Cistanches Herban laatumerkit, jotka perustuvat antioksidanttispektri-vaikutussuhteeseen

Tiivistelmä: Tavoite: Luoda tutkimusmenetelmä laatumerkkien (Q-markkerien) tutkimiseenCistanches Herba(CH) perustuuantioksidanttispektri-vaikutussuhde, joka tarjoaa perustan sen farmakologisten aineiden tutkimukselle ja laadunvalvonnalle. Menetelmät: Ultra-high-performance -nestekromatografiaa (UPLC) käytettiin sormenjälkiprofiilien muodostamiseen 10 CH-erälle. Solujen oksidatiivisen vaurion malli luotiin käyttämällä H2O2:ta, ja CH:n antioksidanttikapasiteetti määritettiin reaktiivisten happilajien puoleen maksimaalisesta estopitoisuudesta sekä happipitoisuuden tasoista.superoksididismutaasijakatalaasikutenfarmakologiset indikaattorit. Spektri-vaikutussuhde muodostettiin pääkomponenttianalyysillä, Pearson-korrelaatioanalyysillä ja osittaisten pienimmän neliösumman regressioanalyysillä. Theaktiiviset komponentitolivat alaisiafarmakologinen validointi. 

Tulokset:CH:n sormenjälkiprofiilit määritettiin käyttämällä UPLC:tä, tunnistaen 17 yhteistä piikkiä. Spektri-vaikutuskorrelaatioanalyysin perusteella valittiin yhdeksän komponenttia. Farmakologiset validointitulokset osoittivat, että geniposidiinihappo, 8-epilogaanihappo,ekinakosidi,akteosidi, isoakteosidi, jatubulosidi Aosoitti antioksidanttiaktiivisuutta pitoisuudesta riippuvaisella tavalla.

Johtopäätös: Tässä tutkimuksessa tutkittiin CH:n Q-markkereita spektri-vaikutussuhteen perusteella, mikä tarjosi viitetietoja sen farmakologisesta aineesta ja laatustandardien parantamisesta.

Avainsanat:Cistanches Herba; Q-merkki;spektri-vaikutussuhde; antioksidantti

Cistanche deserticola on Cistanche deserticola -perheeseen orbaceae kuuluvan kasvin Cistanche deserticola YCMa tai Cistanche tubulosa (Schenk) Wight kuivattu, mehevä varsi, jossa on hilseileviä lehtiä. Se on luonteeltaan lämmin, maultaan makea ja suolainen; se palaa munuaisten ja paksusuolen meridiaaneihin; se ravitsee munuaisten yangia, täydentää esanssia ja verta, kostuttaa suolistoa ja on laksatiivinen, ja se on tärkeä munuaisten virkistys- ja esanssia täydentävä lääke [2-3]. Munuaiset varastoivat esanssia, ja esanssi ja veri tulevat samasta lähteestä. Jos esanssi ja veri ovat puutteellisia, se vaikuttaa ihmiskehon yleisiin elämäntoimintoihin; esanssia tuottava luuydin varastoituu luihin, ja aivot ovat ydinmeri. Jos munuaisesanssi on riittämätön, luut menettävät ravintonsa ja aivot ovat puutteellisia, mikä johtaa luun rappeuttaviin muutoksiin, kuten löysään rakenteeseen, hampaiden menetykseen, muistin menetyksiin, dementiaan ja immuunitoiminnan heikkenemiseen [4-6]. Cistanche deserticola sisältää fenyylietanoidiglykosideja, iridoideja, lignaaneja ja muita rakenneosia, mukaan lukien ekinakosidi, verbaskosidi, verbaskosidi, genipiinihappo ja 8-epistryaanihappo. , tubuliini A jne. [7]. Nykyinen Cistanche deserticolan laadunvalvonta "Kiinan kansantasavallan farmakopean" vuoden 2020 painoksessa määrää vain ekinakosidin ja verbaskosidin sisällön, jotka eivät voi täysin heijastaa perinteisen kiinalaisen lääketieteen monikomponenttisia ja monitahoisia toimintaominaisuuksia. , mikä ei edistä sen laadunvalvontaa ja arviointia.

Parantaakseen perinteisen kiinalaisen lääketieteen laadunvalvontatasoa ja optimoidakseen perinteisen kiinalaisen lääketieteen laadunarviointia akateemikko Liu Changxiao ehdotti uutta perinteisen kiinalaisen lääketieteen laatumerkki (Q-marker) -käsitettä [8]. Niiden joukossa "tehokkuus" on Q-markkerin "viiden periaatteen" [9] ydinelementti ja myös perinteisten kiinalaisten lääkkeiden laadun arvioinnin ydin.

Kun otetaan huomioon nykyinen tutkimustilanne, jossa laatustandardien ja lääkkeiden tehon välinen korrelaatio on heikko, perinteisten kiinalaisten lääkkeiden Q-merkkien tutkiminen ja tieteellisempien ja järkevämpien laatustandardien vahvistaminen on erittäin tärkeää perinteisten kiinalaisten lääkkeiden laadun parantamiseksi. Spektri-vaikutussuhde yhdistää perinteisen kiinalaisen lääketieteen sormenjälkikromatografiset huiput erityisiin farmakodynaamisiin tietoihin perinteisen kiinalaisen lääketieteen tehokkaiden aineiden löytämiseksi, mikä heijastaa perinteisen kiinalaisen lääketieteen luontaista laatua [10]. Spektritehokkuuden matemaattisen mallin perustaminen voi selventää perinteisen kiinalaisen lääketieteen QMarkeria "kokonaisvaltaisen näkökulman" näkökulmasta tarjoamalla enemmän viittauksia perinteisen kiinalaisen lääketieteen myöhempään laadunvalvontaan, laatustandardien muotoiluun ja vaikuttavien ainesosien seulomiseen. Tässä tutkimuksessa käytetään sormenjälkiä yhdistettynä reaktiivisten happilajien puoliinhibitioasteeseen (ROS IC50), superoksididismutaasin (SOD) ja katalaasin (CAT) pitoisuuksiin perinteisen kiinalaisen lääketieteen spektri-vaikutussuhteen tutkimiseen, ja pääkomponenttianalyysiä. (PCA) ), Pearson-korrelaatioanalyysi (PCC) ja osittaisen pienimmän neliösumman regressioanalyysi (PLS) Cistanche deserticolan Q-markkerin kattavaa analysointia varten perustan luomiseksi sen laadunvalvontaan.

1 materiaalia

1.1 Näyte

Cistanche deserticola korjattiin Yutian Countysta Xinjiangista ja Cistanche deserticola Good Agricultural Practice (GAP) -istutuspaikasta Sisä-Mongoliassa. Tutkija Zhang Tiejun Tianjin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd:stä tunnisti sen nimellä Cistanche tubulosa (Schenk) Wight ja Cistanche deserticola.

YC Ma, yksityiskohtaiset tiedot näkyvät taulukossa 1.

1.2 Testaa lääkettä

Echinaceaside (eränumero: 111670-201907, puhtaus: 91,8 %) ja verbaskosidi (eränumero: 111530-201914, puhtaus: 95,2 %) ostettiin molemmat China Institute of Food and Drug Controlilta; isoreskosidi (eränumero: 61303-13 -7), salidrosidi (eränumero: 10338-51-9), 8-epistryknoiinihappo (eränumero: 82509-41-9), genipiinihappo (eränumero: Z24A10X95926) , tuberoosi B (eränumero: 112516-04-08), 2-asetyylieugenoliglykosidi (eränumero: 94492-24-7) ostettiin Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.:ltä, puhtaus on suurempi tai yhtä suuri kuin 98 %; Cistanche-glykosidi A (eränumero: MUST -20062806, puhtaus: 98,51 %), floridiini A (erän numero: MUST19110102, puhtaus: 98,57 %) ostettiin Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd:ltä; kromatografisesti puhdas asetonitriili ja muurahaishappo ostettiin yhtiöltä Tianjin Concord Technology Co., Ltd. Company; Puhdistettu vesi (Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd.). E-vitamiini (VE, V8010, Beijing Solarbio Company); dimetyylisulfoksidi (DMSO, D2660-100ML, Sigma Company of the United States); CellTiter 96® AQueous yksiliuos soluproliferaation havaitsemispakkaus (G3580, Promega Company of the United States); CAT-tunnistus Kit (S0051), SOD-aktiivisuuden havaitsemispakkaus (S0101M) ja ROS-tunnistuspakkaus (S0033S) ostettiin Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd:ltä.

1.3 Laitteet

Waters H-luokan PDA ultra-korkea suorituskyky nestekromatografi (Waters Company, USA); Sartorius BT25S elektroninen vaaka (Sartorius Company, Saksa); H1650 nopea työpöydän sentrifugi (Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.); SpectraMax M5

Mikrolevylukija (Meigu Molecular Instrument Co., Ltd.); WYS-41XDY biologinen mikroskooppi (Tianjin Micro-Instrument Optical Instrument Co., Ltd.).

1,4 solua

Tässä kokeessa käytettiin ihmisen alkion munuaissoluja HEK 293 -soluja, ja ne ostettiin Kiinan tiedeakatemian solupankista.

2 menetelmää

2.1 Sormenjälkikartan luominen

2.1.1 Testiliuoksen valmistus: Punnitse 2 g Cistanche deserticola -lääkemateriaalia, lisää 10 kertaa vesimäärä, kuumenna ja refluksoi 3 kertaa, 1 h joka kerta, sentrifugoi 1:llä.0 × 105 r·min-1 15 minuutin ajan (keskipakosäde on 300 mm), Yhdistä supernatantit ja väkevöi kantaliuokseksi, jonka massapitoisuus on 100 mg·mL-1, laimenna se 10 kertaa, ja suodata se 0,22 um:n mikrohuokoisen suodatinkalvon läpi sen saamiseksi.

2.1.2 Sekavertailuliuoksen valmistaminen

Ota 8-epistrryknihappo, salidrosidi, echinaceaside, cistanche-glykosidi A, genipiinihappo, verbaskosidi, antosyanosidi A, isorbaskosidi ja 2'-asetyylieugenoli. Glykosidi- ja angiosidi B-vertailuaineet mitattiin sopivina määrinä ja punnittiin tarkasti. Liuotetaan 50 % metanoliliuosta ja valmistetaan sekoitettu vertailuaineliuos, jonka massapitoisuus on 20 µg·mL–1.

2.1.3 Kromatografiset olosuhteet

ACQUITY UPLC®BEH C18 -kolonni (100 mm × 2,1 mm, 1,7 µm); liikkuva faasi on asetonitriili (A) ~ 0,1 % muurahaishappoliuos (B), gradienttieluointiohjelma (0 ~ 6 min, 5 % ~ 8 % A; 6 - 10 min, 8 % ~ 15 % A 10-13 min, 15-19 % A, 13-20 min, 19-25 % A); ilmaisuaallonpituus on 237 nm; virtausnopeus on 0,4 ml·min-1; kolonnin lämpötila on 40 astetta; injektiotilavuus on 3 µl.

2.1.4 Viitehuipun valinta

Cistanche deserticolan ultra-suorituskykyisen nestekromatografian (UPLC) kromatogrammissa huippu, jolla oli suurin piikin pinta-alasuhde, kohtalainen retentioaika ja hyvä erotus, valittiin sormenjälkispektrin vertailuhuipuksi. 2.1.5 Metodologinen tutkimus Tarkkuuskoe: Otetaan T1-näyte ja valmistetaan testiliuos kohdan 2.1.1 menetelmän mukaisesti. Ruiskuta näyte 6 kertaa jatkuvasti ja tallenna sormenjälki. Tulokset osoittavat, että kunkin piikin suhteellinen huippualueen RSD on 0,10%~4,61%. , suhteellisen retentioajan RSD on 0,08 % ~ 1,32 %, mikä osoittaa, että instrumentin tarkkuus on hyvä.

Toistettavuustesti: Otetaan näyte T1 ja valmistetaan 6 näytettä testiliuoksesta rinnakkain kohdan 2.1.1 menetelmän mukaisesti ja injektoidaan näyte jatkuvasti. Tulokset osoittavat, että kunkin kromatografisen piikin suhteellinen piikin pinta-ala RSD on 1,35 % ~ 4,80 % ja suhteellinen retentioaika RSD on 0,10 % ~ 1,80 %, mikä täyttää sormenjäljen vaatimukset ja osoittaa, että toistettavuus instrumentti on hyvä.

Stabiilisuustesti: Ota T1-näyte ja valmista testiliuos kohdan 2.1.1 menetelmän mukaisesti, injektoi näytteet testausta varten 0, 2, 4, 8 ja 12 tunnin kohdalla ja kirjaa sormenjälki. Kunkin kromatografisen piikin suhteellisen piikin alueen laskettu RSD on 0,53 %~4,82 % ja suhteellisen retentioajan RSD on 0,09 %~2,17 %, mikä täyttää vaatimukset. sormenjäljestä ja osoittaa, että testituote on vakaa 12 tunnin sisällä.

2.2 Tutkimus Cistanche deserticolan antioksidanttisesta vaikutuksesta

2.2.1 Cistanche deserticola -emäliuoksen valmistus:Ota emäliuos kohdan 2.1.1 mukaisesti, suodata ja steriloi ja laimenna se elatusaineella vaadittuun pitoisuuteen ennen käyttöä.

2.2.2 Cistanche deserticolan ja positiivisen kontrollin VE:n vaikutukset HEK 293 -solujen elinkykyyn

Perusta normaali ryhmä (solususpensio), Cistanche deserticolan annosteluryhmä (25, 50, 100, 200, 400 µg·mL–1), VE-ryhmä (20, 40, 60, 80, 100 µmol·L–1), kukin Aseta 6 kaksoiskuoppaa kullakin konsentraatiolla ja viljelmällä 24 tunnin ajan. Lisää 20 µl CellTiter 96® AQueous -yksiliuosreagenssia jokaiseen kuoppaan solujen elinkelpoisuuden havaitsemiseksi. Jatka viljelyä 2 tuntia. Käytä mikrolevylukijaa kunkin kuopan absorbanssiarvon (OD) havaitsemiseen aallonpituudella 490 nm. Laske solujen eloonjäämisaste kaavan (1) mukaisesti. Eloonjäämisprosentti (%)=(OD-kokeellinen ryhmä/OD-tyhjäryhmä) × 100 % (1)

2.2.3 Cistanche deserticolan vaikutus H2O2:n indusoimaan ROS:iin HEK 293 -soluissa

Solut jaettiin normaaliryhmään (solususpensio) ja Cistanche deserticola -annosteluryhmään (6,25, 12,5, 25, 50, 100 µg·mL–1 Cistanche deserticola ja 60 µm·L–1 H2O2) ja viljeltiin 24 tuntia. Seuraa ROS-tunnistussarjan vaiheita myöhemmissä toimenpiteissä, tarkkaile solujen värjäytymistä suoraan mikroskoopilla ja käytä mikrolevylukijaa kunkin ryhmän fluoresenssin intensiteetin havaitsemiseen. Parametriasetuksissa käytettiin viritysaallonpituutta 488 nm ja emissioaallonpituutta 525 nm. Koe toistettiin kolme kertaa.

2.2.4 Cistanche deserticolan vaikutus H2O2--indusoituun HEK 293 -solujen SOD:hen

Jaa solut normaaliryhmään (solususpensio) ja malliryhmään

(60 µm·L–1 H2O2), VE-ryhmä (60 µm·L–1 VE ja 60 µm·L–1 H2O2), Cistanche deserticola -hoitoryhmä (100 µg·mL–1 Cistanche deserticola ja 60 µm·L–1 H2O2), kerää solut 24 tunnin viljelyn jälkeen, lisää SOD-näytteen valmistusliuos solujen hajottamiseksi, sentrifugoi 4 asteessa, 12000 r·min-1 5 minuuttia (keskipakosäde on 300 mm), ota supernatantti noudata testattavana näytteenä SOD-tunnistussarjaa Noudata alla olevia ohjeita. Koe toistettiin kolme kertaa.

2.2.5 Cistanche deserticolan vaikutus H2O2--indusoituun CAT:hen HEK 293 -soluissa

Noudata kohdan 2.2.4 menetelmää ja ryhmäannostelua, lisää lyysiliuos, sentrifugoi 4 astetta, 12000 r·min-1 10 minuuttia (sentrifugin säde on 300 mm), ota supernatantti ja noudata CAT-tunnistussarja. Seurantatoimenpiteet. Koe toistettiin kolme kertaa.

2.2.6 Tilastollinen analyysi

Tilastolliseen analyysiin käytettiin SPSS 26.{1}} -ohjelmistoa. Kutakin tietoryhmää edusti (±±(). Yksisuuntainen varianssianalyysi suoritettiin tiedolle, joka vastasi normaalijakaumaa. Jos varianssit olivat yhtä suuret, käytettiin pienimmän merkityksellisen eron menetelmää. Jos varianssit olivat epätasaisia, käytettiin Dunnettin T3-menetelmää GraphPad Prism 8:aa, ja P<0.05 was considered as a statistically significant difference.

2.3 Cistanche deserticola -antioksidantin spektri-vaikutuskorrelaatioanalyysi

2.3.1 PCA Cistanche deserticola -lajin 10 erän yhteisten piikkien, joilla on muodostuneet sormenjäljet, huippualueet standardoitiin Z-arvon mukaan ja niistä tehtiin 10 × 17 tilaustietomatriisi, joka tuotiin SPSS 26.0 -ohjelmistoon. PCA:lle.

2.3.2 PCC Käytä SPSS 26:ta.0 suorittaaksesi kaksimuuttujaanalyysin tutkiaksesi spektritehokkuutta Cistanche deserticola -sormenjälkien ja antioksidanttien välillä.

Merkittävyystestauksessa käytetään kaksipuolista testiä (T) P:n kanssa<0.05 as the standard for statistically significant differences.

2.3.3 PLS Tuo Cistanche deserticolan standardoidun huippualueen ja antioksidantin kokeelliset tulokset SIMCA-P 14.1 -ohjelmistoon, aseta piikin pinta-ala X-muuttujaksi ja aseta farmakodynaaminen indeksi Y-muuttujaksi PLS:n suorittamiseksi.

2.4 Cistanche deserticola Q-markkerin antioksidanttiaktiivisuuden tarkastus

2.4.1 Vaikuttavan aineen emäliuoksen valmistus

Punnitse tarkasti sopivat määrät genipiinihappoa, 8-epistrikiinihappoa, echinaceasidea, verbaskosidia, isorebaskosidia ja antosyanosidi A:ta ja lisää DMSO:ta niiden liuottamiseksi 10 mmol·L-1:een kontrollia varten. tuoteratkaisu.

2.4.2 Vaikuttavien aineiden vaikutus HEK 293:n sytotoksisuuteen

Kun HEK 293 -soluja oli inkuboitu 24 tuntia, 100 µl aktiivisen aineosan liuoksia kohdassa 2.4.1 (0,781, 1,563, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 µmol·1) kuhunkin kuoppaan lisättiin erilaisia ​​pitoisuuksia ja stimulaatiota jatkettiin. CellTiter 96® AQueous -yksiliuosreagenssi lisättiin soluihin 24 tuntia myöhemmin solujen elinkelpoisuuden havaitsemiseksi.

2.4.3 Aktiivisten aineosien antioksidanttivaikutus H2O2--indusoituihin HEK 293 -soluihin

Solut ryhmiteltiin seuraavasti: normaaliryhmä, malliryhmä, VE-ryhmä ryhmiteltiin kuten kohdassa 2.2.4, koeryhmä (0.781, 1.563, 3.125 µm·L–1 vaikuttava aine ja 60 µm·L–1 H202), viljeltiin 24 tuntia. Määritä solunsisäiset ROS-tasot, SOD- ja CAT-entsyymipitoisuudet kohtien 2.2.3, 2.2.4 ja 2.2.5 menetelmien mukaisesti.

Wecistanchen tukipalvelu

Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Puhelin:+86 15292862950

Osta lisätietoja teknisistä tiedoista:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop