Hiirien masennuslääkevaikutuksia ja mekanismeja käsittelevien fenyylietanoliglykosidien suhteen ja mekanismeja

Abstrakti:

 

Tämän tutkimuksen tarkoituksena on tutkia terapeuttisia vaikutuksia ja mekanismejaCistanche -fenyylietanoliglykosidit(CPHG: t) hiirten kroonisen arvaamattoman lievän stressin (cums) aiheuttamasta masennuksen kaltaisesta käyttäytymisestä. Hiiret jaettiin satunnaisesti kontrolliryhmään, malliryhmään, suuriannoksisiin CPHGS -ryhmään (700 mg/kg), keskiannoksen CPHGS -ryhmään (350 mg/kg), pieniannoksisen CPHGS -ryhmän (175 mg/kg) ja fluoksetiiniryhmään (15 mg/kg). Neljän viikon vastaavien lääketoimenpiteiden jälkeen suoritettiin neuro -käyttäytymiskokeet; Entsyymissä kytkettyjä immunosorbenttimääritystä käytettiin seerumin välittäjäaineiden tasot havaitsemaan, samoin kuin tulehduksellisten tekijöiden ja välittäjien pitoisuus hippokampuksen kudoksessa. Hematoksyliini-eosiini- ja NISSL-värjäystä käytettiin patologisten muutosten havaitsemiseksi hippokampuksen kudoksessa. Immunohistokemiaa ja immunofluoresenssimenetelmiä käytettiin analysoimaan astrosyyttien ja mikroglian tiheyttä hiirten hippokampuskudoksessa, samoin kuin Toll-tyyppisen reseptorin 4/ydintekijän κB/NOD-kaltaisen reseptoriproteiinin 3 (TLR4/NF-KB/NLRP3) ekspressiotasot. Tulokset osoittivat, että CPHG: t voivat parantaa masennuksen kaltaista käyttäytymistä hiirissä, lisätä makean veden suosimista ja vähentää liikkumattomuutta aikaa, mikä parantaa merkittävästi serotoniinin ja dopamiinin tasoja hiiren seerumissa estäen samalla tulehduksellisten välittäjien ja tekijöiden ilmentymistä hippokampuksessa. Immunohistokemiallinen analyysi osoitti, että CPHG: t voivat lisätä astrosyyttien tiheyttä hippokampuksessa, vähentää mikroglian aktivointia ja estää NLRP3-tulehduksellisten proteiinien ilmentymistä. Immunofluoresenssikokeet osoittivat, että mekanismi, jonka kautta CPHG: t vähentävät tulehduksen muodostumista, vähentämällä TLR4/NF-KB: n signalointireitin aktivointia hippokampuksen kudoksessa. Yhteenvetona voidaan todeta, että CPHG: llä on merkittäviä masennuslääkevaikutuksiaCumsin aiheuttama masennus, kuten käyttäytyminen, mahdollisesti välittäjäaineiden tasojen säätelyn ja neuroinflammatoristen vasteiden estämisen avulla tarjoamalla kokeellista näyttöä sen soveltamisesta masennuksen hoidossa.

Avainsanat: Cistanche -fenyylietanoliglykosidit; masennus; neuroinflammatorinen vaste; astrosyytit; TLR4/NFKB/NLRP3 -reitti

Yrtti Cistanche -raaka -aineet

 

Masennus on yleinen ja monimutkainen afektiivinen mielenterveyshäiriö, jolle on ominaista oireet, kuten matala mieliala, anhedonia, hidas ajattelu ja fysiologinen toimintahäiriö. Vakavissa tapauksissa itsemurha -taipumuksia voi jopa esiintyä [1]. "Kiinalaisten asukkaiden ravitsemus- ja kroonisen sairauden tilasta" (2020) raportti (2020) mukaan masennuksen esiintyvyys kotimaassani saavutti 2,1%, ja Maailman terveysjärjestö on listattu yhdeksi sairauksista, joilla on suurin vammaisuus maailmassa [2]. Koska masennuksen patogeneesi on erittäin monimutkainen, erityinen mekanismi on tähän mennessä epäselvä, mikä on valtava haaste sen hoitoon. Viime vuosina kotimaiset ja ulkomaiset tutkijat ovat havainneet, että masennus voi liittyä läheisesti immuunitulehdukselliseen aktivointiin. Tulehduksellisen vasteen aktivoitumisprosessissa keskushermostossa hippokampuksen tulehduksellisten solujen aktivointi on sen ominainen ilmenemismuoto. Jatkuvasti aktivoidut hippokampuksen tulehdukselliset solut indusoivat useiden tulehduksellisten sytokiinien vapautumisen, muodostaen tulehduksellisen sytokiinin "kaskadin vaikutuksen", osallistuen siten mielenterveysongelmien, kuten masennuksen, patogeneesiin ja patologiseen prosessiin [3]. Tällä hetkellä tämän taudin hoito riippuu pääasiassa länsimaisesta lääketieteestä, kuten fluoksetiinista, venlafaksineista, duloksetiinista jne. Kuitenkin on puutteita, kuten alhainen kliininen parannusaste, näkyvät jäännösoireet, korkea toistumisaste ja helppo aiheuttaa elinten toimintahäiriöitä, mikä rajoittaa sen kliinistä käyttöä [4]. Perinteisessä kiinalaisessa lääketieteessä on enemmän kohteita ja vähemmän sivuvaikutuksia emotionaalisten sairauksien hoidossa, ja sillä on laajat soveltamisnäkymät masennuksen ja sen komplikaatioiden hoidossa [5].

 

Cistanche Deserticolaon kuivattu lihainen varsi Cistanche Deserticola YCMA: n ja/tai Cistanche -tubulosa (Schenk) Wightin fosforilehden kanssa, jotka molemmat ovat Orobanchaceae -perheen kasveja. Se on hyvä ruoka- ja lääketuote. Nykyaikaiset farmakologiset tutkimukset ovat vahvistaneet, että Cistanche Deserticolalla on neuroprotektiivinen vaikutus (se voi estää Alzheimerin tautia, Parkinsonin tautia jne.). "Cistanche -kokonaisglykosidit" -kapselit, jotka koostuvat pääasiassa fenyylietanoliglykosideista Cistanche Deserticolassa, käytetään laajasti neurologisten sairauksien hoidossa [6]. Fenyylietanoliglykosidit (CPHG) ovat tärkeitä aktiivisia ainesosia Cistanche -kokonaisglykosidissa. Heillä on useita biologisia toimintoja, kuten kasvaimen vastainen, immunomodulaatio ja antioksidantti, ja heillä on hyvät soveltamisnäkymät [7]. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että CPHG: t voivat suojata monoamiinien vaikutuksia ja lievittää masennusoireita lisäämällä keramidin metabolista reittiä boutia nigrassa ja dopamiinin (DA) sisältöä striatumissa [8]; Se voi myös säätää hiirten masennusmaista käyttäytymistä perimenopausaalisella oireyhtymällä parantamalla aivojen monoamiinin välittäjäaineiden tasoa [9]. Sen käytöstä ei ole kuitenkaan ollut raportteja kroonisen ennakoimattoman lievän stressin (CUMS) aiheuttaman hiiren masennusmallin hoidossa, ja sen vaikutusmekanismi on vielä selvitettävä. Aikaisemman tutkimuksen perusteella ja yhdistettynä antioksidatiivisessa stressissä olevien CPHG: ien nykyiseen potentiaaliin, säätelemällä neuroinflamointia ja estämään neuronaalista apoptoosia, tässä tutkimuksessa käytettiin CUMS: n indusoimaa hiiren masennusmallia tutkimaan CPHG: n masennuslääkevaikutusta ja TLR4/NF-KB/NLRP3-polun vaikutuksen vaikutuksen mekanismia CPHG: n masennuslääkevaikutus, laajentaa sen kliinistä sovellusta ja kehittää ja käyttää sitä terveysruoana.

 

1 Materiaalit ja menetelmät

1.1 Materiaalit ja instrumentit

CPHGS -uutte (fenyylietanoliglykosidit uutteessa, joka on suurempi tai yhtä suurempi kuin 85%, mukaan lukien echinacosidi, joka on suurempi tai yhtä suuri kuin 40%, verbascosidi, joka on suurempi tai yhtä suuri kuin 16%; erän luku: 20231221, Xinjiang Hotan Dichen Pharmaceutical Biological Co., LTD.); Fluoksetiinihydrokloridikapselit (fluoksetiini, FLX) (erä numero: 8533C, Patheon France Pharmaceutical Company, Ranska); 5- hydroxytryptamiini (5- HT), DA -havaitsemispakkaus (eränumero: 20240305, 20240305, Shanghai Future Industrial Co., Ltd.); indusoitava typpioksidisyntaasi (iNOS), syklooksigenaasi -2 (syklooksigenaasi -2, Cox -2), prostaglandiini E2 (prostagland E2, PGE2), tuumorinekroositekijä alfa (tuumori nekroositekijä alpha, Tnf-), interleuoki 1. (interleukin -1, il -1), il -18 (interleukin -18, il -18), il -6 (interleukin 6, iL -6), Interferon- (Interferon-, i. Entsyymidoidutut immunosorbenttien määrityssarjat (erä nro: ER050A332132, ER035PD09812, ER048H753146, ER10X6398452, ER051H648219, ER09X2865471, ER049H746823 Wuhan Elarite Biotechnology Co., Ltd.); ionisoitu kalsiumia sitova sovitin molekyyli 1 (ionisoitu kalsiumia sitovaa adapterimolekyyli 1, IBA {-1) monoklonaalinen vasta-aine, glia-fibrillaarinen happama proteiini (GFAP) monoklonaalinen vasta-aine, nod-nyökkäinen reseptoriproteiini 3 (NLRP3) monoklonaalinen vasta-aine (batch-nro 3 (NLRP3). Gr 3417890-15, gr 3379124-30, gr 3285067-28, abcam, uk); Tollimainen reseptori 4 (TLR4) monoklonaalinen vasta-aine, fosforyloitu ydintekijä-KB P65 (fosfo-nukleaarinen tekijä-KB P65, P-NF-KB P65) monoklonaalinen vasta-aine (BATCH nro 10032512, 00128965, Wuhan Sanying Biotechnology Co., LTD.); 4% paraformaldehydi, immunofluoresenssivärjäyspakkaus (erä nro 20240106, 20240315, Shanghai Bio-Technology Co., Ltd.); Hematoksyliini ja eosiini (heksa) eosiini, He) värjäyspakkaus, Nissl -värjäyspakkaus (erä numero: 20240401, 20240402, Liaoning Meilun Biology); Immunohistokemia Universal Kit (eränumero: 43731a, Peking Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd.).
ME2 0 4e 1/10, 000 elektroninen tasapaino (Mettler Toledo, USA); Milli-Q-laboratorion puhdas vesijärjestelmä (Merck, Saksa); Spectramax ID3 monitoiminen mikrolevylukija (Molecular Devices, USA); Leicadm 2000 -fluoresenssi pystyssä mikroskooppi (Leica, Saksa); 63008 avoin kenttä, 63010 korotettu plus sokkelo, 63022 pakotettu uinti, DB001 Morris Water Maze, Smart 3.0 Eläinten käyttäytymisen video -analyysijärjestelmä (Shenzhen Ruiwode Life Science Technology Co., Ltd.).

60 SPF C57BL/6 -hiiriä, punnitus 18-22 g, ostettiin Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd.
Hiiriä pidettiin SPF-ympäristössä, ja ympäristön lämpötilaa säädettiin (21 ± 2) asteessa, kosteus pidettiin 60% ± 10%: lla ja 12 tunnin kevyen pimeän syklin. Hiirillä oli vapaa pääsy ruokaan ja veteen, ja koe alkoi yhden viikon mukautuvan ruokinnan jälkeen. Kokeelliset eläimet pidettiin kiinalaisen lääketieteen Shaanxin yliopiston kokeellisessa eläinkeskuksessa. Kaikista tämän tutkimuksen hiiren kokeellisista menettelyistä on hyväksytty Shaanxin kiinalaisen lääketieteen yliopiston eläinkokeiden etiikkakomitea (Sucmdl20231015003).

 

1.2 Kokeelliset menetelmät

1.2.1 Ryhmittely, mallintaminen ja lääkkeen antaminen

Yhden viikon adaptiivisen 7--viikko-vanhojen SPF C57BL/6 -hiirien syöttämisen jälkeen seulottiin sokerivesipreferenssitestin kautta ei-elastiset hiiret, jotka täyttivät seuraavien kokeiden vaatimukset ja jaettiin satunnaisesti kontrolliryhmään (CON), malliryhmä (MOD), korkean annos CPHGS-ryhmän (CPHGS-H; (CPHGS-M; 350 mg/kg), pieniannoksinen CPHGS-ryhmä (CPHGSL; 175 mg/kg) ja fluoksetiiniryhmä (FLX; 15 mg/kg), 10 hiirtä kussakin ryhmässä. CON: ta lukuun ottamatta muiden ryhmien hiirille aloitettiin cums -stressi 4 viikon ajan [10]. Käytettiin yhteensä 10 stressitekijää, mukaan lukien rajoitus (1 h), ravistaminen (1 h), hännän jousitus (1 h), 45- asteen häkin kallistus (24 h), märkä vuodevaatteet (24 tuntia), tyhjä häkki (24 h), yövalaistus (12 h), 41 asteen kuumavesi uinti 5 min, 4 asteen jääveden uintia 5 minuutin ajan ja hännän kiinnitys 2 min. Kaksi ärsykettä valittiin satunnaisesti joka päivä, ja sama ärsyke ei esiintynyt kahdessa peräkkäisessä päivässä. 4 viikon mallinnuksen jälkeen CPHGS-H: lle, CPHGS-M: lle ja CPHGS-L-hiirille annettiin vastaavia CPHGS-annoksia levittämällä kehon painon mukaan, ja FLX-hiirille annettiin fluoksetiinia levittämällä (10 mg/kg). CPHGS-M: n ja FLX: n annos hiirillä muutettiin aikuisten ja hiirten välisen kehon pinta-alan ekvivalentin kertoimen mukaisesti, ja 2 kertaa vaihtelu oli matala ja suuret CPHGS-annokset. CON- ja MOD -hiirille annettiin yhtä suuri määrä deionisoitua vettä levittämällä. Hiiret hajautettiin kerran päivässä 4 viikon ajan. Neuro -käyttäytymiskokeet suoritettiin 8. viikolla.

 

1.2.2 Neuro -käyttäytymiskoe

1.2.2.1 Sokerivesien mieltymyskoe

Ennen sakkaroosin etuustestiä (SPT) hiiriä tulisi sijoittaa yhtenä häkkiin ja sopeutettava sitten sokerivesiin 3 päivän ajan. Ensimmäisenä päivänä kaksi pulloa 1% sakkaroosivettä annettiin 24 tunnin ajan, ja toisena päivänä yksi pullo sokerivettä ja yksi pullo deionisoitua vettä annettiin 24 tunnin ajan. Kolmantena päivänä sokeriveden ja puhtaan veden sijainnit vaihdettiin 24 tuntia, ja koe päättyi 24 tuntia myöhemmin. Neljäntenä päivänä hiiret paastoivat ja heiltä vedettiin vettä 24 tunnin ajan. Viidentenä päivänä yksi pullo sokerivettä ja yksi pullo puhdasta vettä annettiin punnituksen jälkeen, ja sijainnit vaihdettiin 12 tunnin kuluttua. 24 tunnin kuluttua kaksi pulloa otettiin pois ja punnittiin uudelleen, ja sokerivesien kulutusaste laskettiin (sokerin veden kulutusaste=sokerivesien kulutus/(sokerin vedenkulutus + vedenkulutus) × 100%).

 

1.2.2.2 Avoin kenttätesti

Avoin kenttätesti (OFT) suoritettiin 50 cm × 50 cm × 50 cm: n kuution avoimessa laatikossa. Laatikon keskusta määritettiin neliöksi, jonka sivupituus oli 25 cm. Hiiret asetettiin laatikon keskelle ja annettiin sopeutua 5 minuutiksi. Hiirien liikkeen etenemissuunta analysoitiin viimeisen 5 minuutin aikana. Arviointiindikaattorit sisälsivät hiirten kokonaisliikkeen etäisyyden avoimessa kentässä, aktiivisuusajan avoimen kentän keskellä ja kuinka monta kertaa he tulivat keskustaan. 1.2.2.3 Häntäjousitustesti häntä suspensiotestin (TST) on suspendoida hiiri sen hännän perusteella siten, että sen pää pidetään tietyllä etäisyydellä maasta. Hiirien taistelu 6 minuutin kuluessa kirjattiin, ja hiirten liikkumattomuusaika viimeisen 4 minuutin aikana analysoitiin.

 

1.2.2.4 Pakotettu uimakoe

Pakotettu uimatesti (FST) on sijoittaa hiiret läpinäkyvään lieriömäiseen tynnyriin (halkaisija 15 cm × 50 cm korkeus), joka on täynnä (25 ± 2) astetta vettä, vedenpinta saavuttaa 20 cm. Hiirien kamppailu veteen 6 minuutin kuluessa rekisteröitiin, ja hiirten liikkumattomuuden aika analysoitiin viimeisen 4 minuutin aikana.

 

1.2.3 Näytteenkeruu

Kahdeksannen viikon lopussa hiiret nukutettiin syvästi natriumpentobarbitaalin injektiolla (3%, 10 ml/kg) intraperitoneaalisesti. Anestesian jälkeen anestesiavaltio vahvistettiin tarkkailemalla hidasta hengitystä, lihasten rentoutumista eikä vastetta kirurgiseen leikkaukseen. Sitten hiirten veri kerättiin silmien poistolla, ja hiiret tapettiin kohdunkaulan dislokaatiolla. Sydän perfusoitiin suolaliuoksella, ja sitten aivot avattiin nopeasti ja ehjät aivot poistettiin. Se huuhdeltiin esjäähdytetyllä suolaliuoksella ja puolet siitä kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 72 tuntia; Toisen puoliskon hippokampuksen kudos erotettiin jäällä ja varastoitiin nestemäiseen typeen myöhempää käyttöä varten. Ota 10 mg hiiren hippokampuksen kudoksenäytettä, lisää esjäähdytetty fysiologinen suolaliuos massa-tilavuussuhteella 1: 9 ja homogenoi mekaanisesti jäävesihauteessa. Homogenisoinnin jälkeen sentrifugi 4 000 r/min 15 minuutin ajan (keskipakoisäde 4,5 cm) kerää supernatantti havaitsemista varten.

 

1.2.4 Neurotransmitter -indeksin määrittäminen

Ota asianmukainen määrä hiiren seerumia ja hippokampuksen kudoksen homogenaattia supernatanttia ja havaitse 5- HT- ja DA -sisällön sisältö Kit -operaatiomenetelmän mukaisesti.

 

1.2.5 Hippokampuksen kudoksen biokemiallisen indeksin määrittäminen

Ota hippokampuksen kudoksen homogenaatin supernatantti ja käytä BCA -sarjaa proteiinipitoisuuden määrittämiseen. Kit-ohjeiden mukaan tulehduksellisten välittäjien (iNOS, Cox -2 ja PGE2) ja tulehduksellisten tekijöiden (Tnf, IL -1, il -18 {-1}, ifn-) määrittämisen homogenaatin tonze-merkinnän tonze-merrinnän ja pGE: n ja {3} {{{ ja kunkin aineen sisältö lasketaan, ja tiedot tallennetaan ja analysoidaan tilastollisesti.

 

1.2.6 Hän värjää hippokampuksen kudoksen

Koko aivokudosnäytteet, jotka oli kiinnitetty yli 72 tunniksi, otettiin ja parafiinileikkeet tehtiin 4 μm: n paksuudella. Ksyleenillä tehdyn kastelubakteerin jälkeen näytteet hydratoitiin gradientti -etanolilla (upotettiin 100% etanoliin I ja II 5 minuutin ajan ja 95%: iin, 90%: iin, 80% ja 70% etanoliin vastaavasti 2 minuutin ajan) ja pestiin kolme kertaa PBS: llä, värjätty eosiinilla 5 minuutin ajan, huuhdellaan 1%: lla, joka on 1%: lla. Happoetanoli 2 sekunnin ajan ja huuhdeltu vesijohtovedessä 10 minuutin ajan. Dehydratoitu gradientti-etanolilla (80% etanolia 2 minuutin ajan, 95% etanolin 2 minuutin, etanolin I ja 100% etanolin II ajan 5 minuutin ajan), läpinäkyvä ksyleenillä, suljettu neutraalilla kumilla ja kuivattuna ilmakuivattuina. Hippokampuksen kudossolujen morfologiset muutokset kussakin hiiriryhmässä havaittiin mikroskoopilla.

 

1.2.7 hippokampuksen kudoksen nissl -värjäys

Parafiiniosat, jotka on valmistettu kohdassa "1.2.5", kastettiin ja hydratoitiin, värjättiin sitten NISSL-värjäysliuoksella 10 minuutin ajan, pestiin kahdesti tislatulla vedellä 3 minuutin ajan joka kerta, dehydratoitiin gradientti-etanolilla (80% etanolia 2 minuutin ajan, 95% etanolia 2 minuutin ajan, etanolin I ja 100-prosenttisesti etanoli II: n 5 minuutin ajan. Hippokampuksen kudossolujen morfologiset muutokset kussakin hiiriryhmässä havaittiin mikroskoopilla.

 

1.2.8 Hippokampuksen kudoksen immunohistokemia

Parafiiniin upotetut hippokampuksen kudosnäytteet prosessoitiin immunohistokemian (IHC) värjäyksellä universaalin immunohistokemian ohjeiden mukaisesti. Kasvatusten, nesteytyksen, antigeenin korjauksen, peroksidaasin eston ja estämisen jälkeen IBA -1 (1: 400), GFAP (1: 400), LRP31: 300) ja CASPSAE1 (1: 400) primaariset vasta -aineet lisättiin ja inkuboitiin yön yli 4 asteessa. DAB: n värikehityksen jälkeen ydinvärjäyksen, kuivumisen ja tiivistymisen jälkeen havaittiin IBA1: n, GFAP: n, NLRP3: n ja CaspSAE -1 positiivisen ekspression, ja valomikroskoopilla ja kuvat analysoitiin Image J.

1.2.9 Hippokampuksen kudoksen immunofluoresenssin havaitseminen

Parafiiniin upotetut hippokampuksen kudosnäytteet prosessoitiin immunofluoresenssivärjäyksellä immunofluoresenssisarjan ohjeiden mukaisesti. Parafiiniosat, jotka on valmistettu kohdassa "1.2.5", dewaxed, hydratoitu, antigeeni korjattiin ja estettiin, ja sitten TLR4 (1: 400) ja P-NF-KB P65 (1: 200) primaariset vasta-aineet lisättiin osioihin ja inkuboitiin yönä 4 asteessa. Ensisijainen vasta -aine poistettiin seuraavana päivänä, pestiin kolme kertaa PBS: llä, ja sekundaarinen vasta -aine (1: 500) lisättiin ja inkuboitiin pimeässä 1 tunnin ajan. Kolme kertaa pesemisen jälkeen leikkeet suljettiin kiinnittyvällä DAPI: llä. Hippokampuksen kudosalueen fluoresenssisignaali havaittiin fluoresenssimikroskopialla ja kuvat analysoitiin kuvalla J.

 

1.3 Tietojenkäsittely

Kokeelliset tiedot analysoitiin tilastollisesti käyttämällä tilastollista ohjelmistoa SPSS 26. 0 ja GraphPad Prism 9. 0. Tiedot ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonta (x ± s) ja analyysi suoritettiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVA: ta. Vertailu kahden ryhmän välillä suoritettiin käyttämällä Dunnettin testiä. P<0.05 indicated that the difference was statistically significant.