käytti positiivisesti varautunutta taskua ja aromaattista korkkia tunnistaakseen vastaavasti ohjausjuosteen 50 -fosforyloidun adenosiinin ja komplementaarisen juosteen 30 ulkonemaa. . DCL3:n parilliset RNaasi III -domeenit katkaisivat RNA:n molemmat juosteet määrittäen tuotteen pienen RNA:n tarkan pituuden [42]. Endogeenisiä 24 nt:n siRNA:ita tuotetaan pääasiassa heterokromatiinista tai toistuvasti sekvenssirikkaasta alueesta DCL3:lla transposonin vaimennuksen tai genomin stabiilisuuden ylläpitämiseksi; 24 nt siRNA:t estävät myös siirtogeenin tai muun eksogeenisen DNA:n, kuten DNA-virusten, transkription [43–45]. Raportoitiin, että DNA-viruksen infektion jälkeen tuotettiin 24 nt vsiRNA:ita moduloimaan DNA:n metylaatiota ja virus-DNA:n histonimuutoksia ja estämään virusinfektiota [46,47].

DCL4 pilkkoo pitkän endogeenisen dsRNA:n tuottaen 21 nt siRNA:ita, kuten trans-toimivia siRNA:ita (ta-siRNA:ita), jotka ovat ratkaisevia kasvien kehitykselle [48–51]. Arabidopsis dcl4 -mutantti osoitti pitkänomaisten, alaspäin käpristyneiden ruusukelehtien fenotyyppiä [51,52] ja lisääntynyttä antosyaanien kertymistä [53,54]. RNAi-pohjaisessa antiviraalisessa synnynnäisessä immuniteetissa DCL4 havaitsee ja leikkaa pitkän viruksen dsRNA:n tuottamaan 21 nt siRNA:ta virusinfektion estämiseksi, erityisesti sen jälkeen, kun RNA-virus on tarttunut Arabidopsiksessa ja muissa kasveissa [49].

Vaikka kukin DCL on vastuussa erillisen pienen RNA:n tuotannosta, ne voivat toimia redundanttisesti tai hierarkkisesti RNAi-pohjaisessa antiviraalisessa synnynnäisessä immuniteetissa. Esimerkiksi DCL4:ää pidettiin endogeenisenä suppressorina, joka tukahduttaa DCL2--välitteisen 22 nt:n siRNA:iden tuotannon [39,55]; DCL2 toimii kuitenkin redundantti RNAi-pohjaisessa antiviraalisessa synnynnäisessä immuniteetissa, varsinkin kun DCL4:n toiminta on vaarantunut [56]. Siten sekä DCL2:n että DCL4:n puuttuessa virustiitterit lisääntyisivät dramaattisesti [18,57,58]. Lisäksi DCL4:n tuottama 21 nt siRNA voisi myös helpottaa RdDM-reittiä suojautua DNA-virusten infektiolta [41]. DCL2:n ja DCL3:n on toimittava yhdessä perunan karamukulan viroideja vastaan ​​[59]. Lisäksi DCL1 pystyy tuottamaan 21 nt siRNA:ta DCL2:n, DCL3:n ja DCL4:n puuttuessa [55,57].

DsRNA:ta sitovia (DRB) proteiineja tarvitaan myös viruksen RNA:iden oikeaan havaitsemiseen ja pilkkomiseen DCL:illä [60]. Arabidopsiksen genomi koodaa viittä DRB-proteiinia: DRB1/HYL1, DRB2, DRB3, DRB4 ja DRB5 [61]. Ne sisältävät yhdestä kolmeen konservoitunutta dsRNA:ta sitovaa motiivia (dsRBM), jotka koostuvat noin 70 aminohaposta muodostaen - - - - laskoksia ja kaksi -heliksiä vuorovaikutuksessa dsRNA:n kanssa [62,63]. DRB:t ovat vuorovaikutuksessa spesifisten DCL:ien kanssa suorittaakseen erityistehtävänsä pienen RNA:n biogeneesissä ja antiviraalisessa puolustuksessa [60]. Esimerkiksi DRB1:n (HYL1) ja DCL1:n välinen vuorovaikutus tarvitaan miRNA:n biogeneesiin ja se on osallisena RISC:hen latautuvan ohjausjuosteen valinnassa [64–66].

DRB4 on vuorovaikutuksessa DCL4:n kanssa ja muodostaa toisenlaisen paloittelukappaleen siRNA:iden tehokkaaseen käsittelyyn. Raportoitiin, että DRB4-mutaatio johti puutteelliseen antiviraaliseen suojaukseen nauriskeltaisen mosaiikkiviruksen (TYMV) infektiota vastaan ​​[67]. Drb3-mutantti oli yliherkkä kaalin lehtikäpristymisvirukselle (CaLCuV) ja punajuuriviruksen (BCTV) infektiolle, ja viruksen genomin metylaatio väheni merkittävästi drb3:ssa [47]. DRB2 karakterisoitiin äskettäin laaja-alaiseksi antiviraaliseksi efektoriksi; DRB2:n yli-ilmentyminen vähensi useiden erilaisten RNA-virusten kertymistä, mukaan lukien tobacco rattle virus (TRV), tomato bushy stunt virus (TBSV), perunavirus X (PVX) ja grapevine fanleaf virus (GFLV) [68].

3. siRNA:n tuotanto ja monistus

Viruksen dsRNA:n havaitsemisen ja pilkkomisen jälkeen DCL:n kautta tuotetaan primäärinen vsiRNA. Riittävä sekundaarinen vsiRNA on kuitenkin tuotettava amplifikaatiolla tehokkaan viruksenvastaisen puolustuksen aikaansaamiseksi. Isäntä-RNA-riippuvaiset RNA-polymeraasi (RdRP) -proteiinit ovat keskeisiä tekijöitä toissijaisessa vsiRNA-monistuksessa kasveissa ja Caenorhabditis elegantissa. Ne tuottavat eksponentiaalisesti viruksen dsRNA:ta, joka toimii DCL:iden substraatteina vsiRNA:n biogeneesille, käyttäen luultavasti katkaistuja virus-RNA:ita templaatteina [18,69,70].

Arabidopsiksessa on kuusi RdRP-proteiinia (RDR1 - RDR6). RDR1:llä, RDR2:lla ja RDR6:lla on kaikilla eukaryoottisten RDR:ien C-terminaalinen kanoninen katalyyttinen DLDGD-motiivi ja niillä on ortologeja monissa kasvilajeissa, kun taas RDR3:lla, RDR4:llä ja RDR5:llä on yhteinen epätyypillinen DFDGD-aminohappomotiivi katalyyttisessä domeenissa [71]. RDR1:n, RDR2:n ja RDR6:n on hyvin osoitettu hallitsevan RNAi-pohjaista antiviraalista luontaista immuniteettia Arabidopsiksessa, vaikka tandem-toistuvien RDR3:n, RDR4:n ja RDR5:n toimintaa Arabidopsis-genomissa ei ole tunnistettu.

RDR1 voi indusoitua virusinfektiolla [72], viroidilla [73] tai salisyylihappohoidolla [74]. Sen havaittiin monistavan 21 nt tai 22 nt siRNA:ta RNAi-pohjaisessa antiviraalisessa synnynnäisessä immuniteetissa, erityisesti RNA-virusinfektion yhteydessä. RDR1 ei säätele endogeenistä siRNA-biogeneesiä tai kasvien kehitystä. Kuitenkin havaittiin, että RDR1 välitti viruksen aktivoiman endogeenisen siRNA:n (siRNA) tuotantoa, joka on uusi isäntä-siRNA:iden luokka, joka voi edistää antiviraalista puolustusta kasveissa [72].

RDR6 ilmentyy konstitutiivisesti Arabidopsiksen eri kudoksissa. RDR6 ei ainoastaan ​​edistä RNAi-pohjaista antiviraalista synnynnäistä immuniteettia välittämällä vsiRNA-biogeneesiä, erityisesti RNA-virusinfektion jälkeen, vaan se ohjaa myös kasvien kehitystä välittämällä endogeenisen siRNA:n, kuten siRNA:iden, biogeneesiä [75,76]. RDR6 muodostaa tavallisesti siRNA-kappaleita, joissa on geenin vaimentamisen 3 (SGS3) suppressori toimiakseen yhteistyössä prosesseissa [77–80]. Siten rdr6-mutantilla ja sgs3-mutantilla on samat viat virustenvastaisessa puolustuksessa ja kehityksessä [78,81–83]. Mielenkiintoista on, että RDR6 ja miR472 voivat myös säädellä negatiivisesti PAMP-laukaisemaa immuniteettia (PTI) ja efektorilaukaisemaa immuniteettia (ETI) tautiresistenssigeenien transkription jälkeisen kontrollin kautta [84] ja edistää kaksisäikeisen katkeamisen muodostumista meioosissa muissa kasveissa. [75]. Lisäksi riisin (Oryza sativa) RDR6:lla on virusten vastainen rooli suojautumisessa riisiraitavirusta (RSV) vastaan ​​[85].

RDR2 assosioituu pääasiassa Pol IV:n kanssa muodostaen kompleksin lyhyiden dsRNA-prekursoreiden transkriptiota varten, jotka DCL3 pilkkoo ja tuottaa 24 nt siRNA:ta DNA:n metylaatiota ohjaamiseksi [86–89], vaikka RDR2 saattaa myös kyetä tuottamaan 23 dsRNA:ta. 27 nt pieniä RNA:ita MIR-geeneistä välittämään DNA:n metylaatiota [90]. Raportoitiin, että RDR2, Pol IV ja DCL3, RdDM-reitin ydinkomponentit, välittivät 24 nt vsiRNA:n tuotantoa ja niillä oli tärkeä rooli DNA-virusten, kuten geminivirusten, infektioita vastaan ​​[44,45]. Mielenkiintoista on, että RDR1:n ja RDR6:n kautta monistettu 21 nt:n siRNA voisi myös helpottaa RdDM-reittiä ja edistää kasvien puolustusta DNA-viruksia vastaan ​​[91,92].

Äskettäin löydettiin myös useita uusia tekijöitä, jotka osallistuvat sekundaarisen vsiRNA:n monistamiseen. Antiviraalinen RNAi-puutteellinen 1(AVI1)/aminofosfolipidit kuljettava ATPaasi 2 (ALA2), ALA1 ja AVI2 tunnistettiin vankan eteenpäin suuntautuvan geneettisen seulonnan avulla käyttämällä kurkkumosaiikkiviruksen (CMV) mutanttia, jossa VSR-2b:n aloituskodonit oli mutatoitu [17,93–95].

Ala1/ala2- tai avi2-mutantissa sekundaaristen vsiRNA:iden tuotanto väheni dramaattisesti. ALA1/ALA2 sisältävät tyypillisen P4--tyypin ATPaasirakenteen (kuva 2) ja voivat kuljettaa spesifisiä fosfolipidejä kasvien solukalvojen läpi. ALA1 ja ALA2 voisivat toimia yhteistyössä RDR1:n ja RDR6:n kanssa edistääkseen sekundaarista vsiRNA:n biogeneesiä, luultavasti määrittämällä sen substraattifosfolipidin lokalisoinnin soluun [17,94]. AVI2 nimettiin myös rdr6 3 (ENOR3) uudeksi tekijäksi, koska se tunnistettiin myös geneettisellä seulonnalla rdr6-taustasta käyttämällä toista CMV-mutanttia, josta 2b-geeni oli poistettu [96]. AVI2, oletettu magnesiumin kuljettaja Arabidopsiksessa, edisti myös sekundaarista siRNA-biogeneesistä riippuvaista RDR1:tä ja RDR6:ta [93]. Mielenkiintoista on, että kalmoduliinia sitovan transkription aktivaattorin -3 (CAMTA3) havaittiin hiljattain aktivoivan bifunktionaalisen nukleaasin-2 (BN2) stabiloimaan AGO1/2:ta ja DICER-LIKE1:tä ja aktivoimaan RDR6:ta vsiRNA:iden monistamiseksi [97 ].

RDR:t ja uudet tekijät, kuten ALA1/2 ja AVI2, ovat laajalti säilyneet kasveissa ja matoissa varmistamaan riittävän vsiRNA:n biogeneesin tehokkaan RNAi-pohjaisen antiviraalisen synnynnäisen immuniteetin aikaansaamiseksi. RDR:t puuttuvat kuitenkin Drosophilassa, hiirissä ja ihmisissä, joissa äskettäin löydettiin erilainen mekanismi siRNA:n monistumiselle kromosominulkoisen pyöreän DNA:n kautta [21]. Onko uutta mekanismia olemassa myös kasveissa tai matoissa, on vielä tutkimatta.

4. RNAi-efektoriargonautien virusten vastainen toiminta

siRNA on ladattava AGO-efektoreihin RISC:n muodostamiseksi, minkä jälkeen se kohdistuu komplementaarisiin virusgenomeihin PTGS:lle tai TGS:lle RNAi-pohjaisessa antiviraalisessa luontaisessa immuniteetissa. Efektori-AGO:t ovat evoluutionaalisesti konservoituneita ja yleisiä eukaryooteissa, vaikka niitä ei esiinny prokaryooteissa [98]. Niiden osoitettiin säätelevän erilaisia ​​​​biologisia edistysaskeleita kasvien kehityksessä ja kasvien vastetta ympäristön ärsykkeisiin [98–103], sen lisäksi, että ne toimivat virusten vastaisessa puolustuksessa. Kristallografiset tutkimukset osoittivat, että kanoniset eukaryoottiset AGO:t sisältävät viisi domeenia, joita kutsutaan N-terminaaliseksi (N) -alueeksi, PIWI-ARGONAUTE-ZWILLE (PAZ) -alueeksi, keskialueeksi (MID), PIWI-domeeni ja tuntematon funktio 1785 (DUF1785). 104 105] (kuvio 2).

N-domeeni voi estää opas-kohde-pariutumisen paikan 16 ulkopuolella, PAZ-domeeni tunnistaa sRNA:n 30 päätä, MID-domeeni ankkuroi sRNA:n 50 fosfaattia, PIWI-domeenilla on ribonukleaasiaktiivisuutta kohde-RNA:n viipaloimiseksi [106–108] ja DUF1785-domeenien toiminnan osoitettiin äskettäin heikentävän täydellisesti yhteensopivia siRNA- ja miRNA-duplekseja [109]. Yhdessä kaikki domeenit mahdollistavat oikean yhdistelmän sRNA:n ja kohde-RNA:n välillä oikean hiljentymisen varmistamiseksi.

Kymmenen AGO:ta on koodattu Arabidopsikseen [110–113]. AGO1 ja AGO2 ovat RNAi-välitteisen antiviraalisen immuniteetin pääkomponentteja RNA-viruksia vastaan ​​[100]. AGO1 toimii myös miRNA:n efektorina säätelemään kaikkia kasvien kehityksen näkökohtia moduloimalla endogeenisten geenien ilmentymistä [114–122]. Siten ago1 knockout -mutantit ovat tappavia. Siksi AGO1:n toimintaa RNAi-pohjaisessa antiviraalisessa synnynnäisessä immuniteetissa tutkittiin vain käyttämällä hypomorfisia AGO1-mutantteja, kuten ago1-27, joilla oli edelleen vakavia kehitysvirheitä [123]. Toisin kuin AGO1, AGO2 ei osallistu kasvien kehityksen säätelyyn, eikä ago2-mutantilla ole kasvu- ja kehitysvirheitä; AGO2 voi säädellä yksinomaan kasvien puolustusta Arabidopsiksessa. On raportoitu, että AGO2 mieluummin sitoo vsiRNA:ita, joissa on 50 terminaalista A:ta ja AGO1 suosii U:ta [124]. AGO2 tarvitaan vastustuskykyyn laajalle kirjolle kasviviruksia [56,125–128].

Raportoitiin myös, että AGO2:n katalyyttinen aktiivisuus oli välttämätön paikallisen ja systeemisen antiviraalisen aktiivisuuden kannalta [125,127], kun taas ago1-mutantti, jolla oli ehjä katalyyttinen aktiivisuus, oli herkkä virusinfektiolle [123]. AGO2 osallistuu myös resistenssiin fytopatogeenistä Pseudomonas syringae -bakteeria vastaan ​​[129], ja AGO2 sitoutuu miR393b*:n kanssa ja hiljentää MEMB12:n moduloidakseen antimikrobisten PR-proteiinien eksosytoosia ja lisäämällä antiviraalista aktiivisuutta [129]. Siksi AGO1:llä ja AGO2:lla voi olla erillinen rooli kasvien antiviraalisessa puolustuksessa.

AGO4, AGO6 ja AGO9 ovat tärkeimmät efektorit, jotka toimivat Arabidopsiksen RdDM-reitillä. AGO4:n, AGO6:n ja AGO9:n osoitettiin sitovan 24 nt:n heterokromaattisia pieniä häiritseviä RNA:ita (het-siRNA:ita) ja edistävän RdDM-reittiä [130,131]. Raportoitiin, että AGO4 taisteli pääasiassa DNA-virusten aggressiota vastaan ​​moduloimalla RdDM:ää, kuten raportoitiin, että ago4-mutantit olivat alttiita BCTV-infektiolle BCTV-genomin vähentyneen hypermetylaation vuoksi [47]. Yllättäen ago4-mutantit ovat herkkiä useille RNA-viruksille, kuten nauris crinkle -virukselle (TCV), bambumosaiikkivirukselle (BaMV) ja Plantago asiatica mosaiikkivirukselle (PlAMV) [132–135] RdDM-reitistä riippumattoman mekanismin kautta [135]. ].

Muiden AGO-efektorien tavoin AGO5 osallistuu yhdessä AGO2:n kanssa perunavirus X (PVX) systeemisen infektion vähentämiseen, kun taas AGO5:llä on vain toissijainen rooli, kun AGO2 voitetaan alun perin tartunnan saaneissa lehdissä [136]. AGO7:n (tunnetaan myös nimellä ZIP) havaittiin olevan ratkaiseva tekijä TCV-infektion aikana kuvapohjaisella sairausanalyysimenetelmällä [132]. AGO7 voi myös sitoutua miR390:n kanssa ja välittää endogeenisen siRNA:n biogeneesiä [137]. AGO10 toimii yhteistyössä AGO1:n kanssa ja sillä on tarpeeton rooli kukintojen kudosten suojaamisessa naurismosaiikkiviruksen (TuMV) [125] infektiolta, sen lisäksi, että se säätelee versojen apikaalisen meristeemin kehitystä sitomalla miR165/166:ta [138].

Mielenkiintoista on, että joistakin tärkeistä viljelykasveista, kuten riisistä ja tomaatista, löydettiin yli 10 AGO-ortologia, joista 19 ortologia oli riisistä ja 15 tomaatista. Niillä voi kehittyä erilaisia ​​toimintoja virusten vastaisessa puolustuksessa ja kehityksessä. Esimerkiksi, kun RSV-kuoriproteiini (CP) on infektoitunut riisin raita-antiviruksella (RSV), laukaisee JA:n kertymisen ja säätelee JAMYB:lle reagoivaa transkriptiotekijää sitoutumaan suoraan AGO18-promoottoriin AGO18-transkription aktivoimiseksi [139]. AGO18 sitoo ja eristää miR168:n, mikä lisää AGO1:n kertymistä virustenvastaiseen prosessiin [140]. Toisaalta AGO18 sitoo ensisijaisesti miR528:aa lisäämään ROS:n kertymistä ja vastustaakseen virusinfektiota [141]. Julkaisemattomat tietomme osoittavat myös, että joillakin tomaateissa olevilla AGO-ortologeilla on erilaiset toiminnot verrattuna Arabidopsikseen.

5. RNAi:n virussuppressorit

Isäntäkasvien ja virusten välisessä puolustus- ja vastapuolustuksen käsikilpailussa virukset kehittävät VSR-proteiineja inhiboimaan RNAi-pohjaista antiviraalista luontaista immuniteettia. VSR:t kohdistavat RNAi-pohjaisen antiviraalisen reitin eri vaiheisiin vastustaakseen konservoitunutta antiviraalista immuniteettia (taulukko 1) [142,143].

Hyvin yleinen VSR:ien vastatoimi on siRNA:n monistumisen estäminen. Esimerkiksi CMV:n 2b, tomaatin keltaisen lehtikiharan kiinaviruksen (TYLCCNV) C1 ja riisinkeltaisen stuntviruksen (RYSV) P6 häiritsevät sekundaarisen siRNA:n RDR1/6-riippuvaista biogeneesiä [155,180,185]. Tomaattien keltaisen lehtikiharan geminiviruksen (TYLCV) V2, RSV:n P2 ja riisin raitamosaiikkiviruksen (RMSV) P4 ovat vuorovaikutuksessa SGS3:n kanssa sekundaarisen siRNA:n biogeneesin estämiseksi [181,182,189]. Geminivirus V2 -proteiinin havaittiin myös häiritsevän kalmoduliini-CAMTA3-vuorovaikutusta, mikä vähentää RDR6:n ilmentymistä vsiRNA:n biogeneesin vähentämiseksi [97].

Joidenkin VSR:ien havaittiin estävän viruksen dsRNA:n havaitsemista tai pilkkomista. Esimerkiksi TCV:n CP voi estää DCL4:n pilkkomisen [55], ja kukkakaalin mosaiikkiviruksen (CaMV) P6 on vuorovaikutuksessa DRB4:n kanssa estäen dsRNA:n sitoutumisen [154]. Jotkut VSR:t, kuten tomaattitäpläisen lakastumisviruksen (TSWV) NS:t ja perunaviruksen Y (PVY) Hc-Pro, sitoutuvat myös pitkään viruksen dsRNA:han, mikä voi estää virus-RNA:iden havaitsemisen tai käsittelyn DCL:illä. Jotkut muut VSR:t voivat kohdistaa suoraan vsiRNA:han RNAi-pohjaisen antiviraalisen synnynnäisen immuniteetin estämiseksi. Esimerkiksi P19, tunnettu tombusvirusten VSR, sitoo ja eristää vsiRNA:ta, kun taas bataattien kloroottisen stunt criniviruksen (SPCSV) RNaasi III sitoo ja välittää siRNA:n hajoamista, ja kesäkurpitsakeltaisen mosaiikkiviruksen (ZYRNAMV) HC-Pro vähentää stabiilisuus häiritsemällä siRNA-metylaatiota HEN1:llä. Effektori-AGO:iden antiviraalisen toiminnan häiritseminen on toinen strategia, jota jotkut VSR:t käyttävät. Esimerkiksi potato leafroll viruksen (PLRV) P0 voi välittää AGO1:n hajoamista, ja CMV:n 2b voi häiritä AGO1:tä ja AGO4:ää ja häiritä niiden toimintaa.

Yllättäen, toisin kuin yllä olevat VSR:t, jotka vastustavat RNAi-pohjaista antiviraalista luontaista immuniteettia, muiden mekanismien havaittiin antagonisoivan joidenkin VSR:ien aiheuttamia antiviraalisia vasteita. Äskettäin tehty tutkimus osoitti, että VSR p19 voi olla vuorovaikutuksessa reseptorin kaltaisen kinaasin (RLK) kanssa MITÄÄN MERISTEM 1:n (BAM1) ja BAM2:n kanssa estääkseen RNA:n vaimentamisen solusta soluun [193, 194]. Tomaattilehtien kihara Guangdongin viruksen (ToLCGdV) VSR C4 voi myös olla vuorovaikutuksessa BAM1:n kanssa PTGS:n ja käänteismetylaatiovälitteisen TGS:n tukahduttamiseksi [195]. Lisäksi kertynyt näyttö viittaa autofagian moduloimiin kasvi-virusvuorovaikutuksiin [196,197]. On raportoitu, että lastireseptori BRCA1:n NAAPURI (NBR1) voisi kohdistaa HC-Pro:n tukahduttaakseen TuMV:n viruksen kertymisen [198]. Kuitenkin B, ohraraitamosaiikkiviruksen (BSMV) VSR, kohdistui AUTOFHAGY PROTEIN7:ään (ATG7) häiritsemään ATG7–ATG8-vuorovaikutusta ja edistämään virusinfektiota [199].

Nyt tiedämme, että melkein kaikilla kasviviruksilla, erityisesti patogeenisillä kasviviruksilla, on yksi tai useampi VSR. VSR:ien olemassaolo edistää virusten ja virusepidemioiden onnistunutta aggressiota; ne myös estävät vakavasti arvostustamme kasvien ja muiden eukaryoottien välttämättömästä antiviraalisesta luontaisesta immuniteetista.

For more information:1950477648nn@gmail.com