Cistanche Salsan kokonaisglykosidin suojaava vaikutus kokeelliseen maksavaurioon

Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964audrey.hu@wecistanche.com

Wang Yanfang, Zhao Jijun, Hai Pengli, Xue Peifeng, Li Hui, Li Minhui

Abstrakti

Tässä kokeessa luotiin malli alkoholin aiheuttamasta maksavauriosta hiirillä, ja tarkastusindikaattoreina käytettiin maksan toiminnan biokemiallisia indikaattoreita ja maksan histopatologisia muutoksia. Tutkicistanche salsan kokonaisglykosidin suojaava vaikutus kokeelliseen alkoholiperäiseen maksavaurioon. Anna yhteensäcistanche salsan glykosidisuuri annos (130 mg/kg) ja keskiannos letkulla (100 mg/kg), pieni annos (65 mg/kg) ja bidentaatti (150 mg/kg) positiivisena kontrollilääkkeenä. Tulokset osoittivat, että seerumin ALT- ja AST-arvot ovat kohonneet merkittävästi; SOD-aktiivisuus maksassa vähenee ja MDA-pitoisuus lisääntyy; maksasolujen lipidoosi ilmenee. Cistanche salsa suuren annoksen ryhmän kokonaisglykosidi parantaa maksan toimintaindeksiä ja vähentää maksasolujen lipidien rappeutumista. Tämän perusteella alustava määritysekinakosidijaakteosidicistanche-salsan kokonaisglykosidin pitoisuus oli 29,1 prosenttia. Yllä olevat kokeet osoittavat, että cistanche-salsan kokonaisglykosidilla on suojaava vaikutus alkoholin aiheuttamaan maksavaurioon hiirillä, ja on myös vahvistettu, että ekinakosidi ja akteosidi ovat cistanche-salsan kokonaisglykosidin tärkeimmät vaikuttavat aineet.

Avainsanat: cistanche-salsan kokonaisglykosidi; korkean suorituskyvyn nestekromatografia; akteosidi; ekinakosidi; alkoholista johtuva maksavaurio

Citanche salsaon Cistanche-kasvi Orobanchaceae-heimosta (Orobanchaceae), joka tunnetaan myös nimellä salina, monivuotinen ruohomainen loiskasvi, jota esiintyy pääasiassa aavikoilla, aavikoilla ja muilla kuivilla alueilla. Tärkeimmät tuotantoalueet ovat Xinjiangissa ja Sisä-Mongoliassa. 1]. Koska saman suvun ja saman suvun Herba Cistanchea on louhittu suuria määriä ja loiskasveja on vaikea lisääntyä, lääkevarat vähenevät päivä päivältä ja markkinoiden kysyntään on vaikea vastata. Maassamme kansanmusiikkisalsaa käytetään cistanche deserticolan korvikkeena, mutta sen tutkimusraportteja on vähän. Fenyylietanoidiglykosideja sisältävän aineluokan cistanche salsan (Cistanche salsan kokonaisglykosidit) kokonaisglykosidia on tutkittu farmakologisesti sen lääkinnällisen arvon selventämiseksi.Cistanche-salsan kokonaisglykosidilla on hermoja suojaava vaikutus[2] ja voi suojata DNA:ta hydroksyylin (OH·) aiheuttamilta oksidatiivisilta vaurioilta [3]. Cistanche-salsan fenyylietanoidiglykosidit voivat lisätä merkittävästi superoksididismutaasin (SOD) aktiivisuutta hiiren sydämessä, maksassa ja aivokudoksissa [4]. Yllä oleva tutkimus viittaa siihen, ettäcistanche-salsan kokonaisglykosidion antioksidanttinen vaikutus.

Alkoholiperäisen maksasairauden (ALD) ilmaantuvuus lisääntyy maassani vuosi vuodelta. Alkoholista on tullut toiseksi yleisin maksavaurioiden aiheuttaja virushepatiitin jälkeen [5]. Alkoholiperäisen maksavaurion hoitoon turvallisia ja tehokkaita lääkkeitä ei ole. Kasvivarojen käyttäminen alkoholin vastaisten ja maksaan suojaavien lääkkeiden ja terveystuotteiden kehittämiseen on herättänyt laajaa huomiota lääke- ja elintarviketeollisuudessa. Laajan kirjallisuuden jälkeen on havaittu, että alkoholin aiheuttama maksavaurio liittyy oksidatiiviseen stressiin jacistanche salsan kokonaisglykosidilla on vaikutusta alkoholipitoiseen maksavaurioony. Suojavaikutuksen tutkimus on vielä tyhjä. Tämän kokeen tutkimus tarjoaa tieteellisen perustan cistanche-salsan kokonaisglykosidin kehittämiselle ja hyödyntämiselle.

1 Materiaalit ja varusteet

1. 1 Lääkkeet ja reagenssit

Cistanche salsatoimitti Mongolian lääkemateriaalien tunnistamisen ja standardoinnin avainlaboratorio, Baotou Medical College; Bifendate-pudotuspillerit (Zhejiang Wanbang Pharmaceutical Co., Ltd., eränumero A02121139); Alaniiniaminotransferaasi (ALT) -sarja, aspartaamihappoaminotransferaasi (AST) -pakkaus, malondialdehydi (MDA) -testipakkaus, superoksididismutaasi (SOD) -pakkaus, Coomassie briljanttisinisen proteiinin määrityspakkaus (Nanjing Jiancheng Institute of Bioengineering, eränumero 20110422); 56-asteinen viina (Beijing Red Star Co., Ltd.); muut reagenssit ovat kotimaisia ​​puhtaita.

1. 2 eläintä

72 Kunming-lajin uroshiirtä, paino 17-22 g (Inner Mongolia University Laboratory Animal Center, Animal Qualification Certificate No.:6 (Mongolia 2002-0001)).

1. 3 Instrumentit

Ultravioletti-näkyvä spektrofotometri [Unico (Shanghai) Instrument Co., Ltd., malli UV-2000]; Mikrolevylukija (Beckman Coulter, USA, malli AD340); Nopea sentrifugi (Hangzhou Aipu Instrument Equipment Co., Ltd., malli TG18-WS); Korkean suorituskyvyn nestekromatografi (Thermo Fisher Scientific, Model Ultimate 3000); Analyyttinen vaaka (METTLER TOLEDO Instruments Co., Ltd. malli AR153O); Ultraäänioskillaattori (Shanghai Branson, malli SB3200); Jäädytyskuivausaine (Beijing Boyikang Experimental Instrument Co., Ltd., malli FD-1-50).

2 Menetelmät ja tulokset

2. 1 Tutkimus cistanche-salsan kokonaisglykosidista

2. 1. 1 Cistanche-salsan uuton kokonaisglykosidi

2. 1. 1. 1 Raakauutteen uuttaminen

Punnitse 100 g karkeaa cistanche-salsajauhetta, lisää 600 ml 70-prosenttista etanolia ja liota 3 tuntia, uuta ultraäänellä 30 minuuttia, suodata ja toista edellä mainitut vaiheet kahdesti suodatinjäännökselle, yhdistä suodos ja väkevöi etanolin talteenottamiseksi, kunnes sillä ei ole alkoholin makua, ota talteen uute ja pakastekuivaa, jolloin saadaan cistanche salsa -raakauute 19,46 g.

2. 1. 1. 2 Puhdistusprosessi

Laita 10 g cistanche salsan raakauutetta dekantterilasiin, lisää 20 ml vettä ultraääneen liukenemiseksi, lisää 80 ml absoluuttista etanolia, ravista hyvin ja aseta se 12 tunniksi ja suorita sitten suodatus. Suodos konsentroitiin talteen ottamiseksi. etanolissa, kunnes alkoholi ei maistu, ja kylmäkuivataan, jolloin saadaan 8,408 g cistanche-salsauutteen kokonaisglykosidia.

2. 1. 2 Eläinten ryhmittely ja hoito

72 hiirtä ruokittiin adaptiivisesti 2 päivää ennen koetta, ja ne jaettiin satunnaisesti kuuteen ryhmään, joissa kussakin oli 12 hiirtä, eli tyhjään kontrolliryhmään, alkoholista maksavaurion malliryhmään ja positiiviseen kontrolliryhmään (150 mg). /kg bidentaattia), cistanche salsan suuren annoksen ryhmän kokonaisglykosidi (130 mg/kg), cistanche salsan keskiannoksisen ryhmän kokonaisglykosidi (100 mg/kg) ja pienikokoisen cistanche salsan glykosidin kokonaismäärä. annosryhmä (65 mg/kg). Kunkin ryhmän eläimille annettiin mahalaukunsisäistä antoa (ig) kahdesti päivässä, ja ig:n tilavuus oli 0,2 ml/20 g ruumiinpainoa. Nollakontrolliryhmälle ja malliryhmälle annettiin yhtä suuret määrät suolaliuosta. Kaksi tuntia kunkin annon jälkeen, lukuun ottamatta nollakoekontrolliryhmää, muille ryhmille annettiin 56-asteista nestettä 0,4 ml/20 g ruumiinpainoa 10 peräkkäisenä päivänä akuutin alkoholin aiheuttaman maksavaurion mallin aiheuttamiseksi. Mallin rakentamisen 9. päivänä paastoaminen ei ollut sallittua. 10. päivänä annettiin 56-asteista valkoviiniä 3 tuntia. Silmämunasta otettiin verta ja seerumi erotettiin. Verenoton jälkeen hiiret tapettiin. Punnitse, ota maksan oikea lohko ja aseta se 10-prosenttiseen formaldehydikiinnitysliuokseen ja aseta loput maksasta jääkaappiin -20 asteeseen.

2. 1. 3 Tilastollinen käsittely

Käytä SPSS 11.5 -tilastoohjelmistoa tietojen käsittelyyn, varianssianalyysiin, P<0.05 is="" statistically="">

2. 1. 4 Cistanche salsan kokonaisglykosidin vaikutus ruumiinpainoon, maksan painoon ja akuutin alkoholiperäisen maksavaurion maksaindeksiin hiirillä

Kuten taulukosta 1 käy ilmi, malliryhmän hiirten maksan paino ja maksaindeksi olivat merkittävästi korkeammat kuin nollakontrolliryhmän (P<0.05), indicating="" liver="" damage.="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" liver="" weight="" and="" liver="" index="" of="" mice="" in="" the="" total="" glycoside="" of="" the="" cistanche="" salsa="" high-dose="" group="" and="" the="" positive="" control="" group="" were="" significantly="" reduced="" (p=""><0.01). there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="" total="" glycoside="" of="" cistanche="" salsa="" medium="" and="" low-dose="" groups="" (="" p="">0.05).

2. 1. 5 Cistanche salsan kokonaisglykosidin vaikutus seerumin AST- ja ALT-arvoihin

Kerättyä verta sentrifugoitiin nopeudella 3,5 x 103 r/min 10 minuuttia seerumin valmistamiseksi. Lain menetelmää käyttäen UV-Vis-spektrofotometrin 505 nm lukemia käytettiin ALT- ja AST-aktiivisuuden määrittämiseen seerumissa. Kuten taulukosta 2 käy ilmi, seerumin ALT- ja AST-arvot malliryhmässä olivat merkittävästi korkeammat kuin nollakontrolliryhmässä (P<0.05), indicating="" that="" the="" model="" group="" was="" successfully="" modeled.="" the="" serum="" alt="" and="" ast="" of="" mice="" in="" the="" positive="" control="" group="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" in="" the="" model="" group=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" serum="" alt="" and="" ast="" of="" mice="" in="" the="" total="" glycoside="" of="" the="" cistanche="" salsa="" high-dose="" group="" were="" significantly="" lower=""><0.01). there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="" total="" glycoside="" of="" the="" cistanche="" salsa="" middle="" and="" low="" dose="" group="" and="" the="" model="" group="" (p="">0.05).

2. 1. 6 Cistanche salsan kokonaisglykosidin vaikutus MDA-pitoisuuteen ja SOD-aktiivisuuteen maksassa

Ota 0,3 g maksakudosta 10 prosentin ja 1 prosentin homogenaattien valmistamiseksi. Sentrifugoi 1-prosenttista maksahomogenaattia nopeudella 3,5 × 103 r/min 10 minuuttia ja ota supernatantti. Liuos, proteiini maksahomogenaatissa, määritettiin Coomassie Brilliant Blue -menetelmällä. Ota 1 prosentti maksan homogenaattisupernatanttia, toimi SOD-testilaatikon mukaisesti ja lue 450 nm:ssä mikrolevylukijasta. Ota 10 prosenttia maksan homogenaattisupernatanttia, toimi MDA-määrityssarjan mukaisesti ja mittaa absorbanssi (A532) spektrofotometrillä 532 nm:ssä.

Kuten taulukosta 3 käy ilmi, MDA-pitoisuus malliryhmän maksassa oli merkittävästi korkeampi kuin nollakontrolliryhmässä (P<0.05), and="" the="" sod="" activity="" was="" significantly="" reduced=""><0.05). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" mda="" content="" in="" the="" liver="" of="" the="" positive="" control="" group="" was="" significantly="" lower=""><0.01), and="" the="" activity="" of="" sod="" was="" significantly="" increased=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" mda="" content="" of="" the="" total="" glycoside="" of="" the="" cistanche="" salsa="" high-dose="" group="" was="" significantly="" lower=""><0.01), and="" the="" activity="" of="" sod="" was="" significantly="" increased=""><0.01). the="" total="" glycoside="" of="" cistanche="" salsa="" medium="" and="" low="" dose="" groups="" had="" no="" difference="" in="" mda="" and="" sod="" compared="" with="" the="" model="" group="" (p="">0.05).

2. 1. 7 Cistanche salsan kokonaisglykosidin vaikutus maksakudoksen patologisiin muutoksiin hiirillä

Patologinen tutkimus: maksakudos kiinnitetty 10-prosenttisella formaldehydillä, tavanomainen parafiiniin upotettu leike (viipaleen paksuus 5 μm), HE-värjäys ja maksan histopatologisten muutosten tarkkailu valomikroskoopilla.

Tyhjäkontrolliryhmän maksa on väriltään tummanpunainen ja rakenteeltaan pehmeä. Maksakudoksen rakenne on normaali ja maksalohkojen rakenne on ehjä. Se on monikulmio, jossa on selkeät rajat, ja ydin on pyöreä ja sijaitsee selvästi solun keskellä. Malliryhmän hiirten maksan tilavuus ja kokonaisglykosidi cistanche salsa medium- ja pieniannoksisissa ryhmissä kasvoivat ja väri muuttui keltaiseksi. Patologiset muutokset mikroskoopissa olivat pääasiassa hepatosyyttien rasvadegeneraatiota, jossa soluissa oli diffuuseja lipidivakuoleja ja hepatosyyttejä. Suuri, sytoplasma on täynnä pieniä lipidipisaroita ja tyhjiöitä, ja ydin on edelleen keskellä. Positiivisessa kontrolliryhmässä ja cistanche salsa suuren annoksen kokonaisglykosidissa hiirillä maksasolujen lipidoosi väheni jossain määrin ja lipidipisaroiden määrä pieneni jossain määrin.

2. 2 Cistanche-salsan kokonaisglykosidin pääkomponenttianalyysi

2. 2. 1 Kromatografiset olosuhteet

Kromatografiset olosuhteet olivat kromatografinen pylväs ZORBAX ODS (250 × 4,6 mm, 5 μm); liikkuva faasi: metanoli 0,2-prosenttinen muurahaishappoliuos (27,5-72,5), gradienttieluointi; kolonnin lämpötila 30 astetta; virtausnopeus 1 ml/min; tunnistusaallonpituus 334 nm. Yllä olevissa kromatografisissa olosuhteissa erotetaanekinakosidijaakteosidion hyvä.

2. 2. 2 Vertailuliuoksen valmistaminen

Punnitse tarkasti 1,3 mg ja 1,2 mgekinakosidijaakteosidivertailuaine {{0}},13 mg/ml ekinakosidivertailuaineliuoksen ja 0,12 mg/ml akteosidivertailuliuoksen valmistamiseksi.

2. 2. 3 Testiliuoksen valmistaminen

Punnitse tarkasti 0,1082 g cistanche-salsauutteen kokonaisglykosidista ja laimenna 50 ml:ksi liikkuvan faasin liuoksella.

2. 2. 4 Lineaarinen suhde

Piirrä tarkasti vertailuratkaisu {{0}}. 06, 0. 12. 0. 18. {{10}}. 24. 0. 30, 0. 48. 0. 54. 0. 72. 1. Konsentraatiolla 20 mg/ml, ruiskuta 5 μL nestekromatografiaan peräkkäin ja laske regressioyhtälö siten, että kahden vertailuaineen injektiotilavuus (ug) on ​​abskissa ja vastaava piikin pinta-ala ordinaatta. ekinakosidi: Y=11.868 X-0.0785, R=0.9997; akteosidi: Y=18.026X-0.1913, R=0.9997. Tämän seurauksena ekinakosidivertailuaineella on hyvä lineaarinen suhde alueella 0,0635 - 0,4445 ug; akteosidivertailuaine on välillä 0,059-1,18 ug. Sisäinen lineaarinen suhde on hyvä.

2. 2. 5 Tarkkuustesti

Ota tarkasti 10 µl samaa testiliuosta ja toista injektio 5 kertaa yllä olevissa kromatografisissa olosuhteissa. Kirjaa kromatogrammi ja määritä piikin pinta-ala. Tuloksena on ekinakosidin RSD 0,89 prosenttia,RSD ofakteosidi on 1,87 prosenttia, mikä osoittaa, että instrumentin tarkkuus on hyvä.

2. 2. 6 Vakavuustesti

Sama testiliuos vastaavasti 0, 2, 4, 8, 16, 32, 40, 48 tunnin kohdalla, vedä tarkasti 10 l, ruiskuta se nestekromatografiin, kirjaa kromatogrammi ja mittaa sen piikin pinta-ala . Tuloksena on ekinakosidin RSD 1, 58 prosenttia, RSD onakteosidion 0. 49 prosenttia, mikä osoittaa, että testiliuos on 48 tunnin sisällä

Vakaus on hyvä.

2. 2. 7 Toistettavuustesti

Punnitse tarkasti noin 0,2 mg samaa näyte-erää, yhteensä 5 osaa, ja valmista 5 osaa liuosta. Pipetoi 10 μl tarkasti nestekromatografiin, kirjaa kromatogrammi ja määritä piikin pinta-ala sisällön määritysmenetelmän mukaisesti. Tuloksena on ekinakosidi. RSD 1,91 prosenttia ja verbascum-glykosidien RSD oli 2,08 prosenttia, mikä osoittaa, että määritysmenetelmällä on hyvä toistettavuus.

2. 2. 8 Palautumisnopeuden testi

Punnitse tarkasti 0,2 g acistanche-salsan kokonaisglykosidi, lisää tietty määräekinakosidi ja akteosidivertailuaineet, valmistele testiliuos edellä 2.2.3 kohdan mukaisella menetelmällä ja suorita määritys sisällön määritysmenetelmän mukaisesti määritellyissä kromatografisissa olosuhteissa. Tulos Ekinakosidin keskimääräinen talteenottoaste on 98,49 prosenttia, RSD 1,06 prosenttia, akteosidin keskimääräinen talteenottoaste on 97,35 prosenttia ja RSD on 1,45 prosenttia.

2. 2. 9 Näytteiden määritys

Otetaan tarkasti 10 µl vertailuliuosta ja testiliuosta, ruiskutetaan näyte, määritetään edellä mainitut kromatografiset olosuhteet ja lasketaan näytteen pitoisuus ulkoisen standardin menetelmällä. Tulokset on esitetty taulukossa 4. Ekinakosidin keskimääräinen pitoisuus on 24,5 prosenttia jaakteosidion 4,6 prosenttia.

3 Keskustelu

Alkoholin maksavaurioilla tarkoitetaan maksavaurioita ja pitkäaikaisen runsaan juomisen aiheuttamia patologisia muutoksia. Pitkäaikainen liiallinen alkoholinkäyttö voi aiheuttaa maksasoluvaurioita ja sitten kehittää maksafibroosia ja jopa maksakirroosia [6]. Malliryhmään verrattuna suuren annoksen cistanche salsa -ryhmän kokonaisglykosidi tässä kokeessa vähensi merkittävästi ALT- ja AST-aktiivisuutta hiiren seerumissa, vähensi merkittävästi MDA-pitoisuutta maksassa ja lisäsi merkittävästi SOD:n aktiivisuutta. , joka vähensi maksasolujen lipidoosia jossain määrin. , Vähennä lipidipisaroiden määrää. Keski- ja matalaannosryhmän ja malliryhmän välillä ei ollut merkittävää eroa. Tämän kokeen tulokset ovat yhdenmukaisia ​​s.:n tutkimustulosten kanssaCistanchen kokonaisglykosidien rotektiivinen vaikutus alkoholin maksavaurioon hiirillä [7].

Cistanche salsan kokonaisglykosidi suojaa maksasoluvaurioiltavähentämällä solukalvon läpäisevyyttä ja lisäämällä vereen vapautuvien ALT- ja AST-pitoisuutta; se voi lisätä SOD:n aktiivisuutta ja poistaa suuren määrän alkoholin tuottamia vapaita radikaaleja kehon aineenvaihdunnassa. ; Se voi vähentää MDA:n muodostumista ja estää sitä vahingoittamasta kudossolujen kalvorakennetta [8-10]. Cistanche-salsan kokonaisglykosidilla on suojaava vaikutus alkoholista maksavaurioita vastaan, ja sillä on määrällinen vaikutussuhde. Kirjallisuudesta tarkasteltuna ei ole olemassa kvantitatiivista analyysiä cistanche salsan kokonaisglykosidin vaikuttavista aineista. Tässä artikkelissa sisältöakteosidijaekinakosidi, cistanche-salsan kokonaisglykosidin pääkomponentit, analysoitiin kvantitatiivisesti ensimmäistä kertaa HPLC:llä, jonka osuus glykosidien kokonaismäärästä oli 29,1 prosenttia. Tarjoa tieteellinen perusta cistanche-salsan kokonaisglykosidin kehittämiselle ja käytölle. Nykyaikaiset farmakologiset tutkimukset ovat osoittaneet, että ekinakosidilla on suojaava vaikutus vetyperoksidin ja oksidatiivisen stressin vaurioittamiin PC12-soluihin verisuonidementiarotilla [11,12]. Molemmatekinakosidilla ja akteosidilla on estäviä vaikutuksia hepatosyyttien sytotoksisuuteenD GalN ja TNF- indusoivat [13]. Lisäksi oletetaan, ettäcistanche-salsan kokonaisglykosidi suojaa hiiriä alkoholin aiheuttamalta maksavaurioltavoidaan tehostaaekinakosidi ja akteosidiparantaa solujen antioksidanttientsyymiaktiivisuutta, parantaa maksasolujen antioksidanttikapasiteettia, mikä ylläpitää maksasolujen plasmakalvon eheyttä, jotta maksasolut voivat toimia normaalisti Puolustus- ja korvaustoiminnot. Eristelemme yhdisteitä edelleen tulevissa tutkimuksissa ja tutkimme molekyylibiologian tekniikoilla monomeeristen yhdisteiden säätelyä maksasolujen apoptoosissa ja niiden suhdetta läheisten kohdegeenien säätelyyn.

viittauksia

1 Zhang HW. Tutkimukset kemiallisista aineosista ja

Cistanche salsan sormenjälki (CA Mey.) G. Beck. Hot: Inner Mongolia Medical College, MSc. 2008.

2 Tian XF, Pu XP. Cistanches salsan fenyylietanoidiglykosidit estävät metyylifenyylipyridinium-ionin indusoimaa apoptoosia hermosoluissa. J Ethnopharmacol, 2005, 97: 59-63.

3 Wang XW, Jiang XY, Wu LY. Cistanchen glykosidien puhdistavat vaikutukset vapaita radikaaleja vastaan ​​ja sen suojaus OH·-indusoitua DNA-vauriota vastaan ​​in vitro China Pharm J, 2001, 36: 29-32.

4 Wu HH. Cistanche salsan fenyylietanoidiglykosidien valmistus ja antioksidanttivaikutus. Nanjing: Nanjingin maatalousyliopisto, MSc. 2008.