Viimeaikaiset edistysaskeleet punkkiantigeenien löytämisessä ja punkkien vastaisten rokotteiden kehittämisessä, osa 1

Abstrakti:

Punkit voivat vaikuttaa vakavasti ihmisten ja eläinten terveyteen kaikkialla maailmassa ja aiheuttaa merkittäviä taloudellisia menetyksiä vuosittain. Kemiallisia punkkien torjuntaan käytetään laajasti punkkien torjunta-aineita, jotka vaikuttavat negatiivisesti ympäristöön ja johtavat punkkien vastustuskykyisten punkkipopulaatioiden syntymiseen. Rokotetta pidetään yhtenä parhaista vaihtoehtoisista tavoista torjua punkkeja ja punkkien välittämiä sairauksia, koska se on halvempi ja tehokkaampi kuin kemiallinen torjunta. Monia antigeenipohjaisia ​​rokotteita on kehitetty transkriptomiikan, genomiikan ja proteomisten tekniikoiden nykyisen kehityksen seurauksena.

Jotkut näistä (esim. Gavac® ja TickGARD®) ovat kaupallisesti saatavilla ja niitä käytetään yleisesti eri maissa. Lisäksi tutkitaan huomattava määrä uusia antigeenejä uusien punkkien vastaisten rokotteiden kehittämisen näkökulmasta.

Lisätutkimusta tarvitaan kuitenkin uusien ja tehokkaampien antigeenipohjaisten rokotteiden kehittämiseksi, mukaan lukien erilaisten epitooppien tehokkuuden arviointi eri punkkilajeja vastaan ​​niiden ristireaktiivisuuden ja korkean immunogeenisyyden varmistamiseksi. Tässä katsauksessa käsittelemme viimeaikaisia ​​edistysaskeleita antigeenipohjaisten rokotteiden (perinteisten ja RNA-pohjaisten) kehityksessä ja annamme lyhyen yleiskatsauksen uusien antigeenien viimeaikaisista löydöistä sekä niiden lähteistä, ominaisuuksista ja niiden testaamiseen käytetyistä menetelmistä. tehokkuutta.

Antigeenit ovat aineita, jotka voivat aiheuttaa immuunivasteen, mukaan lukien bakteerit, virukset, solut jne. Immuniteetti on kehon kykyä reagoida ulkoisiin antigeeneihin, mukaan lukien synnynnäinen immuniteetti ja hankittu immuniteetti. Antigeenien ja immuniteetin välinen suhde on läheinen, ja immuniteetti voi tunnistaa antigeeneja ja hyökätä niitä vastaan, mikä suojaa kehoa taudeilta. Esimerkiksi kun ihmiskeho altistuu tietylle taudinaiheuttajalle, immuunijärjestelmä tunnistaa antigeenin ja tuottaa vasta-aineita sen kimppuun välttääkseen taudin. Siksi antigeenien ja immuniteetin välinen vuorovaikutus on tärkeä mekanismi hyvän terveyden ylläpitämisessä. Tästä näkökulmasta meidän on siis kiinnitettävä huomiota vastustuskyvyn parantamiseen päivittäisessä elämässämme. Cistanchella on merkittävä vaikutus vastustuskyvyn parantamiseen. Cistanche sisältää runsaasti erilaisia ​​antioksidantteja, kuten C-vitamiinia, C-vitamiinia, karotenoideja jne. Nämä ainesosat voivat poistaa vapaita radikaaleja, vähentää oksidatiivista stressiä ja parantaa immuunijärjestelmän vastustuskykyä.

Napsauta cistanche deserticola -lisäosaa

Avainsanat:

rokotteet; antigeeniehdokkaat; punkkien vastainen rokote; punkkien hallinta.

1. Esittely

Punkit ovat ulkoloisia, jotka saastuttavat ihmisiä ja eläimiä ja aiheuttavat merkittäviä taloudellisia menetyksiä. Ne ovat toiseksi tärkeimmät vektorit tautien leviämisessä ihmisillä hyttysten jälkeen [1,2]. Ne ovat myös yksi tärkeimmistä vektoreista maailmanlaajuiseen karjateollisuuteen ja lemmikkieläimiin vaikuttavien tautien leviämisessä [3–5]. Punkkeilla on vähän luonnollisia vihollisia, mikä tekee punkkitartuntojen hallinnasta haastavaa. Kemialliset punkkimyrkyt ovat olleet vain osittain tehokkaita, ja niillä on useita ei-kohdehaittoja, kuten punkkien valinta punkkien ja eläintuotteiden ympäristön ja eläintuotteiden saastumisesta kemikaalijäämillä [6].

Lisäksi punkkien levittämien tautien torjumiseksi käytetään eräissä maissa joitakin antigeenipohjaisia ​​rokotteita; Tarvitaan kuitenkin uusia ja tehokkaampia lähestymistapoja, mukaan lukien uusien rokotteiden kehittäminen, jotka kohdistuvat punkkitartuntojen ja patogeenien aiheuttamiin infektioihin [7,8].

Perinteisesti "eristä-inaktivoi-injektoi" -periaatteella on ollut ratkaiseva rooli loisten/patogeenien torjuntaan tarkoitetun rokotteen suunnittelussa ja kehittämisessä. Ensimmäisen sukupolven rokotteet koostuivat elävistä, heikennetyistä tai kuolleista taudinaiheuttajista. Toisen sukupolven rokotteet koostuivat puhdistetuista loisten/patogeenien komponenteista, ja ne kehitettiin soluviljelmän, polysakkaridikemian, yhdistelmä-DNA-tekniikan ja immunologian kehityksen seurauksena [9,10]. Genomiikan ja muun "omiikan" edistyminen viimeisen kahden vuosikymmenen aikana on johtanut "kolmannen sukupolven" rokotteiden kehittämiseen, jotka perustuvat sellaisiin teknologioihin kuin toiminnallinen omiikka, käänteinen rokotus ja systeemibiologian lähestymistapa.

Tavanomaisten rokotteiden kehitysmenetelmien rajoitusten voittamiseksi rokotteiden kehittämisestä on tullut entistä räätälöidympää keskittyen antigeeniosiin, joihin suojaavat immuunivasteet kohdistuvat [11,12], ja laaja näkökulma taudinaiheuttajasta ja sen vuorovaikutuksesta isännän immuunijärjestelmä [13]. Siksi nykyaikainen rokotologia luottaa yhä enemmän uusiin omiikkalähestymistapoihin, joissa hyödynnetään korkean suorituskyvyn huipputeknologioita, kuten genomiikkaa, transkriptomiikkaa ja proteomiikkaa, sekä perusimmunologian, isäntä-patogeenibiologian, immunomiikan, kehittyneen bioinformatiikan, laskennallisen mallintamisen ja paranneltujen edistysaskeleiden ohella. ymmärrystä ja teknologisia innovaatioita.

Kemikaalien käyttöön verrattuna rokottaminen on viisas vaihtoehto, koska se on ympäristön kannalta turvallista ja kustannustehokasta torjua punkkitartuntoja [12,14]. Vaikka rokotus on järkevä strategia punkkitartunnan hillitsemiseksi, vain muutamia rokotteita on toistaiseksi kaupallistettu, ja ristiinreaktiivisen immuniteetin indusoimisesta punkkilajeja vastaan ​​on kiinnitetty vain vähän huomiota [15].

Uusien rokotteiden kehittämiseksi on ratkaisevan tärkeää tunnistaa ja karakterisoida uudet antigeeniehdokkaat, jotka olisivat konservoituneempia ja pystyisivät indusoimaan ristiinreaktiivisen immuniteetin isäntälajissa. Tämän katsauksen tavoitteena on antaa yleiskuva perinteisistä ja RNA-pohjaisista rokotteista ja niiden käyttömahdollisuuksista sekä uusista antigeeneistä, joita voidaan hyödyntää lupaavina antigeeniehdokkaina rokotteiden kehittämisessä.

2. Antigeenien tunnistaminen: etenemissuunnitelma punkkien vastaisen rokotteen kehittämiseksi

Antigeenien tunnistaminen on ensiarvoisen tärkeää punkkien vastaisen rokotteen kehittämisessä. On ratkaisevan tärkeää ymmärtää isäntä-loinen-patogeeni-vuorovaikutuksiin liittyvät molekyylimekanismit, jotta voidaan tunnistaa antigeeniehdokkaat, jotka todennäköisesti toimivat ehdokkaina/kohteina rokotteen kehittämisessä. Ihanteellinen antigeenikandidaatti indusoi pitkäkestoisia ja tehokkaita immuunivasteita isännässä [16,17]. Monia tutkimuksia on tehty sen jälkeen, kun Allen ja Humphreys julkaisivat havaintonsa vuonna 1979, ja niissä on käytetty erilaisia ​​antigeenejä, mukaan lukien kokonaisia ​​punkkihomogenaatteja ja sisäelimiä, indusoimaan vaihtelevia immuniteettitasoja punkkeja vastaan ​​[16].

Ixodes scapulariksen, ensimmäisen sekvensoidun punkkilajin, jälkeen on ilmaantunut useita uusia mahdollisuuksia ennustaa, seuloa ja tunnistaa punkkitartuntoja vastaan ​​suojaavia antigeenejä [18]. Nykyään on saatavilla monia nukleotidi- ja proteiinitietokantoja punkin eri kudoksista ja kehitysvaiheista, ja tunnetaan laaja valikoima punkkiin vaikuttavia ärsykkeitä, kuten punkkien ruokinta tai patogeenien aiheuttama infektio [17,19].

Todennäköisyys valita punkeista peräisin olevia suojaavia antigeeniehdokkaita punkkitartunnan ja patogeeni-infektion torjuntaan on myös lisääntynyt viimeaikaisen omiikkateknologian (ts. transkriptomiikan, proteomiikan ja metabolomiikan) kehityksen seurauksena [20]. Lisäksi käänteisen rokotteen (RV) tai rokotteen käyttö on mahdollistanut uusien rokoteantigeeniehdokkaiden löytämisen [20].

Tämän seurauksena synteettisiä ja rekombinanttiproteiineja on arvioitu ja niiden on osoitettu kykenevän indusoimaan jonkin tason suojaavaa immuniteettia. Tämän osion tarkoituksena on käsitellä saatavilla olevan kirjallisuuden perusteella eri kudoksista peräisin olevia antigeeniehdokkaita, jotka on tunnistettu, joiden tehokkuus on arvioitu ja joita pidetään mahdollisina ehdokkaina punkkien vastaisen rokotteen kehittämisessä (taulukko 1 ja Kuvio 1).

Kuva 1. Yleiskatsaus punkkirokoteantigeenikohteiden jakautumisesta ja tehokkuuden arviointikaaviosta punkkitartuntojen ja punkkien välittämien tautien ehkäisyssä.

2.1. Munaan liittyvät antigeenikandidaatit

Munankeltuainen on olennainen komponentti punkkien kehityksessä, koska se toimii säiliönä erilaisille proteiineille, joilla on ratkaiseva rooli näiden niveljalkaisten alkion kehityksessä [21,22]. Kuten hyönteisissä, keltuaisen proteiinit syntetisoituvat punkkien rasvakehossa [21,23]. Keltuaisen hajoamisen suorittavat erityyppiset entsyymit, joita löytyy munista. Boophilus Yolk pro-Cathepsin (BYC) on esimerkki keltuaisen proteinaasista, joka on eristetty R. microplus -munista ja jonka on raportoitu osallistuvan punkin alkioprosessiin.

Erityisesti näillä entsyymeillä on keskeinen rooli munankeltuaisen tärkeimmän proteiinipitoisen komponentin, viteliinin, hajoamisessa [21]. BYC:n eristivät ensin da Silva Vaz Jr et ai. [24] R. microplus -munista ja rokotettiin sitten karjaan sen roolin määrittämiseksi isännän immuniteetin indusoinnissa. Tämän entsyymin havaittiin tarjoavan osittaisen suojan punkkeja vastaan ​​ja laukaisevan suojaavan immuunivasteen nautakarjassa, mutta sen teho oli 14–36 prosenttia. Myöhempi tutkimus ekspressoi rekombinanttia BYC-proteiinia prokaryoottisessa ilmentämisjärjestelmässä (E. coli).

Kiinnostavaa kyllä, rekombinanttiproteiini osoitti kokonaistehokkuutta (25,24 prosenttia) verrattuna entsyymiin, joka oli eristetty suoraan munankeltuaisesta [25,26]. Näytti siltä, ​​että useat tekijät voivat vaikuttaa tämän proteiinin tehokkuuteen, esimerkiksi BYC-proteiinin valmistusmenetelmä voi vaikuttaa proteiinin rakenteeseen ja lopulta sen toimintoihin. Lisäksi tämä vaihtelu voi liittyä myös punkin kantaan tai muihin koeolosuhteisiin [24].

Vitelliin, lipoglykoproteiini, jota esiintyy myös munankeltuaisessa, kuten muutkin keltuaiset, syntetisoituu niveljalkaisten rasvakappaleissa [27,28]. Punkkeissa vitelliini tai vitellogeniinit ovat ratkaisevia munien kehitykselle ja munanpoikkeamiselle, kuten kolmen vitellogeniinigeenin hiljentäminen H. longicornis -bakteerissa osoittaa [29]. Vitellin-proteiini puhdistettiin punkin munista kuuden korkean molekyylipainon (44–107 kDa) polypeptidin ei-kovalenttisena kompleksina. Samanaikaisesti tämän tutkimuksen kanssa 80 kDa:n glykoproteiini (GP80) eristettiin ja puhdistettiin R. microplus -toukista.

Molemmat proteiinit siirrostettiin sitten niiden tehokkuuden tutkimiseksi. Vitellin- ja GP80-rokotus osoitti 68 prosentin kokonaistehokkuutta, mikä viittaa siihen, että molempia antigeenejä sisältävä rokote voi indusoida immuunivasteen ja antaa myös osittaisen suojan R. microplus -bakteeria vastaan ​​lampasisännissä [28].

On huomattava, että kun rekombinantti heksahis-GP80 (HH-GP80), joka oli väärin laskostettu eikä glykosyloitu, injektoitiin isäntään samoissa koeolosuhteissa, se ei osoittanut tehoa [28]. Yllä olevan tutkimuksen tulosten perusteella näyttää siltä, ​​että vitelliinin ja GP80:n rokottaminen voi saada aikaan immuunivasteita lampaissa ja saattaa osittain suojata lampaita B. micro plus -punkkia vastaan. HH-GP80:n oikea laskostuminen on ratkaisevan tärkeää sen aktiivisuuden kannalta, koska suojaavat epitoopit liittyvät proteiinin ja/tai siihen kiinnittyneiden oligosakkaridien laskostumiseen, ja nämä epitoopit ovat välttämättömiä sen aktiivisuudelle.

Vitelliiniä hajottava kysteiiniendopeptidaasi (VTDCE) on toinen munaan liittyvä entsyymi, jonka identifioivat ja eristivät Seixas et ai. [30]. Kuten BYC, tätä entsymaattista proteiinia ei syntetisoidu R. microplusin munasarjassa ja se on osallisena vitelliinin hydrolyysissä, mikä tarjoaa ravinteita kehittyville alkioille.

Molempien entsyymien havaittiin kuitenkin säätelevän vitelliinin hydrolyysiä eri tavalla [30]. Sama tutkimusryhmä analysoi myöhemmin puhdistettua VTDCE-proteiinia antigeeninä ja havaitsi, että tämä proteiini tarjoaa myös osittaisen suojan punkkeja vastaan, koska karjan immunisointi johti 21 prosentin tehokkuuteen ja 17,6 prosentin laskuun hedelmällisten munien painossa [31]. Munaan liittyvät proteiinit BYC ja VTDCE tarjosivat rajoitetun suojan isännälle punkkitartuntoja vastaan, eivätkä siksi näytä olevan sopivia antigeeniehdokkaita, kun niitä käytetään yksinään rokotteessa.

2.2. Sylkirauhasiin liittyvät antigeenikandidaatit

Punkit sisältävät angiotensiinia konvertoivan entsyymin kaltaista proteiinia, joka pystyy säätelemään verenpainetta säätelemällä nestetilavuutta, samalla tavalla kuin angiotensiinia konvertoiva entsyymi nisäkkäissä [32,33]. Tämän säädön avulla punkki voi ruokkia jatkuvasti isännän verta. Punkin B. micro plus:n sylkirauhaset ja keskisuoli sisältävät vähän glykoproteiinia, joka on nimeltään Bm91 [32]. Bm91 ei tällä hetkellä sisälly kaupallisiin punkkien vastaisiin rokotteisiin, mutta sen katsotaan olevan kandidaatti punkkien torjuntaan [34]. Kun rekombinantti Bm91-proteiini arvioitiin yksinään kenttäolosuhteissa, joissa oli luonnollista punkkitartuntaa, tulokset olivat pettymys, sillä tämä proteiini osoitti vain 6 prosentin tehoa, mikä ei vaikuta sopivalta punkkien torjuntaan tarkoitetun rokotteen kehittämisessä [35].

Kuitenkin, kun E. colissa tuotettu rekombinantti Bm91-proteiini yhdistettiin Bm86:n kanssa (antigeenikandidaatti, jota käytetään kaupallisissa rokotteissa) ja sitten tätä proteiiniyhdistelmää käytettiin rokotteena, tulokset olivat paljon lupaavampia. , koska Bm91-lisäys paransi Bm86-antigeenin tehoa [33], mikä viittaa siihen, että näiden kahden proteiinin (Bm91 ja Bm86) yhdistelmä näyttää olevan tehokas strategia uuden antigeenin kehittämiseksi. - punkkirokote.

Sylkirauhasten transkriptomiset ja differentiaaliset geeniekspressioanalyysit ovat osoittaneet, että punkkilajien (esim. R. microplus ja Dermacentor andersoni) genomi käsittää proteiinisekvenssin, jonka nimi on flagelliform silk protein [36,37]. Differentiaalisen geeniekspression karakterisointi R. microplusin sylkirauhasissa vasteena A. marginale -infektiolle korosti molekyylimekanismeja, joilla punkki on vuorovaikutuksessa patogeenin kanssa. Myöhemmät toiminnalliset tutkimukset ovat osoittaneet, että flagelliform silkkiproteiinilla (SILK) voi olla ratkaiseva rooli A. marginalen tartunnassa ja lisääntymisessä punkeissa. Punkkista ja taudinaiheuttajasta peräisin olevien molekyylien välinen vuorovaikutus osallistuu A. marginalen lisääntymiseen sylkirauhassoluissa [36,38].

Tämän tutkimuksen jälkeen ehdotettiin, että flagelliforminen silkkiproteiini voisi olla sopiva antigeenikandidaatti rokotteen kehittämiseen. Tätä tarkoitusta varten Merino et ai. [14] tuottivat rekombinanttia flagelliformista silkkiproteiinia ja analysoivat sen antigeenisen aktiivisuuden injektoimalla sitä karjaisäntään. Rekombinanttiproteiinin havaittiin olevan erinomainen antigeeniehdokas, koska se tarjosi 62 prosentin suojan punkkitartuntoja ja punkkien välittämiä infektioita (esim. babesioosi) vastaan ​​nautakarjassa. Rokotus flagelliformisilla silkkiproteiinilla vähensi A. marginalen lisääntymistä karjassa. Antigeenispesifiset vasta-ainetiitterit korreloivat vähentyneiden punkkitartuntojen ja patogeeni-infektion kanssa, mikä osoittaa, että rokotteen vaikutus on seurausta vasta-ainevasteesta.

Lisäksi geeniä koodaavien rokoteantigeenien ilmentymiseen nautakarjaa ruokkivissa punkeissa vaikutti myös rokotus ja yhteisinfektio A. marginalen ja B. bigeminan kanssa. Näin ollen näyttää siltä, ​​että rokotteet, joissa käytetään punkkiproteiineja, jotka osallistuvat vektorin ja patogeenin vuorovaikutukseen, voivat olla tehokkaita sekä torjumaan punkkitartuntaa että estämään patogeenitartuntaa samanaikaisesti [14].

Salp15 on I. scapularis -bakteerin immuunivastetta heikentävä sylkiproteiini, jonka molekyylipaino on 15 kDa ja joka estää CD4- ja T-solujen aktivaatiota, komplementtiaktiivisuutta, sytokiinituotantoa ja dendriittisolujen toimintaa isännässä [39–41]. Myöhemmät tutkimukset tutkivat Salp15:n molekyylimekanismia. B. burgdorferi tuottaa ulkopinnan proteiinia, OspC:tä, solun ulkopinnalla. Spirokeettien (B. burgdorferi spirochetes) tuotanto infektoituneiden punkkien keskisuolessa alkaa, kun se ruokkii isännästä tulevaa verta, joka sitten kuljetetaan isännälle.

Kun Salp15 poistuu sylkirauhasista ja B. burgdorferi spirokeetat siirtyvät isäntään, Salp15 on fyysisesti vuorovaikutuksessa OspC:n kanssa B. burgdorferi spirokeettien pinnalla, mikä helpottaa spirokeettien selviytymistä, patogeenien siirtymistä ja isäntäinfektiota [38,42 ]. Salp15–OspC-vuorovaikutus voi siten mahdollisesti peittää OspC:n isännän immuunivasteelta, jolloin spirokeetta on suojattu immuunivasteelta [38]. Äskettäin Escherichia coli -ilmentämisjärjestelmää käytettiin Salp15-rekombinanttiproteiinin syntetisoimiseen, ja järjestelmän havaittiin olevan tehokas tämän proteiinin tuottamisessa huomattavalla saannolla, jolla on hyvä liukoisuus. Nämä Salp15-rekombinanttiproteiinin ominaisuudet osoittavat, että tällä on käytännöllistä käyttöä ja sitä voidaan käyttää punkkien vastaisten rokotteiden tuottamiseen [41, 43, 44].

Metalloproteaasit (MP:t) ovat monitoimisia proteiineja, jotka osallistuvat monenlaisiin monimutkaisiin fysiologisiin ja patologisiin prosesseihin elävissä organismeissa [45]. Useita MP:itä on tunnistettu eri punkkilajeista, ja niiden katsotaan olevan ratkaisevan tärkeitä punkkien verijauhoon liittyvien toimintojen ylläpitämisessä [46–49]. Esimerkiksi ixodid-punkkien sylkirauhaset sisältävät MP:itä, jotka tunnustetaan tärkeimmiksi bioaktiivisiksi komponenteiksi elintärkeissä fysiologisissa toiminnoissa, ja siksi niitä harkitaan käytettäväksi mahdollisina kohteina torjuntastrategioissa näiden ulkoloisten torjumiseksi [49]. MP:ien antigeenisen potentiaalin arvioimiseksi Ali et ai. (2015) [50] monistivat R. micro plus MP:tä koodaavan sekvenssin fragmentin, ekspressoivat sitä rekombinanttiproteiinina ja käyttivät tämän proteiinin puhdistettua muotoa rokoteantigeeninä R. microplusia vastaan ​​karjassa [50]. Rekombinantti R. micro plus MP - proteiini osoitti 60 prosentin kokonaistehokkuutta .

Lisäksi se vähensi ruokkivien punkkien määrää, tuotettujen munien määrää ja kuoriutuneiden munien määrää, mikä teki [41] siitä ihanteellisen ehdokkaan punkkien vastaisen rokotteen kehittämisessä [50]. Sopivien antigeeniehdokkaiden tutkimiseksi edelleen R. microplusista Maruyama et ai. [51] suorittivat RNA-seq-tutkimuksen sylkirauhasista kaikissa R. microplusin ruokintavaiheissa, ja he havaitsivat fragmentin transkriptomista, joka oli samanlainen kuin MP (Rm239) sekä kolme muuta geeniä, mukaan lukien Rm39, Rm76 ja Rm180. . Näiden proteiinien käyttö rokotteina osoitti, että ne kaikki voivat estää hemostaattisia vasteita, tukahduttaa isännän vasta-ainevasteita ja vähentää punkin kykyä sitoutua isäntään käyttämällä glysiiniä sisältävää sementtiproteiinia.

Siksi kirjoittajat kehittivät monikomponenttisen punkkien vastaisen rokotteen käyttämällä näitä neljää erilaista proteiinia [51]. Nautakarjan immunisointi tällä monikomponenttisella rokotteella vähensi R. microplus -tartuntaa 73,2 prosentilla, mikä osoittaa, että moniantigeenisen punkintorjuntarokotteen formulaatio voi olla tehokkaampi kuin yksikomponenttiset rokotteet [51].

Ribosomit, joita kutsutaan myös proteiinitehtaiksi, ovat kaikkien elävien organismien komponentteja. On osoitettu, että ribosomaalisella proteiinilla P{{0}} on keskeinen rooli ribosomien translaatioaktiivisuuden säätelyssä ja auttamalla organismia sopeutumaan aineenvaihduntaan erilaisiin ympäristöolosuhteisiin. Se kuuluu happamien proteiinien ryhmään, jotka muodostavat varren kaltaisen rakenteen ribosomin suurimmassa ribosomialayksikössä [52]. On todisteita, jotka osoittavat, että punkin sylki sisältää ribosomaalisia proteiineja, joilla on rooli isännän puolustusmekanismien kiertämisessä [53–55]. Äskettäin raportoitiin, että rekombinantilla ribosomaalisella proteiinilla P0 rokotetuilla kaniinilla oli voimakkaita humoraalisia vasteita, jotka ensisijaisesti vähensivät nymfien sulamista ja naaraan lisääntymistä. Proteiini osoitti 57,5 ​​prosentin suojan O. erraticus -tartuntoja vastaan, mutta se ei tarjonnut ristisuojaa afrikkalaisen punkin Ornithodoros moubata -tartuntoja vastaan ​​[56].

Toisessa tutkimuksessa tutkijat syntetisoivat kemiallisesti 20 aminohapon peptidin, joka oli peräisin Rhipicephalus-punkkien ribosomaalisesta P0-proteiinista, ja konjugoivat sen menestyksekkäästi Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) -proteiiniin. Megathura crenulate toimii antigeeninä R. microplus -bakteeria vastaan, ja sen teho on 96 prosenttia nautakarjassa [57]. Tässä tutkimuksessa tulokset viittasivat siihen, että KLH:hon konjugoitu P0 on erinomainen rokote. Tällaisen rokotteen valmistaminen tulee kuitenkin olemaan kallista, eikä se siksi välttämättä ole kustannustehokasta karjan kannalta. Sen vuoksi on välttämätöntä suorittaa lisätutkimusta antigeenisen rokotteen rekombinanttituotannosta sen tehokkuuden arvioimiseksi ja sen tuotannon tekemiseksi taloudellisesti kannattavammaksi.

Seriiniproteaasi-inhibiittorit: Yritykset eristää antigeenejä punkkilajeista ovat tunnistaneet joitain seriiniproteaasi-inhibiittoreita (serpiinejä), joilla näytti olevan antigeenikykyä. Serpiinit osallistuvat erilaisiin fysiologisiin toimintoihin eläimillä, erityisesti nautakarjalla, missä ne vaikuttavat veren hyytymiseen, muuttavat protrombiiniaikaa ja aktivoivat osittain tromboplastiiniaikaa [58–60]. Serpiinit häiritsevät punkkien immuunijärjestelmää ja helpottavat siten näiden loisten alkuruokintaprosessia [61]. Andreotti et ai. [62] eristi ja tunnisti R. micro plus trypsiiniestäjiä (BmTI:t) toukkauutteista.

Sen antigeenisen aktiivisuuden arvioimiseksi risteytyskarja rokotettiin BmTI:llä, jonka havaittiin häiritsevän leukosyyttien migraatiota toukkien kiinnittymiskohdassa [63,64]. Vasikoiden rokottaminen BmTI-antigeeneillä vähensi merkittävästi naaraspuolisten punkkien määrää ja painoa, mikä johti 72,8 prosentin tehokkuuteen R. microplus -bakteeria vastaan. Nämä tiedot viittaavat siihen, että BmTI-immunisaatio voi toimia toukkien kehityksen varhaisessa vaiheessa [65]. Sen tutkimiseksi, voiko typistetty BmTI myös indusoida immunisaation, BmTI:n N-terminaalinen fragmentti syntetisoitiin ja sen tehokkuus (18,4 prosenttia) naudassa oli pienempi kuin täyspitkän proteiinin.

Näin ollen immunisointi N-terminaalisella domeenilla ei riitä parantamaan BmTI:iden vaikutusta isännän ja loisen välisiin vuorovaikutuksiin [64]. Samoin kun rekombinantteja R. microplus larvae -trypsiini-inhibiittoreita (rRmLTI:itä) käytettiin rokotekokeena, tehokkuus (32 prosenttia) oli jälleen alhainen, mikä viittaa siihen, että sekä katkaistu että koko rekombinanttiproteiini ovat vähemmän tehokkaita, todennäköisesti johtuen rokotteen puutteesta. proteiinin tarkka laskostuminen in vitro. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että trypsiini-inhibiittorit näyttävät sopivilta ehdokkailta tehokkaan rokotteen tuottamiseksi; Menetelmää niiden suuren mittakaavan valmistamiseksi on kuitenkin parannettava niiden tehokkuuden parantamiseksi [66]. Useita muita serpiinejä on arvioitu mahdollisiksi punkkien vastaisiksi rokoteehdokkaiksi eri punkkilajeista, mukaan lukien Amblyomma americanum (AAS19), Haemaphysalis longicornis (HLS2), Rhipicephalus (Boophilus) microplus ja niin edelleen. Kaikki nämä serpinit osoittivat osittaista suojaa isännälle; suojan taso voi kuitenkin vaihdella punkkilajin ja serpin tyypin mukaan [67–69].

Yhden tai useamman punkin proteiinien yhdistäminen yhdeksi polypeptidiketjuksi edustaa houkuttelevaa punkkien vastaista rokotusstrategiaa. Siksi trypsiini-inhibiittoreita/tai serpiinejä yhdistettynä muiden punkkiproteiinien immunogeenisten fragmenttien kanssa voidaan käyttää moniantigeenirakenteina. Esimerkiksi syntetisoitiin kimeerinen proteiini, joka sisälsi yhdistelmä-Bm86-Campo Grande -antigeenin (BmCG), rRmLTI:n ja Escherichia colin (LTB) lämpölabiilin enterotoksiini B -alayksikön molekyyliadjuvanttina. Tällä kimeerisellä RmLTI-BmCG-LTB-antigeenillä oli 55,6 prosentin tehokkuus R. microplus -bakteeria vastaan ​​nautaeläimillä.

2.3. Keskisuoleen liittyvät antigeenikandidaatit

Ferritiiniproteiinit ovat tärkeitä raudan fysiologiselle varastoinnille myrkyttömässä mutta biologisesti saatavilla olevassa muodossa. Ne ovat elintärkeitä punkkien ruokinnan aikana nautitun veren raudan aineenvaihdunnassa [70,71]. Tähän mennessä kaksi ferritiinimolekyyliä (ferritiini 1 ja ferritiini 2) on tunnistettu ja karakterisoitu. Ferritiini 1 (FER1) sijaitsee soluissa, missä se osallistuu raudan fysiologiseen varastointiin.

Ferritiini 2:lle (FER2) ei ole toiminnallisia ortologeja selkärankaisilla. Se ilmentyy pääasiassa suolistossa ja sillä on ratkaiseva biologinen rooli raudan kuljettamisessa sylkirauhasiin ja munasarjoihin [71]. FER2-proteiinia on raportoitu useissa punkkilajeissa, mukaan lukien D. variabilis, R. microplus, I. ricinus, Haemaphysalis longicornis ja I. scapularis [71,72]. FER2:n toimintahäiriötutkimusten perusteella se on lupaava rokoteehdokas, koska tämän geenin tukahduttaminen heikentää punkkien ruokintakykyä, alentaa munasoluja ja vähentää toukkien kuoriutumista [71].

FER2:n lisäksi FER1 on osoitettu sopivaksi antigeeniehdokkaaksi useiden punkkilajien torjuntaan. Hajdusek et ai. testasi R. microplusin (RmFER2) rekombinanttia FER2-proteiinia nautakarjan immunisoimiseksi ja havaitsi, että FER{4}}-pohjainen rokote osoitti 64 prosentin kokonaistehokkuutta [73]. Samoin H. longicorniksen rekombinanttiproteiineja FER1 ja FER2 on käytetty kanien immunisointiin. Molemmat proteiinit ovat erittäin immunogeenisiä ja indusoivat isännän vasta-ainetuotantoa. Isännän immunisointi vähensi merkittävästi tartunnan saaneiden punkkien tunkeutunutta painoa ja vähensi munien ja täysin kuoriutuneiden punkkien lukumäärää. Rekombinantti FER2 aiheutti kuitenkin suuremman alenemisen suuremmalla tehokkuudella (49 prosenttia) kuin rekombinantti FER1 (34 prosenttia) [72].

Äskettäin Manjunathachar ja työtoverit [74] raportoivat, että H. anatolicum FER2:lla, Krimin ja Kongon verenvuotokuumeen leviäjällä rokotettu vasikka oli vahvasti suojattu toukkien (51,7 prosenttia) ja aikuisten (51,2 prosenttia) punkkitartunnalta. sekä punkkeja vastaan, joiden FER2 on kaatunut RNAi:n toimesta. Monet muut viimeaikaiset tutkimukset ovat myös vahvistaneet, että FER2 tarjoaa merkittävän suojan isännälle punkkitartuntoja vastaan ​​käyttämällä FER2:n rekombinanttiproteiinia [75–77]. Molekyyliseen suojamekanismiin kuuluu pääasiassa anti-FER2-vasta-aineiden tuotanto isäntäkehossa, jotka siirtyvät puutiaisiin ruokintaprosessin aikana, ja anti-FER2-vasta-aineet sitoutuvat FER2:een punkin suoliston soluissa tai hemolymfissä, mikä estää FER2:n muodostumisen. kokoonpano ja/tai toiminta.

Äskettäin on havaittu, että FER2-proteiinin ennustetut antigeeniset alueet ovat säilyneet eri punkkilajeissa. Tätä proteiinia voidaan siksi käyttää rokotteen tuottamiseen lajien välistä suojaa varten [77]. Äskettäisessä tutkimuksessa FER2-ortologit O. moubatassa (OMFER2) ja O. erraticuksessa (OEFer2) karakterisoitiin, ja tutkijat havaitsivat, että niillä on suuri sekvenssien samankaltaisuus (85,3 prosenttia). O. moubata Fer2:n (tOMFER2) rekombinanttimuoto voi saada aikaan vahvoja humoraalisia vasteita kaneissa. O. erraticuksessa tällä proteiinilla ei kuitenkaan ole mitään suojaavaa vaikutusta huolimatta suuresta sekvenssien samankaltaisuudesta, mikä viittaa siihen, että pieni ero niiden sekvensseissä voi määrittää, onko niillä suojaava vaikutus vai ei. Tästä huolimatta tämän tutkimuksen tulokset vahvistavat, että OMFER2:lla on potentiaalia toimia rokotteiden antigeeniehdokkaana [78].

TROSPA on punkkireseptori, jota tarvitaan spirokeettien kolonisaatioon I. scapularis -bakteerissa. B. burgdorferin ulkopinnan proteiini A (OspA) tuotetaan runsaasti näissä spirokeetoissa, ja se on kriittinen tarttumiselle vektoriin spesifisen sitoutumisen kautta TROSPA:han [79,80]. Eri punkkilajeissa, mukaan lukien R. microplus, I. scapulars ja R. annulatus, TROSPA:lla voi olla rooli infektiomekanismeissa ja Babesia-patogeenien lisääntymisessä. Lisäksi ulkopinnan proteiinit OspA ja OspB ilmentyvät, kun spirokeetat saapuvat punkkiin ja asuvat niissä [81]. Niiden ilmentyminen kuitenkin tukahdutetaan siirron aikana isäntään, kun taas OspC:n ja bba52:n ilmentymät lisääntyvät. BBA52:lla ja borrelian OspC-proteiinilla on täydentäviä, mutta ei-olennaisia ​​​​rooleja tartuntaprosessissa, koska nämä antigeenit sijaitsevat kaikki ulkokalvossa ja ilmentyvät yhdessä ruokinnassa olevissa punkeissa [82–84].

Reseptorin biologista toimintaa ei tunneta, mutta OspA:n sitoutuminen TROSPA:han on välttämätön, jotta punkit B. burgdorferi -bakteerin kolonisoimaan punkkien suolistossa, mikä tukee bakteeri-infektiota vektorissa [79]. B. burgdorferin infektio saa aikaan tiettyjen punkkigeenien (TROSPA ja salp15) tuotannon, jotka voidaan kohdistaa estämään Borrelia-spirokeettien ja muiden punkkien välittämien mikrobien leviämistä [80,85]. TROSPA:n estäminen TROSPA-antiseerumilla tai RNAi:n kautta vähentää B. burgdorferin kiinnittymistä I. scapularsin suoleen ja vähentää siten vektorin bakteerikolonisaatiota ja mahdollista patogeenin siirtymistä isäntään [79]. Tämän vuorovaikutuksen seurauksena rekombinantti TROSPA analysoitiin nautakarjassa antigeenirokotteena puutiaisten tartunnan ja taudinaiheuttajien leviämisen estämiseksi, mutta se ei vaikuttanut punkkien ruokintaan tai hedelmällisyyteen [14].

Akvaporiinit (AQP) tai kalvon läpi kulkevat vesikanavat ovat tärkeässä roolissa veden homeostaasissa ja kylmäsuojauksessa [86,87]. Ne ovat evoluutionaalisesti erittäin konservoituneita jäseniä suuresta tärkeimpien sisäisten proteiinien perheestä. Ne muodostavat solukalvoon huokosia, jotka kuljettavat vettä tai muita liuenneita aineita [86,88,89]. Veden ja pienten neutraalien liuenneiden aineiden kuljettamisen lisäksi AQP:t osallistuvat lukuisiin fysiologisiin prosesseihin [90].

Punkkeilla AQP:itä on raportoitu ruoansulatuskanavassa, Malpighian tubuluksissa ja myös sylkirauhasissa [91]. AQP:t vähentävät isännän veritilavuutta punkin suolistossa, mikä on tärkeä fysiologinen toiminto, koska punkit nielevät suuria määriä verta suhteessa niiden kokoon ja painoon [62]. Fragmentti akvaporiinista R. micro plus engorged naaraista on eristetty ja sen jälkeen tuotettu yhdistelmä-DNA-tekniikalla ja nimetty RmAQP1-rokotteeksi [62]. Tämän rokotteen tehoa R. microplus -bakteeria vastaan ​​testattiin kahdessa karjakokeessa, mikä osoitti 68 prosentin ja 75 prosentin tehokkuuden. Tämä viittaa siihen, että RmAQP1 voi olla mahdollinen rokoteantigeeni [62] ja että akvaporiineja voidaan käyttää punkkien vastaisissa rokotteissa [62]. Hiljattain tehdyssä saman lajin RmAQP2:ta koskevassa tutkimuksessa on osoitettu, että RmAQP2:n solunulkoisten domeenien synteettisellä peptidillä rokotetut naudat pystyivät vähentämään täyteyteen ruokkivien punkkien määrää 25 prosentilla, mikä viittaa siihen, että tämä kohde (RmAQP2) voi olla hyödyllinen komponentti rokotecocktailissa punkkien puremista vastaan ​​[92].

Toinen I. ricinus -tutkimus vahvisti punkkien AQP-antigeenien tehokkuuden punkkitartuntojen torjunnassa osoittamalla IrAQP- ja CoAQP-rokotteen vaikutuksen I. ricinus -punkkin toukkuun kaneissa. CoAQP-antigeenissä olevan AQP:n konservoituneen alueen sisältävän rokotteen teho oli korkeampi kuin IrAQP-rokotteen [93]. Lisäksi rokotus synteettisillä immunogeenisillä peptideillä, jotka oli johdettu Ornithodoros erraticus AQP:istä (OeAQP ja OeAQP1), antoi karjalle merkittävän suojan homologista O. erraticus -lajia vastaan, mutta lajien välinen suoja Ornithodoros moubataa vastaan ​​oli heikompi [94]. Lisäksi joissakin muissa tutkimuksissa on myös tunnistettu AQP:itä eri lajeista, mukaan lukien O. moubata ja Ixodid-punkit, ja bioinformatiikan analyysit viittaavat siihen, että näillä AQP:illä on hyvät mahdollisuudet käyttää rokotteena. Siksi tarvitaan lisää kokeellisia todisteita näiden AQP:iden antigeenipotentiaalin vahvistamiseksi [95, 96].

I. ricinus on yksi niistä punkkilajeista, jotka ovat vastuussa punkkien välittämien tautien lisääntyvästä esiintyvyydestä seuraeläimissä Euroopassa [4]. AQP-pohjaisten rokotteiden vaikutus I. ricinus -toukkien tartunta- ja moldingiin saattaa johtaa puutiaisten tartuntojen vähenemiseen rokotetuissa eläimissä ja tukee sitä, että CoAQP voi olla ehdokas suojaava antigeeni erilaisten samaa isäntäravintoa syövien punkkilajien torjuntaan.

Tutkimus, jossa käytettiin ekspressiokirjaston immunisaatiota punkkitartuntojen hiirimallia vastaan, osoitti, että 4D8-proteiini, josta myöhemmin nimitettiin subleasing (SUB), on mahdollinen antigeeni, jota voitaisiin käyttää rokotteena I. scapularis -bakteeria vastaan ​​[97]. Havaittiin, että SUB:n geenin ja proteiinin sekvenssit ovat säilyneet selkärangattomissa ja selkärankaisissa. Lisäksi tämä geeni on tunnistettu ja karakterisoitu eri punkkilajeissa, ja sen on havaittu ilmentyvän aikuisten punkkien eri kehitysvaiheissa ja eri kudoksissa [98]. SUB:n laajan levinneisyyden vuoksi sen ehdotettiin olevan hyvä antigeenirokoteehdokas. SUB:n antigeenipotentiaalia on aiemmin tutkittu nautakarjassa rekombinanttiproteiineilla, ja todettiin, että SUB voi suojata (51 prosentin teho) punkkeja vastaan.

Lisäksi SUB-rokotteen ja punkkien autosidisen torjunnan yhdistelmällä, joka seurasi SUB-geenin kaatumista nautakarjaa syövissä punkeissa R. microplusin kontrolloimiseksi, saavutettiin 75 prosentin teho hoidon jälkeen [99 100]. Lisäksi Shakya ja työtoverit tuottivat R. microplusin rekombinantti-SUB:ta ja käyttivät tätä rekombinanttiproteiinia naudan immunisointiin. Nämä märehtijät altistettiin sitten R. microplus -toukille. Lisäksi arvioitiin tämän proteiinin tehoa toista maantieteellisesti erilaista punkkikantaa vastaan. Rekombinantin SUB:n tehokkuus vaihteli 32,7 prosentista 44,1 prosenttiin ja osoitti suurta sekvenssihomologiaa Meksikosta ja Intiasta peräisin olevien punkkikantojen välillä [101]. Toisessa tutkimuksessa rekombinantti SUB syntetisoitiin kimeerisenä proteiinina MSP1a:n kanssa ja käytettiin sen jälkeen karjalle R. microplusin kontrolloimiseksi.

Yllättäen tämä kimeerinen proteiini osoitti 81 prosentin tehokkuutta [102]. SUB-sovelluksen onnistuneiden ja lupaavien tulosten seurauksena tämän antigeenin yhdistelmä Bm86:n kanssa testattiin ja sen oletettiin antavan parempia tuloksia, mutta kokonaistehokkuus ei tukenut tämän yhdistelmän käyttöä rokotteena. Vaikka on osoitettu, että korkeat määrät spesifisiä vasta-aineita aktivoituvat kullekin antigeenille, kun kahta antigeeniä annetaan samanaikaisesti, ne erotetaan erilaisiksi formulaatioiksi ja niitä käytetään eri inokulaatiokohdissa eläimessä [103, 104].

Aiemmin ligandiineina tunnetut glutationi-S-transferaasit (GST:t) muodostavat monitoimisten proteiinien perheen, joka on laajalti levinnyt eläinkunnassa. Näillä entsymaattisilla proteiineilla on rooli solunsisäisessä kuljetuksessa, ruuansulatuksessa, prostaglandiinien tuotannossa, sekä endogeenisten että eksogeenisten aineiden detoksifikaatiossa ja suojautumisessa oksidatiivista stressiä vastaan. GST:n ilmentymistasot lisääntyvät organismeissa, kun ne altistetaan hyönteis- ja punkkimyrkeille [105]. Kanin seerumi, joka sisälsi polyklonaalisia vasta-aineita R. microplusin GST:tä vastaan, reagoi H. longicorniksen ja R. appendiculatuksen rekombinantin GST:n kanssa, mikä viittaa siihen, että punkkien GST:t voisivat olla osa yleistä rokotetta, joka suojaa useammalta kuin yhdeltä punkkilajilta [106]. .

Tämän alustavan tutkimuksen perusteella Parizi ja työtoverit (2011) eristivät GST:n H. longicornis -bakteerista ja tuottivat rekombinantti-GST:tä ja käyttivät tätä karjan rokottamiseen R. microplus -bakteeria vastaan ​​[107]. Tämä suojasi karjaa R. micro plus - bakteerilta 57 prosentin teholla . Yhdistelmä-GST-proteiini tarjosi osittaisen ristiinsuojaavan immuniteetin isännässä, mikä viittaa siihen, että GST:n proteiinia suojaava kapasiteetti ei ole riittävä, ja näin ollen tämän proteiinin käyttö yhden antigeenin rokotteessa ei näyttäisi olevan tehokas estämään punkkitartuntoja. 107].

For more information:1950477648nn@gmail.com