Tulehduksellisten infiltraattien kvantitatiivinen arviointi munuaissiirtobiopsioissa käyttämällä multipleksisen tyramidisignaalin vahvistusta ja syväoppimista

Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com

Meyke Hermsen¹Valeri Volk²Jan Hinrich Bräsen²et ai

Abstrakti

Viivästynyt siirteen toiminta (DGF) on vahva riskitekijä interstitiaalisen fibroosin ja tubulaarisen atrofian (IFTA) kehittymiselle munuaissiirroissa. Tulehduksellisten infiltraattien kvantitatiivinen arviointi DGF-potilaiden munuaisbiopsioista voi paljastaa ennustavia markkereita IFTA:n kehittymiselle. Tässä tutkimuksessa yhdistimme multipleksisen tyramidisignaaliamplifikaation (mTSA) ja konvoluutiohermoverkkoja (CNN:t) arvioidaksemme tulehduksellista mikroympäristöä DGF-potilaiden (n=22) munuaisbiopsioissa, jotka otettiin 6 viikkoa transplantaation jälkeen. Potilaat ositettiin IFTA-kehityksen kannalta (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" one="" mtsa="" panel="" was="" developed="" for="" visualization="" of="" capillaries,="" t-="" and="" b-lymphocytes,="" and="" macrophages,="" and="" a="" second="" mtsa="" panel="" for="" t-helper="" cell="" and="" macrophage="" subsets.="" the="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged="" and="" custom-made="" python="" scripts="" enabled="" conversion="" to="" artificial="" brightfield="" whole-slide="" images="" (wsi).="" we="" used="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" with="" cytoplasmatic="" staining="" patterns="" in="" immunohistochemistry="" and="" developed="" two="" new="" cnns="" for="" the="" detection="" of="" macrophages="" and="" nuclear-stained="" lymphocytes.="" f1="" scores="" were="" 0.77="" (nuclear-stained="" lymphocytes),="" 0.81="" (cytoplasmatic-stained="" lymphocytes),="" and="" 0.82="" (macrophages)="" on="" a="" test="" set="" of="" artificial="" brightfield="" wsi.="" the="" cnns="" were="" used="" to="" detect="" inflammatory="" cells,="" after="" which="" we="" assessed="" the="" peritubular="" capillary="" extent,="" cell="" density,="" cell="" ratios,="" and="" cell="" distance="" in="" the="" two="" patient="" groups.="" in="" this="" cohort,="" the="" distance="" of="" macrophages="" to="" other="" immune="" cells="" and="" peritubular="" capillary="" extent="" did="" not="" vary="" significantly="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" between="" patient="" groups.="" cd163+="" cell="" density="" was="" higher="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (p="" <="" 0.05).="" cd3+cd8−/cd3+cd8+="" ratios="" were="" higher="" in="" patients="" with=""><10% ifta="" development="" (p="" <="" 0.05).="" we="" observed="" a="" high="" correlation="" between="" cd163+="" and="" cd4+gata3+="" cell="" density="" (r="0.74," p="" <="" 0.001).="" our="" study="" demonstrates="" that="" cnns="" can="" be="" used="" to="" leverage="" reliable,="" quantitative="" results="" from="" mtsa-="" stained,="" multi="" spectrally="" imaged="" slides="" of="" kidney="" transplant="">

Cistanche deserticola ehkäisee munuaissairauksia, napsauta tästä saadaksesi näytteen

Johdanto

Viivästynyt siirteen toiminta (DGF) munuaisensiirron jälkeen on monitekijäinen ja liittyy pääasiassa luovuttajan ominaisuuksiin ja iskemia-aikaan. DGF:n kuvataan yleensä dialyysin tarpeeksi 7 päivän sisällä transplantaation jälkeen, ja se on vahva kroonisen munuaissiirteen vaurion riskitekijä [1–3]. Klassinen kroonisen munuaisvaurion komponentti on interstitiaalinen fibroosi ja tubulaarinen atrofia (IFTA). Kaikki DGF-potilaat eivät kuitenkaan edisty IFTA:n kehittymiseen, ja DGF:n ja IFTA:n välinen monimutkainen suhde on edelleen huonosti ymmärretty. Tämä johtuu ensinnäkin mahdollisesti aiheuttavien tapahtumien ja toiminnan heikkenemisen välisestä viiveestä ja toiseksi mahdollisten indusoijien vaihtelevista ja monimutkaisista vaikutuksista, kuten hylkimisreaktiosta ja lääkityksen sivuvaikutuksista [1, 4]. Tulehduksen ja spesifisten makrofagien yleinen esiintyminen on kuvattu useissa tutkimuksissa siirteen menetyksen ennustajana [5–8]. Taustalla olevia patologisia prosesseja ei kuitenkaan täysin ymmärretä, ja korkeat tulehdustasot eivät aina johda pitkäaikaiseen siirteen menettämiseen. Ympäristöärsykkeiden seurauksena makrofagit saavat erikoistoimintoja ja polarisoituvat erilaisiksi fenotyypeiksi. Lukuisat tutkimukset viittaavat siihen, että tietyt makrofagien alatyypit (vaihtoehtoisesti aktivoidut makrofagit) osallistuvat kudosten uusiutumiseen indusoimalla kudosten korjausta tai fibroosia. Polarisoitumisen kohti kudosten uudelleenmuotoilua (joskus profibroottista) fenotyyppiä tiedetään olevan riippuvainen monista ympäristön ärsykkeistä, muun muassa T-auttajalymfosyyttien alatyypeistä [9–11]. T-auttajasolupopulaatioiden arviointi siirressä DGF:n aikana paljasti vallitsevan T-auttaja 1 -alatyypin, mutta korrelaatioita siirteen lopputulokseen tai etenemiseen IFTA:han ei ole toistaiseksi tutkittu [12]. Kattava arvio tulehduksellisesta mikroympäristöstä, joka keskittyy erityisesti makrofageihin ja T-auttajasolujen alaryhmiin huolellisesti valituissa potilasryhmissä, saattaa antaa käsityksen siitä, miksi jotkut, mutta eivät kaikki, DGF-potilaat edistyvät IFTA:n kehittämiseen.

Tulehduksellisten infiltraattien kattavaa tutkimusta haittaavat kuitenkin useat (tekniset) rajoitukset. Perinteiset immunohistokemian (IHC) ja immunofluoresenssitekniikat tukevat vain rajoitetun määrän solumarkkereiden visualisointia yhdessä kudososassa. Pienten, arvokkaiden kudosfragmenttien, kuten munuaisbiopsioiden, sarjaleikkaus ei ole toivottavaa ja solujen välisten suhteiden tulkinta eri osissa on vaikeaa. Lisäksi tulehduksellisten infiltraattien kvantitatiiviseen arviointiin visuaalisella arvioinnilla liittyy huomattavan paljon havaintojen välistä vaihtelua [13]. Perinteiset kuvankäsittelytekniikat, kuten pikselikynnys, vedenjakaja ja morfologiaan perustuva segmentointi, perustuvat ennakkotietoon kaikista morfologisista soluesityksistä ja kudosvärjäytysten intensiteetistä koko tietojoukon [14–16]. Siksi näiltä menetelmiltä puuttuu usein luotettavuus biologisten ja teknisten kuvien muunnelmille, ja ne muuntuvat huonosti uusiksi tai ulkoisiksi tietokokonaisuuksiksi. Digitaalisen patologian yleistyminen on nopeuttanut vaihtoehtoisten menetelmien kehittämistä koko diakuvien (WSI) arviointiin [17, 18]. Syväoppimismallit, erityisesti konvoluutiohermoverkot (CNN) ovat osoittautuneet kykeneviksi segmentoimaan ja havaitsemaan relevantteja biologisia rakenteita histopatologisissa dioissa [19–23]. Näillä tekniikoilla on mahdollisuus siirtyä subjektiivisesta visuaalisesta arvioinnista ja perinteisestä kuvankäsittelystä tarkkaan, objektiiviseen ja toistettavaan solun havaitsemiseen.

Tämän tutkimuksen tavoitteena on kehittää menetelmä useiden tulehdussolumarkkerien objektiiviseen, kvantitatiiviseen arviointiin välttäen laajan sarjalevyleikkauksen tarvetta. Tätä varten yhdistämme multiplex IHC-, monispektrikuvantamisen ja syväoppimismallit. Näiden tekniikoiden sovellettavuuden osoittamiseksi tutkimme tulehdusmikroympäristön korrelaatioita, jotka on kvantifioitu syväoppimismalleilla, IFTA:n kehityksen kanssa DGF-potilaiden valvontasiirteen biopsioissa.

cistanche-uute munuaissairauksien hoitoon

Materiaalit ja menetelmät

Tulehduksellisen mikroympäristön arvioimiseksi DGF-potilaiden munuaisbiopsioissa suoritimme multipleksisen IHC:n seurantabiopsioista, jotka otettiin 6 viikkoa transplantaation jälkeen. Potilaat ositettiin IFTA-kehityksen kannalta (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" multiplex="" ihc="" was="" performed="" using="" tyramide="" signal="" amplification="" (mtsa)="" panels.="" one="" mtsa="" panel="" was="" designed="" for="" the="" visualization="" of="" capillaries,="" macrophages,="" and="" t="" and="" b="" lymphocytes="" (panel="" i),="" and="" one="" mtsa="" panel="" for="" the="" visualization="" of="" polarized="" t-helper="" lymphocytes="" and="" macrophages="" (panel="" ii).="" second,="" the="" mtsa="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged,="" and="" custom-made="" python="" scripts="" were="" used="" to="" convert="" the="" multispectral="" images="" to="" artificial="" brightfield="" ihc="" wsi.="" converting="" the="" slides="" to="" artificial="" ihc="" wsi="" allowed="" for="" the="" application="" of="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" in="" ihc="" [22].="" this="" existing="" cnn="" was="" designed="" for="" cytoplasmatic="" lymphocyte="" markers.="" hence,="" a="" second="" and="" third="" cnn="" was="" developed="" in="" this="" study="" for="" the="" quantification="" of="" macrophages="" and="" nuclear="" lymphocyte="" markers="" in="" ihc="" wsi.="" these="" three="" cnns="" were="" subsequently="" used="" to="" quantitatively="" assess="" the="" inflammatory="" infiltrates="" in="" the="" two="" patient="" groups="" and="" to="" study="" the="" correlations="" of="" the="" inflammatory="" microenvironment="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" with="" the="" development="" of="" ifta="" 6="" months="" after="">

Kudosnäytteet

Käytimme Hannover Medical Schoolissa (Hannover, Saksa) saatuja munuaissiirteen saajien seurantabiopsioita, jotka hankittiin tulevan seurantabiopsiaohjelman yhteydessä. Sisällyttämiskriteerit olivat: DGF:n esiintyminen (määritelty muodossa<500 ml="" urine="" production="" within="" the="" first="" 24="" h="" after="" transplantation="" and/or="" the="" need="" for="" dialysis="" within="" 7="" days="" post-transplantation),="" absence="" of="" rejection="" in="" any="" of="" the="" surveillance="" biopsies="" or="" biopsies="" for="" cause="" within="" the="" first="" year="" post-transplantation,="" and="" absence="" of="" ifta="" in="" the="" surveillance="" biopsy="" taken="" at="" 6="" weeks="" after="" transplantation="" (based="" on="" the="" pathology="" report="" and="" graded="" according="" to="" the="" banff="" lesion="" grading="" system="" [24]).="" all="" patients="" were="" treated="" with="" dialysis="" because="" of="" no,="" or="" insufficient="" graft="" function,="" variably="" manifested="" by="" (combinations="" of)="" anuria,="" oliguria,="" metabolic="" de-arrangement="" with="" acidosis,="" or="" hyperkalemia.="" none="" of="" the="" patients="" had="" hyperkalemia="" or="" hypervolemia="" alone.="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" (ffpe)="" from="" biopsies="" taken="" 6="" weeks="" and="" 6="" months="" post-transplantation="" was="" collected.="" six="" patients="" did="" not="" undergo="" a="" surveillance="" biopsy="" procedure="" 6="" months="" after="" transplantation.="" instead,="" the="" surveillance="" biopsy="" was="" taken="" at="" 3="" months="" post-transplantation="" was="" included="" (n="3)" or="" the="" nearest="" cases="" with="" sufficient="" cortical="" tissue="" (here="" defined="" as="" ≥4="" glomeruli)="" in="" both="" the="" 6="" weeks="" and="" the="" 6="" months="" biopsy="" were="" included="" in="" the="" study="" (n="24)." one="" case="" was="" excluded="" because="" of="" interstitial="" nephritis="" of="" unknown="" cause="" and="" one="" more="" case="" due="" to="" fixation="" artifacts.="" a="" final="" number="" of="" 22="" patients="" were="" included="" in="" this="" study="" (table="">

IFTA-arviointi

Interstitiaalisen fibroosin (ci) ja tubulaarisen atrofian (ct) (IFTA) laajuus 6 viikon ja 6 kuukauden kohdalla, ilmaistuna Banff-leesion luokitusjärjestelmällä [24], saatiin patologiaraportista. Varhaisten tulehduksellisten infiltraattien ja IFTA-kehityksen välisen suhteen arvioimiseksi yksityiskohtaisemmin kaikki PAS-värjätyt objektilasit digitoitiin uudelleentarkastelua varten Pannoramic 250 Flash II digitaalisella diaskannerilla (3DHistech, Unkari) ja 20 × objektiivi resoluutiolla 0,24 μm/pikseli. Molempien aikapisteiden (6 viikkoa ja 6 kuukautta) PAS WSI:n pisteytti IFTA:n laajuuden (pinta-alan prosenttiosuus, 10 prosentin välein) kolme munuaispatologia. Patologien keskimääräisiä IFTA-pisteitä käytettiin lopullisena pisteenä laskettaessa IFTA:n muutos 6 viikon ja 6 kuukauden välillä transplantaation jälkeen. Potilaat osoittivat IFTA-pisteiden absoluuttisen nousun 10 prosenttia tai enemmän (n=13) ja ei tai<10% increase="" of="" ifta="" (n="9)" (table="" 1).="" recipient="" characteristics,="" donor="" characteristics,="" and="" banff="" ci,="" ct,="" ti,="" i,="" and="" i-ifta="" lesion="" scores="" (obtained="" from="" the="" pathology="" report)="" are="" listed="" in="" table="" 1="" for="" both="" patient="" groups.="" significant="" differences="" between="" patient="" groups="" were="" assessed="" using="" the="" independent="" samples="" mann–whitney="" u="" test="" or="" fisher's="" exact="" test="" and="" are="" displayed="" in="" table="">

Lisäksi Banff-leesion pisteitä verrattiin aikapisteiden välillä käyttämällä Wilcoxon signed ranks -testiä. Tämä paljasti merkittäviä eroja 6 viikon ja 6 kuukauden biopsioiden välillä Banff-luokkien ti (p=0.017), ci (p=0.004) ja ct (p=0.011) osalta. .

Multiplex TSA-värjäys

Suoritimme multipleksisen IHC:n käyttämällä mTSA:ta useiden solumarkkerien visualisoimiseksi 6 viikon biopsioissa. Primaarisen ja sekundaarisen vasta-aineen kanssa inkuboinnin jälkeen kudosta käsiteltiin fluoresoivasti leimatulla tyramidilla. Sekundaarisesta vasta-aineesta peräisin oleva piparjuuriperoksidaasi katalysoi aktiivisten tyramidiradikaalien muodostumista. Tyramidiradikaalit sitoutuvat kovalenttisesti antigeenin tyrosiinitähteisiin. Tämä pysyvä sitoutuminen mahdollisti primaarisen ja sekundaarisen vasta-ainekompleksin lämmön aiheuttaman poistamisen säilyttäen samalla fluoresoivan tyramidikertymän [25]. Tämä mahdollisti myöhemmän peräkkäisen inkubaation muiden samasta lajista peräisin olevien vasta-aineiden kanssa kohdeantigeenejä vastaan.

mTSA suoritettiin kahdelle peräkkäiselle dialle 6 viikon seurantabiopsioista. Kehitimme kaksi mTSA-paneelia arvioimaan tulehduksellista infiltraatia ja peritubulaarisen kapillaarin laajuutta potilasryhmissämme. Paneeli I oli olemassa anti-CD3-, CD4-, CD8-, CD20-, CD68- ja CD34-vasta-aineista. Paneelia II käytettiin T-auttajasolujen ja makrofagien polarisaation tutkimiseen käyttämällä anti-CD4-, Tbet-, GATA3-, CD68- ja CD163-vasta-aineita. Vasta-ainespesifikaatiot, laimennokset ja värjäysjärjestykset on lueteltu lisätaulukossa 1. Kaikista objektilaseista tehtiin parafiini ksyleenissä, dehydratoitiin 95-prosenttisessa etanolissa, pestiin vesijohtovedellä ja keitettiin epitooppien hakemista varten 10x laimennetussa trisboraatti-EDTA:ssa (T). , 0658, VWR Life Sciences, USA) puskuri. Jäähdytyksen jälkeen objektilasit pestiin 3-prosenttisella vetyperoksidaasiliuoksella endogeenisen peroksidaasin estämistä varten ja pestiin tris-puskuroidulla suolaliuospuskurilla, jossa oli 0,05 prosenttia Tween 20:tä (822184, Merck KGaA, Saksa) (TBS-T). Proteiinisalpaus suoritettiin käyttämällä TBS-T:tä, jossa oli 1 % naudan seerumialbumiinia (BSA) (mTSA-vaihe 1). Primäärisiä vasta-aineita inkuboitiin 1 tunti huoneenlämpötilassa tai yön yli neljässä Celsius-asteessa (mTSA-vaihe 2). TBS-T:ssä pesun jälkeen levyjä inkuboitiin HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (Poly-HRP-GAMs/Rb IgG, VWRKDPVO999HRP, Immunologic, Alankomaat) kanssa 30 minuuttia huoneenlämpötilassa (mTSA vaihe 3). Seuraavaksi TSA suoritettiin käyttämällä Opal 7-color Manual IHC Kit -sarjan (NEL811001KT, Akoya Biosciences, US) Opal TSA -fluoroforeja (mTSA vaihe 4) (fluoroforit ja niitä vastaavat vasta-aineet on lueteltu lisätaulukossa 1). Vasta-aine-TSA-kompleksi poistettiin keittämällä TBE-puskurissa (mTSA-vaihe 5). mTSA-vaiheet 1–5 toistettiin, kunnes objektilasit värjättiin kaikilla vastaavan paneelin vasta-aineilla. Diat peitettiin fluoromount-G:llä, jossa oli DAPI (00-4959-52, Thermo Fisher, USA).

herba cistanche

Multiplex TSA-validointi

Toistuvat kiehumisjaksot voivat vaikuttaa kohdeepitoopin affiniteettiin. Jotkut vasta-aineet osoittavat heikompaa värjäytymiskuviota, kun kudosta on keitetty useita kertoja, toiset vasta-aineet tarvitsevat enemmän keittojaksoja saavuttaakseen optimaalisen värjäytymisintensiteetin, ja toiset eivät vaikuta lainkaan. Arvioimme tämän vaikutuksen kaikille vasta-aineille käyttämällä kromogeenistä IHC:tä FFPE-kontrollirisakudoksessa. Jokaisesta testatusta vasta-aineesta (n=9) leikattiin kuusi leikettä (paksuus 4 μm). Kaikista objektilaseista tehtiin parafiini ksyleenissä, dehydratoitiin 95-prosenttisessa etanolissa, pestiin vesijohtovedellä ja keitettiin epitooppien hakemista varten 10x laimennetussa TBE:ssä (kiehumissykli yksi). Jäähdytyksen jälkeen yksi objektilasi testattua vasta-ainetta kohti säilytettiin fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS). Loput lasit keitettiin uudelleen. Tämä sykli toistettiin viisi kertaa. Kaikki objektilasit pestiin tämän jälkeen 3-prosenttisella vetyperoksidaasiliuoksella ja huuhdeltiin PBS:ssä. Primäärisiä vasta-aineita (lisätaulukko 1) inkuboitiin 1 tunti huoneenlämpötilassa. Inkuboinnin jälkeen objektilasit pestiin PBS:ssä. Objektilasit, jotka on värjätty anti-CD68-, Tiibet- ja GATA3-vasta-aineilla, vaativat lisäinkuboinnin 15 minuutin ajan post-vasta-aineestolla (PAB) (VWRKDPVB-esto, Immunologic, Alankomaat). Inkuboinnin jälkeen objektilasit pestiin PBS:ssä ja inkuboitiin HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa (seuraa PAB VWRKDPVB110HRP:tä, Immunologic, Alankomaat, muiden osalta katso sekundaarista vasta-ainetta täydentävä taulukko 1). Visualisointi suoritettiin käyttämällä 3,3'-diaminobentsidiiniä (DAB) (Bright-DAB, VWRKBS04, Immunologic, Alankomaat). Tulokset on visualisoitu lisäkuvassa 1. Näiden tulosten perusteella määritimme optimaalisen vasta-ainejärjestyksen mTSA-kokeille lisätaulukon 1 mukaisesti.

Jos kiinnostavat epitoopit sijaitsevat yhdessä, tyramidikertymät voivat häiritä toisiaan. Tämän steerisen eston testaamiseksi käytimme risojen kontrollikudoslevyjä ja värjäsimme ne mTSA-paneeleillamme. Vasta-aineen ilmentymistä mTSA:ssa verrattiin yksivärisillä objektilaseilla, jotka kävivät läpi saman määrän kiehumissyklejä. Emme havainneet eroja värjäyskuvioissa yksi- ja multipleksivärjättyjen objektilasien välillä (esimerkit sisältyvät paneeliin I, täydentävät kuvat 2 ja 3). Kaikkia mTSA:n primäärisiä vasta-aineita käytettiin samassa laimennoksessa, jota käytettiin kromogeeniseen IHC:hen. Fluoresoivan signaalin intensiteetti optimoitiin säätämällä TSA-liuoksen laimennoksia.

Multiplex TSA-kuvaus

Monispektrikuvaus suoritettiin käyttämällä Vectra Polaris Imaging System -järjestelmää (CLS143455, Akoya Biosciences, USA) 20x objektiivilla, resoluutiolla 0,49 μm pikseliä kohden ja käyttämällä DAPI-, FITC-, CY3-, Texas Red- ja Cy5 spektrikuutiot. Vectra-järjestelmä mahdollistaa alueiden manuaalisen valinnan monispektrihakua varten, jotka järjestelmä jakaa myöhemmin ruutuihin (kuva 1.1). Autofluoresenssin spektrit ja kaikki Opal TSA -fluoroforit tallennettiin ennalta spektri "kirjastoon" käyttämällä Inform Advanced Image Analysis Software 2.4.6 -ohjelmistoa. (Akoya Biosciences, USA). Spektrikirjasto mahdollisti multipleksilaatan hajoamisen useiksi yksittäisiksi laatoiksi, jotka edustavat kunkin fluoroforin panosta ("sekoittamisen purkaminen"). Tämä johti yksikromiin, monikanavaisiin laattoihin, joista jokainen vastasi yhtä fluoroforia ja siten vasta-ainetta (kuva 1.2).

Muunnos keinotekoiseen kirkaskentän IHC:hen

Tallennettujen koordinaattien perusteella laatat ommeltiin luomaan monikanavainen WSI käyttämällä mukautettua python-skriptiä (kuva 1.3). Kanavat, jotka edustavat DAPI-signaalia (IDAPI) ja kanavat, jotka edustavat yhtä vasta-aineista (IIHC), muutettiin keinotekoiseksi hematoksyliini- ja DAB-värjäykseksi, vastaavasti (kuvat 1.4 ja 1.5). Perustuen tunnettuun kromaattiseen hematoksyliiniin ja DAB Cx, Cy-koordinaatteihin sävy-saturation-density (HSD) -muunnoksen jälkeen, värjäysvektorit hankittiin aikaisemmissa tutkimuksissa [26, 27]. Näitä värjäysvektoreita käytettiin puna-vihreä-sinisten arvojen laskemiseen keinotekoiselle kirkaskentän IHC:lle (kuva 1.5):

CR:llä st väriaineen valon absorptio st spektrin punaisessa osassa. Arvot B:lle ja G:lle laskettiin samalla tavalla.

Kuva-analyysi

Kiinnostavat alueet (ROI)

Kiinnostuksen kohteet (ROI) merkittiin jokaiselle kohortin tapaukselle käyttämällä automaattista diaanalyysialustaa (ASAP; versio 1.9, saatavilla avoimen lähdekoodin ohjelmistona GitHubissa). Nämä ROI:t koostuivat aivokuoren tubulointerstitiumista, mikä sulkee pois kapselin, glomerulukset ja valtimot. Koska munuaisten subkapsulaaristen alueiden tulehdusta ei pidetä epäspesifisenä siirtopatologiassa, tässä tutkimuksessa biopsiat analysoitiin ensisijaisesti kapselin alaosan ulkopuolelle (määriteltynä 400 µm kapselin alapuolella). Toissijaisesti toistimme analyysit, mukaan lukien kapselin alaosa. Visuaalisia esimerkkejä ROI:ista on lisäkuvassa 4.

Lymfosyyttien havaitseminen CNN I

Keinotekoiset kirkaskentän IHC-kuvat, jotka edustavat CD3-, CD4-, CD8- ja CD20-värjäytymistä, analysoitiin käyttämällä olemassa olevaa CNN-verkkoa U-Net-arkkitehtuurilla [22, 28]. Tämä verkko on erityisesti suunniteltu sytoplasmaattisten lymfosyyttimarkkerien havaitsemiseen IHC:ssä. CNN-suorituskyky voidaan ilmaista tarkkuudella, muistilla ja F1--pisteellä, missä:

CNN saavutti testisarjassa tarkkuuden {{0}},76, takaisinkutsun 0,79 ja F1-pistemäärän 0,78 jota käytettiin alkuperäisessä paperissa, joka koostuu perinteisestä IHC WSI:stä. Yksittäisten positiivisten solujen havaitseminen edellyttää CNN-lähdön kynnysarvoa, jota seuraa jälkikäsittely. Koska CD3-värjäytyminen mTSA-paneelissa oli voimakkaampi verrattuna CD4:ään, CD8:aan ja CD2:een0, kolmelle jälkimmäiselle käytettiin alempaa objektintunnistuskynnystä (0,4) ja alkuperäistä kohteen havaitsemiskynnystä CD3:lle (0,7). CNN:n suorituskyvyn arvioimiseksi keinotekoisissa kirkkauskentän IHC WSI:issä tässä tutkimuksessa käytettiin neljää keinotekoista kirkaskentän IHC WSI:tä (CD8 ja CD20 kahdelta potilaalta) tässä tutkimuksessa. Pistemerkinnät (n=1115) luotiin ASAP-ohjelmistolla. Verkon käytön jälkeen laskettiin tarkkuus, palautus ja F1- CNN-suorituskyvyn arvioimiseksi. Havaintoja pidettiin todella positiivisina, jos ne löydettiin 4 µm:n etäisyydeltä (lymfosyyttien keskimääräinen halkaisija) perustotuusmerkinnästä. Kun 4 µm:n alueelta löydettiin kaksi havaintoa, vain sitä havaintoa, joka oli lähinnä huomautusta, pidettiin todella positiivisena. Myöhemmin lymfosyyttien havaitsemismenetelmää CNN I käytettiin kaikkien sytoplasmaattisia lymfosyyttimarkkereita (CD3, CD4, CD8 ja CD20) edustavien keinotekoisten kirkkaiden kenttien IHC WSI:n analysointiin.

Lymfosyyttien havaitseminen CNN II

Keinotekoisen kirkaskentän IHC WSI:n analyysi ydinvärjäytyskuvioilla (kuten T-bet ja GATA3 esittivät) DAPI:ta ja CD4:ää edustavat kanavat valittiin yhdistettäväksi yhdeksi WSI:ksi (4). Aiemmissa tutkimuksissa hankittuja värjäysvektoreita käytettiin keinotekoisesti värjäämään DAPI-signaali siniseksi (hematoksyliini) ja CD4-signaali ruskeaksi (DAB), mikä johti keinotekoiseen kirkkaaseen IHC WSI:ään (5).

vaadittiin uuden CNN:n koulutusta, validointia ja testausta. Tätä tarkoitusta varten leikattiin yhdeksän objektilasia munuaisten, risojen ja umpilisäkkeen FFPE-kontrollikudoksesta. Nämä objektilasit IHC-värjättiin anti-Tiibetillä (klooni 4B1{{10}}, 14-5825-82, Thermo Fisher Scientific, USA) ja anti-GATA3:lla (klooni L50-823, CM -405B, Biocare Medical, Alankomaat) vasta-aineita. Diat digitoitiin Pannoramic 250 Flash II -digitaalisella diaskannerilla resoluutiolla 0,12 μm/pikseli. Kaksi tarkkailijaa tuotti 5726 pisteen merkintää eri alueilla käyttämällä ASAP-ohjelmistoa. Viiden dian huomautuksia käytettiin U-Net-arkkitehtuurin CNN:n opetukseen käyttämällä 256 × 256 pikselin patch-tiedostoja, joiden pikselikoko oli 0,49 μm/pikseli. Kahta WSI:tä käytettiin CNN:n validointiin ja kohteen havaitsemiskynnyksen (0,4) määrittämiseen. CNN:n suorituskyky perinteisessä IHC WSI:ssä arvioitiin kahden IHC WSI:n pidätetyllä testisarjalla. CNN:n suorituskyky keinotekoisen kirkaskentän IHC WSI:ssä arvioitiin toissijaisella testisarjalla, joka koostui neljästä keinotekoisesta kirkaskentän IHC WSI:stä (Tiibet ja GATA3 kahdelta potilaalta) 1082 pisteen merkinnöillä. Tarkkuus, muistaminen ja F{22}}pisteet laskettiin suorituskyvyn arvioimiseksi molemmissa testisarjoissa. Havaintoja pidettiin todella positiivisina, jos ne löydettiin 4 µm:n etäisyydeltä pohjatotuusmerkinnästä. Kun 4 µm:n alueelta löydettiin kaksi havaintoa, vain sitä havaintoa, joka oli lähinnä huomautusta, pidettiin todella positiivisena. Myöhemmin lymfosyyttien havaitsemismenetelmää CNN II käytettiin kaikkien keinotekoisten kirkkaiden kenttien IHC WSI:iden analysointiin, jotka edustavat ydin (lymfosyytti) markkereita (Tiibet ja GATA3).

Makrofagien havaitseminen CNN

Toisin kuin lymfosyyttien havaitsemisessa, yksittäisten makrofagien tunnistaminen ei ole yksiselitteistä. Erityisesti ryhmittyneissä kohtauksissa voidaan odottaa huomattavaa havainnointivaihtelua. Siksi paljon suurempaa määrää tapauksia ja ihmismerkintöjä käytettiin omistetun kolmannen CNN:n kouluttamiseen CD68 plus- ja CD163 plus -makrofagien havaitsemiseen. IHC-värjätyt objektilasit (n=111) alkuperäisestä ja transplantoidusta munuaiskudoksesta kerättiin. IHC-värjäykset suoritettiin käyttämällä anti-CD68:aa (klooni PG-M1, GA61361-2, Dako Omnis, Tanska tai klooni KP1, M0876, Dako, Tanska) tai anti-CD163:a (klooni MRQ) -26 tai 10D6, NCL-L-CD163, Leica Biosystems, UK) vasta-aine. IHC-diat digitoitiin käyttämällä panoraama 250 Flash II -digitaalidiaskanneria tai Aperio AT2 -diaskanneria (Leica Biosystems, Wetzlar, Saksa) resoluutiolla 0.24 tai 0. 0,25 μm/pikseli. Neljä tarkkailijaa tuotti 37 709 pisteen merkintää useille ROI:ille WSI:issä käyttäen makrofagien annotaatioprotokollaa, josta sovittiin ensimmäisten pilottikokeiden jälkeen. 101 dian huomautuksia käytettiin YoloV2-arkkitehtuurin CNN:n koulutukseen [29]. Yolo sopii erityisesti tunnistustehtäviin. Seitsemästä konvoluutiokerroksesta koostuvaa verkkoa harjoitteltiin 256 × 256 pikselin paikoilla, jotka erotettiin resoluutiolla 0,98 μm/pikseli ja rajauslaatikot 21 μm (keskimääräisen makrofagikoon perusteella). Kymmenen WSI:tä käytettiin CNN:n validointiin ja objektien havaitsemiskynnyksen (0,45) ja ei-maksimivaimennusparametrien (0,05) määrittämiseen. CNN:n suorituskyky perinteisessä IHC WSI:ssä arvioitiin kymmenen IHC WSI:n pidätetyllä testisarjalla. CNN:n suorituskyky keinotekoisen kirkaskentän IHC WSI:ssä arvioitiin toissijaisella testisarjalla, joka koostui neljästä keinotekoisesta kirkaskentän IHC WSI:stä (CD68 ja CD163 kahdelta potilaalta) ja 1033 pisteen huomautuksia. Tarkkuus-, muisti- ja F1-pisteet laskettiin suorituskyvyn arvioimiseksi molemmissa testisarjoissa. Havaintoja pidettiin todella positiivisina, jos ne löydettiin 21 µm:n etäisyydeltä (keskimääräinen makrofaagin halkaisija) perustotuusmerkinnästä. Kun 21 µm:n alueella löydettiin lisää havaintoja, vain merkintää lähinnä oleva ilmaisu katsottiin todella positiiviseksi. Myöhemmin makrofagien havaitsemisohjelmaa CNN käytettiin kaikkien makrofagimarkkereita (CD68 ja CD163) edustavien keinotekoisten kirkaskenttien IHC WSI:n analysointiin.

cistanche tubolosa testosteroni

Kaksinkertainen positiivisuus

Solujen positiivisuus kahdelle markkerille (kaksoispositiivisuus) arvioitiin määrittämällä pikselien lukumäärä solujen ilmaisujen välillä eri kanavissa. Jos kahden lymfosyyttihavainnon välinen etäisyys oli<4 µm,="" the="" cell="" was="" considered="" double-positive.="" for="" macrophages,="" this="" was="" set="" to=""><21µm. this="" was="" used="" to="" assess="" cd3+cd4+,="" cd3+cd8+,="" cd4+tbet+,="" cd4+gata3+,="" and="" cd68+cd163+="">

Cell numbers were calculated inside the ROIs, and cell densities were based on cell count and the area of the annotated ROI.

Tilasuhteet

Automaattinen soluntunnistus WSI:ssä mahdollistaa solujen välisten tilasuhteiden tutkimisen. Keskimääräinen lyhin etäisyys määritettiin (alueilla subkapsulaarista aluetta lukuun ottamatta) CD68 plus -soluille ja CD3 plus -, CD3 plus CD8 plus - ja CD20 plus -soluille paneelin I WSI:ssä molemmille potilasryhmille sekä CD163 plus -solujen ja CD4:n välillä. plus , CD4 plus Tbet plus ja CD4 plus GATA3 plus molempien potilasryhmien WSI:ssä.

Peritubulaarinen kapillaari laajuus

Peritubulaarisen kapillaarin laajuuden arvioimiseksi Fidžin alueella analysoitiin CD34-kanavaa edustavat sekoittamattomat WSI:t (ImageJ versio 2.0.0, USA, makrot ja laajennukset: "Open and Duplicate", "ASAP" ROI Reader") [30]. Positiiviset pikselit määritettiin automaattisen kynnyksen avulla ja ilmaistiin sen jälkeen prosentteina ROI:n sisällä olevien pikselien kokonaismäärästä.

Tilastollinen analyysi

Seuraavien solupopulaatioiden tiheydet laskettiin 6 viikon biopsioissa: T-lymfosyytit (CD3 plus ), sytotoksiset T-lymfosyytit (CD3 plus CD8 plus ), B-lymfosyytit (CD20 plus ), makrofagit (CD68 plus , paneelit I ja II), polarisoidut makrofagit (CD68 plus CD163 plus, CD163 plus), T-auttaja 1 -lymfosyytit (CD4 plus Tbet plus) ja T-auttaja 2 -lymfosyytit (CD4 plus GATA3 plus). Spearmanin korrelaatiokertoimet laskettiin sen arvioimiseksi, oliko korrelaatio olemassa T-auttaja 1:n ja T-auttaja 2:n lymfosyyttitiheyden (CD4 plus Tbet plus, CD4 plus GATA3 plus) ja polarisoituneiden makrofagien tiheyden (joko CD68 plus CD163 plus tai CD163 plus) välillä. Havaitsimme CD68-signaalin (fluorofori 540 nm) paneelin I keinotekoisissa CD4 (fluorofori 520 nm) IHC:issä. Siksi raportoimme lisäksi solutiheydet CD3- ja CD8-soluille. Arvioidaksemme eroja potilasryhmien välillä, joilla on erilaiset IFTA-tulokset, raportoimme solutiheyden mediaani-, vähimmäis- ja enimmäisarvot ryhmää kohti. Merkittävät erot solutiheydessä ja peritubulaarisen kapillaarin laajuudessa (määritelty CD{35}}positiivisena pikseliprosenttina) ryhmien välillä arvioitiin käyttämällä Mann–Whitneyn U-testiä riippumattomille näytteille. Riippumattomien näytteiden t-testillä arvioitiin, osoittavatko potilaat, joilla oli erilaisia ​​IFTA-tuloksia, merkittävästi erilaisia ​​CD3- ja CD8-/CD3- ja CD8-solusuhteita. Potilasryhmien väliset erot CD68 plus- ja CD163 plus -solujen spatiaalisissa suhteissa muiden immuunisolujen kanssa arvioitiin merkitsevyyden suhteen käyttämällä Mann–Whitneyn U-testiä riippumattomille näytteille.

Tulokset

CNN-pohjainen IHC-positiivisten solujen havaitseminen

Jotta voitaisiin soveltaa olemassa olevia CNN-verkkoja, jotka alun perin kehitettiin kirkaskenttämikroskopiaan, mTSA-fluoresenssikuvat muunnettiin keinotekoisiksi kirkaskenttäkuviksi. Kuvassa 2 on esimerkkejä mTSA-värjäytyneistä alueista ja niitä vastaavista keinotekoisista kirkaskentän IHC-kuvista. Esimerkki keinotekoisesta kirkaskentän IHC WSI:stä on esitetty täydentävässä kuvassa 4. Moniresoluutioiset WSI:t voitiin avata ja katsella digitaalisessa diassa. ohjelmistot, kuten ASAP ja Aperio ImageScope [v12.4.3.5008]. Kuten kuvassa 2 näkyy, keinotekoinen kirkaskenttä IHC WSI soveltui alun perin perinteistä IHC WSI:tä varten kehitettyjen CNN:ien automaattiseen analyysiin.

Kolmea CNN:tä käytettiin tulehdussolujen kvantitatiiviseen arviointiin 6 viikon mTSA-värjätyissä siirtobiopsioissa: lymfosyyttien havaitsemiseen sytoplasmisella (CNN I) ja tumalla (CNN II) IHC-värjäyksellä ja makrofagien havaitsemiseen. Taulukossa 2 on esitetty CNN-suorituskyky (tarkkuus-, palautus- ja F{3}}-pisteet) sekä DAB-värjättyjen IHC-WSI:iden että keinotekoisten kirkkaiden kenttien IHC-WSI:iden pit-out-sarjoille. CNN-suorituskyky oli tyypillisesti yhtä hyvä tai parempi kuin aiemmin kuvattu CNN-perusviiva (F1-pistemäärällä 0,78), jonka suorituskyvyn osoitettiin olevan verrattavissa kokeneiden manuaalisten tarkkailijoiden suorituskykyyn [22] . Vaikka lymfosyyttien havaitseminen CNN II osoitti jonkin verran heikompaa suorituskykyä virtuaalisissa kirkkaiden kenttien kuvissa verrattuna todellisiin DAB-kuviin (joihin CNN koulutettiin), CNN:llä havaittiin päinvastainen makrofagien havaitseminen.

Esimerkki onnistuneesta automaattisesta kaksoispositiivisuuden arvioinnista on kuvassa 3.

Eri solutyyppien korrelaatio

Vahvin korrelaatio havaittiin CD4 plus GATA3 plus solutiheyden ja CD163 plus solutiheyden välillä (Spearmanin kerroin 0,75, p < 0.001)="" 6="" viikon="" biopsia="" (lisäkuva="" 5a).="" tämä="" korrelaatio="" oli="" heikompi="" cd4="" plus="" tbet="" plus="" solutiheyden="" ja="" cd163="" plus="" solutiheyden="" välillä="" (spearmanin="" kerroin="" 0.61,="" p="">< 0.01)="" (täydentävä="" kuva="" 5b)="" .="" kun="" solupopulaatio="" rajoitettiin="" kaksoispositiivisiin="" makrofageihin="" (cd68="" plus="" cd163="" plus="" ),="" spearmanin="" korrelaatiokerroin="" oli="" 0,65="" (p="">< 0,01)="" cd4="" plus="" gata3="" plus="" -solujen="" kanssa="" ja="" 0,66="" (p="">< 0,01)="" cd4:n="" kanssa.="" plus="" tbet="" plus="" -solut="" (lisäkuva="" 5c,="" d).="" subkapsulaarisen="" alueen="" sisällyttäminen="" analyyseihin="" ei="" muuttanut="">

Tulehduksellisten infiltraattien vertailuIFTA:han etenevien potilaiden verrattuna ei-IFTA:han

Potilailla, jotka etenivät IFTA:han 6 kuukauden iässä, CD163 plus solutiheys oli merkittävästi korkeampi 6 viikkoa transplantaation jälkeen otetuissa biopsioissa (mediaani 505 solua/mm2) verrattuna potilaisiin, jotka eivät edenneet IFTA:han (mediaani 370 solua/mm2; p=0). 0,043) (taulukko 3). Subkapsulaarisen alueen sisällyttäminen johti tämän vaikutuksen lievään vähenemiseen (p=0.051). Molemmissa paneeleissa käytettiin CD68:aa ja CD4:ää. mTSA-paneelilla I värjätyillä objektilaseilla oli enemmän CD68-positiivisuutta kuin mTSA-paneelilla II:lla värjätyillä objektilaseilla. CD4-solutiheys on korkeampi mTSA-paneelissa II verrattuna mTSA-paneeliin I (taulukko 3).

Peritubulaarisen kapillaarin laajuus oli samanlainen 6 viikon biopsioissa DGF-potilaista, joilla oli erilaiset IFTA-tulokset (taulukko 3), sekä poissuljettaessa (p=0.74) että mukaan lukien (p=0.90) subkapsulaarinen alue. analyysistä/analyysissä.

CD3 plus CD8-/CD3 plus CD8 plus solusuhteiden arviointi osoitti huomattavasti korkeamman suhteen potilailla, joilla oli<10% ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (ratio="" of="" 17.5)="" than="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" (ratio="" of="" 9.80;="" p="0.043)" (table="">

Keskimääräinen lyhin etäisyys CD68 plus -soluista CD3 plus -, CD3 plus CD8 plus - ja CD20 plus -soluihin (paneeli I) ja CD163 plus -soluista CD4 plus -, CD4 plus Tbet plus - ja CD4 plus GATA3 plus -soluihin (paneeli II) teki eivät eroa merkittävästi potilasryhmien välillä. Tulokset näkyvät kuvassa 4.

cistanche-uute: parantaa munuaisten toimintaa ja fyysistä voimaa

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa kehitimme menetelmän tulehduksellisten solujen infiltraattien tarkkaan ja objektiiviseen kvantifiointiin munuaisensiirtopotilaiden, joilla on DGF, siirrännäinen biopsia, joka kiertää munuaisbiopsiamateriaalin laajan sarjaleikkauksen. Tätä tarkoitusta varten yhdistimme multipleksisen IHC:n, tyramidisignaalin vahvistuksen, monispektrisen kuvantamisen ja kvantifioinnin CNN:illä. Olimme ensimmäiset, jotka muunsimme laatoitetun monispektrisen datan yhdeksi keinotekoiseksi kromogeeniseksi kuvaksi solumarkkeria kohti, mikä helpotti WSI-analyysiä ja kirkaskentän IHC:tä varten suunniteltujen CNN:ien käyttöä. Suunnittelimme kaksi uutta CNN:tä tumavärjäytyneiden lymfosyyttien ja makrofagien havaitsemiseen ja osoitimme perinteisellä IHC WSI:llä kehitettyjen CNN:ien yleistettävyyden keinotekoiseen kirkaskenttä IHC WSI:hen. Menetelmämme soveltuvuus osoitettiin käyttämällä CNN:iden saamia kvantitatiivisia tuloksia tutkittaessa tulehduksellisen mikroympäristön korrelaatioita 6 viikon DGF-potilaiden biopsioissa IFTA:n kehittymisen kanssa 6 kuukautta transplantaation jälkeen.

Käytimme kaupallisesti saatavilla olevaa manuaalista värjäyssarjaa multiplex IHC:lle immuunisolujen ja peritubulaaristen kapillaarien visualisoimiseksi seurantabiopsioissa, jotka otettiin 6 viikkoa transplantaation jälkeen. Multipleksinen värjäysmenettely koostui useista pesu-, inkubaatio- ja kudoksen keittämisvaiheista ja sisältää useita reagenssiliuoksia. Laajat menetelmien validoinnit ja laadunvalvonta ovat siksi erittäin tärkeitä, ja on suositeltavaa käyttää spesifisiä vasta-aineita, jotka tuottavat tasaisen värjäytymisintensiteetin. Suoritetuista validointivaiheista huolimatta mTSA-paneelien I ja II objektilasien CD4-kanavissa havaittiin makrofagien kaltaisia ​​värjäytymiskuvioita. CD4- ja CD68-värjäyssyklejä ei suoritettu peräkkäin, joten tätä ilmiötä ei voitu aiheuttaa CD68-vasta-aineen epätäydellinen poistaminen (lisätaulukko 1). Vaikka makrofagien kaksoispositiivisuuden harvinaisia ​​esiintymiä CD4:n kanssa on kuvattu [31], uskottavampi selitys on fluoroforien emissiospektrien läheisyys, joita käytettiin CD4:n (520 nm) ja CD68:n (540 nm) visualisoinnissa. fluoresenssimikroskoopin FITC-suodatinkuutiolla. Tämä voi aiheuttaa vahvan CD68-signaalin "vuotoa" CD4-kanavaan. Suuri osa tästä signaalista jätettiin pois analyysistä paneelissa I, koska vain CD4 plus -soluja, jotka olivat kaksoispositiivisia CD3:n kanssa, käytettiin yleiseen T-auttajasoluanalyysiin. Siitä huolimatta päätimme arvioida epäsuorasti myös yleisiä T-auttajasoluja käyttämällä CD3:a plus CD8−:a korvaajana. Paneelissa II CD4:ää käytettiin vain yhdessä Tiibetin ja GATA3:n kanssa, mikä rajoitti riskiä väärien positiivisten havaintojen käyttöön.

Alempi CD68-positiivisuus havaittiin paneelissa II verrattuna paneeliin I. Oletamme, että tämä on seurausta CD163:een kuuluvan tyramidikertymän aiheuttamasta steerisestä inhibitiosta ("sateenvarjovaikutus") [32]. Havaitsimme huomattavasti enemmän CD163--positiivisia soluja tutkitussa kohortissa kuin risojen kudoksessa, jota käytettiin steerisen eston tarkistamiseen, mikä mahdollisesti selittää, miksi tätä vaikutusta ei havaittu validoinnin aikana.

Multiplex IHC on yhdistetty monispektrikuvaukseen kasvaimen mikroympäristön tutkimiseen useissa onkologisissa tutkimuksissa ja viime aikoina myös munuaissiirteen hylkimisreaktion analysointiin [33–35]. Kaikkien mTSA-levyjen markkerien osuuden poistamiseksi leikkeet kuvataan Vectra-järjestelmällä tai vastaavalla fluoresenssimikroskoopilla, jossa on monispektrijärjestelmä. Vähäisen suurennoksen yleiskuvan tallennuksen jälkeen Vectra-järjestelmä jakaa kudoksen laatoiksi ja skannaa laatat automaattisesti monispektrisesti. Tämä johtaa kuvaruutuihin, joissa on useita vaikuttavia spektrejä. Koska yksittäisten fluoroforien spektrit tunnetaan ennalta tallennetusta spektri "kirjastosta", on mahdollista hajottaa multipleksilaatat useiksi yksittäisiksi laatoiksi, jotka edustavat kunkin fluoroforin panosta ("sekoittumatta jättäminen"). Useimmissa tutkimuksissa sekoittamattomat kuvat analysoidaan myöhemmin kaupallisella ohjelmistolla. Monissa tapauksissa nämä ohjelmat eivät tue WSI-analyysiä, niillä on vaikeuksia analysoida klusteroituja soluja, eivätkä ne usein kestä artefakteja ja värjäytymisvariaatioita. Sekoittamattomien laattojen muuntaminen keinotekoisiksi kirkaskentän IHC WSI:iksi mahdollisti olemassa olevan CNN:n, joka on erityisesti suunniteltu lymfosyyttien havaitsemiseen IHC:ssä [22] (kutsutaan nimellä lymfosyyttien havaitseminen CNN I). Tämä verkko voi havaita yksittäisiä ja ryhmittyneitä lymfosyytit suurella tarkkuudella samalla kun se on kestävä taustavärjäytymiselle (kuva 2, CD3). Lisäksi koulutimme kaksi uutta CNN:tä ydinvärjäytymiskuvioiden (Tiibet, GATA3) (lymfosyyttien havaitsemiseen CNN II) ja makrofagien havaitsemiseen. Makrofageja on tunnetusti vaikea havaita niiden hajaantuneen värjäytyskuvion vuoksi. Makrofagien havaitsemista CNN koulutettiin siksi käyttämällä neljän eri asiantuntijan huomautuksia. Ennen huomautusten tekemistä suunniteltiin useita kokouksia, joissa keskusteltiin ja arvioitiin makrofagien annotoinnin kriteereitä. Tämä johti verkkoon, joka pystyy havaitsemaan makrofagit toistettavalla tavalla samalla kun se on kestävä ei-spesifiselle värjäykselle (taulukko 2, kuva 2 ja täydentävä kuva 6). Tietojemme mukaan tämä on ensimmäinen algoritmi makrofagien havaitsemiseen skannatuista histopatologisista leikkeistä. Testasimme kaikkien kolmen verkon suorituskykyä testisarjalla, joka koostui perinteisestä IHC WSI:stä (samanlainen kuin harjoittelun aikana käytettyjä), ja toissijaisessa testisarjassa, joka koostui keinotekoisesta kirkaskentästä IHC WSI:stä, joka luotiin monispektrisesti tallennetuista kuvista. Kaikki CNN:t osoittavat erittäin hyvää suorituskykyä ensisijaisissa testisarjoissa ja vastaavat F{11}}-pisteet toissijaisissa testisarjoissa. Lymfosyyttien havaitsemisen CNN I:n suorituskykymittarit laskettiin normaalista kudoksesta, artefakteista ja soluklustereista. Toisen testisarjan keinotekoinen kirkaskentän IHC ei sisältänyt kudosartefakteja ja vähemmän soluklustereita. Tämä voi selittää tämän verkon yleisen paremman suorituskyvyn toisessa testisarjassa. Makrofagien havaitsemista varten CNN koulutettiin ja testattiin neljän eri annotaattorin annotaatioilla. Vaikka merkintäkriteereistä keskusteltiin erityisesti, merkintätyylissä havaittiin kuitenkin vaihtelua. CNN:n herkkyys on siis luultavasti jossain annotaatiotyylien ääripäiden keskellä. Toisen testisarjan merkinnät loi yksi annotaattori, mikä ilmeisesti vastasi CNN-herkkyyttä.

Kuvattujen CNN:ien avulla pystyimme tutkimaan tulehduksellista infiltraattia ennennäkemättömällä tarkkuudella ainutlaatuisessa sarjassa tiukasti valituista DGF-potilaiden varhaisvalvontabiopsioista.

Valitettavasti useat näytteet jouduttiin sulkemaan pois analyysistä, mikä johtui enimmäkseen riittämättömästä jäännöskudoksesta diagnostisen käsittelyn jälkeen. Vaikka tietojoukon koko oli rajallinen, havaitsimme merkittävästi korkeammat CD163 plus solutiheydet niiden DGF-potilaiden biopsioista, jotka etenivät IFTA:n kehittymiseen, mikä on sopusoinnussa näiden solujen mahdollisen profibroottisen roolin kanssa [11]. Vaikka havaittu suuntaus oli yhdenmukainen julkaistujen tietojen kanssa, emme voineet vahvistaa CD68:n ja makrofagien varhaisen esiintymisen haitallista vaikutusta, jota on aiemmin raportoitu muissa munuaisensiirtopotilasryhmissä [7, 36, 37]. Löysimme positiivisen korrelaation CD4 plus GATA3 plus -solujen ja CD163 plus -solujen tiheysten välillä, mikä saattaa vahvistaa T-auttaja 2 -lymfosyyttien osuuden profibroottiseen mikroympäristöön. Vaikka tässä tutkimuksessa ei löydetty uusia ennustavia biomarkkereita IFTA-kehitykseen DGF-potilailla, kehitimme menestyksekkäästi menetelmiä tulehduksellisen infiltraatin tarkkaan, toistettavaan ja skaalautuvaan arviointiin harvassa kudoksessa, kuten siirtobiopsiat. Nämä menetelmät ovat arvokkaita tulevissa kvantitatiivisissa tutkimuksissa, jotka koskevat tulehdusta histopatologisessa kudoksessa.

Voit lievittää lisämunuaisen väsymystä cistanchella napsauttamalla tätä saadaksesi lisätietoja

Tietojen saatavuus

Tässä tutkimuksessa esitettyjen tietojen käyttöä koskevat yhteistyöpyynnöt voidaan osoittaa vastaavalle tekijälle (jeroen.vanderlaak@radboudumc.nl) tai FF:lle (Feuerhake. Friedrich@mh-hannover.de).

Kiitokset

Kiitämme Mark Gorrisia ja Kiek Verrijpiä neuvoista mTSA-värjäystä ja -kuvausta varten, Merijn van Erpiä räätälöityjen ImageJ-toimintojen kehittämisestä ja Sophie van den Broekia, Milly van de Warenburgia ja Martijn Ottenia perustotuuden luomisesta makrofagien havaitsemisverkostoa varten. Lisäksi kiitämme Irina Scheffneriä hänen avusta kliinisen tiedon keräämisessä.

Tekijän panoksetMH, VV, JS, WG, FF, BS, LBH ja JAWML

suunnitteli tutkimuksen. JS, WG ja FF keräsivät ja toimittivat potilasmateriaalin ja kliiniset tiedot. FF koordinoi MHH:ssa tehtyjä toimia. JHB, EJS ja JK saivat IFTA-prosenttiosuuden PAS-diasta. MH suoritti mTSA-värjäykset, paneelien I ja II validoinnit sekä paneelin I kuvantamisen ja sekoittumisen poistamisen. VV-kuvattu ja sekoittamaton paneeli II. DJG kehitti menetelmät mTSA-laattojen muuntamiseksi keinotekoisiksi kirkkauskentän WSI:ksi. MH suoritti muunnokset. ZS-C kehitti lymfosyyttien havaitsemisen CNN:t ja kirjoitti skriptit lymfosyyttien kvantifiointiin. JL kehitti makrofagien havaitsemisen CNN:t ja kirjoitti skriptit makrofagien kvantifiointiin. MH suoritti solu- ja kapillaarimääritykset. NSS laski solujen etäisyydet. MH, BS, LBH ja JAWML analysoivat tiedot. MH teki luvut ja laati paperin. Kaikki kirjoittajat tarkistivat ja hyväksyivät käsikirjoituksen lopullisen version.

RahoitusTätä työtä tuki ERACoSysMed-aloite (projekti SysMIFTA) osana Euroopan unionin Horizon 2020 -puiteohjelmaa, jonka tarjosi ZonMw (apuraha nro 9003035004), Saksan tutkimus- ja koulutusministeriön (BMBF) yhteisrahoituksella, apuraha nro . FKZ031L-0085A (SysMIFTA), FKZ01ZX1710A (MicMode-I2T) ja FKZ01ZX1608A (SYSIMIT). JAWML sai konsulttipalkkiot Philipsiltä (Alankomaat) ja apurahoja

ContextVision, Philips (Alankomaat) ja Sectra (Ruotsi), lähetetyn työn ulkopuolella. JK sai taloudellista tukea Hollannin munuaissäätiöltä (projekti DEEPGRAFT, apuraha nro 17OKG23).

Eettisten standardien noudattaminen

EturistiriitaKirjoittajat eivät ilmoittaneet kilpailevia etuja.

Eettinen hyväksyntä ja suostumus osallistumiseenTiedonkeruu ja analysointi suoritettiin potilaan tietoisen suostumuksella ja Hannover Medical Schoolin eettisen lautakunnan (nro 2765) hyväksynnällä.

Kustantajan huomautusSpringer Nature pysyy neutraalina julkaistujen karttojen ja institutionaalisten yhteyksien suhteen.

Avoin pääsyTämä artikkeli on lisensoitu Creative Commons Attribution 4:n.0 Kansainvälinen lisenssi, joka sallii käytön, jakamisen, mukauttamisen, jakelun ja jäljentämisen missä tahansa välineessä tai muodossa, kunhan annat asianmukaisen tunnustuksen alkuperäiselle kirjoittajalle (alkuperäisille kirjoittajille) ) ja lähde, anna linkki Creative Commons -lisenssiin ja ilmoita, onko muutoksia tehty. Tämän artikkelin kuvat tai muu kolmannen osapuolen materiaali sisältyy artikkelin Creative Commons -lisenssiin, ellei materiaalin luottorajassa toisin mainita. Jos materiaali ei sisälly artikkelin Creative Commons -lisenssiin ja käyttötarkoituksesi ei ole lakisääteinen tai ylittää sallitun käytön, sinun on hankittava lupa suoraan tekijänoikeuksien haltijalta.

Viitteet

1. Siedlecki A, Irish W, Brennan DC. Viivästynyt siirteen toiminta munuaisensiirrossa. Am J -siirto. 2011;11:2279–96.

2. Khalkhali HR, Ghafari A, Hajizadeh E, Kazemnejad A. Pitkäaikaisen siirteen menetyksen riskitekijät munuaissiirteen vastaanottajilla, joilla on krooninen allografin toimintahäiriö. Exp Clin Transplant. 2010;8:277–82.

3. Yarlagadda SG, Coca SG, Formica RN, Poggio ED, Parikh CR. Viivästyneen siirteen toiminnan ja allograftin ja potilaan eloonjäämisen välinen yhteys: systemaattinen katsaus ja meta-analyysi. Nephrol Dial -siirto. 2009;24:1039–47.

4. Schröppel B, Legendre C. Viivästynyt munuaissiirteen toiminta: mekanismista translaatioon. Kidney Int. 2014;86:251–8.

5. Mengel M, Reeve J, Bunnag S, Einecke G, Jhangri GS, Sis B, et ai. Kokonaistulehduksen pisteytys on parempi kuin nykyinen Banff-tulehduksen pistemäärä ennustettaessa lopputulosta ja molekyylihäiriön astetta munuaissiirreissä. Am J -siirto. 2009;9:1859–67.

6. Cosio FG, Grande JP, Wadei H, Larson TS, Griffin MD, Stegall

MD. Ennustaa myöhemmän munuaissiirteen toiminnan heikkenemisen varhaisen seurantabiopsian perusteella. Am J -siirto. 2005;5:2464–72.

7. Toki D, Zhang W, Hor KLM, Liuwantara D, Alexander SI, Yi Z, et ai. Makrofagien rooli ihmisen munuaissiirteen fibroosin kehittymisessä ensimmäisenä vuonna siirron jälkeen. Am J -siirto. 2014;14:2126–36.

8. Ikezumi Y, Suzuki T, Yamada T, Hasegawa H, Kaneko U, Hara M, et ai. Vaihtoehtoisesti aktivoidut makrofagit kroonisen munuaissiirteen vaurion patogeneesissä. Pediatr Nephrol. 2015;30:1007–17.

9. Biswas SK, Mantovani A. Makrofagien plastisuus ja vuorovaikutus lymfosyyttialaryhmien kanssa: syöpä paradigmana. Nat Immunol. 2010; 11:889–96.

10. Anders HJ, Ryu M. Munuaisten mikroympäristöt ja makrofagien fenotyypit määräävät munuaistulehduksen ja -fibroosin etenemisen tai paranemisen. Kidney Int. 2011;80:915–25.

11. Ordikhani F, Pothula V, Sanchez-Tarjuelo R, Jordan S, Ochando J. Macrophages in organ transplantation. Frontiers Immunol. 2020;11:582939.

12. Loverre A, Divella C, Castellano G, Tataranni T, Zaza G, Rossini M, et ai. T-auttaja 1, 2 ja 17 solun alajoukot munuaisensiirtopotilailla, joilla on viivästynyt siirteen toiminta. Transpl Int. 2011;24:233–42.

13. Klauschen F, Müller KR, Binder A, Bockmayr M, Hägele M, Seegerer P, et ai. Kasvaimia infiltoivien lymfosyyttien pisteytys: visuaalisesta arvioinnista koneoppimiseen. Seminaari Cancer Biol. 2018;52:151–7.

14. Lauren J, Häyry P, Paavonen T. Kuva-analyysiin perustuva menetelmä kroonisten allograftivaurioindeksin parametrien kvantifiointiin. AMPS. 2006; 114:440–8.

15. Malpica N, Solórzano CO, de, Vaquero JJ, Santos A, Vallcorba I, García-Sagredo JM, et ai. Vedenjakaja-algoritmien soveltaminen klusteroitujen ytimien segmentointiin. Sytometria. 1997;28:289–97.

16. Lai YK, Rosin PL. Tehokas pyöreä kynnys. IEEE Trans Med Imaging. 2014; 23:992–1001.

17. Litjens G, Kooi T, Ehteshami Bejnordi B, Setio AAA, Ciompi F, Ghafoorian M, et ai. Tutkimus syväoppimisesta lääketieteellisessä kuva-analyysissä. Med Image Anal. 2017; 42:60–88.

18. Madabhushi A, Lee G. Kuvaanalyysi ja koneoppiminen digitaalisessa patologiassa: haasteita ja mahdollisuuksia. Med Image Anal. 2016;33:170–5.

19. Ehteshami Bejnordi B, Veta M, Diest PJ, van, Ginneken B, van, Karssemeijer N, Litjens G, et ai. Syväoppimisalgoritmien diagnostinen arviointi imusolmukkeiden etäpesäkkeiden havaitsemiseksi rintasyöpää sairastavilla naisilla. JAMA. 2017; 318: 2199–210.

20. Hermsen M, Bel T, de, Boer M, den, Steenbergen EJ, Kers J, Florquin S, et ai. Syväoppimiseen perustuva munuaiskudoksen histopatologinen arviointi. J Am Soc Nephrol. 2019; 30:1968–79.