Suojaavat huumori- ja soluimmuunivasteet SARS-CoV:lle-2 jatkuvat jopa vuoden toipumisen jälkeen

SARS-CoV-2-rokote on käynnistetty maailmanlaajuisesti tehokkaan väestötason immuniteetin luomiseksi tämän viruksen leviämisen hillitsemiseksi. Suojaavan immuniteetin tehokkuus ja kesto ovat kansanterveyden kannalta kriittisiä tekijöitä. Tässä raportoimme SARS-CoV-2-spesifisen immuunivasteen kinetiikasta 204 henkilöllä 1-vuoden ajan COVIDista toipumisen jälkeen-19. RBD-IgG- ja täyspitkän piikki-IgG-pitoisuudet ja seerumin neutralointikyky laskevat ensimmäisten 6 kuukauden aikana, mutta pysyvät vakaana jopa vuoden ajan sairaalasta kotiutumisen jälkeen. Jopa henkilöillä, jotka olivat tuottaneet korkeita IgG-tasoja varhaisessa toipilasvaiheessa, IgG-tasot olivat laskeneet samanlaiselle tasolle vuotta myöhemmin.

Laumaimmuniteetilla tarkoitetaan rokottamattomien tai tartunnan saamattomien ihmisten tehokasta suojaa yhteiskunnassa, kun yhä useammat yhteiskunnan ihmiset ovat saaneet immuniteetin tietylle taudille rokotuksen tai luonnollisen tartunnan kautta. Tämä vähentää epidemian leviämisen ja esiintymisen mahdollisuutta. Yleisesti ottaen, kun 70 - yli 90 prosenttia yhteiskunnan väestöstä on saanut immuniteetin sairautta vastaan, yhteiskunnan väestön immuniteetti voi saavuttaa riittävän tason suojaamaan rokottamattomia tai tartunnan saamattomia ihmisiä. Tartunnan saaneet ihmiset ovat immuuneja taudille.

Samalla meidän on parannettava myös omaa vastustuskykyämme, mikä edellyttää hyviä elämäntapoja, kuten terveellistä ruokavaliota ja riittävää liikuntaa. Lisäksi havaitsimme, että Cistanche voi myös parantaa immuniteettia. Cistanche sisältää runsaasti antioksidantteja, jotka voivat vähentää vapaita radikaaleja ihmiskehossa. rooli, mikä parantaa immuniteettia.

Napsauta cistanche tubulosa -etuja

Erityisesti RBD-IgG-taso korreloi positiivisesti seerumin neutralointikyvyn kanssa, mikä viittaa RBD-IgG:n edustavaan rooliin seerumin suojan ennustamisessa. Lisäksi virusspesifinen soluimmuunisuoja, mukaan lukien piikki- ja nukleoproteiinispesifinen, säilyi 6 kuukauden ja 12 kuukauden välillä. Kaiken kaikkiaan tutkimuksemme tukee virusspesifisen suojaavan immuniteetin säilymistä yli vuoden.

Vaikeiden akuutin hengitystieoireyhtymän koronavirus 2 -virusten (SARS-CoV-2) spesifiset immuunivasteet ovat kriittisiä viruksen replikaation estämisessä, taudin vakavuuden lievittämisessä ja uudelleentartunnan estämisessä1–4. Villityypin SARS-CoV-2-infektiosta toipuneet henkilöt voivat suojautua D614G-mutantin1 aiheuttamalta uudelleentartunnalta. Deng et ai. osoittivat, että SARS-CoV-2:lle altistuneet kädelliset kehittävät voimakkaita vasta-ainevasteita reesusmakakki-infektiomallissa ja ovat enimmäkseen immuuneja uudelleentartunnalle2.

In a clinical trial testing the protective effect of neutralizing antibodies, outpatients who received neutralizing antibody therapy were less likely to have a COVID-19–related hospitalization or visit to an emergency department and were less likely to develop severe symptoms3. A two-dose regimen of BNT162b2 elicited robust immune protection against COVID-19 in persons aged >16 vuotta 4. SARS-CoV-2 toipilaspotilaat ja rokotteen saajat synnyttävät yleensä vahvan immuunivasteen. Suojaavat immuunivasteet SARSCoV-2-infektiota vastaan ​​koostuvat kahdesta pääosasta, humoraalisesta immunoglobiinista (IgA ja IgG) ja T-soluvasteista.

Ihanteellinen tavoite on saada aikaan steriili infektio; Näin ollen useimmat tutkimukset keskittyvät suojaavaan seerumin IgG-analyysiin sen helpon saatavuuden varmistamiseksi1,2,4,5. Tehokas T-soluimmuunisuoja kohdistuu viruksia sisältäviin soluihin, rajoittaa viruksen leviämistä in vivo, nopeuttaa viruksen puhdistumaa ja lievittää sairauden taakkaa. Virusspesifiset humoraaliset ja T-soluvasteet voivat kestää hieman heikentyneenä jopa 6–8 kuukautta toipilaisilla SARS-CoV{10}}-henkilöillä5,6. Se, voidaanko suojaavaa immuunimuistia ylläpitää pitkällä aikavälillä ja voivatko vasta-aineet tai T-solut antaa kestävän suojan, vaatii lisätutkimuksia, ja tämän alueen ymmärtäminen hyödyttää myös rokotteiden kehittämistä.

Tässä analysoimme virusspesifisten humoraalisten ja solujen immuunivasteiden dynaamisia muutoksia 1 vuoteen asti COVID-19 pitkittäisseurantakohortissa. Tässä edustavassa potilasryhmässä SARS-CoV-2-spesifiset IgM- ja IgA-tasot laskivat merkittävästi taustatasoille yhden vuoden sisällä. Piikkispesifinen IgG ja seerumin suojakyky laskivat merkittävästi ensimmäisen 6 kuukauden aikana, mutta säilyivät jopa 1 vuoden ajan. SARS-CoV{11}}-spesifiset T-soluimmuunivasteet pysyivät vakaina jopa vuoden sairaalasta kotiutumisen jälkeen. Nämä havainnot viittaavat siihen, että suojaava immuunivaste SARS-CoV-virusta vastaan{14}} voi kestää vähintään vuoden.

Tulokset

COVID{0}}-kohortin ominaisuudet.

Tähän seurantatutkimukseen osallistui edustava 204 toipuneen henkilön kohortti (68,2 prosenttia) 299 potilaasta saman ajanjakson aikana, jotka vietiin Guangzhoun kahdeksanteen kansansairaalaan Guangzhoussa, Kiinassa 20.1.–29.2.2020. Näistä osallistujista 29:llä diagnosoitiin vaikeita oireita, 162:lla kohtalaisia, 12:lla lieviä ja yhdellä oireettomana (taulukko 1). Heidän ikänsä ja sukupuolensa edustivat koko potilaspopulaatiota (Supp. Kuva 1). Ainoaa oireetonta potilasta lukuun ottamatta kaikki henkilöt luovuttivat verinäytteitä useaan ajankohtaan; onneksi 50 henkilöä (24,5 prosenttia 204:stä) suoritti koko seurantakierroksen ja antoi verinäytteitä kaikissa neljässä seurantaajankohdassa. Siten immuunimuistin kinetiikka oli mahdollista. Lyhyesti sanottuna seurantakohortti edustaa koko COVID{20}}-potilaiden väestöä Guangzhoussa vuoden 2020 alussa.

SARSCoV-vasta-aineiden pituussuuntaiset muutokset{0}}.

Piikkien SARS-CoV-2 reseptoria sitovalla domeenilla (RBD) on olennainen rooli viruksen sitoutumisessa sen reseptoriin, angiotensiinia konvertoivaan entsyymiin 2 (ACE2). RBD-spesifisten vasta-aineiden tasot korreloivat sen kanssa ja edustavat sitä. neutralointikyky7. Analysoimme kiertävien RBD-spesifisten IgM-, IgA- ja IgG-vasta-aineiden kinetiikkaa ajan myötä kaksivaiheisella epäsuoralla immunotestillä elektrokemiluminesenssi-immunomäärityssarjoilla8.

First, all patients were positively seroconverted (at least one IgM >1 COI, IgA >1 COI, or IgG >1 COI) vähintään kerran, mikä vahvisti todellisen SARS-CoV-2-infektion esiintyneen kaikilla valituilla potilailla. Vaikeat potilaat tuottivat merkittävästi korkeammat RBD-IgA-, RBD-IgG- ja piikki-IgG-arvot, mutta eivät RBD-IgM, kuin keskivaikeat potilaat sairaalavaiheessa (kuvat 1a–d ja lisäkuva 2). Tuloksemme tuki, että immuunijärjestelmän pidempi altistuminen viruksille lisäsi virusspesifisten vasta-aineiden muodostumista.

Seuraavaksi havaitsimme, että RBD-spesifisen IgM:n taso laski dramaattisesti arvosta 4,669 (keskimääräinen COI, jäljempänä) arvoon 0,785 (negatiivinen) (noin kuusinkertainen, p < 0.0 001, pariton t-testi Welchin korjauksella) 3 kuukauden kuluessa purkamisesta (kuva 1a). RBD-spesifinen IgA laski myös huomattavasti arvosta 9,283 arvoon 3,234 (vain 286-}kertainen, p < 0,0001, pariton t-testi Welchin korjauksella) 3 kuukauden sisällä, mutta pysyi 6 kuukaudessa (3,491, p { {24}}.073, pariton t-testi Welchin korjauksella). Lopulta RBD-IgA muuttui negatiiviseksi 12-kuukauden pisteessä (0,57) (p < 0,0001, pariton t-testi Welchin korjauksella) (Kuva 1b). Koska IgA suorittaa limakalvossa neutralointitehtävää, sen seerumipitoisuuksien odotettiin olevan jopa huipussaan alhaisempia kuin limakalvokudoksissa. Vaatii lisätutkimuksia, pystyvätkö limakalvokudokset säilyttämään stabiilin IgA:n.

RBD-IgG:tä pidettiin kriittisenä indikaattorina immuunisuojassa virusinfektioita vastaan. Analyysimme osoitti, että RBDIgG laski 287-kertaiseksi arvosta 825 AU/ml 287 AU/ml kolmen ensimmäisen kuukauden aikana (p < 0.0001, pariton t-testi Welchin korjauksella) ja edelleen arvoon 153 AU/ml 6-kuukauden ajankohtina (p=0.0033) (kuva 1c, pariton t-testi Welchin korjauksella), mikä oli yhdenmukainen aiempien raporttien kanssa5,6 .

Erityisesti RBD-IgG-tasot säilyivät stabiilina 1 vuoteen asti (keskimäärin 170 AU/ml, kuvio 1c). Täyspitkän piikki-IgG:n taso, mitattuna itsenäisesti, osoitti samanlaista mallia kuin RBD-IgG:llä (kuvio 1d), mikä edelleen vahvistaa edellä esitettyä havaintoa, että vasta-aine pysyisi vakaana 6 kuukaudesta 1 vuoteen nopean laskun jälkeen.

RBD-IgG- ja täyspitkät piikki-IgG-tasot osoittivat vahvan positiivisen korrelaation (r=7411, p < 0,0001,n=474, Pearson-korrelaatio, kuva 1e). Vahva positiivinen korrelaatio RBD-IgG:n ja täyspitkän piikki-IgG:n välillä havaittiin useissa aikapisteissä (kuva 1e ja lisäkuva 3).

Thus, RBD-IgG was used in the following analysis. To investigate what kind of patients tends to maintain long-term RBD-IgG-producing capacity, we test the influence of initial antibody titers on antibody persistence. We divided the follow-up individuals with at least the first three follow-up visits into high RBD-IgG (maximal titer >1000 AU/ml) ja matala (100 < maksimititteri).<1000 AU/ml) groups. We observed that the high group had significantly higher RBD-IgG levels at the in-hospital stage (p = 0.0004, an unpaired t-test with Welch's correction), 1-month (p = 0.0026, an unpaired t-test with Welch's correction), and 3-month (p = 0.0363, an unpaired t-test with Welch's correction) visits. But the difference diminished at the 6-month visit (p = 0.2212, an unpaired t-test with Welch's correction) and the 12-month visit (p = 0.7074) (Fig. 1f). Next, we demonstrated that disease severity does not necessarily contribute to higher RBD-IgG maintenance with individuals with at least three continuous follow-up serum samples (Fig. 1g). Therefore, our results showed that neither the antibody levels nor the disease severity would affect the RBD-specific IgG antibody persistence.

Fig. 1 Kinetics of SARS-CoV-2 viral-specific antibodies up to 1 year. SARS-CoV-2-infected individuals who attended the follow-up program were included in this analysis. a–c RBD-IgM, IgA, and IgG changes since symptom onset. x-axis, follow-up time (day). y-axis, antibody titer (COI cut-off index; or arbitrary unit, AU/ml). The shaded regions represent the in-patient stage. The average values in the 1-month, 3-month, 6-month, and 12-month stages were labeled. P values (two-tailed) were shown. Mild (black dots), moderate (blue dots), and severe (red dots) symptoms. d Full-length spike-IgG changes since symptom on-set. x-axis, follow-up time (day). y-axis, antibody titer (AU/ml). e Correlation of RBD-IgG and Spike-IgG. In-hospital stage (black), 1-month follow-up (red), 3-month follow-up (blue), 6-month follow-up (purple), and 12-month follow-up (green). Pearson r number and p-value (two-tailed) were shown. f Longitudinal analysis of RBD-specific IgG between patients with high titer (RBD-IgG >1000 AU/ml, oranssi ympyrä) ja potilaat, joilla on matala tiitteri (RBD-IgG)<1000 AU/ml, empty circle). g Longitudinal analysis of RBD-specific IgG between severe patients (red circle) and moderate patients (pink circle). Lines in the x-axis and y-axis in a–e indicate the cut-off values. a–d, Mean values were labeled for each column. f, g, Data were presented as median with interquartile range. An unpaired t-test with Welch's correction analysis was applied, and p-values (two-tailed) were labeled. Source data are provided as a Source Data file.

Seerumin SARS-CoV-suojan kinetiikka-2.

Suoritimme seerumin mikroneutralisointimäärityksen käyttämällä elävää SARSCoV-2-infektiojärjestelmää, joka on kultainen standardi seerumin suojauksen arvioimiseksi virusinfektiota vastaan, jotta voidaan selvittää, suojaako seerumi edelleen SARS-CoV-2-infektiota vastaan. Havaitsimme, että seerumin neutraloivat tiitterit laskivat 1 kuukaudesta 3 kuukauteen (p=0.0024, pariton t-testi Welchin korjauksella) ja 6 kuukauteen (p=0.0168, pariton t- testi Welchin korjauksella) samalla tavalla kuin RBD-IgG ja Spike-IgG (kuvio 2a). Myöhemmin ne pysyivät vakaina 12-kuukauteen asti (p=0.591, pariton t-testi Welchin korjauksella), mikä viittaa siihen, että SARSCoV-2-spesifinen humoraalinen suoja voi jatkua pitkään.

Koska vaikeat potilaat tuottivat korkeita vasta-ainetasoja kuin kohtalaiset potilaat, ei vielä tiedetty, voisivatko korkeat tasot antaa tehokkaamman suojan. Huomasimme, että vakavat oireet johtivat vain ohimenevästi korkeampaan neutralointikykyyn aikaisemmassa toipilasvaiheessa (p=0.020, pariton t-testi Welchin korjauksella), joka väheni 3-kuukaudesta { {4}}vuoden vierailu (Supp. Kuva 4).

Sitten analysoimme RBD-IgG:n korrelaation seerumin mikroneutralisaation kanssa. Havaitsimme, että RBD-IgG:n ja neutraloinnin välillä oli merkittävä positiivinen korrelaatio (r=0.4070, p < 0.0001, n {{6} }, Pearson-korrelaatio) (kuvio 2b). Ei ole yllättävää, että Spike-IgG-tasoilla oli positiivinen korrelaatio seerumin neutralointikapasiteetin kanssa (lisäkuva 4). On huomattava, että RBD-IgG:n ja seerumin neutraloinnin välinen korrelaatio ei saavuttanut tilastollista merkitsevyyttä sairaalahoitovaiheen aikana (r=0.2101, p=0.0905, Pearson-korrelaatio, lisäkuva 5a). positiivisesti ylläpidetty 1-kuukaudessa (r=0,3952, p < 0,0001, Pearson-korrelaatio), 3-kuukaudessa (r=0.2769, p=0). 0135, Pearson-korrelaatio), 6-kuukausi (r=3846, p=0.0005, Pearson-korrelaatio) ja 12-kuukausi (r=0.5216, p < 0,0001, Pearson-korrelaatio) käynnit (Supp. Kuvat 5b–e).

SARS-CoV-2-spesifisen T-soluimmuunivasteen kinetiikka.

Virusspesifiset muisti-T-solut voivat lopulta vähentää taudin vakavuutta eliminoimalla viruksen infektoituneet solut9, mikä muodostaa toisen tärkeän haaran virusinfektion torjunnassa, kun se tapahtuu. Tutkiaksemme, voisiko suojaava T-sellulaarinen immuunivaste jatkua, loimme Nucleoprotein (N) -peptidipoolin sen runsaimpien virusproteiinien10 ja Spike-peptidipoolien takia, koska ne ovat tärkeitä virusinfektioissa ja laajassa sovelluksessa6. Spike-peptidejä käytettiin S1- ja S2-peptidipoolien muodostamiseen kätevää käsittelyä varten. Käytimme kolmea peptidipoolia virusspesifisten T-solujen gamma-interferonin (IFN-) entsyymiin linkitetyn immunosorbenttipisteen (ELISPOT) analyysiin käyttämällä tuoreita eristettyjä PBMC:itä 6-kuukauden ja 12-kuukauden käyntien ajalta. ELISPOT-detektiotulokset yhdeltä edustavalta yksilöltä näytettiin (kuvio 3a).

Verrattuna sairaalassa toipilaan oleviin potilaisiin, virusspesifisiä IFN:ää erittävien solujen kokonaismäärä väheni 6-kuukauden käynneillä ja pysyi vakaana 12-kuukauden käynneille (kuva 3b). Samanlaisia ​​muutoksia havaittiin N-, S1- ja S2-proteiineilla (kuvio 3c). Vaikeat potilaat näyttävät tuottavan jatkuvan vahvan T-soluimmuunijärjestelmän Spike-proteiinia vastaan ​​(lisäkuva 7). SARSCoV-2 T-soluvasteen koostumusanalyysi paljasti, että N:n, S1:n ja S2:n prosenttiosuudet säilyvät hyvin, mutta ne ovat vain hieman laskeneet (kuva 3d), mikä viittaa mahdolliseen pitkäkestoisen muistin T just olemassaoloon. SARS-infektiona vuonna 200311.

Keskustelu

Yhdessä näkökohdassa tutkimuksemme osoitti, että molemmat SARS-CoV{1}}-spesifiset humoraaliset immuunivasteet voivat säilyä jopa vuoden ajan. Havaitsimme, että virusspesifinen RBD-IgG, Spike-IgG ja seerumin neutralointikyky heikkenivät nopeasti kuudessa kuukaudessa, kuten aikaisemmissa raporteissa5, 6, 12, 13. Onneksi kolme parametria pysyvät vakaina sen jälkeen 1 vuoden. Näyttää siltä, ​​että virusspesifinen IgG voisi pitää nykyisen tasonsa jonkin aikaa.

Kuva 2 Pitkittäinen analyysi seerumin suojasta SARS-CoV-2-infektiota vastaan. Useista ajankohdista kerätyt seerumit testattiin elävää SARS-CoV-2-virusinfektiota vastaan. suoritettiin mikroneutralisointimääritys käyttämällä elävää SARS-CoV-2-infektiosoluviljelyjärjestelmää. y-akseli, seerumin laimennuslaskokset. Tiedot esitettiin keskiarvona ± SEM. Värilliset pisteet kuvaavat taudin vakavuutta. Lievät (tyhjät pisteet), kohtalaiset (siniset pisteet) ja vakavat (punaiset pisteet) oireet. Pariton t-testi Welchin korjausanalyysillä käytettiin, ja p-arvot (kaksisuuntaiset) leimattiin. b Mikroneutralisoinnin (laimennuslaskokset) ja RBD-IgG:n (mielivaltainen yksikkö, AU/ml) korrelaatio. Yhteensä 475 paria analysoitiin ja Pearsonin r- ja p-arvot (kaksisuuntaiset) näytettiin. Viivat x-akselilla ja y-akselilla a ja b osoittavat raja-arvot. Lähdetiedot toimitetaan lähdetietotiedostona.

Kuva 3 SARS-CoV-2-spesifinen T-soluvaste toipuneilla COVID-19-potilailla. Edustavia ELISpot-kuoppakuvia, joissa näkyy IFN:ää erittävät solut. N, S1 ja S2, nukleokapsidin (N), Spike 1 -alayksikön (S1) ja 2:n (S2) synteettinen päällekkäinen peptidipooli. Con A, Concanavalin A positiivinen kontrolli. b IFN:ää erittävien solujen pistemäärät, jotka osoittavat SARS-CoV-2-spesifisen immuunivasteen vähenemisen ajan myötä. Luvut ovat N:n, S1:n ja S{15}}stimuloitujen kaivojen summa. Tiedot esitettiin mediaanina kvartiilivälillä. c Raincloud-kuvaajat osoittavat erilaisia ​​T-soluvastetasoja kolmen peptidipoolin välillä eri seurantapisteissä. d Vohvelipistekaavio, joka näyttää prosenttiosuuden SARS-CoV{18}}-vasteesta 1-vuoden seurannan aikana. Tilastot Mann-Whitneyn U-testillä. P-arvo (kaksisuuntainen) näytettiin. b, c Tiedot esitettiin laatikko-ja viikset-kaavioina (mediaani kvartiilien, ylärajan ja alarajan kanssa). Lähdetiedot toimitetaan lähdetietotiedostona.

Toisessa näkökulmassa tutkimuksemme osoitti, että SARS-CoV-2-spesifinen T-soluvaste voi myös olla suhteellisen stabiili pitkällä aikavälillä (kuva 3). Tämä havainto on erittäin tärkeä nykytilanteessa. Useat pahamaineiset kannat 14–18, kuten B.1.1.7 (myös 501Y.V1, UK-kanta), B.1.351 (myös 501Y.V2, Etelä-Afrikan kanta), B.1.617.1 ja B.1.617.2 (Intia) -kanta), B.1.525 (myös 20 A, Nigeria-kanta) ja B.1.1.28.1 (myös 501Y.V3, Brasilia-kanta) ovat ilmaantuneet joko tarttuvuudella tai patogeneesillä tai molemmilla. Uudet mutantit, joita esiintyy pääasiassa RBD-alueella, voisivat mahdollisesti välttää neutralointisuojan, joka on saatu joko luonnollisen infektion tai SARS-CoV{30}} -rokotteen kautta15, 17, 18.

Toisin kuin neutraloivat vasta-aineet, virusspesifiset T-solut eivät pystyneet estämään viruksen pääsyä soluihin, mutta voivat silti tappaa solunsisäisen viruksen tuhoamalla suoraan viruksen infektoimat solut, jotka esittelevät viruspeptidejä2,11. Koska lukuisia virusepitooppeja19 voidaan tuottaa mistä tahansa virusproteiineista Spike-proteiinin lisäksi suuren histokompatibiliteettikompleksin esittelyyn, uudet mutaatiot eivät voineet helposti rikkoa T-solujen immuunivalvontaa. Tästä näkökulmasta katsottuna rokotteet, jotka voivat indusoida kestäviä virusspesifisiä T-soluimmuunivasteita, ovat lupaavia rakentamaan tehokkaan väestön immuniteetin SARS-CoV-virusta vastaan-2.

menetelmät

Potilastiedot.

Guangzhoun kahdeksas kansansairaala, Guangzhoun hallituksen nimeämä virallinen sairaala, otti vastaan ​​ja hoiti COVID{0}}-potilaita SARS-CoV-2-endeemisen ensimmäisen aallon aikana tammikuusta 2020 maaliskuuhun 2020. 299 potilasta vastaanotettiin Guangzhoun kahdeksannen kansansairaala osallistui tähän retrospektiiviseen tutkimukseen. Kaksisataa neljä potilasta osallistui seurantatutkimukseen antamalla vähintään kerran. Sairaalan tietojärjestelmästä kerättiin yleiset potilastiedot, mukaan lukien ikä, sukupuoli ja kliininen diagnoosi. Kaikki potilaat diagnosoitiin National Health and Health Commissionin julkaiseman uuden koronaviruskeuhkokuumeen diagnoosi- ja hoitosuunnitelman (koeversio 7) kriteerien mukaisesti. Vakavien oireiden diagnoosi tehtiin seuraavien kriteerien mukaan:

1. Hengitysvaikeudet, hengitystiheys (RR) Suurin tai yhtä suuri kuin 30 kertaa/min levossa.

2. Happisaturaatio Vähemmän tai yhtä suuri kuin 93 prosenttia lepotilassa.

3. Valtimoveren hapen osapaine (PaO2)/happipitoisuus (FiO2) Vähintään 300 mmHg).

4. Heikentynyt rintakehän radiologiakuvaus (röntgen- ja korkearesoluutioinen CT-kuvaus) apuvälineenä.

Keskivaikea oire diagnosoitiin, kun potilailla oli näkyvää keuhkokuumetta, kuumetta ja/tai muita hengitystieoireita. Lievä oire diagnosoitiin lievästi epämiellyttävänä, mutta ilman keuhkokuumeoireita. Oireettomia tapauksia diagnosoitiin, kun potilailla ei ollut merkkejä kliinisistä oireista, mutta heidän varmistui SARS-CoV-2-viruksen RNA-positiiviseksi seurantavaiheessa virukselle altistumisen tai läheisen kosketuksen jälkeen vahvistettujen tapausten kanssa.

Määritelmät.

Kaikki tähän seurantaohjelmaan osallistuvat henkilöt jaettiin kahteen vaiheeseen: potilas- ja seurantavaiheeseen. Jälkimmäinen ryhmiteltiin edelleen seuraavasti: 1-kuukausi (60 päivän sisällä kotiutuksen jälkeen), 3-kuukausi (70 - 135 päivää), 6-kuukausi (150 - 220 päivää) ja {{11 }}kuukausi (280–360 päivää).

Virusspesifisten IgA-, IgG- ja IgM-vasta-aineiden mittaus.

Plasma- tai seeruminäytteet inaktivoitiin 56 asteessa 30 minuutin ajan ja säilytettiin -80 asteessa ennen testausta. Plasmanäytteissä olevat IgA-, IgG- ja IgM-vasta-aineet SARS-CoV-2 RBD-piikkiproteiinia vastaan ​​testattiin kaksivaiheisilla epäsuoran immunomäärityksen elektrokemiluminesenssi-immunomäärityssarjoilla (Kangrun Biotech Co., Ltd.) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti sanottuna seeruminäytteitä inkuboitiin ensin modifioitujen mikropartikkelien kanssa. Mikrohiukkaset päällystettiin SARS-CoV-2-piikkiproteiinin RBD:llä ja akridiiniesterileimatuilla vasta-aineilla ihmisen vasta-aineiden Fc-domeenia vastaan. Useiden sitoutumattomien aineiden poispesukierrosten jälkeen signaalin havaitseminen suoritettiin automaattisella kemiluminesenssi-immuunianalysaattorilla (KAESER1000, Chongqing Cosmax Biotech Co., Ltd.).

Samoin plasmanäytteissä olevat IgG-vasta-aineet SARS-CoV-2-täyspitkää Spike-proteiinia vastaan ​​testattiin kaksivaiheisilla epäsuoran immunotestin elektrokemiluminesenssi-immunomäärityssarjoilla (Mairui Biotech Co., Ltd.) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaikki testit suoritettiin tiukoissa bioturvallisuusolosuhteissa. Vasta-ainetiitteri testattiin kerran seeruminäytettä kohti. Vasta-ainetasot esitetään mitattuina kemiluminesenssiarvoina jaettuna raja-arvolla (cut-off index, COI). COI<1 was regarded as negative, and COI >1 pidettiin positiivisena.

Mikroneutralisointitesti.

Lämmöllä inaktivoitu seerumi sarjalaimennettiin nelinkertaiseksi (1:4 - 1:1024) ja sekoitettiin sitten yhtä suureen tilavuuteen (125 ul) virusliuosta, joka sisälsi 100 TCID50 SARS-CoV-2. Seuraavaksi seerumi-virusseoksia inkuboitiin ensin 2 tuntia 37 asteessa ja levitettiin sitten puolikonfluentille VERO E6 -yksikerrokselle kahtena rinnakkaisena. 4-päivän inkubaation jälkeen viruksen saastuttamat kuopat arvioitiin. Kuopat, joilla oli näkyvä sytopatogeeninen vaikutus, määriteltiin positiivisiksi virusinfektioiksi.

Ihmisen IFN-ELISPOT-määritykset

IFN-ELISPO-määritykset suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla (1) Lyhyesti sanottuna MultiScreen 96-kuoppasuodatinlevyt (Merck Millipore, Darmstadt, Saksa) päällystettiin antihumaanilla IFN-monoklonaalisella vasta-aineella (U-Cytech, Alankomaat, nro CT{ {5}}) yön yli 4 °C:ssa. Kuopat pestiin PBS:llä ja suojattiin R10-väliaineella (RPMI-1640, 0,05 mM, 2-merkaptoetanoli, 1 mM natriumpyruvaatti, 2 mM L-glutamaatti, 10 mM 4-(2-hydroksietyyli)-1-piperatsiinietaanisulfonihappo [HEPES], 10 % naudan sikiön seerumi [FBS] ja penisilliini/streptomysiini (1×)) 2 tuntia 37 °C:ssa. Juuri eristettyjä PBMC:itä maljattiin ja stimuloitiin SARSCOV-2 S1- tai S2- tai N-peptidipoolien (GenScript, Kiina) läsnä ollessa 24 tuntia 37 °C:ssa. SARS-COV{{29 }} peptidit ovat 20 aminohapon pituisia, ja kymmenen aminohappoa on päällekkäin peräkkäisten peptidien välillä. Levyt pestiin PBS-Tween 20:llä (PBST), minkä jälkeen niitä inkuboitiin biotinyloidun ihmisen IFN-detektiovasta-aineen (U-Cytech, Alankomaat, nro CT640-10) ja alkaliseen fosfataasiin (AKP) konjugoidun streptavidiinin (BD) kanssa. , USA, nro 554065). Täplät kehitettiin inkuboimalla NBT/BCIP:ssä (Pierce, USA) 10 minuutin ajan. Täplät laskettiin käyttämällä ELISPOT-lukijaa (Bioreader 4000, BIOSYS, Saksa). Spottia muodostavien solujen (SFC) määrä ilmoitetaan antigeenispesifisten IFN- -erittävien solujen lukumääränä miljoonaa PBMC:tä kohden.

Tilastollinen analyysi.

Pariton t-testi Welchin korjauksella, Chi-neliötestillä ja Pearson-korrelaatiotestillä käytettiin tietojen analysointiin GraphPad PRISM -ohjelmistossa (versio 5.{7}}1). Ryhmien välisiä eroja verrattiin Mann-Whitneyn U-testillä ja Kruskal-Wallis rank-sum -testillä moninkertaiseen vertailuun R-studion kanssa (versio 4.0.2).

Eettinen hyväksyntä.

Guangzhoun kahdeksannen kansansairaalan lääketieteen eettinen komitea (nro 202001134 ja 202020153) hyväksyi tutkimuksen. Kirjallinen suostumus saatiin vapaaehtoisilta henkilöiltä.

Raportoinnin yhteenveto.

Lisätietoa tutkimussuunnittelusta löytyy tähän artikkeliin linkitetystä Nature Research Reporting Summarysta.

Tietojen saatavuus

Kirjoittajat vakuuttavat, että kaikki tämän tutkimuksen tuloksia tukevat tiedot ovat saatavilla paperista ja sen lisätietotiedostoista. Lähdetiedot sisällytetään lähdetietotiedostona. Lähdetiedot esitetään tässä julkaisussa.

Viitteet

1. Garcia-Beltran, WF et ai. COVID-19-neutralisoivat vasta-aineet ennustavat taudin vakavuuden ja eloonjäämisen. Cell 184, 476–488 (2020).

2. Deng, W. et ai. Ensisijainen altistuminen SARS-CoV-2-tartunnalle suojaa reesusmakakien uudelleentartunnalta. Science 369, 818–823 (2020).

3. Chen, P. et ai. SARS-CoV-2 neutraloiva vasta-aine LY-CoV555 Covid-potilailla-19. N. Engl. J. Med 384, 229–237 (2020).

4. Polack, FP et ai. BNT162b2 mRNA Covid-19 -rokotteen turvallisuus ja teho. N. Engl. J. Med. 383, 2603–2615 (2020).

5. Huang, C. et ai. 6-COVIDin kuukauden seuraukset-19 sairaalasta kotiutuneilla potilailla: kohorttitutkimus. Lancet 397, 220–232 (2021).

6. Dan, JM et ai. Immunologinen muisti SARS-CoV-2:lle arvioitu enintään 8 kuukauden ajan tartunnan jälkeen. Science 371, eabf4063 (2021).

7. Tan, CW et ai. SARS-CoV-2-korvikeviruksen neutralointitesti, joka perustuu vasta-ainevälitteiseen ACE2-piikkiproteiini-proteiinivuorovaikutuksen estoon. Nat. Biotechnol. 38, 1073–1078 (2020).

8. Hu, F. et ai. Heikentynyt spesifinen humoraalinen immuunivaste SARS-CoV-2-reseptoriin sitoutuvaa domeenia vastaan ​​liittyy viruksen pysyvyyteen ja ajoittain tapahtuvaan leviämiseen maha-suolikanavassa. Cell Mol. Immunol. 17, 1119–1125 (2020).

9. Lukacs, NW & Malinczak, CA Soluimmuniteetin valjastaminen hengitystieviruksia vastaan ​​annettavaa rokotusta varten. Rokotteet 8, 783 (2020).

10. Kim, D. et ai. SARS-CoV-2-transkription arkkitehtuuri. Cell 181, 914–921 (2020).

11. Le Bert, N. et ai. SARS-CoV-2-spesifinen T-soluimmuniteetti COVID-19- ja SARS-tapauksissa sekä tartunnan saamattomat kontrollit. Nature 584, 457–462 (2020).

12. He, Z. et ai. Anti-SARSCoV-2-vasta-aineiden seroprevalenssi ja humoraalinen immuunikestävyys Wuhanissa, Kiinassa: pitkittäinen, populaatiotason poikkileikkaustutkimus. Lancet 397, 1075–1084 (2021).

13. Figueiredo-Campos, P. et ai. Anti-SARS-CoV-2-vasta-aineiden seroprevalenssi COVID-19-potilailla ja terveillä vapaaehtoisilla jopa 6 kuukautta taudin alkamisen jälkeen. euroa J. Immunol. 50, 2025–2040 (2020).

14. Marot, S. et ai. Ison-Britannian ja Etelä-Afrikan SARS-CoV-2-muunnelmien neutralointi heterogeenisuus BNT162b2-rokotetuissa tai toipuvissa COVID{5}}-terveydenhuollon työntekijöissä. Clin. Tartuttaa. Dis. ciab492 https://doi.org/ 10.1093/cid/ciab492 (2021). [Verkossa ennen tulostusta].

15. Sabino, EC et ai. COVID-taudin uudelleen puhkeaminen-19 Manausissa Brasiliassa korkeasta seroesiintyvyydestä huolimatta. Lancet 397, 452–455 (2021).

16. Singh, J., Rahman, SA, Ehtesham, NZ, Hira, S. & Hasnain, SE SARS-CoV-2 huolestuttavia muunnelmia on syntymässä Intiassa. Nat. Med. 27, 1131–1133 (2021).

17. Planas, D. et ai. Tartunnan aiheuttavien SARS-CoV-2 B.1.1.7- ja B.1.351-varianttien herkkyys neutraloiville vasta-aineille. Nat. Med. 27, 917–924 (2021).

18. Hacisuleyman, E. et ai. Rokotteen läpimurtoinfektiot SARS-CoV-2-muunnelmilla. N. Engl. J. Med. 384, 2212–2218 (2021).

19. Kiyotani, K., Toyoshima, Y., Nemoto, K. & Nakamura, Y. SARS-Covin mahdollisten T-soluepitooppien bioinformaattinen ennustaminen-2. J. Hum. Genet. 65, 569–575 (2020).

Kiitokset

Kiitämme kaikkia COVID{0}}-seurantaryhmän jäseniä heidän epäsuorasta panoksestaan ​​tähän tutkimukseen. Kiitämme kaikkia lääkäreitä ja sairaanhoitajia, jotka ovat hoitaneet näitä potilaita ja keränneet näytteet eristysosastolla. Kiitämme myös kaikkia laboratorioteknikkoja, jotka käsittelivät näytteitä ja suorittivat mittaukset Guangzhoun kahdeksannessa kansansairaalassa. Tätä työtä tuki Kiinan kansallinen luonnontieteellinen säätiö (nro 81670536, 81770593 ja 82061138006), kansallinen keskeisten tartuntatautien valvontaohjelma (2017ZX10202203-004-002 ja 2018ZX10301404-003-002), Guangdongin maakunnan osasto. tiede- ja teknologiarahaston (nro 2020B1111330002), Guangzhoun terveystieteen ja teknologian ohjelman (20211A010029), kiinalais-saksalaisen tutkimuksen edistämiskeskuksen (SGC) Rapid Response -rahoituspyynnön kahdenvälisille yhteistyöehdotuksille Kiinan ja Saksan välillä COVIDissa{{14 }} Aiheeseen liittyvä tutkimus (nro C-0032) ja Guangzhou Laboratoryn hätäavainohjelma (EKPG21-29).

Tekijän panokset

XD, FH, CL, XT ja FL vastasivat tutkimuksen suunnittelusta, tutkimuksen ohjauksesta ja tietojen analysoinnista. FH ja FL kirjoittivat paperin. CF, YW, HH, FC, GT, YL, JL, JC ja MJ vastasivat potilaiden rekrytoinnista sekä näytteiden ja kliinisen tiedon keräämisestä. JS, PL, LF ja LC suorittivat sekvensointi- ja bioinformatiikan analyysit. QF, LG ja SC suorittivat viruksen RNA:n havaitsemisen ja vasta-ainetestit. CK suoritti mikroneutralisointimäärityksen.

Kilpailevat kiinnostuksen kohteet

Kirjoittajat eivät ilmoittaneet kilpailevia etuja.

Lisäinformaatio

Kirjeenvaihto ja materiaalipyynnöt tulee lähettää osoitteeseen XD, FH, XT tai FL

Vertaisarviointitiedot Nature Communications kiittää Bin Caota ja muita nimettömiä arvioijia heidän panoksestaan ​​tämän työn vertaisarvioinnissa. Vertaisarvioijaraportit ovat saatavilla.

Julkaisijan huomautus Springer Nature pysyy neutraalina julkaistujen karttojen ja institutionaalisten yhteyksien suhteen.

Avoin pääsy

Tämä artikkeli on lisensoitu Creative Commons Attribution 4:n.0 Kansainvälinen lisenssi, joka sallii käytön, jakamisen, mukauttamisen, jakelun ja jäljentämisen missä tahansa välineessä tai muodossa, kunhan mainitset asianmukaisesti alkuperäisen kirjoittajan ( s) ja lähde, anna linkki Creative Commons -lisenssiin ja ilmoita, jos muutoksia on tehty. Tämän artikkelin kuvat tai muu kolmannen osapuolen materiaali sisältyy artikkelin Creative Commons -lisenssiin, ellei materiaalin luottorajassa toisin mainita. Jos materiaali ei sisälly artikkelin Creative Commons -lisenssiin ja käyttötarkoituksesi ei ole lakisääteinen tai ylittää sallitun käytön, sinun on hankittava lupa suoraan tekijänoikeuksien haltijalta.

For more information:1950477648nn@gmail.com