Formononetiini lievittää autoimmuunista eturauhastulehdusta JAK/STAT-modulaation ja immuunijärjestelmän tasapainottamisen kautta: vaikutukset CP/CPPS- ja TCM-Cistanche-uutteen lisäaineisiin

Tavoite:Tutkia kuinka formononetiini (FN) säätelee T-auttajatyyppi 1 (Th1) -solujen erilaistumista ja makrofagien polarisaatiota JAK/STAT-signalointireittien kautta kokeellisen autoimmuunisen eturauhastulehduksen (EAP) hiirimallissa.
Menetelmät:Neljäkymmentä urospuolista ei-lihavaa diabeettista (NOD) hiirtä jaettiin satunnaisesti neljään ryhmään: normaali kontrolli, EAP-mallikontrolli, pieniannoksinen FN (LFN, 50 mg/kg) ja suuriannoksinen FN (HFN, 100 mg/kg). EAP indusoitiin kolmessa viimeksi mainitussa ryhmässä injektoimalla ihonalaisesti eturauhasen antigeenejä (PAg), jotka oli emulgoitu täydelliseen Freundin adjuvanttiin (CFA). Mallintamisen jälkeen LFN- ja HFN-ryhmät saivat mahalaukunsisäistä FN:ää 50 tai 100 mg/kg/päivä, vastaavasti; normaalit ja mallikontrollit saivat karboksimetyyliselluloosanatriumia (CMC-Na). Päivänä 42 hoidon aloittamisen jälkeen hiiret lopetettiin ja kudokset kerättiin. Eturauhasen patologia arvioitiin HE-värjäyksellä; Th1-solujen erilaistumista ja makrofagien polarisaatiota eturauhasessa arvioitiin immunofluoresenssikaksoisvärjäyksellä (CD4 interferonilla [IFN-]; indusoituva typpioksidisyntaasi [iNOS] ja CD206). Th1-solujen ja makrofagien suhteet pernassa mitattiin virtaussytometrillä ja seerumin IFN- ja tuumorinekroositekijä- (TNF-) -tasot ELISA:lla. Fosforyloitunut (p)-JAK1, JAK1, p-JAK2, JAK2, p-STAT1 ja STAT1 eturauhaskudoksessa määritettiin Western blot -menetelmällä.
Tulokset: Verrattuna mallikontrolleihin, molemmat FN-annokset johtivat rauhasepiteelisolujen järjestynempään järjestykseen, vähensivät merkittävästi eturauhasen tulehduspisteitä (P < 0,05), vähensivät Th1-solujen ja M1-makrofagimarkkerien osuutta (P < 0,05) ja lisäsivät M2-makrofagimarkkereita eturauhas- ja pernakudoksissa.0 (P <0). Seerumin IFN- ja TNF-tasot laskivat huomattavasti LFN- ja HFN-ryhmissä (P < 0,05). Molekyylitasolla suhteet p-JAK1/JAK1, p-JAK2/JAK2 ja p-STAT1/STAT1 eturauhaskudoksessa laskivat kaikki merkittävästi (P ​​< 0,05), mikä osoittaa, että FN:llä on terapeuttisia vaikutuksia EAP:ssa moduloimalla JAK/STAT-signalointia, edistämällä tulehduksen paranemista ja palauttamalla immuunitasapaino.
Johtopäätös:FN lievittää EAP:tä estämällä JAK/STAT-signalointireittejä ja säätelemällä Th1-erilaistumista ja makrofagien polarisaatiota. Nämä havainnot sekä kasvava kiinnostus perinteisen kiinalaisen lääketieteen (TCM) lisäravinteisiin, kuten Cistanche-uutetta koskeviin lisäravinteisiin immuunimodulaatioon ja lantion kivun tukemiseen, viittaavat usean tavoitteen strategiaan, joka on edelleen validoinnin arvoinen tiukoissa, vertaisarvioiduissa olosuhteissa.

Avainsanat:formononetiini;autoimmuuni eturauhastulehdus; tulehduksellinen vaste; JAK/STAT-signalointireitit; hiiret;TCM-yrtti-Cistanche-uutelisä; immunomodulaatio

 

 

TCM-yrtti-Cistanche-uutelisä

 

 

 

Tarkista tuoteluettelo

Wecistanchen tukipalvelu - Kiinan suurin vesisäiliön viejä:
Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com

 

Johdanto

Krooninen eturauhastulehdus/krooninen lantion kipuoireyhtymä (CP/CPPS) vaikuttaa 5–10 %:iin miehistä ja se on noin 90 % kaikista eturauhastulehduksista. Se on erityisen yleistä nuorten ja keski-ikäisten miesten keskuudessa, ja se ilmenee ensisijaisesti alavatsan, perineumin ja lantion alueen kipuina, joihin usein liittyy alempien virtsateiden oireita ja joskus erektiohäiriöitä. Nykyiset ensilinjan hoidot sisältävät ei-steroidiset tulehduskipulääkkeet (NSAID), antibiootit ja -adrenergisten reseptoreiden salpaajat, joko yksin tai yhdistelmänä. Kuitenkin korkea uusiutumisaste johtaa siihen, että monet potilaat ovat tyytymättömiä näihin hoito-ohjelmiin. Siksi uusia terapeuttisia interventioita ja syvempää tietoa CP/CPPS:n patogeneesistä tarvitaan kiireesti.

 

CM-yrtti Cistanche-uutteen lisäaine Edut

Yhä useammat todisteet osoittavat, että immuunijärjestelmän häiriöillä on ratkaiseva rooli CP/CPPS:n kehittymisessä. Potilailla esiintyy yleensä laajaa T-lymfosyyttien ja monosyyttien infiltraatiota eturauhaskudoksessa ja kohonneita leukosyyttejä ekspressoituneissa eturauhasen eritteissä, joita hallitsevat CD4+ T-lymfosyytit ja makrofagit. Prekliiniset tiedot viittaavat lisäksi siihen, että immunosuppressiiviset strategiat voivat lievittää tulehdusta ja kipua CP/CPPS:ssä. Siten leukosyyttien infiltraation ja tulehdusvasteen kohdistaminen voi olla tehokasta oireiden lievittämisessä. Formononetiinilla (FN), tärkeä bioaktiivinen isoflavoni useissa TCM-yrteissä, on antioksidanttisia ja anti-inflammatorisia ominaisuuksia. On epäselvää, voiko FN parantaa CP/CPPS:ää. Tässä arvioimme FN:n terapeuttista vaikutusta hiiren EAP-mallissa. Samanaikaisesti kasvavan kliinisen kiinnostuksen kanssa integroivia lähestymistapoja kohtaan havaitsemme, että TCM-yrtti Cistanche-uutetta täydentäviä lisäaineita tutkitaan immunomoduloivan ja anti-inflammatorisen tuen saamiseksi lantion kipuoireyhtymissä; Vaikka ne eivät ole tämän tutkimuksen painopiste, ne kontekstualisoivat FN:n laajemmassa TCM-pohjaisessa terapeuttisessa maisemassa.

 

Materiaalit ja menetelmät

 

Eläimet

6–7 viikon ikäiset urospuoliset NOD-hiiret saatiin Shanghain perinteisen kiinalaisen lääketieteen yliopiston (SUTCM) koeeläinkeskuksesta (lisenssi SYXK [Hu] 2020-0009; todistus SCXK [Jing] 2021-0006). Eläimiä pidettiin 12 tunnin valo/12 tunnin pimeyden jaksoissa niin, että ruokaa ja vettä oli saatavilla ad libitum. SUTCM:n Institutional Animal Care and Use Committee (hyväksyntänumero PZSHUTCM2301040003) hyväksyi kaikki menettelyt.

Reagenssit ja lääkkeet
Formononetiini (MedChemExpress, HY-N0183); täydellinen Freundin adjuvantti (CFA; Sigma-Aldrich, F5881); fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS); naudan seerumialbumiini (BSA); erittäin herkät ECL-sarjat (Shanghai YaYme Biotech, CB012, PS113, SQ201); vasta-aineet p-JAK1:lle, JAK1:lle, p-JAK2:lle, JAK2:lle, p-STAT1:lle, STAT1:lle, GAPDH:lle ja DAPI:lle (Cell Signaling Technology, #74129, #3344, #3776, #3230, #9167, #9172, #5174, #86); RIPA-puskuri- ja BCA-proteiinimääritys (Thermo Fisher Scientific, 89901, A55866); HE-värjäyssarja (Servicebio, GP1031); iNOS ja CD206 (Abcam, ab178945, ab125028); APC anti-hiiri CD3, FITC anti-hiiri CD4, PE anti-hiiri IFN- (BioLegend, 100235, 100405, 505807).

 

Instrumentit
Elektroforeesilaitteet (E11001, Bio-Rad); laserpyyhkäisykonfokaalinen mikroskooppi (LSM 780, Zeiss); CytoFLEX virtaussytometri (Beckman Coulter).

EAP-mallin perustaminen
Viikon sopeutumisen jälkeen hiiret satunnaistettiin neljään ryhmään (n=10): kontrolli, malli, FN pieni annos (50 mg/kg) ja FN suuri annos (100 mg/kg). EAP indusoitiin aikaisempien menetelmien mukaisesti. Eturauhasen antigeenejä (PAg) sisältävä supernatantti valmistettiin Sprague-Dawley-rotan eturauhashomogenaatista ja sekoitettiin 1:1 CFA:n kanssa. Päivinä 0 ja 28 hiiret saivat ihonalaisen injektion molempiin takajalkatyynyihin, alaselkään ja hännän tyveen joko PAg:a (300 ug/hiiri; EAP-ryhmät) tai PBS:ää (kontrolli), emulgoituna CFA:lla (150 µl/hiiri). FN-ryhmät saivat päivittäin mahalaukunsisäistä FN:ää (50 tai 100 mg/kg); kontrolli- ja malliryhmät saivat tilavuutta vastaavan CMC-Na:n. Koe päättyi päivänä 42, jota seurasi inhimillinen eutanasia.

Eturauhaskudoksen HE värjäys
Eturauhanen kiinnitettiin 4-prosenttisessa paraformaldehydissä, dehydratoitiin, upotettiin parafiiniin ja leikattiin 5 μm:n pituiseksi. Leikkeet värjättiin käyttämällä HE-pakkausta ja kuvattiin konfokaalimikroskopialla. Tulehdus arvosteltiin 0–3 vakiintuneiden kriteerien perusteella, 0 osoitti, ettei tulehdusta ja 3 osoitti merkittävää tulehdussolujen infiltraatiota.

Virtaussytometria Th1-soluille ja makrofageille
Yksisoluiset suspensiot valmistettiin ja niitä ylläpidettiin PBS:ssä, jossa oli 0,5 % BSA:ta. Pinta- ja solunsisäinen värjäys noudatti standardiprotokollia käyttäen APC anti-CD3, FITC anti-CD4 ja PE anti-IFN- . Soluja stimuloitiin 50 ng/ml PMA:lla, 1 ug/ml ionomysiinillä ja 5 ug/ml brefeldiini A:lla 37 asteessa 4 tunnin ajan, sitten värjättiin solunsisäisesti 4 asteessa 30 minuutin ajan. Tiedot hankittiin CytoFLEXillä ja analysoitiin FlowJolla.

Immunofluoresenssivärjäys makrofageille
Kiinteistä eturauhasleikkeistä tehtiin parafiini, niille tehtiin antigeenin haku ja estettiin 10 % vuohen seerumilla 30 minuutin ajan. Primaarisia vasta-aineita (iNOS, CD206) levitettiin yön yli 4 °C:ssa. PBS-pesujen jälkeen fluoroforilla leimattuja sekundaarisia vasta-aineita levitettiin 1 tunnin ajan 37 asteessa pimeässä. Tumat vastavärjättiin DAPI:lla 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, mitä seurasi PBS-pesu ja kiinnitys fluoresenssimikroskopiaa varten.

Sytokiinien mittaus

Seerumin IFN- ja TNF-määrät määritettiin käyttämällä ELISA-sarjoja valmistajan ohjeiden mukaisesti.

 

Western Blot

Eturauhasen kudokset hajotettiin RIPA-puskurissa (proteaasin ja fosfataasin estäjien kanssa). Proteiinipitoisuus mitattiin BCA-määrityksellä. Valmistettiin sopivat prosenttiosuudet geelit; yhtä suuret määrät proteiinia suoritettiin elektroforeesilla ja siirrettiin PVDF-kalvoille. Primaarisia vasta-aineita (p-JAK1, JAK1, p-JAK2, JAK2, p-STAT1, STAT1, GAPDH; kaikkia 1:1000) inkuboitiin yön yli 4 asteessa, minkä jälkeen pestiin ja inkuboitiin HRP-konjugoitujen sekundaaristen vasta-aineiden kanssa (1:5000) 1 tunnin ajan. Nauhat visualisoitiin tehostetulla kemiluminesenssilla ja kuvattiin. Suhteellinen proteiiniekspressio laskettiin densitometrisellä analyysillä.

 

Tilastollinen analyysi

Tiedot analysoitiin GraphPad Prism 9.0:lla. Yksisuuntaista ANOVAa käytettiin useiden ryhmien vertailuihin. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD; P:tä pienempi tai yhtä suuri kuin 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevänä.

 

Keskustelu

Tämä tutkimus osoittaa, että formononetiini lieventää histopatologista tulehdusta, vaimentaa Th1-polarisaatiota, siirtää makrofagien fenotyyppejä pro-inflammatorisesta M1:stä pro-resoloivaan M2:een ja vähentää JAK1/2-STAT1-fosforylaatiota eturauhaskudoksessa EAP-hiirimallissa. Vähentynyt systeeminen IFN- ja TNF-pitoisuus vahvistaa entisestään FN:n anti-inflammatorisia ja immunosäätelyvaikutuksia. Nämä tulokset ovat linjassa aikaisempien raporttien kanssa FN:ää moduloivista JAK/STAT-reiteistä iskemia-reperfuusio- ja ateroskleroosimalleissa, mikä korostaa konservoituneita anti-inflammatorisia mekanismeja. TCM:n laajemmassa kontekstissa integratiiviset hoitoreitit sisältävät joskus kasviperäisiä aineita, kuten Cistanche (Rou Cong Rong) -uutetta, joita on tutkittu immunomodulaation, väsymyksen ja urogenitaalisen tuen osalta. Vaikka Cistanche-uutetta ei testattu täällä, tulevissa kontrolloiduissa tutkimuksissa voitaisiin verrata tai yhdistää FN:ää standardoituihin TCM-yrtti-Cistanche-uutetta sisältäviin lisäravinteisiin, jotta voidaan tutkia mahdollista synergiaa JAK/STAT:iin liittyvissä tulehduksissa ja lantion kivuissa. Kaikissa kliinisissä käännöksissä on noudatettava näyttöön perustuvia standardeja, laatukontrolloitua hankintaa ja turvallisuusseurantaa.

Johtopäätökset
Formononetiini lievittää kokeellista autoimmuunista eturauhastulehdusta estämällä JAK/STAT-signalointia ja säätelemällä Th1-erilaistumista ja makrofagien polarisaatiota. Nämä havainnot tarjoavat mekaanisen perusteen FN- ja mahdollisesti lisäravinteiden TCM-strategioiden, kuten Cistanche-uutteen lisäravinteiden, edelleen kehittämiselle CP/CPPS:n immunomodulatorisina interventioina, jotka odottavat validointia tiukoissa, vertaisarvioiduissa prekliinisissä ja kliinisissä tutkimuksissa.

Viitteet
[1] He SL, Zhang ZJ, Wu JH, et ai. Erektiohäiriön vaikutus psykologisiin oireisiin potilailla, joilla on CP / CPPS. Journal of Hunan Normal University (Medical Sciences), 2021, 18(5): 27–30.
[2] Polackwich AS, Shoskes DA. Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: A review of evaluation and therapy. Prostate Cancer and Prostatic Diseases, 2016, 19(2): 132–138.
[3] Sun Y, Liu Y, Liu B, et ai. Akupunktion tehokkuus CP/CPPS:ssä: satunnaistettu tutkimus. Annals of Internal Medicine, 2021, 174(10): 1357–1366.
[4] Franco JV, Turk T, Jung JH, et al. Ei-farmakologiset toimenpiteet CP/CPPS:n hoitoon. Cochrane Database of Systematic Reviews, 2019, 10: CD012551.
[5] Rees J, Abrahams M, Doble A, et ai. Kroonisen bakteeriperäisen eturauhastulehduksen ja CP/CPPS:n diagnoosi ja hoito: konsensusohje. BJU International, 2015, 116(4): 509–525.
[6] Pena VN, Engel N, Gabrielson AT, et ai. CP/CPPS:n diagnostiikka- ja hallintastrategiat. Drugs & Aging, 2021, 38(10): 845–886.
[7] Chen L, Zhang M, Liang C. CP/CPPS: Toinen autoimmuunisairaus? Archives of Immunology and Therapy Experimentalis, 2021, 69(1): 24.
[8] Murphy SF, Schaeffer AJ, Thumbikat P. Kroonisen lantion kipuoireyhtymän immuunivälittäjät. Nature Reviews Urology, 2014, 11(5): 259–269.
[9] Appiya SM, Khan FU, Naveed M, et ai. Interventiot CP/CPPS:lle: Missä olemme ja mitä seuraavaksi? European Journal of Pharmacology, 2019, 857: 172429.
[10] Yu L, Zhang Y, Chen Q, et ai. Formononetiini suojaa aivoiskemia-reperfuusioon liittyvältä tulehdukselta JAK2/STAT3:n kautta. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2022, 149: 112836.
[11] Ma X, Wang J. Formononetin: Reitti suojella hermosoluja. Frontiers in Integrative Neuroscience, 2022, 16: 908378.
[12] Ma C, Xia R, Yang S, et ai. Formononetiini heikentää ateroskleroosia KLF4-SRA-vuorovaikutuksen kautta ApoE-/--hiirissä. Theranostics, 2020, 10(3): 1090–1106.
[13] Du HX, Yue SY, Niu D, et al. Suolen mikrofloora moduloi Th17/Treg-erilaistumista EAP:ssa propionaatin kautta. Frontiers in Immunology, 2022, 13: 915218.
[14] Du H, Chen X, Zhang L, et ai. EAP indusoi oppimismuistin heikkenemistä ja neuroplastisia muutoksia hiirillä. Cellular and Molecular Neurobiology, 2020, 40(1): 99–111.
[15] Zhang Y, Feng R, Chen S, et ai. CXCR7:n aiheuttava vaikutus EAP-vaurioon ja fibroosiin. International Immunopharmacology, 2025, 144: 113368.