Cistanches Herban laatumerkit, jotka perustuvat antioksidanttispektri-vaikutussuhteeseen

Abstrakti

Tavoite: Luoda tutkimusmenetelmä laatumarkkereille (Q-markkereille).Cistanches Herba(CH) perustuuantioksidanttispektri-vaikutussuhde, joka tarjoaa perustan sen farmakologisten aineiden tutkimukselle ja laadunvalvonnalle. Menetelmät: Ultra-high-performance -nestekromatografiaa (UPLC) käytettiin sormenjälkiprofiilien muodostamiseen 10 CH-erälle. Solujen oksidatiivisen vaurion malli luotiin käyttämällä H2O2:ta, ja CH:n antioksidanttikapasiteetti määritettiin reaktiivisten happilajien puolet maksimaalisesta estopitoisuudesta sekä superoksididismutaasin ja katalaasin tasoista farmakologisina indikaattoreina. Spektri-vaikutussuhde muodostettiin pääkomponenttianalyysillä, Pearson-korrelaatioanalyysillä ja osittaisten pienimmän neliösumman regressioanalyysillä. Aktiivisille komponenteille tehtiin farmakologinen validointi. Tulokset: CH:n sormenjälkiprofiilit määritettiin käyttämällä UPLC:tä, tunnistaen 17 yhteistä piikkiä. Spektri-vaikutuskorrelaatioanalyysin perusteella valittiin yhdeksän komponenttia. Farmakologiset validointitulokset osoittivat, että geniposidiinihappo, 8-epilogaanihappo,ekinakosidi, akteosidi,isoakteosidi, jatubulosidi Aosoitti antioksidanttiaktiivisuutta pitoisuudesta riippuvaisella tavalla. Johtopäätös: Tässä tutkimuksessa tutkittiin CH:n Q-markkereita spektri-vaikutussuhteen perusteella, mikä tarjosi viitetietoja sen farmakologisesta aineesta ja laatustandardien parantamisesta.

Avainsanat:Cistanches Herba; Q-merkki;spektri-vaikutussuhde; antioksidantti

Orgaaninen kaskansuuute, jossa on 30 % KINAKOOSIDEA JA 12 % AKTEOSIDIA MUUNAISTEN TOIMINTAAN

Cistancheon kuivattu mehevä varsi, jossa on hilseileviä lehtiä Cistanche deserticola YCMa tai Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, joka kuuluu Orobanchiaceae-heimon Cistanche-sukuun. Se nauhoitettiin ensimmäisen kerran "Shen Nong's Materia Medicassa" ja se on listattu huippuluokkaan [1]. Se on luonteeltaan lämmin, maultaan makea ja suolainen; se palaa munuaisten ja paksusuolen meridiaaneihin; se ravitsee munuaisten yangia, täydentää esanssia ja verta, kostuttaa suolistoa ja on laksatiivinen, ja se on tärkeä lääke munuaisten tonisoinnissa ja esanssin täydentämisessä [2-3]. Munuaiset varastoivat esanssia, ja esanssi ja veri tulevat samasta lähteestä. Jos esanssi ja veri ovat puutteellisia, se vaikuttaa ihmiskehon yleisiin elämäntoimintoihin; esanssia tuottava luuydin varastoituu luihin, ja aivot ovat ydinmeri. Jos munuaisesanssi on riittämätön, luut menettävät ravintonsa ja aivot ovat vajavaisia, mikä johtaa luun rappeuttaviin muutoksiin, kuten löysä rakenne, hampaiden menetys, muistin menetys, dementia ja immuunitoiminnan heikkeneminen [4-6]. Cistanche deserticola sisältää fenyylietanoliglykosideja, iridoideja, lignaaneja ja muita rakenneosia, mukaan lukien echinaceaside, verbascoside, isorbascoside, genipiinihappo ja 8-epistryaanihappo. , tubuliini A jne. [7]. Nykyinen Cistanche deserticolan laadunvalvonta "Kiinan kansantasavallan farmakopean" vuoden 2020 painoksessa määrää vain echinaceaside- ja verbascoside-sisällön, jotka eivät voi täysin heijastaa perinteisen kiinalaisen lääketieteen monikomponenttisia ja -kohdetoimintoja. , mikä ei edistä sen laadunvalvontaa ja arviointia.

Parantaakseen perinteisen kiinalaisen lääketieteen laadunvalvontatasoa ja optimoidakseen perinteisen kiinalaisen lääketieteen laadunarviointia akateemikko Liu Changxiao ehdotti uutta perinteisen kiinalaisen lääketieteen laatumerkki (Q-marker) -käsitettä [8]. Niiden joukossa "tehokkuus" on Q-markkerin "viiden periaatteen" [9] ydinelementti ja myös perinteisten kiinalaisten lääkkeiden laadun arvioinnin ydin.

Kun otetaan huomioon nykyinen tutkimustilanne, jossa laatustandardien ja lääkkeiden tehon välinen korrelaatio on heikko, perinteisten kiinalaisten lääkkeiden Q-merkkien tutkiminen ja tieteellisempien ja järkevämpien laatustandardien vahvistaminen on erittäin tärkeää perinteisten kiinalaisten lääkkeiden laadun parantamiseksi. Spektri-vaikutussuhde on yhdistää perinteisen kiinalaisen lääketieteen sormenjälkikromatografiset huiput erityisiin farmakodynaamisiin tietoihin perinteisen kiinalaisen lääketieteen tehokkaiden aineiden löytämiseksi, mikä heijastaa perinteisen kiinalaisen lääketieteen luontaista laatua [10]. Spektritehokkuuden matemaattisen mallin perustaminen voi selventää perinteisen kiinalaisen lääketieteen QMarkeria "kokonaisvaltaisen näkökulman" näkökulmasta tarjoamalla lisää viittauksia perinteisen kiinalaisen lääketieteen myöhempään laadunvalvontaan, laatustandardien muotoiluun ja vaikuttavien ainesosien seulomiseen. Tässä tutkimuksessa käytetään sormenjälkiä yhdistettynä reaktiivisten happilajien puoliinhibitioasteeseen (ROS IC50), superoksididismutaasin (SOD) ja katalaasin (CAT) pitoisuuksiin perinteisen kiinalaisen lääketieteen spektri-vaikutussuhteen tutkimiseen, ja pääkomponenttianalyysiä. (PCA) ), Pearson-korrelaatioanalyysi (PCC) ja osittaisen pienimmän neliösumman regressioanalyysi (PLS) Cistanche deserticolan Q-markkerin kattavaa analysointia varten perustan luomiseksi sen laadunvalvontaan.

1 materiaalia

1.1 Näyte

Cistanche deserticolaoli korjattu Yutian Countysta, Xinjiangista ja Cistanche deserticola Good Agricultural Practice (GAP) -istutuspaikasta Sisä-Mongoliassa. Tutkija Zhang Tiejun Tianjin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd:stä tunnisti sen nimellä Cistanche tubulosa (Schenk) Wight ja Cistanche deserticola.

YC Ma, yksityiskohtaiset tiedot näkyvät taulukossa 1.

1.2 Testaa lääkettä

Echinaceaside (eränumero: 111670-201907, puhtaus: 91,8 %) ja verbaskosidi (eränumero: 111530-201914, puhtaus: 95,2 %) ostettiin molemmat China Institute of Food and Drug Controlilta; isoreskosidi (eränumero: 61303-13 -7), salidrosidi (eränumero: 10338-51-9), 8-epistryknoiinihappo (eränumero: 82509-41-9), genipiinihappo (eränumero: Z24A10X95926) , tuberosiini B (eränumero: 112516-04-08), 2-asetyylieugenoliglykosidi (eränumero: 94492-24-7) ostettiin Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.:ltä, puhtaus on suurempi tai yhtä suuri kuin 98 %; Cistanche-glykosidi A (eränumero: MUST -20062806, puhtaus: 98,51 %) ja vaskuliini A (erän numero: MUST19110102, puhtaus: 98,57 %) ostettiin Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd:ltä; kromatografisesti puhdas asetonitriili ja muurahaishappo ostettiin yhtiöltä Tianjin Concord Technology Co., Ltd. Company; Puhdistettu vesi (Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd.). E-vitamiini (VE, V8010, Beijing Solarbio Company);

dimetyylisulfoksidi (DMSO, D2660-100ML, Sigma Company, USA); CellTiter 96® AQueous yksiliuos soluproliferaation havaitsemispakkaus (G3580, Promega Company, USA); CAT-tunnistuspakkaus (S0051), SOD-aktiivisuuden havaitsemispakkaus S0101M) ja ROS-ilmaisusarja (S0033S) ostettiin Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd:ltä.

1.3 Laitteet

Waters H-luokan PDA ultra-korkea suorituskyky nestekromatografi (Waters Company, USA); Sartorius BT25S elektroninen vaaka (Sartorius Company, Saksa); H1650 nopea työpöydän sentrifugi (Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.); SpectraMax M5

Mikrolevylukija (Meigu Molecular Instrument Co., Ltd.); WYS-41XDY biologinen mikroskooppi (Tianjin Micro-Instrument Optical Instrument Co., Ltd.).

1,4 solua

Tässä kokeessa käytettiin ihmisen alkion munuaissoluja HEK 293 -soluja, ja ne ostettiin Kiinan tiedeakatemian solupankista.

2 menetelmää

2.1 Sormenjälkikartan luominen

2.1.1 Testiliuoksen valmistus: Punnitse 2 g Cistanche deserticola -lääkemateriaalia, lisää 10 kertaa vesimäärä, kuumenna ja refluksoi 3 kertaa, 1 h joka kerta, sentrifugoi 1:llä.0 × 105 r·min-1 15 minuutin ajan (keskipakosäde on 300 mm), Yhdistä supernatantit ja väkevöi kantaliuokseksi, jonka massapitoisuus on 100 mg·mL-1, laimenna se 10 kertaa, ja suodata se 0,22 um:n mikrohuokoisen suodatinkalvon läpi sen saamiseksi.

2.1.2 Sekavertailuliuoksen valmistaminen

Ota 8-epistrryknihappo, salidrosidi, echinaceaside, cistanche-glykosidi A, genipiinihappo, verbaskosidi, antosyanosidi A, isorbaskosidi ja 2'-asetyylieugenoli. Glykosidi ja angiosidi B -vertailuaine mitattiin sopivina määrinä ja punnittiin tarkasti. Liuotetaan 50 % metanoliliuosta ja valmistetaan sekoitettu vertailuaineliuos, jonka massapitoisuus on 20 µg·mL–1.

2.1.3 Kromatografiset olosuhteet

ACQUITY UPLC®BEH C18 -kolonni (100 mm × 2,1 mm, 1,7 µm); liikkuva faasi on asetonitriili (A) ~ 0.1 % muurahaishappoliuos (B), gradienttieluointiohjelma (0 - 6 min, 5 % ~ 8 % A; 6 - 10 min, 8 % - 15 % A 10-13 min, 15-19 % A, 13-20 min, 19-25 % A); ilmaisuaallonpituus on 237 nm; virtausnopeus on 0,4 ml·min-1; kolonnin lämpötila on 40 astetta; injektiotilavuus on 3 µl.

2.1.4 Viitehuipun valinta

Cistanche deserticolan ultra-suorituskykyisen nestekromatografian (UPLC) kromatogrammissa huippu, jolla on suurin piikin pinta-alasuhde, kohtalainen retentioaika ja hyvä erotus, valittiin sormenjälkispektrin vertailuhuippuksi.

2.1.5 Metodologinen katsaus

Tarkkuuskoe: Otetaan näyte T1 ja valmistetaan testiliuos kohdan 2.1.1 menetelmän mukaisesti. Ruiskuta näyte 6 kertaa jatkuvasti ja tallenna sormenjälki. Tulokset osoittavat, että kunkin piikin suhteellinen huippualueen RSD on 0,10 %~4,61 % ja suhteellinen retentioaika RSD Se on 0,08 % ~ 1,32 %, mikä osoittaa, että instrumentilla on hyvä tarkkuutta.

Toistettavuustesti: Otetaan näyte T1 ja valmistetaan 6 näytettä testiliuoksesta rinnakkain kohdan 2.1.1 menetelmän mukaisesti ja injektoidaan näyte jatkuvasti. Tulokset osoittavat, että kunkin kromatografisen piikin suhteellinen piikin pinta-ala RSD on 1,35 % ~ 4,80 % ja suhteellinen retentioaika RSD on 0,10 % ~ 1,80 %, mikä täyttää sormenjäljen vaatimukset ja osoittaa, että toistettavuus instrumentti on hyvä.

Stabiilisuustesti: Ota T1-näyte ja valmista testiliuos kohdan 2.1.1 menetelmän mukaisesti, injektoi näytteet testausta varten 0, 2, 4, 8 ja 12 tunnin kohdalla ja kirjaa sormenjälki. Kunkin kromatografisen piikin suhteellisen piikin alueen laskettu RSD on 0,53 %~4,82 % ja suhteellisen retentioajan RSD on 0,09 %~2,17 %, mikä täyttää vaatimukset. sormenjäljestä ja osoittaa, että testituote on vakaa 12 tunnin sisällä.

2.2 Tutkimus Cistanche deserticolan antioksidanttisesta vaikutuksesta

2.2.1 Cistanche deserticola -emäliuoksen valmistus

Ota emäliuos kohdan 2.1.1 mukaisesti, suodata ja steriloi se ja laimenna se elatusaineella vaadittuun pitoisuuteen ennen käyttöä.

2.2.2 Cistanche deserticola ja positiivinen kontrolli

VE:n vaikutus HEK 293 -solujen elinkelpoisuuteen asetettiin normaaliksi ryhmäksi (solususpensio), Cistanche deserticola -hoitoryhmäksi (25, 50, 100, 200, 400 µg·mL–1), VE-ryhmäksi (20, 40, 60). , 80, 100 µmol·L–1), aseta 6 kaksoiskuoppaa kullekin pitoisuudelle, viljele 24 tuntia, lisää 20 µL CellTiter 96® AQueous -yksiliuosreagenssia jokaiseen kuoppaan solujen elinkelpoisuuden havaitsemiseksi, jatka viljelyä 2 tuntia, ja käytä mikrolevylukijaa solujen elinkelpoisuuden havaitsemiseksi 490 nm:ssä. Kunkin kuopan absorbanssiarvoa (OD) käytettiin solujen eloonjäämisasteen laskemiseen kaavan (1) mukaisesti. Eloonjäämisprosentti (%)=(OD-kokeellinen ryhmä/OD-tyhjäryhmä) × 100 % (1)

2.2.3 Cistanche deserticola H2O2-induktiossa

ROS:n vaikutus HEK 293 -soluihin. Solut jaettiin normaaliryhmään (solususpensio) ja Cistanche deserticola -annosteluryhmään (6,25, 12,5, 25, 50, 100 µg·mL–1 Cistanche deserticola ja 60 µm·L–1 H2O2) ja viljeltiin 24 tuntia. Seuraa ROS-tunnistussarjan vaiheita myöhemmissä toimenpiteissä, tarkkaile solujen värjäytymistä suoraan mikroskoopilla ja käytä mikrolevylukijaa kunkin ryhmän fluoresenssin intensiteetin havaitsemiseen. Parametriasetuksissa käytettiin viritysaallonpituutta 488 nm ja emissioaallonpituutta 525 nm. Koe toistettiin kolme kertaa.

2.2.4 Cistanche deserticola -pari

H2O2:n vaikutus SOD:hen HEK 293 -soluissa. Solut jaettiin normaaliryhmään (solususpensio), malliryhmään (60 µm·L–1 H2O2), VE-ryhmään (60 µm·L–1 H2O2 ja 60 µm·L–1 H2O2), Cistanche deserticola -hoitoryhmään (100). µg·mL–1 Cistanche deserticola ja 60 µm·L–1 H2O2), kerää solut 24 tunnin viljelyn jälkeen, lisää SOD-näytteen valmistusliuosta solujen hajottamiseksi ja sentrifugoi 4 asteessa ja 12 000 r·min{22} } min (sentrifugointisäde on 300 mm), ota supernatantti testattavaksi näytteeksi ja seuraa SOD-tunnistussarjan ohjeita myöhemmissä toimenpiteissä. Koe toistettiin kolme kertaa.

2.2.5 Cistanche deserticola H2O2-induktiossa

CAT:n vaikutukset HEK 293 -soluihin käsiteltiin kohdan 2.2.4 menetelmän mukaisesti ja ryhmiteltiin ryhmiin. Lisää käsittelyn jälkeen lyysiliuos, sentrifugoi 4 astetta ja 12 000 r·min-1 10 minuuttia (keskipakoisäde on 300 mm), ota supernatantti ja noudata seuraavissa toimenpiteissä CAT-tunnistussarjan ohjeita. . Koe toistettiin kolme kertaa.

2.2.6 Tilastollinen analyysi

Tilastolliseen analyysiin käytettiin SPSS 26.{1}} -ohjelmistoa. Jokaista dataryhmää edusti (±±(). Yksisuuntainen varianssianalyysi suoritettiin normaalijakauman mukaisille tiedoille. Jos varianssit olivat yhtä suuret, käytettiin Pienin merkitsevän eron menetelmää. Jos varianssit olivat epätasainen, käytettiin Dunnettin T3-menetelmää GraphPad Prism 8:aa, ja P<0.05 was considered as a statistically significant difference.

2.3 Cistanche deserticola -antioksidantin spektri-vaikutuskorrelaatioanalyysi

2.3.1 PCA Cistanche deserticola -lajin 10 erän yhteisten piikkien, joissa on muodostuneet sormenjäljet, huippualueet normalisoitiin Z-arvolla ja niistä tehtiin 10 × 17 -tilaustietomatriisi, joka tuotiin SPSS 26.0 -ohjelmistoon. PCA:lle.

2.3.2 PCC

SPSS 26.0 käytettiin kaksimuuttujaanalyysissä tutkimaan spektrin tehokkuutta Cistanche deserticola -sormenjälkien ja antioksidanttien välillä. Merkittävyystesti suoritettiin käyttämällä kaksipuolista testiä (T), jossa P<0.05 as the standard for statistically significant differences.

2.3.3 PLS

Tuo Cistanche deserticolan standardoidun huippualueen ja antioksidantin kokeelliset tulokset SIMCA-P 14.1 -ohjelmistoon, aseta piikin alue X-muuttujaksi ja farmakodynaaminen indeksi Y-muuttujaksi PLS:n suorittamiseksi.

2.4 Cistanche deserticola Q-markkerin antioksidanttiaktiivisuuden tarkastus

2.4.1 Vaikuttavien aineiden emäliuoksen valmistus. Punnitse tarkasti sopivat määrät genipiinihappoa, 8-epistrikiinihappoa, echinaceasidea, verbaskosidia, isorebaskosidia ja antosyanosidi A:ta ja lisää DMSO:ta niiden liuottamiseksi 10 mmol·L-1 vertailuliuokseen.

2.4.2 Vaikuttavien aineosien vaikutus HEK 293:n sytotoksisuuteen.

Kun HEK 293 -soluja on inkuboitu 24 tuntia, lisää kuhunkin kuoppaan eri pitoisuuksia aktiivisten aineosien liuoksia kohdassa 2.4.1 (0.781, 1.563, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 µmol·L–1 ) 100 µl, jatkuva stimulaatio

Kun soluja oli inkuboitu 24 tuntia, CellTiter 96® AQueous -yksiliuosreagenssi lisättiin solujen elinkelpoisuuden havaitsemiseksi.

2.4.3 Aktiivisten aineosien antioksidanttivaikutus H2O2--indusoituihin HEK 293 -soluihin.

Solut ryhmitellään seuraavasti: normaaliryhmä, malliryhmä ja VE-ryhmä ryhmitellään kohdan 2.2.4 mukaisesti. Koeryhmä (0.781, 1.563, 3.125 µm·L–1 aktiivisuuskoostumus ja 60 µm·L–1 H2O2), viljeltiin 24 tuntia. Määritä solunsisäiset ROS-tasot, SOD- ja CAT-entsyymipitoisuudet kohtien 2.2.3, 2.2.4 ja 2.2.5 menetelmien mukaisesti.

Wecistanchen tukipalvelu

Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Puhelin:+86 15292862950

Osta lisätietoja teknisistä tiedoista:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop