Konsentraatin osuudella varhaisen laktaation lypsylehmien ruokavaliossa on ristiriitaisia ​​vaikutuksia kiertävien leukosyyttien maailmanlaajuisiin transkriptomiin profiileihin, terveyteen ja hedelmällisyyteen pariteetin mukaan

Abstrakti:Lypsylehmien kiertävien leukosyyttien toiminta heikkenee poikimisen jälkeen, jolloin negatiivinen energiatase on riskitekijä. Leukosyyttien transkriptomista profiileja verrattiin erikseen 44:llä monen synnytyksen (MP) ja 18:lla alkusynnyttävällä (PP) Holstein–Friesian lehmillä, jotka saivat ruokintaa, joka poikkesi tiivistesuhteesta, jotta voidaan testata, voitaisiinko immuunijärjestelmän toimintahäiriöitä lieventää asianmukaisella ravinnolla. Poikimisen jälkeen lehmille tarjottiin joko (1) alhaista rikastetta (LC); (2) keskitasoinen tiiviste (MC) tai (3) korkea tiiviste (HC) ruokavalio, jossa tiivisteen suhde ruohosäilörehuun on 30 %:70 %, 50 %:50 % ja 70 %:30 %. Lehmän fenotyyppitietoihin sisältyivät kiertävät metaboliitit, maitotuotot sekä terveys- ja hedelmällisyystiedot. Maidon kiertävien leukosyyttien RNA-sekvensointi 14 päivän kohdalla suoritettiin. HC-ruokavalio paransi energiatasapainoa molemmissa ikäryhmissä. PP:ssä oli enemmän eri tavalla ilmentyneitä geenejä kuin MP-lehmissä (460 vs. 173, HC vs. LC vertailu) ja vähän päällekkäisyyksiä. LC-ruokavaliota saaneiden MP-lehmien komplementti- ja hyytymiskaskadi sekä synnynnäiset immuunipuolustusmekanismit patogeeneja vastaan ​​lisääntyivät, ja niillä oli trendi lisätä utaretulehdustapauksia ja heikentää hedelmällisyyttä. Sitä vastoin HC-ruokavaliolla PP-lehmät osoittivat suurempia immuunivasteita sekä geenin ilmentymisen että fenotyyppitietojen perusteella ja pitemmällä poikimisvälillä hedelmöittymiseen. MP- ja PP-lehmien leukosyytit reagoivat siksi eri tavalla ruokavalioon iän, ravintonsaannin ja immuniteetin välillä, mikä vaikutti heidän terveyteen ja myöhempään hedelmällisyyteen.

Cistanche-edut miehille - vahvistavat immuunijärjestelmää

Napsauta tästä nähdäksesi Cistanche Enhance Immunity -tuotteet

【Kysy lisää】 Sähköposti:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Avainsanat:synnytyksen jälkeinen immunosuppressio; synnynnäinen immuniteetti; aineenvaihdunta; leukosyytit; imetyksen ruokavaliot; transkriptio; jäljentäminen; lehmät

1. Esittely

Varhain synnytyksen jälkeen lypsylehmille on ominaista immunosuppressio, joka vaikuttaa synnynnäiseen ja adaptiiviseen immuniteettiin, mukaan lukien sekä soluvälitteinen että humoraalinen immuniteetti. Verenkierrossa olevat leukosyytit kerääntyvät kudoksiin, kuten maitorauhaseen ja kohdun limakalvoon tulehduksen aikana. Aiemmat tutkimukset ovat kuitenkin osoittaneet sekä leukosyyttien määrän että niiden toimintakyvyn alenemisen synnytyksen aikana [1,2]. Raportoituja vaikutuksia ovat heikentynyt fagosytoosi ja oksidatiivinen purkausaktiivisuus [3–5], kiertävien T-solujen heikentynyt vaste mitogeenisille aineille ja B-solujen vähentynyt immunoglobuliinin tuotanto [6,7]. Syyt ovat monitekijäisiä, mutta näyttävät liittyvän ravinteiden jakautumiseen maidontuotannon hyväksi imetyksen alussa, mikä vaarantaa immuunitoiminnan [8–10]. Leukosyytit tarvitsevat riittävän määrän glukoosia, erilaisia ​​rasvahappoja ja kolesterolia tai oksisteroleja ylläpitääkseen ja toimiakseen [8,11,12]. Poikimisen jälkeen saatavilla oleva ravintorauhanen on kuitenkin etusijalla, mikä vaatii noin 25 % enemmän metaboloituvaa energiaa ja proteiinia kuin mitä rehu saa [8,13,14]. Lisäksi synnytykselle on tunnusomaista tulehdusprosessit, jotka liittyvät erilaisten prostaglandiinien, steroidien ja sytokiinien erityksen muutoksiin sekä mahdollisiin vammoihin synnytysprosessin aikana [15–17]. Poikimisen aiheuttamilla tulehdusreaktioilla ja kudosmobilisaation aikana vapautuvilla metaboliiteilla on voimakkaita ruokahaluttomuutta vähentäviä vaikutuksia, jotka vähentävät entisestään saantia ja pahentavat negatiivista energiatasapainoa (NEB) [18]. Kun rehun saanti ei pysty vastaamaan kasvavaan energiantarpeeseen, lehmät siirtyvät NEB-jaksoon, jolloin osa yksilöistä muuttuu metabolisesti epätasapainoiseksi [19–21]. NEB liittyy insuliiniresistenssiin, hepaattisen kasvuhormonin (GH) reseptorin ilmentymisen vähenemiseen ja hepaattisen IGF{23}}-synteesin vähenemiseen [22,23]. GH:n irrottaminen insuliinista synnytyksen jälkeisillä lehmillä on mukautus, joka asettaa etusijalle glukoosin saannin kudoksiin, kuten rintarauhasen epiteelisoluihin, joissa otto on riippumaton insuliinista [8]. Tässä tilanteessa maitorauhasen ja immuunijärjestelmän välinen kilpailu energiahuollosta on väistämätöntä, koska ne molemmat ovat riippuvaisia ​​samoista olennaisista substraateista ja molemmat ovat suuria energiankuluttajia. Kvidera et ai. [24] osoittivat, että täyden immuunivasteen aktivoituminen lehmillä vaati 2,5-3,1 kg glukoosia päivässä. Tämä on samanlainen kuin maidontuotannon arvioitu 2,7 kg:n glukoosin tarve päivässä 40 kg/vrk [8].

Kudosten mobilisaatioon liittyy myös esteröimättömien rasvahappojen (NEFA:iden), beetahydroksibutyraatin (BHB) lisääntyneiden verenkierron pitoisuuksien ja IGF-1 vähenemisen, jotka kaikki vaikuttavat immuunijärjestelmän toimintahäiriöihin [5,9,10,20 ]. Esimerkiksi äskettäinen tutkimuksemme osoitti, että leukosyyttien solujen välinen adheesio estyi, kun NEFA-pitoisuus ylitti 750 µM [25]. Vaikka kudosmobilisaatio on nisäkkäiden normaali sopeutuminen imetyksen tukemiseen, monet tutkimukset ovat osoittaneet, että vakavalla NEB:llä on suuri vaikutus lehmän myöhempään kykyyn tulla raskaaksi oikea-aikaisesti [26]. Tämä voi johtua useista tekijöistä, mukaan lukien viivästykset sopivan kohdun ympäristön palauttamisessa [2]; pitkittynyt anovulaatiojakso [27], huono intrafollikulaarinen ympäristö [28] ja munasolujen laadun heikkeneminen [29]. Lypsyhiehot poikivat yleensä noin 90 % kypsästä ruumiinpainostaan ​​[30]. Edellinen tutkimuksemme osoitti, että primiporous (PP) lehmät olivat korkeammat insuliini-, IGF-1- ja leptiinipitoisuudet verenkierrossa, alhaisemmat veren aineenvaihduntatuotteiden (BHB, NEFA:t ja urea) pitoisuudet ja korkeammat glukoosipitoisuudet kuin monisikijöillä (MP) ) lehmille vähintään 7 viikkoa poikimisen jälkeen [31,32]. Tämä osoittaa, että PP-lehmien varhaisessa laktaatiossa on vähemmän somatotrofisen akselin irtoamista verrattuna MP-lehmiin, mikä liittyy maitorauhasen ravinteiden heikompaan priorisointiin, mikä mahdollistaa jatkuvan kasvun. Geeniekspressioprofiilit kiertävissä leukosyyteissä eroavat myös PP- ja MP-lehmien välillä varhaisen laktaation aikana [33].

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Ravitsemushallinnan optimointi kuiva-ajan aikana voi lisätä kuiva-aineen saantia (DMI), vähentää synnytyksen jälkeisten sairauksien ilmaantuvuutta ja parantaa hedelmällisyyttä [34]. On olemassa yleisiä ohjeita siitä, kuinka vähentää ruokkimiseen ja hoitoon liittyvää sairausriskiä [35]. Käytettävissä on kuitenkin vain vähän tietoa yksittäisen lehmän aineenvaihdunnan epätasapainossa synnytyksen jälkeisenä aikana ravitsevista koostumuksista, jotka voivat parantaa immuunijärjestelmää, vähentää tautien ilmaantuvuutta ja parantaa myöhempää lisääntymiskykyä. Runsaasti ravintoaineiden saantipotentiaalia sisältävien ruokavalioiden laatiminen on käytännöllinen lähestymistapa [36]. Tässä tutkimuksessa varhaisessa laktaatiossa oleville lehmille tarjottiin matalaa (LC), keskimääräistä (MC) tai suurta tiivistettä (HC) ruokkia, jotka perustuivat tiivisteen osuuteen ruohosäilörehussa ja vaikutuksista aineenvaihdunnan terveyteen ja sairauksiin sekä systeemiseen immuniteettiin ( arvioimalla globaaleja kiertävien leukosyyttien geeniekspressioprofiileja) määritettiin. PP- ja MP-lehmien tiedot analysoitiin erikseen, jotta vältetään pariteetista aiheutuvat hämmentävät vaikutukset. Hypoteesimme oli, että korkean pitoisuuden ruokavaliot parantaisivat immuunitoimintaa ja edistäisivät hedelmällisyyttä.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

2. Tulokset

2.1. Ruokavalion vaikutus kuiva-aineen saantiin, maitosatoon, energiatasapainoon ja veren aineenvaihduntaan

Maitoparametrit, ruumiinpaino (BW), DMI, kehon kuntopisteet (BCS), energiatasapaino (EBAL) ja veren metaboliitit sekä MP- että PP-lehmillä noin 14 päivän maidossa (DIM) on esitetty taulukossa 1. DMI MP-lehmät erosivat merkittävästi kolmen ravintoryhmän välillä järjestyksessä HC > MC > LC (p < 0.01–0.0{{11) }}1). HC-ruokavaliota saaneiden MP-lehmien maitotuotos oli merkittävästi korkeampi kuin LC-ruokavaliota saaneiden (p < 0.05). Ero energiakorjatussa maitotuotannossa (ECM) LC- ja HC-ryhmien välillä oli merkitsevä (p < 0.05), MC-ryhmässä keskiarvot. EBAL-arvot kaikissa kolmessa MP-ryhmässä olivat negatiivisia, mutta MC- ja HC-lehmien arvot olivat merkittävästi parempia (vähemmän negatiivisia) kuin LC-lehmillä (p < 0,01). Verenkierrossa sekä glukoosin (p < 0,01) että IGF-1 (p < 0,001) pitoisuudet HC-lehmillä olivat merkittävästi korkeammat kuin LC-lehmillä. MP-lehmät, joille tarjottiin HC-ruokavaliota, tuottivat myös vähemmän kiertävää ureaa (p < 0,001), BHB:tä (p < 0,05) ja NEFA:ita kuin LC-ruokavaliossa pitoisuuksilla LC > MC > HC, vaikka NEFA-pitoisuuksien erot ravintoryhmien välillä eivät olleet tilastollisesti merkittäviä.

Taulukko 1. Kuiva-aineen kokonaissaanti, maidon parametrit, ruumiinpainot, energiatasapaino, kehon kuntopisteet ja veren aineenvaihduntatuotteet noin 14 päivää poikimisen jälkeen, analysoituna pariteetin ja ruokavalion mukaan 1,2

PP-lehmillä MC- tai HC-ruokavaliota saaneiden DMI oli korkeampi kuin LC-ruokavaliota saaneiden (p < {0}}.01). Maitotuotot eivät eronneet merkittävästi. EBAL oli positiivinen lehmillä, joille tarjottiin MC- tai HC-ruokavaliota, kun taas niillä, joille tarjottiin LC-ruokavaliota, se oli negatiivinen. Erot EBAL:ssa HC- ja LC PP-lehmien välillä olivat merkitseviä (p < 0,05). Mitatuista metaboliiteista vain ureapitoisuudet erosivat ryhmien välillä ja olivat alhaisempia HC-lehmillä (LC > MC > HC, p < 0,001 LC vs. HC tai MC).

2.2. Ruokavalion vaikutus tulehdusparametreihin

Ruokavalion vaikutukset kohtussa ja rintarauhasessa mitattuihin tulehdusparametreihin on esitetty taulukossa 2. PP-lehmillä polymorfonukleaaristen leukosyyttien suhde kohdun epiteelisoluihin (PMN:t: UEC:t) kohtusta sytoharjalla kerättyihin oli merkittävästi suurempi lehmät HC:llä verrattuna LC-ruokavalioon (p < 0.05). MP-lehmillä suuntaus oli sama, LC < MC < HC, mutta ei saavuttanut tilastollista merkitsevyyttä. Maidon osalta LC-ruokavaliota saaneiden MP-lehmien SCC oli merkittävästi korkeampi kuin joko MC- tai HC-ruokavaliolla (p < 0,05), kun taas PP-lehmillä ei-merkittävä trendi oli päinvastainen. . Maidon N-asetyyli- -d-glukosaminidaasi (NAGaasi) ja laktaattidehydrogenaasi (LDH), maitoentsyymit, jotka viittaavat utaretulehdukseen, seurasivat samoja yleistrendejä kuin SCC-arvot, mutta erot eivät olleet merkittäviä. Näitä tuloksia tukivat terveystiedot. HC-ruokavaliolla olevilla MP-lehmillä ei esiintynyt yhtään utaretulehdustapausta (0/15), kun taas LC-ruokavaliossa olevista lehmistä 4/14 (28,6 %) todettiin kliininen utaretulehdus 16 päivän kuluessa poikimisesta. Suuntaus oli jälleen päinvastainen PP-lehmien kohdalla, kun yksi kuudesta (16,7 %) oli LC-ruokavaliossa, jolla oli kliininen utaretulehdus, verrattuna yhteen kliiniseen ja kahteen subkliiniseen utaretulehdustapaukseen HC-ruokavaliolla (50 %).

Taulukko 2. Tulehdusparametrit noin 14 päivää poikimisen jälkeen pariteetin ja ruokavalion mukaan 1,2.

2.3. Hedelmällisyystiedot

Hedelmällisyystietojen yksityiskohdat on esitetty taulukossa 3. MP-lehmien osalta LC-ruokavaliolla syntyneiden lehmien hedelmöityminen kesti hieman kauemmin ja vaati enemmän palveluita hedelmöittymistä kohti kuin HC-lehmät (2,4 ± 0,42 vs. 1,6 ± 0.23), vaikka useampaa HC-lehmää joko ei tarjottu (johdon päätös) tai ne eivät tulleet raskaaksi ollenkaan (6{{10}}.0% vs. 71,4 %). Mikään näistä eroista ei kuitenkaan ollut merkittävä. PP-lehmien kohdalla tilanne oli päinvastainen: LC-lehmillä oli lyhin aika hedelmöittymiseen 29 päivää (p < {{20}},05), kun viisi kuudesta eläimestä tuli raskaaksi ensimmäisen kerran. . Sitä vastoin puolet HC-ryhmästä joko jäi käyttämättä (n=2) tai he eivät tulleet raskaaksi (n=1), ja kolme, jotka tulivat raskaaksi, vaativat 2,0 ± 0,41 hoitoa hedelmöittymistä kohti. Tämä johti siihen, että HC-ryhmällä oli merkittävästi korkeampi "vasikan mukaan" (ICB) -pistemäärä (p < 0,05).

Taulukko 3. Hedelmällisyystiedot pariteetin ja ruokavalion mukaan 1,2

2.4. Leukosyyttien transkriptomiset profiilit lehmillä tarjosivat erilaisia ​​​​määriä tiivistettä

RefSeqin (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly, 1. toukokuuta 2022) toimittama ARS-UCD 1.2:n viitenaudan genomi sisältää 35 158 geeniä, joista 19 001 leukosyyttigeeniä oli kvantifioitavissa sekvensoinnin yhteydessä FASTQ-tiedostot yhdistettiin siihen. Tulivuorikaaviot, jotka osoittavat ilmentymisprofiilit sekä MP- että PP-lehmillä, jotka saivat kolmea eri ruokavaliota, on esitetty kuvassa 1. MP-lehmillä HC:n ja LC:n vertailussa oli 173 differentiaalisesti ekspressoitunutta geeniä (DEG), MC:n ja PP:n välillä 126. LC ja 68 HC vs. MC (lisätiedosto S1A–C). Venn-kaavio osoitti, että mikään geeni (yhteinen DEG) ei ollut merkitsevä kaikissa kolmessa ruokavaliovertailussa (kuvio 2A). PP-lehmien vertailussa HC vs. LC oli 460 astetta, MC vs. LC välillä 178 ja HC vs. MC välillä 128 (lisätiedosto S2A–C). Vain yksi yhteinen geeni (DCN, kertainen muutos (FC)=−7,3) oli merkittävä kaikissa kolmessa ruokavaliovertailussa (kuva 2B). Tämä koodaa dekoriinia, proteiinia, jolla on rooli kollageenifibrillien muodostumisessa. Kaiken kaikkiaan havaittiin, että leukosyyttigeenin ilmentymisen ruokavaliovertailuissa PP:ssä havaittiin suurempi määrä DEG:itä kuin MP-lehmillä pienemmästä ryhmäkoosta huolimatta, ja suurin osa näistä geeneistä oli säädellyt HC-ruokavaliossa. Lisäksi eri ikäryhmien välillä tunnistetuissa geeneissä oli vain vähän päällekkäisyyttä, kuten kuvan 3 Venn-kaavioista näkyy. Tämä viittaa siihen, että ruokavalioilla oli erilaisia ​​vaikutuksia leukosyyttien transkriptioon PP- ja MP-lehmillä. Molemmissa ikäryhmissä suurimmat erot havaittiin LC vs. HC -ruokavaliolla tarjottujen lehmien välillä, joten keskityimme tähän vertailuun myöhemmissä analyyseissä.

Kuva 1. Tulivuorikäyrät esittävät ilmentymisprofiilit sekä MP- että PP-lehmillä, jotka saavat kolmea erilaista ruokavaliota. (A) MP lehmät HC vs. LC, (B) MP lehmät HC vs. MC, (C) MP lehmät MC vs. LC, (D) PP HC vs. LC, (E) PP HC vs. MC ja (F) ) PP MC vs. LC. HC: korkea tiiviste (n=6 PP-lehmillä ja n=14 MP-lehmillä), MC: keskitasoinen tiiviste (n=5 PP-lehmillä ja n=15 MP-lehmillä ) ja LC: alhainen tiiviste (n=6 PP-lehmillä ja n=14 MP-lehmillä). Taiton muutokset loki2-muunnettiin. Vihreät pisteet osoittavat alassäänneltyjä geenejä, joiden p (BH) < 0.05 ja kertaiset muutokset Alle tai yhtä suuri kuin −1,5 ja punaiset pisteet osoittavat säädeltyjä geenejä, joiden p (BH) < {{ 16}}.05 ja kertaiset muutokset Suuremmat tai yhtä suuret kuin 1,5. Oranssit pisteet osoittavat geenejä, joiden p (BH) < 0,05, mutta absoluuttiset kertamuutokset < 1,5.

Kuva 2. Venn-kaaviot, jotka esittävät kiertävien leukosyyttien differentiaalisesti ilmentyviä geenejä kolmen ravintoryhmän välillä (A) monisikivillä (MP) lehmillä ja (B) esisyntyneillä (PP) lehmillä. HC: korkea tiiviste (n=6 PP-lehmillä ja n=14 MP-lehmillä), MC: keskitasoinen tiiviste (n=5 PP-lehmillä ja n=15 MP-lehmillä ) ja LC: alhainen tiiviste (n=6 PP-lehmillä ja n=14 MP-lehmillä).

Kuvio 3. Venn-diagrammit, jotka esittävät PP- ja MP-lehmien välisten leukosyyttien verenkierrossa ilmenneitä geenejä (A) korkean tiivisteen (HC) ja matalan tiivisteen (LC) vertailussa; (B) HC keskiainekonsentraatilla (MC) ja (C) MC LC:llä. HC: n=6 PP-lehmillä ja n=14 MP-lehmillä, MC: n=5 PP-lehmillä ja n=15 MP-lehmillä ja LC: n {{5 }} PP-lehmillä ja n=14 MP-lehmillä

2.5. Leukosyyttigeenien ilmentymisprofiilien vertailu korkea- tai matalakonsentraattista ruokavaliota saavien monisikivien lehmien välillä

20 suurinta ylös- ja alasäädeltyä DEG-arvoa p-arvojen (BH-säädetty) perusteella HC-ravinnolla ruokittujen MP-lehmien verrattuna LC-ruokavaliolla ruokittujen lehmien 20 suosituin on esitetty lisätiedostossa S1D, E. Ylössäänneltyjen DEG-arvojen joukossa useimmat osallistuivat GO:iin. immuunijärjestelmän toimintoja, prosessia, aineenvaihduntaa ja vastetta ärsykkeisiin, ja monilla koodaavilla proteiineilla on useita rooleja. Esimerkiksi ALAS2:lla (koodaa 50 -aminolevulinaattisyntaasi 2:ta) on rooli aineenvaihduntaprosessissa, vasteessa ärsykkeisiin ja kehitysprosessissa. COL1A1 (kollageenin tyypin I alfa 1 -ketju) ja DAB2 osallistuvat aineenvaihduntaan, vasteeseen ärsykkeisiin, monisoluiseen organismiin, liikkumiseen ja kehitykseen. Parhaat 20 huonommin säädeltyä geeniä kuvaavat selkeää teemaa immuniteetin muutoksista 14 siihen liittyvän DEG:n kanssa. Näistä DMTB1, FGA, FGB ja TF koodaavat antimikrobisia peptidejä, ALB ja TF koodaavat negatiivisia akuutin vaiheen proteiineja (APP) ja FGA ja FGG koodaavat positiivisia APP:ita. Kahdeksalla geenillä on rooli aineenvaihdunnassa ja 10 on mukana vasteessa ärsykkeisiin.

cistanche-kasveja lisäävä immuunijärjestelmä

Leukosyytti-DEG:t, jotka oli johdettu vertaamalla HC:tä LC-ryhmään, alistettiin seuraavaksi GO-rikastusanalyysille. 76 ylöspäin säädeltyä DEG:tä rikastutettiin merkittävästi 208 toiminnolla, joista 20 parasta rikastuspisteiden perusteella on esitetty kuvassa 4A. Nämä liittyivät solutoiminnan eri näkökohtiin, verihiutaleperäisen kasvutekijän sitoutumisen päällä. Monet toiminnot liittyivät proteiinien ja aminohappojen aineenvaihduntaan (mukaan lukien APLP1, COL1A1, COL1A2, COL3A1, HTR1B ja P2RY12 useimmissa), biomineralisaatioon ja kollageenin käsittelyyn (mukaan lukien COL1A1, COL1A2, SPP1 ja TUFT1) ja soluviestintään. Sitä vastoin 97:n alasäädellyn DEG:n päätoiminnoilla oli selkeä teema erilaisista immuunipuolustusprosesseista (kuvio 4B), jotka liittyivät pääasiassa 20 DEG:hen. Näistä FGA (positiivinen APP) väheni 85--kertaisesti HC vs. LC -vertailussa. GO-selaintyökalu tiivisti sekä ylös- että alas-säädeltyjen DEG:iden biologiset toiminnot kahdeksaan merkittävään luokkaan (taulukko 4). Biomineralisaatiota lukuun ottamatta kaikki muut biologiset toiminnot, erityisesti ne, jotka liittyvät immuunipuolustukseen, liittyivät pääasiassa alentuneisiin DEG:ihin.

Kuva 4. 20 suosituinta GO-funktiota, jotka liittyvät HC:n ja LC:n vertailuista saatuihin DEG-arvoihin. (A) MP-ylössäädetyt DEG:t, (B) MP-alassäädetyt DEG:t, (C) PP-ylössäädellyt DEG:t ja (D) PP-alassäädetyt DEG:t.

Taulukko 4. Yhteenveto leukosyyttien DEG-arvojen GO-rikastamisen päätehtävistä vertaamalla korkeaa (n=14) ja alhaista (n=14) tiivisteruokavaliota saaneiden monisikivien lehmien välillä laktaation alkuvaiheessa.

Taulukko 4. Jatk.

Yhdistetyt ylös ja alas säädellyt DEG:t (n=173) rikastuivat merkittävästi 23 KEGG-reitillä, jotka liittyivät pääasiassa erilaisiin immuuni- ja aineenvaihduntaprosesseihin (taulukko 5). Komplementti- ja koagulaatiokaskadit olivat kärjessä kahdeksalla alassäädetyllä DEG:llä (CFB, FGA, FGB, FGG, KNG1, PROC, SERPINA1 ja VTN). NOD:n kaltaisen signaloinnin tulehdusreitti liittyi kuuteen DEG:hen (IFNB1, MAPK10, OAS1X, OAS1Y, OAS1Z ja OAS2), joista kaikki paitsi MAPK10 olivat alasäädeltyjä. Proteiinin pilkkoutumis- ja imeytymisreitti sisälsi kuusi DEG:tä, joista kolme (COL1A1, COL1A2 ja COL3A1) oli säädelty ylöspäin ja kolme alasäädelty (CELA2A, COL5A3 ja ELN). Viisi alasäädeltyä DEG:tä osallistui peroksisomiproliferaattorin aktivoimien reseptorien (PPAR:ien) signalointireittiin (APOA2, APOC3, FABP1, HMGCS2 ja PCK1). Solunulkoisen matriisin ja reseptorin vuorovaikutuksen reitit, fokaalinen adheesio ja sfingolipidisignaali ovat kaikki mukana solu- ja kudosrakenteen ylläpitämisessä.

Taulukko 5. Merkittävät reitit, jotka tunnistettiin KEGG-reitin rikastamisella, jotka liittyvät erilaisesti ilmentyviin leukosyyttigeeneihin monisikivillä lehmillä, jotka tarjosivat runsaasti tiivistettä sisältävää ruokavaliota (n=14) verrattuna niihin, joille tarjottiin vähätiivisteistä ruokavaliota (n=14).

2.6. Leukosyyttigeenien ilmentymismallien vertailu korkea- tai matalakonsentraattia saaneiden lehmien välillä

20 suurinta kiertävää leukosyytti-DEG:tä PP-lehmissä, joita ruokittiin HC:llä, verrattuna LC-ruokavalioon, on lueteltu lisätiedostossa S2D, E. Immuuni- ja aineenvaihduntaprosessit hallitsivat huippusäädeltyjen DEG:iden biologisia toimintoja, jotka sisälsivät 11 ja 12 DEG:tä. Näistä ACSL6, MMP9 ja SLC11A1 osallistuvat leukosyyttien proliferaatioon ja ACSL6, ADGRG3, COL1A2, DUSP1, HCK, MMP9 ja PADI4 kehitysprosessiin. SLC40A1 on tärkeä raudan kuljettaja, jolla on keskeinen rooli solujen ja systeemisen raudan tasapainottamisessa. Jotkut näistä DEG:istä koodaavat proteiineja, joilla on useita toimintoja. Esimerkiksi MMP9, DUSP1, SLC11A1 ja COL1A2 liittyvät useimpiin yllä oleviin GO-toimintoihin. Ylhäältä alassäädeltyjen DEG:iden biologiset toiminnot olivat monipuolisempia. Immuunijärjestelmän prosessiin osallistui kahdeksan DEG:tä, viidellä roolia aineenvaihdunnassa ja kaksi liittyi sekä leukosyyttien lisääntymiseen että kehitysprosessiin (EPCAM ja FCRL3). Jälleen jotkut DEG:t, esimerkiksi CD96 ja FCRL3, koodaavat proteiineja, joilla on useita rooleja.

PP-lehmillä HC vs. LC -vertailusta johdettu 382 ylössäädeltyä DEG:tä liittyi merkitsevästi 690 GO-toimintoon, joista 20 parasta on esitetty kuvassa 4C. Kaikki nämä sisälsivät 116 DEG:tä (lisätiedosto S2F), joilla oli erilaisia ​​​​immuunitoimintoja. Päätoiminto oli solupinnan reseptorin signalointireitti. Tämä liittyi 43 DEG:iin, jotka sisälsivät geenejä, jotka koodaavat monia immuuniligandien reseptoreita, kuten CXCR1, CXCR2, IL17RD ja IL1RAP. Tällä toiminnolla oli kuusi merkittävää alatoimintoa, mukaan lukien lipopolysakkaridi (LPS) -välitteinen signalointireitti (PTAFR, TLR4 ja SCARB1) ja immuunivasteen säätelemä solupinnan reseptorin signalointireitti. Monisoluisen organismin prosessin säätelyn tärkein alatoiminto oli sytokiinituotannon säätely 24 ylössäädellyllä DEG:llä, kuten MARK13, LTF ja TLR4. Alassäänneltyjä DEG-arvoja oli vähemmän (vain 78), jotka liittyivät 298 merkittävään GO-toimintoon, alhaisemmilla rikastumispisteillä ja monipuolisemmilla biologisilla prosesseilla. Kuva 4D näyttää 20 parasta toimintoa. Monet näistä liittyivät immuniteetin näkökohtiin, kuten soluadheesio, immuunivasteen välittäjän tuotannon säätely, vaste LPS:lle ja vaste bakteerialkuperää oleville molekyyleille. Toiset liittyivät homeostaasin ylläpitämiseen, kuten solun pintaan, sytolyysiin, transmembraaniseen kuljetukseen ja seriinityyppiseen endopeptidaasiin. Yhteenveto merkittävistä biologisista toiminnoista, jotka liittyvät sekä ylös että alas säädeltyihin DEG:ihin, tuotti seitsemän luokkaa (taulukko 6), joissa immuunijärjestelmäprosessi on päällä ja useimmat muut toiminnot liittyvät myös immuunipuolustukseen. Esimerkiksi DEG:t rikastivat liikkumista kemotaktisilla ja immuuniominaisuuksilla sekä lajien välisellä vuorovaikutuksella organismien välillä, mikä sisältää tunkeutuneiden patogeenien tappamisen. Sekä soluprosessi että biologinen säätely liittyivät suuriin määriin DEG:itä. Soluprosessi (n=239 DEG:tä) sisälsi monia alitoimintoja, jotka liittyvät soluadheesioon, solujen tappamiseen, immuunisoluaktivaatioon ja solupopulaatioiden lisääntymiseen. Biologiseen säätelyyn (125 DEG) liittyy myös monia immuunitoimintoja, kuten immuunijärjestelmän prosessin säätely, liikkuminen ja vasteet ärsykkeisiin. Kaikki nämä toiminnot sisälsivät pääasiassa HC-ruokavaliossa säädeltyjä DEG-arvoja.

Taulukko 6. Yhteenveto DEG:iden GO-rikastamisen päätehtävistä vertailussa alkusyntyneiden lehmien välillä, jotka tarjosivat korkeaa (n=6) ja matalaa (n=6) tiivisterehua varhaisessa laktaatiossa.

Taulukko 6. Jatk.

Yhdistetyt ylös ja alas säädellyt DEG:t (460) PP-lehmillä rikastuivat 35 merkittävällä KEGG-reitillä (taulukko 7). Monet niistä liittyivät aineenvaihduntaprosesseihin, joihin osallistui aminohappoja (valiini, leusiini, isoleusiini, arginiini ja glutationi), proteiineja, lipidejä (arakidonihappo, glyserolipidi ja kolesteroli), B6-vitamiinia ja joitain hormoneja (aldosteroni, kortisoli, kilpirauhanen ja kasvuhormoni). ). Nämä aineenvaihduntareitit olivat pääasiassa rikastettuja HC-ruokavaliossa säädellyillä DEG:illä. Esimerkiksi aminohappojen biosynteesi yhdistettiin viiteen säädeltyyn DEG:hen (ARG2, ASS1, GPT2, SDS ja SDSL), kasvuhormonin synteesin, erittymisen ja vaikutuksen reittiä rikastutti kuusi säädeltyä (ADCY6, CREB3L2, CREB5, FOS). , MAPK13 ja SOCS3) ja yksi alasäädelty (BCAR1) DEG, ja arakidonihappometabolia sisälsi viisi ylössäädeltyä DEG:tä (CYP2J2, GGT5, GPX3, PLB1 ja TBXAS1). Useat immuuni-/tulehdusprosessiin liittyvät reitit rikastuivat myös merkittävästi, jälleen pääasiassa lisääntyneillä DEG:illä. Näihin kuuluivat kemokiini-, MAPK- ja TNF-signalointireitit sekä komplementti- ja koagulaatiokaskadit. Esimerkiksi kemokiinin signalointireitti sisälsi kahdeksan ylöspäin säädeltyä (ADCY6, CCL16, CCR1, CXCL13, CXCR1, CXCR2, GNG7 ja HCK) ja kaksi alassäädeltyä DEG:tä (BCAR1 ja CCR5), TNF-signalointireitti sisälsi kuusi ylössäädeltyä DEG:tä (CREB3L2, CREB3L2, , FOS, MAPK13, MMP9 ja SOCS3), ja MAPK-signalointireitit sisälsivät 12 säädeltyä DEG:tä, mukaan lukien IL1A, MAP3K6 ja MAPK13.

Taulukko 7. Merkittävät reitit, jotka tunnistettiin Kegg-reitin rikastamisella, jotka liittyvät eri tavalla ilmentyviin leukosyyttigeeneihin alkusyntyneillä lehmillä, jotka tarjosivat runsaasti tiivistettä sisältävää ruokavaliota (n=6) verrattuna niihin, joille tarjottiin vähätiivisteistä ruokavaliota (n=6).

3. Keskustelu

Synnytyksen jälkeisillä lypsylehmillä on homeostaattiset mekanismit, jotka säätelevät ravinteiden jakautumista laktaation ja muiden tärkeiden elämäntoimintojen, kuten immuniteetin ja kasvun, välillä [8]. Kudosten mobilisaatio on nisäkkäiden normaali sopeutuminen imetyksen tukemiseen, mutta osa lehmistä muuttuu metabolisesti epätasapainoiseksi [35,37]. Tällaiset eläimet kokevat liiallista rasvakudoksen mobilisaatiota, insuliiniresistenssiä ja systeemistä tulehdusta, mikä vaikuttaa heikentyneeseen immuniteettiin, jota usein havaitaan tällä hetkellä [38]. Tämä liittyy tulehduksen välittäjiin, kuten TNF ja IL6 [39,40]. Päivänä 14 poikimisen jälkeen, kun tässä tutkimuksessa kiertävät leukosyyttinäytteet kerättiin, solut olivat siksi altistuneet tulehdukselliselle stimulaatiojaksolle. Olemme osoittaneet seuraavan sukupolven sekvensoinnilla ja bioinformatiikka-analyysillä, että eri tiivisteosuuksilla tehdyt ruoat tuottivat erilaisia ​​vaikutuksia verenkierron leukosyyttitranskriptomiin PP- ja MP-lehmillä varhaisessa laktaatiossa. Tämä liittyi eroihin heidän terveytensä ja hedelmällisyytensä välillä. Nämä tiedot ovat lisänneet uusia havaintoja aiempaan raporttiimme ruokavalion vaikutuksista maidontuotantoon ja immuniteettiin [32].

3.1. Korkean ja matalan pitoisuuden ruokavalion vaikutusten vertailu monisikijöille

HC-ruokavaliolla olevilla MP-lehmillä oli korkeampi DMI kuin MC- ja LC-lehmillä, ja tämä liittyi sekä glukoosin että IGF{{0}} korkeampiin verenkierrossa oleviin pitoisuuksiin. Tämä johti siihen, että HC-lehmät olivat vähemmän vakavassa NEB:ssä ja tuottivat enemmän maitoa. HC-ruokavalio muotoiltiin täyttämään sekä imetyksen että kehon homeostaasin ylläpitämisen energia- ja proteiinitarpeet, ja metaboliittimittaukset vahvistivat, että niiden aineenvaihduntatila oli todellakin parempi kuin LC-lehmillä, ja kudosten mobilisaatiotarve oli pienempi energiantarpeen täyttämiseksi. Tämän pitäisi auttaa nopeuttamaan synnytyksen jälkeisten tulehdusprosessien paranemista, koska monet tulehdussairaudet imetyksen alkuvaiheessa liittyvät aineenvaihduntahäiriöihin tai ovat niiden aiheuttamia [38] ja olemme aiemmin osoittaneet, että kohdun tulehdus hävisi nopeammin lehmillä, joilla oli parempi energiatasapaino. [2]. Tässä tutkimuksessa PMN-solujen ja epiteelisolujen suhteessa kohdun luumenissa ei ollut eroa ruokavalion mukaan MP-lehmillä. Tätä indeksiä pidetään usein sytologisen endometriitin indikaattorina [41]. Ruokavalion mukaisia ​​eroja havaittiin kuitenkin maitorauhasessa, koska LC-lehmillä oli korkeampi SCC, ja tämä liittyi siihen, että suurempi osa heistä koki kliinistä utaretulehdusta ensimmäisen 16 DIM:n aikana (28,6 % vs. 0 % LC:ssä vs. HC-ryhmät).

Suurin osa leukosyyttitranskriptomin analyysissä tunnistetuista DEG:istä osallistui immuuni- ja/tai aineenvaihduntaprosesseihin, kuten immuunisolupopulaatiossa odotettiin. Merkittävin KEGG-reitti oli komplementti- ja hyytymiskaskadi, johon sisältyi kuusi HC-lehmien eniten alasäädeltyä geeniä. Näistä CFB koodaa komplementtitekijää B, joka on komplementin aktivaation vaihtoehtoisen reitin komponentti. FGA, FGB ja FGG koodaavat kolmea hyytymistekijän fibrinogeenin alayksikköä, joka on veritulpan avainkomponentti ja joka on myös tärkeä bakteerien sitomisessa verihiutaleisiin [42]. KNG1:n koodaama kininogeenin korkean molekyylipainon muoto on myös välttämätön veren hyytymiselle, ja kininogeeni vapauttaa bradykiniiniä, peptidiä, jolla on erilaisia ​​toimintoja, mukaan lukien antibakteerinen ja antifungaalinen aktiivisuus. VTN:n koodaama vitronektiini osallistuu myös hyytymisreitin säätelyyn ja haavan paranemiseen, kun taas sen hepariinia sitova domeeni tarjoaa antimikrobisia ominaisuuksia. PROC koodaa plasman glykoproteiinia, jonka aktivoitu muoto sisältää seriiniproteaasidomeenin, joka toimii hyytymistekijöiden V ja VIII aktivoituneiden muotojen hajotuksessa, kun taas SERPINA1 koodaa seriiniproteaasi-inhibiittoria, jonka kohteita ovat plasmiini, trombiini ja plasminogeeniaktivaattori. Komplementin ja hyytymiskaskadin lisääntyminen on aiemmin osoitettu rintakudoksessa varhaisena isännän vasteena E. colille tai Staphille. aureus-infektio [43]. Koska tämä reitti ilmentyi voimakkaammin LC-ruokavaliolla olevilla lehmillä, tämä tukee näyttöä utaretulehduksen suuremmasta esiintyvyydestä näillä eläimillä.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Toinen GO-selaimen tiivistämä huipputoiminto oli patogeenien tappamisprosessi (lajien välinen vuorovaikutus organismien välillä), joka liittyi HC-lehmien 14 alentuneeseen DEG:hen (taulukko 4). Tämä sisälsi useita geenejä, jotka osallistuivat antiviraaliseen aktiivisuuteen (IFI6, IFNB1, ISG15, MX2, OAS1Y, OAS1Z, OAS2 ja RSAD2), jotka ilmentyivät alhaisemmilla tasoilla. Näistä IFNB1 koodaa interferoni beeta 1:tä, kun taas muut ovat kaikki interferonin stimuloimia geenejä [44,45]. Ne ovat kaikki myös osa NOD-like reseptorin (NLR) signalointireittiä. NLR:t ovat sytosolisia kuviontunnistusreseptoreita, joita aktivoivat useat ei-itse-komponentit, mukaan lukien bakteeripeptidoglykaani, mikä saattaa käynnistää NF-kappa B-/AP-1--riippuvaisen proinflammatoristen sytokiinien ilmentymisen, tyypin I interferonien ilmentymisen, autofagian ja tulehdus [46]. Äskettäinen tutkimuksemme osoitti, että tämä reaktioreitti lisääntyi E. coli -tartunnan saaneiden lehmien leukosyyteissä [47]. Toinen tunnistettu geeni oli MPO, joka koodaa myeloperoksidaasia, entsyymiä, joka on varastoitu PMN:iden ja makrofagien atsurofiilisissä rakeissa. Sitä vapautuu solunulkoiseen nesteeseen tulehdusprosessien aikana ja sitä on käytetty tulehduksen ja oksidatiivisen stressin merkkiaineena [48]. IL1R2 koodaa interleukiini 1 -reseptoriperheen jäsentä ja oli yksi merkittävimmistä alentuneista DEG:istä, jotka tunnistettiin MP-lehmillä. Tämä voi sitoa IL1A-, IL1B- ja interleukiini 1 -reseptoria, tyyppi I (IL1R1/IL1RA), mutta toimii houkutusreseptorina ligandiaktiivisuuden estämiseksi.

Geeni, jolla oli merkittävin erilainen ilmentyminen eri ruokavalioilla olevien MP-lehmien välillä, oli FCER1A, jonka ilmentyminen oli vähäisempää HC-lehmillä. Tämä koodaa IgE-reseptorin alayksikköä, joka on allergisten vasteiden käynnistäjä, jotka ovat saattaneet kehittyä edistämään isännän puolustusta loisia vastaan ​​välittäjäaineiden, kuten histamiinin, vapautumisen kautta [49]. Mielenkiintoista on, että FCER1A oli yksi vain 18 geenistä, joiden ilmentymistaso tunnistettiin erottavaksi lihahiehojen hedelmällisyyden välillä [50]. Sen tarkka rooli karjassa on edelleen epäselvä, mutta rokotekokeissa, joissa vasikoilla oli kokeellisesti infektoitunut taloudellisesti tärkeä loisankeromainen Ostertagia ostertagi, sen ilmentymistasot veressä korreloivat positiivisesti syöttösolumäärien kanssa ja negatiivisesti matojen lukumäärän kanssa [51]. Kolme muuta säädeltyä geeniä HC-lehmissä, joilla on jonkin verran immuunitoimintaa, olivat ALAS2, GZMB ja LIF. ALAS2 koodaa 50 -aminolevulinaattisyntaasi 2:ta, erytroidispesifistä mitokondriossa sijaitsevaa entsyymiä, joka katalysoi ensimmäistä ja nopeutta rajoittavaa vaihetta hemin biosynteesireitissä. Hemi on olennainen kofaktori useissa keskeisissä prosesseissa, mukaan lukien hapen kuljetuksessa, kun taas tämän geenin mutaatiot on yhdistetty useisiin ihmisen sairauksiin, mukaan lukien anemia [52]. GZMB koodaa preproteiinia, jota luonnolliset tappajasolut ja sytotoksiset T-lymfosyytit erittävät ja jota prosessoidaan aktiivisen proteaasin tuottamiseksi, joka indusoi kohdesolun apoptoosia ja prosessoi myös sytokiinejä ja hajottaa solunulkoisia matriksiproteiineja [53]. LIF:n koodaama sytokiinileukemiaa estävä tekijä tunnistettiin alun perin osallistumalla makrofagien erilaistumiseen, mutta sillä on myös osoitettu olevan tärkeä rooli alkionkehityksessä ja tiineyden muodostumisessa useissa lajeissa, mukaan lukien nautakarja [54].

MP-lehmien HC vs. LC -vertailusta saadut DEG:t rikastuivat myös useilla merkittävillä reiteillä, jotka liittyvät glukoosi-, proteiini- ja rasvahappometaboliaan. Näihin sisältyi neljä alassäädeltyä DEG:tä, jotka osallistuivat PPAR-signalointireitteihin (APOA2, APOC3, FABP1 ja PCK1). Tässä tutkimuksessa kolme pääasiallista PPAR-isoformia (A, D, G) havaittiin leukosyyttipopulaatiosta. Vaikka ruokavalio ei vaikuttanut itse PPAR:ien ilmentymiseen, tämä reitti voi vaikuttaa glukoosi- ja lipidiaineenvaihduntaan, rasvasolujen erilaistumiseen ja tulehdusvasteisiin osallistuvien geenien ilmentymiseen [55,56] ja edistää metabolista sopeutumista rajoitettuun ravintoainetarjontaan. indusoivat hapetukseen osallistuvia geenejä [57]. Retinolin aineenvaihduntareitti oli myös heikosti säädelty HC-lehmillä, ja RBP4:n ja TTR:n (joka koodaa retinolia sitovaa proteiinia ja vastaavasti transtyretiiniä) ekspressio, jotka molemmat toimivat retinolin kuljettajina veressä. Retinolin vuorovaikutus PPAR-signalointireitin kanssa vaikuttaa monien muiden alavirran geenien transkriptioon [58]. APOA2 ja APOC3 yhdessä APOH:n kanssa ovat myös osa kolesterolin aineenvaihduntareittiä. Kolesteroli on plasmakalvon pääkomponentti ja vaikuttaa sekä sen organisaatioon että toimintaan [59,60]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat korostaneet kolesterolin nousevaa roolia tärkeänä synnynnäisen ja adaptiivisen immuunitoiminnan modulaattorina [61].

Glykolyysin/glukoneogeneesin reittiin liittyi kolme alentunutta DEG:tä HC-ruokituilla lehmillä (ADH1C, ALDOB ja PCK1). Näistä PCK1 koodaa fosfoenolipyruvaattikarboksikinaasia 1:tä, joka toimii pääsäätelypisteenä glukoneogeneesin säätelyssä. Tämä entsyymi yhdessä GTP:n kanssa katalysoi fosfoenolipyruvaatin muodostumista oksaloasetaatista vapauttaen hiilidioksidia ja BKT:tä. Immuuni-/tulehdusreittien aktivoituminen edistää glukoneogeenisten geenien transkriptiota toll-like reseptorin 4 (TLR4) kautta [62]. Tämä voi saada immuunisolut vaihtamaan glukoosiaineenvaihduntansa oksidatiivisesta fosforylaatiosta glykolyysiin tuottaakseen sekä energiaa että ravintoaineita, joita tarvitaan lisääntymiseen ja immuunimolekyylien tuotantoon [12,63]. Tämä johtaa lisääntyneeseen glukoosin kysyntään, joka kilpailee laktaatin tuotantotarpeen kanssa [64].

Yhteenvetona voidaan todeta, että HC- ja LC-ruokavaliossa olevien MP-lehmien geenien ilmentymiserot osoittavat LC-lehmien suuremman lisääntyneen immuunitoiminnan ja tulehduksen. Tähän liittyi suurempi utaretulehduksen ilmaantuvuus. Sitä vastoin geenit, jotka koodaavat joitain proteiineja, jotka todennäköisesti hyödyttävät terveyttä ja hedelmällisyyttä, kuten ALAS2 ja LIF, säädeltiin HC-lehmissä. Tämä tukee mitattuja aineenvaihdunta-indeksejä, jotka osoittavat, että HC-ruokavaliolla olevilla MP-lehmillä oli parantunut EBAL-status, mikä luultavasti auttoi suojaamaan niitä tarttuvien tai aineenvaihduntasairauksien kehittymiseltä.

3.2. Korkea- ja matalatiivisteisen ruokavalion vaikutusten vertailu alkusyntyneillä lehmillä

Samoin kuin MP-lehmät, myös HC-ruokavaliolla olevilla PP-lehmillä oli korkeampi DMI, noin 4 kg/d, mutta maidon tuotto ei noussut merkittävästi. Veren glukoosi-, NEFA-, BHB- tai IGF-1-pitoisuuksissa ei ollut merkittäviä eroja, ja vain urea oli korkeampi LC-ruokavaliossa. Sitä vastoin leukosyyttigeenien ilmentymisessä oli merkittävämpiä eroja ravintoryhmien välillä kuin MP-lehmillä, HC vs. LC -vertailuissa tunnistettiin 460 vs. 173 DEG:tä, joista 83 % oli säädelty HC-ruokavaliolla olevilla PP-lehmillä. Vain pieni osa DEG-arvoista oli päällekkäisiä kahden ikäryhmän välillä (kuva 3), mikä viittaa siihen, että muutokset leukosyyttien toiminnassa varhaisen laktaation ruokavalioon nähden olivat herkempiä PP-lehmillä kuin MP-lehmillä. Olimme odottaneet, että HC-ruokavaliosta olisi hyötyä PP-lehmille lisäämällä niiden DMI:tä ja täyttämällä täysin lasketut hajoamattomien ja metaboloituvien proteiinien tarpeet. EBAL oli todellakin parantunut HC-ruokavaliossa, mutta geeniekspressioanalyysi osoitti immuunipuolustukseen osallistuvien geenien paljon suurempaa säätelyä. HC-ruokituilla lehmillä oli myös korkeampi PMN:n: UEC-suhde kohdussaan sekä numeerisesti suurempi SCC ja enemmän utaretulehdustapauksia. Tämä viittaa siihen, että he olivat itse asiassa enemmän kuin vähemmän alttiita sairauksille. Olemme aiemmin havainneet, että tässä tutkimuksessa kolmen ensimmäisen laktaation viikon aikana kerätyillä PP-lehmistä kerätyillä neutrofiileillä oli merkittävästi korkeampi fagosyyttiindeksi ja hapettumisindeksi verrattuna MP-lehmiin, mutta 2-ruokavalion ja pariteetin vaikutukset näitä mittauksia ei raportoitu [32].

HC vs. LC -vertailussa tunnistettuihin immuunijärjestelmän prosesseihin sisältyivät solupinnan reseptorin ja muodontunnistussignalointireittien lisääntyminen, kemotaksinen, sytokiinituotanto ja leukosyyttien migraatio HC-ruokituilla lehmillä. Tunnistetut DEG:t yhdistettiin erilaisiin immuunipuolustusmekanismeihin, mukaan lukien useat antimikrobiset peptidit (AMP) (CATHL6, CXCL13, DEFB1, LTF, PGLYRP1, PGLYRP4, SA100A8, SA100A9, S100A1 ja SLC11A1). Ne eivät voi vain tappaa tunkeutuneita organismeja suoraan, vaan myös auttaa moduloimalla muita immuuni- ja antimikrobisia prosesseja [65–67]. Antimikrobisten peptidien lisääntynyt säätely leukosyyttien transkriptomisissa profiileissa on aiemmin osoitettu lehmillä, joilla on kliininen utaretulehdus [47,68] ja metriiitti/endometriitti [69,70]. Leukosyyttien adheesiotoiminto liittyi 16:een ylös- ja viiteen alentuneeseen DEG:hen HC-ruokituilla eläimillä. Leukosyyttien tarttuminen kapillaarin seinämiin on tärkeä ensimmäinen askel, jotta ne voivat siirtyä verestä ja liikenteestä kohti kudosvaurioita, infektioita ja tulehdusta [71]. Sekä solu-solu- että solu-matriisivuorovaikutukset vaikuttavat leukosyyttien fenotyyppiin, ja adheesioreittien säätelyhäiriöt voivat johtaa jatkuvaan leukosyyttien aktivaatioon, jossa tulehdus ei ole ratkennut [72]. Tunnistetuista lisääntyneistä säädellyistä DEG:istä ADAM8, ANGPTL3, CD24, ICAM3 ja THY1 ovat kaikki mukana ekstravasaatiossa [73,74], kun taas FN1:llä, NRP1:llä, TNFAIP6:lla ja VCAN:lla on potentiaalisia rooleja leukosyyttisolujen kaupassa ja tulehtuneissa kudoksissa [72, 75]. Geenit, jotka koodaavat kemokiinireseptoreita CXCR1 ja CXCR2, lisääntyivät myös HC-ruokituilla lehmillä; nämä ovat molemmat tärkeitä stimuloitaessa PMN:n kemotaksia kohti infektiokohtia sekä aktivoimaan biokemiallisia prosesseja, jotka tappavat tunkeutuvia bakteereja [76].

HC-ruokituilla lehmillä adheesioon liittyvistä vähentyneistä geeneistä BCAR1 koodaa monifunktionaalista proteiinia, joka tunnetaan nimellä cas ja joka osallistuu solujen liikkuvuuteen, apoptoosiin ja solusyklin säätelyyn [77]. BCAR1:n polymorfismit on aiemmin liitetty SCC:hen ja utaretulehdukseen [78]. ADGRG1 (tunnetaan myös nimellä GPR56) koodaa G-proteiiniin kytkettyä reseptoria, joka sitoo kollageeni 3:a ja transglutaminaasi 2:ta, molemmat kudosstrooman komponentteja. ADGRG1:llä osoitettiin olevan rooli ihmisen luonnollisissa tappajasoluissa (NK), joissa se estää niiden sytotoksisuutta [79]. Sen omaa ilmentymistä säätelee alas sytokiinien aiheuttaman aktivaation jälkeen, mikä olisi sopusoinnussa tässä esitettyjen tulosten kanssa. CD96-proteiini toimii myös estävänä tarkistuspistereseptorina NK-soluissa [80]. Aiemmat tutkimukset leukosyyttien transkriptomin muutoksista siirtymäkauden aikana ovat myös löytäneet muutoksia geenien ilmentymisessä, jotka liittyvät transendoteliaaliseen migraatioon, vaikkakin erilaisilla päätelmillä, jotka raportoivat joko aktivoitumisesta poikimisen jälkeen [81] tai estymisestä [82]. Analyysimme tunnisti myös joukon eroja aminohappoaineenvaihdunnan merkkisignalointireiteissä HC-ruokavaliolla olevilla PP-lehmillä verrattuna LC-ruokavaliossa oleviin, jotka liittyvät viiden säädellyn DEG:n (ARG2, ASS1, GPT2, SDS ja SDSL) koodaamiin entsyymeihin. . Näistä ASS1 koodaa arginiinisukkinaattisyntaasia 1, joka katalysoi arginiinin biosynteesireitin toiseksi viimeistä vaihetta, kun taas ARG2 koodaa arginaasia, katalysoimalla arginiinin hydrolyysiä ornitiiniksi ja ureaksi. L-arginiini voidaan myös muuttaa typpioksidiksi, signaalimolekyyliksi, jolla on keskeinen rooli tulehduksen patogeneesissä [83]. Glutamiini-pyruviinitransaminaasi 2 (GPT2) on mitokondrioentsyymi, joka katalysoi alaniinin ja 2-oksoglutaraatin välistä palautuvaa transaminaatiota pyruvaatin ja glutamaatin muodostamiseksi. Tämän geenin säätely lisääntyy metabolisen stressin olosuhteissa ja sillä on rooli glukoneogeneesin edistämisessä aminohappoaineenvaihdunnasta [84]. Seriinidehydrataasi (SDS) koodaa entsyymiä, joka muuttaa L-seriinin pyruvaaiksi ja ammoniakiksi, kun taas seriinidehydrataasin (SDSL) ennustetaan osallistuvan isoleusiinin biosynteesiin treoniinista.

Kolesterolin aineenvaihduntareitti liittyi neljään lisääntyneeseen DEG:hen HC-ruokavaliossa (ANGPTL3, LRP1, SCARB1 ja SORT1). Tämä saattaa johtaa kolesterolin kerääntymiseen HC-ruokittujen lehmien leukosyyteihin ja edistää tulehdusta, mukaan lukien TLR-signaloinnin lisääntyminen, tulehduksen aktivoituminen ja monosyyttien ja neutrofiilien lisääntyminen luuytimessä ja pernassa [85]. Arakidonihapon aineenvaihduntareitti viidellä säädellyllä DEG:llä (kuten on lueteltu aiemmin) johtaa pro- ja anti-inflammatoristen tuotteiden, kuten prostaglandiinien ja leukotrieenien, tuotantoon [86]. Glyserolipidien aineenvaihduntareitti liittyi neljään ylössäädeltyyn DEG:hen (DGAT2, DGKG, GK ja GPAT3), jotka koodaavat lipogeenisiä geenejä, jotka osallistuvat triasyyliglyserolin synteesiin. Sen kerääntyminen voi indusoida leukosyyttien aktivaatiota ja tulehdusta [87,88]. Kaikki nämä havainnot tukevat johtopäätöstä, että HC-ruokavalio lisäsi leukosyyttien aineenvaihduntareittejä PP-lehmissä tavalla, joka lisäsi niiden immuuni-/tulehdusvasteita. Aikaisempi työ lehmillä on keskittynyt pääasiassa kuiva-aikaan ja on osoittanut, että yliruokinta ja korkea BCS tällä hetkellä edistävät myöhempää lipidien mobilisaatiota ja lisääntynyttä tulehdusvastetta synnytyksen aikana [34]. Tässä tutkimuksessa kohdun PMN:UEC-suhde ja suuntaus korkeampaan SCC:hen tukevat oletusta, että leukosyyttien migraatio kohtuun ja maitorauhaseen lisääntyi HC-ruokavaliota saavilla PP-lehmillä. Vaikka tämä on olennainen osa immuunipuolustusta, yliaktivoituminen voi edistää hyper-tulehdusta. Näiden havaintojen vahvistamiseksi tarvitaan lisätutkimuksia suuremmalla otoskoolla.

3.3. Yhtäläisyyksiä monisikivien ja alkusyntyneiden lehmien ruokavalioon

In terms of metabolic changes, both the MP and PP cows had higher circulating concentrations of urea when on the LC diet. Blood urea in both late pregnancy and early lactation may rise following mobilization of amino acids stored in skeletal muscle [89] or when dietary protein supply exceeds energy availability or protein needed [90], so these situations could have applied here. Elevated levels of urea have been associated with reduced fertility, but only at >4,5 mmol/L, korkeampi kuin pitoisuudet, jotka saavutettiin LC-ruokituilla eläimillä tässä tutkimuksessa [91]. Mitä tulee leukosyyttigeenin transkriptiotietoihin, on mielenkiintoista huomata, että molemmissa ikäryhmissä HC vs. LC -vertailusta johdetut DEG:t rikastuivat proteiinien pilkkoutumis- ja imeytymisreitillä, jossa kollageenin eri isoformeja koodaavilla geeneillä on tärkeä rooli. . Niiden joukossa oli kolme ylössäädeltyä kollageenigeeniä (COL1A1, COL1A2 ja COL3A1) sekä MP- että PP-lehmillä ja yksi alasäädelty (COL5A3) kollageenigeeni MP-lehmillä. Niiden ilmentymisarvot näytteissä olivat pieniä, mutta erot olivat merkittäviä. Osa tästä RNA:sta saattaa olla peräisin fibrosyyteistä, solupopulaatiosta, joka käsittää vain 0,1–0,5 % ei-erytrosyyttisiä soluja ääreisveressä [92,93]. Kollageeni on pitkään vakiintunut immuunijärjestelmän tehostaja, joka osallistuu moniin immuuni-/tulehdusprosesseihin [93,94]. Sen lisääntynyt tuotanto kiertävässä veressä HC-ruokavaliolla voi siksi vaikuttaa leukosyyttien toimintaan.

3.4. Vaikutukset hedelmällisyyteen

Monet aiemmat tutkimukset ovat raportoineet, että lehmien toisiinsa liittyvällä metabolisella ja immuunitilalla ja taudin ilmaantuvuus varhaisessa laktaatiossa on suuri vaikutus niiden myöhempään hedelmällisyyteen (esim. [38,95]). Oma työmme osoitti, että MP-lehmät, joiden IGF-1-pitoisuus oli alhainen 14 DIM:ssä, tulivat vähemmän todennäköisesti raskaaksi [37]. Äskettäin raportoimme, että 63 %:lla lehmistä, joilla oli alhainen IGF-1 tällä hetkellä, oli useita terveysongelmia ensimmäisen 35 DIM:n aikana, kun taas vain 26 % korkean IGF-1-tason lehmistä. Tämä sisälsi enemmän eläimiä, joilla oli kohtutulehdus ja kliininen utaretulehdus [10]. Foley et ai. [69] erotti terveet lehmät, jotka pystyivät palauttamaan homeostaasin 3 viikon kuluessa poikimisen jälkeen, ja toiset, jotka kokivat vakavamman ja pitkittyneen tulehdusvasteen, joka sitten kehittyi kliiniseen endometriittiin. Yhteyden perifeeriseen vereen osoittivat Galvão et ai. [96], joka osoitti, että huonommassa EBAL:ssa olevien lehmien neutrofiilien glykogeenipitoisuus oli pienempi seitsemällä DIM:llä ja näillä eläimillä oli enemmän kohtusairauksia, mikä mahdollisesti liittyi hapettavien polttoaineiden saatavuuden vähenemiseen immuunivasteisiin. Varhaisen imetyksen aikana esiintyvä kliininen utaretulehdus liittyy myös lisääntyneeseen ennen implantaatiota tapahtuvan alkion menetyksen määrään, mikä osoittaa, että alhainen BCS lisää riskiä entisestään [97]. On ehdotettu useita sytokiinien ja prostaglandiinien tuotantoon ja muihin tulehdusvälittäjiin liittyviä mekanismeja, jotka voivat vaikuttaa munasarjoihin ja/tai aiheuttaa epäsuotuisan kohtuympäristön [98, 99]. Tutkimuksemme lehmistä saadut hedelmällisyystiedot tukivat havaintoja, jotka liittyvät niiden immuunitilaan ja terveyteen varhaisen laktaation aikana. LC-ruokavaliota saaneet MP-lehmät tarvitsivat numeerisesti enemmän S/C-arvoa huonomman EBAL-arvonsa mukaisesti sekä näyttöä leukosyyttitranskriptomin analyysistä aktiivisemmasta immuunipuolustuksesta, mitä tukee heidän korkeampi utaretulehduksen ilmaantuvuus. Sitä vastoin HC-ruokavaliolla olevilla PP-lehmillä hedelmöittyminen kesti huomattavasti kauemmin ja harvempi tuli raskaaksi LC-ruokittua lehmiä verrattuna. Heillä oli enemmän näyttöä tulehduksesta raskauden alkuvaiheessa, vaikka heidän laskettu EBAL-arvonsa oli parempi. Tällä hetkellä taustalla olevat mekanismit, jotka aiheuttavat heidän huonon terveydentilansa ja hedelmällisyytensä, ovat epävarmoja, vaikka olemme myös löytäneet maailmanlaajuiseen geeniekspressioon perustuvia todisteita lisääntyneestä maksatulehduksesta ja fibroosista (Cheng, Little, Ferris, Takeda, Ingvartsen, Crowe ja Wathes, julkaisemattomat havainnot) .

3.5. Tutkimuksen rajoitukset

PP-lehmiä oli saatavilla vähemmän ryhmää kohden, mikä heikensi fenotyyppeihin liittyvien analyysien tilastollista tehoa. Siksi tarvitaan lisätutkimuksia suuremmalla otoskoolla, jotta voidaan vahvistaa ruokavalion vaikutukset lisääntymiseen ja sairauksiin. Tässä tutkimuksessa erotimme kaiken RNA:n koko ääreisverestä käyttämällä Tempus-putkia ja sen eristysjärjestelmää. Tämä tarjoaa helpon keräämisen laajamittaista maatilatutkimusta varten, mutta ei erota solutyyppejä, joihin kuuluvat T- ja B-lymfosyytit, luonnolliset tappajasolut, verihiutaleet, monosyytit, granulosyytit (neutrofiilit, eosinofiilit ja basofiilit) ja fibrosyytit. Esitettyihin geeniekspressiotietoihin ovat siksi vaikuttaneet mahdolliset hoitovaikutukset tiettyjen solutyyppien suhteellisiin osuuksiin niiden yksittäisten transkription muutosten lisäksi. Nämä tulokset perustuvat myös geenien transkriptiotasoihin, eivätkä ne sisällä tietoja niiden translaation jälkeisestä prosessoinnista, joka vaikuttaa myös siihen, kuinka paljon toiminnallista proteiinia tuotetaan.

4. Materiaalit ja menetelmät

4.1. Eläimet ja ruokavaliot

Kaikki toimenpiteet suoritettiin Animals (Scientific Procedures) Act 1986 -lain mukaisesti, ja niillä oli Home Office Project License -numero PPL2754 ja laitoksen nimeämistodistus. Työ hyväksyttiin myös Agri-Food and Biosciences Instituten etiikka- ja hyvinvointikomiteassa (AFBI, Belfast, Pohjois-Irlanti, Iso-Britannia). AFBI:n karjasta rekrytoitiin 62 holstein-friisiläistä lypsylehmää. Heistä 18 oli PP (laktaatio 1) ja 44 MP laktaatioluvuilla 2–7 (3,5 ± 1,28) ja kaikki lehmät olivat eläinlääkärin tarkastamana terveitä. Poikimispaino oli 680 ± 62 (keskiarvo ± STD) kg MP-lehmille ja 550 ± 39 kg PP-lehmille. Poikimisen jälkeen PP- ja MP-lehmät jaettiin erikseen kolmeen ravintoryhmään, ja kussakin ikäryhmässä jakautuminen tasapainotettiin ennustetun rasvan ja proteiinin (kg), poikimista edeltävän BW:n ja BCS:n ennustetun välityskyvyn mukaan. MP-lehmät tasapainotettiin myös pariteetin ja edellisen laktaation 305-päivämaidon mukaan. Lehmille tarjottiin joko (1) matalaa tiivistettä (LC, 30 % tiiviste plus 70 % ruohosäilörehua, n=6 PP:lle ja n=14 MP:lle); (2) keskikokoinen tiiviste (MC, 50 % tiiviste plus 50 % ruohosäilörehua, n=6 PP:lle ja n=15 MP:lle) tai (3) korkea tiiviste (HC, 70 % tiiviste plus 30 % ruohosäilörehu, n=6 PP:lle ja n=15 MP) ruokavaliolle (prosenttiosuudet kuiva-aineesta). Konsentraatti kullekin hoidolle formuloitiin siten, että saavutettiin yhteinen ruokavalion raakaproteiinin (CP) pitoisuus kullekin LC:lle, MC:lle ja HC:lle (152, 152 ja 154 g/kg DM, vastaavasti), kun taas laskettu ruokavalion metaboloituvan energian kokonaismäärä ( ME) pitoisuudet olivat 12,0, 12,4 ja 12,8 MJ/kg DM. Ruokavalion arvioitiin tarjoavan 1556, 1997 ja 2420 g/d tehokasta pötsissä hajoavaa proteiinia; 559, 733 ja 888 g/d hajoamatonta proteiinia ravinnosta ja 1346, 1817 ja 2275 g/d metaboloituvaa proteiinia LC:lle, MC:lle ja HC:lle, vastaavasti. Hoitoannoksen saantia valvottiin Calan Broadbent -ruokintajärjestelmällä (American Calan Inc., Northwood, NH, USA), joka oli yhdistetty elektroniseen tunnistusjärjestelmään, mikä mahdollisti yksittäisten lehmien syönnin kirjaamisen päivittäin. Jokaisen hoidon ruokavaliot tarjottiin 107 %:lla edellisten päivien saannista, jotta varmistettiin ad libitum -kulutus. Kaikille lehmille tarjottiin myös 0,5 kg ylimääräistä tiivistettä joka lypsämisen yhteydessä salparuokintajärjestelmän avulla, mikä auttoi ylläpitämään tehokasta lehmän virtausta. Tämä tutkimus oli osa laajempaa projektia, ja täydelliset tiedot tarjotuista ruokavalioista, ruokinnan hallinnasta ja rehun koostumuksesta kuvattiin aiemmin [32].

4.2. Lehmän fenotyyppitietojen kerääminen

Ruumiinpainot kirjattiin kahdesti viikossa punnitusvaakojen avulla. BCS:n arvoksi arvioitiin noin 14 DIM [100]. Kaikki lehmät lypsettiin kahdesti päivässä ja niiden päivittäiset tuotokset kirjattiin. Maitonäytteet analysoitiin kahdesti viikossa käyttämällä keski-infrapuna-analyysiä proteiini-, rasva- ja laktoosipitoisuuksien suhteen, ja maidon somaattiset solut laskettiin. Lisää aamumaitonäytteitä (2 x 8 ml) kerättiin kahdesti viikossa ja säilytettiin -18 ◦C:ssa LDH:n (EC. 1.1.1.27) ja NAGaasin (EC 3.2.1.30) analyysiä varten fluorometrisiä määrityksiä [101] varten. Energiakorjattu maitotuotos (ECM; kg/vrk) laskettiin ryhmässämme käytetyillä menetelmillä [32]. Kunkin lehmän EBAL arvioitiin käyttämällä aiemmin kuvattua menetelmää [102].

Kliininen utaretulehdus diagnosoitiin standardimenetelmillä, jotka perustuivat päivittäisiin havaintoihin epänormaalien maidon ulkonäön (esim. hiutaleet, hyytymät), laadun, maidontuotannon ja rintarauhasen tulehdusvasteiden (punoitus, turvotus, kuumuus tai kipu) muutoksista. Maidon SCC-lukemat ja kliiniset diagnoosit käytettiin lehmien luokitteluun kolmeen ryhmään. Terveillä lehmillä määriteltiin SCC < 100,000 solua/ml maitoa eikä kliinisiä oireita. Subkliinisesti mastitisoidut lehmät määriteltiin sellaisiksi, joiden SCC oli välillä 100,000 - 400,000 solua/ml maitoa eikä ilmeisiä kliinisiä oireita. Lehmille, joilla oli diagnosoitu kliininen utaretulehdus, oli SCC > 400 000 solua/ml maitoa, ja niillä oli joitain yllä mainituista kliinisistä oireista. Lehmät siemennettiin havaitun kiiman aikana käyttäen normaalia laumakäytäntöä ja hedelmällisyystietoja seuraavan laktaation ajan tai kunnes eläin teurastettiin, haettiin laumarekistereistä. Raportoidut tiedot sisälsivät päivät ensimmäiseen hoitoon (DFS), päivät hedelmöittymiseen (avoimia päiviä), palvelut hedelmöityskohtaisesti ja hedelmöityneiden lehmien osuus. Lisäksi hedelmöitystiedot pisteytettiin käyttämällä 4-pisteitä vasikassa (ICB) -pisteenä (1)<100 days, (2) 100–200 days, (3) >200 päivää tai (4) ei tullut raskaaksi tai teurastettiin.

4.3. Kohdun sytologinen analyysi

Jokaiselta lehmältä otettiin kohdun sytoharjanäyte (Minitube, Minitüb GmbH, Tiefenbach, Saksa) noin klo 14 DIM kohdun limakalvon sytologian arvioimiseksi, kuten aiemmin on kuvattu [103]. Kaksoissuojattu sytoharja ohjattiin manuaalisesti kohdunkaulan läpi kohtuun, sisäsuojus puristettiin ulos ulkosuojasta ja harjaa pyöritettiin varovasti kohdun limakalvon seinämää vasten. Harja vedettiin sitten sisäsuojukseen ja poistettiin. Objektilasit sytologista tutkimusta varten valmistettiin rullaamalla sytoharja puhtaalle lasimikroskooppilevylle ja kiinnittämällä näyte Fisherbrand™ CytoPrep™ Cytology Fixative -aineella (Fishers Scientific, Blanchardstown, Irlanti). Kiinteät objektilasit lähetettiin UCD School of Veterinary Medicine, University College Dublin, Irlanti prosessoitavaksi ja värjättiin modifioidulla Giemsa-värillä. Sytologinen arviointi suoritettiin laskemalla PMN:iden UEC:t 400-kertaisella suurennuksella (Leitz Labourlux-S, Wetzlar, Saksa) ja määrittämällä niiden suhde laskemalla keskiarvo 10 suuren tehokentän lukemista diaa kohti.

4.4 Kiertävien aineenvaihduntatuotteiden ja IGF:n analyysi-1

14 ± 2 (keskiarvo ± STD) päivää poikimisen jälkeen otettiin 10 ml verinäytteitä kaikkien lehmien kaulalaskimosta Na-hepariiniputkiin plasmaa varten ja tavallisiin putkiin seerumia varten. Sen jälkeen kun plasma tai seerumi oli erotettu sentrifugoinnilla, niitä säilytettiin -20 ◦C:ssa analyysiin asti. Plasman glukoosin, urean, BHB:n, NEFA:n ja kolesterolin pitoisuudet mitattiin käyttämällä aiemmin kuvattuja menetelmiä [20,25]. Lyhyesti sanottuna seerumin NEFA-konsentraatio määritettiin ACS-ACOD-menetelmällä käyttämällä NEFA C Kits -pakkauksia (Wako, Neuss, Saksa). Plasman glukoosin määrä määritettiin entsymaattisella menetelmällä (ADVIA 1800 Clinical Chemistry System, Siemens Healthcare Diagnostics, Ballerup, Tanska). Seerumin BHB määritettiin mittaamalla absorbanssi 340 nm:ssä johtuen NADH:n tuotannosta alkalisessa pH:ssa BHB-dehydrogenaasin läsnä ollessa. Seerumin urea analysoitiin spektrofotometrialla. Intra- ja inter-analyysi variaatiokertoimet (CV) olivat kaikissa tapauksissa alle kolme ja neljä prosenttia, vastaavasti, sekä alhaisilla että korkeilla kontrollinäytteillä. Seerumin IGF{11}}-pitoisuudet määritettiin radioimmunomäärityksellä happaman etanoliuuton jälkeen [104]. Analyysin sisäinen CV oli 12,4, 7,5 ja 9,9 % matalan, keskitason ja korkean kontrollinäytteillä, vastaavasti.

4.5. Veren RNA:n erottaminen

Verinäytteet RNA:n uuttamista varten kerättiin kaulasuonipunktiolla kaikilta lehmistä 14 ± 2 DIM:ssä Tempus-veri-RNA-putkiin (Thermo-Fisher Scientific, Loughborough, UK). Putkia ravisteltiin voimakkaasti 15–20 sekuntia välittömästi keräämisen jälkeen, sitten jäädytettiin ja säilytettiin -80 ◦C RNA:n uuttamista varten. Kokoveren RNA uutettiin käyttämällä Tempus Spin RNA -eristyspakkauksia (Thermo-Fisher) noudattaen valmistajan ohjeita, kuten aiemmin on kuvattu [20]. Agilent BioAnalyzer 2000 (Agilent Technologies UK Ltd., Cheadle, UK) ja Agilent RNA 6000 Nano Kit (Agilent Technologies UK Ltd., Cheadle, UK) käytettiin RNA:n määrän ja eheyden arvioimiseen. Lisäksi määrä ja puhtaus validoitiin NanoDrop 1000:lla (Thermo Fischer). Laatutiedot on koottu lisätiedostoon S3. Tämä osoitti, että kaikilla RNA-näytteillä oli kohtuullinen eheys (RIN-luku > 8,7, 9,3 ± 0,3) ja puhtaus (260/280 välillä 2,01 - 2,15, keskiarvo ± STD 2,10 ± 0,03), joten yhtään eläintä ei poistettu analyysistä. RNA säilytettiin -80 ◦C:ssa myöhempää RNA-sekvensointia varten.

4.6. RNA-sekvensointi, kartoitus ja kvantifiointi

Uutettu leukosyytti-RNA sekvensoitiin Illumina NextSeq 500 -alustalla, kuten aiemmin on kuvattu [68]. Lyhyesti, käyttämällä epMotion-nesteenkäsittelytyöasemaa (Eppendorf, Hampuri, Saksa) 750 ng kokonais-RNA:ta käänteistranskriptoitiin cDNA-sekvensointikirjastoihin Illumina TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Ribo-Zero Gold -pakkauksella (Illumina, San Diego, CA, USA) ). Yhdistetyt cDNA-kirjastot sekvensoitiin Illumina NextSeq 500 -sekvensoijalla 75 nukleotidin pituisilla yksipään lukemilla, jotta saavutettiin keskimäärin 33,5 miljoonaa lukua näytettä kohti. Raaka FASTQ-tiedostot talletettiin Euroopan nukleotidiarkistoon (E-MTAB-9347 ja E-MTAB-9431). Kaikki sekvensointianalyysit suoritettiin käyttämällä CLC Genomic Workbench v21:tä (Qiagen, Manchester, UK). Jokainen näyte sisälsi neljän kaistan lukemat, ja ne yhdistettiin yhdeksi fastq-tiedostoksi. Sekä raaka- että leikattujen fastq-tiedostojen laatu arvioitiin Illumina Pipeline 1.8:n jälkeen ja kaikki epäonnistuneet lukemat poistettiin. Lukemat kartoitettiin sitten referenssigenomiin Bos taurus -kokoonpanoon (ARS-UCD1.2, jonka tarjoaa RefSeq osoitteessa https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly, haettu 1. tammikuuta 2021) ja kvantifioitiin lukemina geeniä kohti, lukemia kilobase-miljoonaa kohti (RPKM) ja transkriptioita kiloemäsmiljoonaa kohti (TPM). Nämä tallennettiin geeniekspressiotiedostoina (GE) CLC Genomics Workbenchiin käytettäväksi seuraavassa differentiaalisen geeniekspression analyysissä.

4.7. Ruokavalioryhmien välisen differentiaalisen geeniekspression analyysi

Ennen ruokavaliovaikutuksen differentiaalista ilmentymisanalyysiä käytimme pääkomponenttianalyysiä (PCA) RPKM-arvojen kanssa poikkeamien tunnistamiseen, ja tämä osoitti, että kaksi lehmää (Blood020009, MP ja Blood020103, PP) olivat populaatiopoikkeavia. ja siksi ne jätettiin pois lisäanalyysistä (lisätiedosto S4A). Pääkomponenttianalyysi osoitti myös, että PP- ja MP-lehmien yleisessä geeniekspressiokuviossa oli vain rajallinen päällekkäisyys (lisätiedosto S2B). Tämä tuki alkuperäistä tutkimussuunnitelmaa kunkin ikäryhmän analysoimiseksi erikseen. Kaikista yksittäisistä näytteistä johdetut GE-tiedostot erotettiin siksi ikäryhmittäin (PP, n=5–6 ryhmää kohti ja MP, n=14–15 ryhmää kohti). PP- tai MP-lehmien ravintoryhmien väliset DEG-arvot tunnistettiin CLC Genomics Workbench V21:llä yksisuuntaisella ANOVA-kaltaisella menettelyllä. Useiden testien vääriä löytöjä (FDR) säädettiin Benjamini-Hochbergillä (BH) ja merkitsevyyden katsottiin olevan p < 0,05. Kertosuunnat (FC:t) laskettiin korkeamman konsentraattiryhmän geeniekspressiosuhteena alemman konsentraatin ryhmään (esim. HC vs. LC, MC vs. LC tai HC vs. MC), jos korkeamman konsentraattiryhmän arvo oli oli suurempi kuin alemman konsentraatin ryhmässä (positiivinen kertamuutos, noususäätely). Jos alemman konsentraatin ryhmän arvo oli suurempi kuin korkeamman konsentraattiryhmän, käytettiin alemman konsentraatin ryhmän suhdetta korkeampaan konsentraattiryhmään (esim. LC vs. HC, MC vs. HC ja LC vs. MC ) (negatiivinen laskosmuutos, alassäätö). Lisäanalyysiä varten valittiin DEG-arvot, jotka säädeltiin ylös- ja alaspäin absoluuttisella kertamuutoksella, joka oli suurempi tai yhtä suuri kuin 1,5 ruokavalioryhmien välillä.

4.8 Gene Ontology (GO) -rikastusanalyysi

Ruokavalioryhmien välisistä parivertailuista saadut DEG-arvot syötettiin Partek Genomics Suite V7.1:een (Partek Incorporation, Chesterfield, MO, USA) GO-rikastusanalyysiä varten DEG:iden ja niihin liittyvän Kioto Encyclopedia -tietosanakirjan biologisten toimintojen ja vuorovaikutusten tutkimiseksi. Geenit ja genomit (KEGG) -reitit Bos tauruksen ARS-UCD1.2 genomin kanssa. Käytettiin Fisherin tarkkaa testiä BH-säädöllä ja tilastollinen merkitsevyys otettiin huomioon p < 0,05.

4.9. Fenotyyppitietojen tilastollinen analyysi

Kaikista lehmistä saadut tiedot jaettiin ensin ikäryhmittäin (PP- ja MP-lehmät) tutkimussuunnitelman mukaan. DMI-, BW-, maitoparametrien, EBAL:n, BCS:n, kiertävien metaboliittien (glukoosi, urea, BHB, NEFA:t, kolesteroli ja IGF{0}}), SCC (logaritmisesti muunnettu) ja kohdun solujen määrät. ja niiden suhteet koottiin keskiarvona ± keskiarvon standardivirhe (SE). Tilastollista analyysiä käytettiin ruokavalioryhmien välisten erojen vertaamiseen käyttämällä yksisuuntaista ANOVAa, joka on rakennettu SPSS V28 -ohjelmistopakettiin (Chicago, IL, USA). Kunkin muuttujan varianssin homogeenisuus testattiin Levenen tilastoilla ennen ANOVAa. Tulokset osoittivat, että PP-lehmien ECM-, EBAL-, glukoosi-, urea-, BHB- ja IGF-1-ryhmien välistä homogeenisuutta ei saavutettu, joten näille muuttujille sovellettiin logaritmista muunnosa. Kun ANOVA osoitti merkitystä, suoritettiin useita vertailuja Fisherin LSD-menetelmään erojen syyn tunnistamiseksi. Koska maidon SCC:n ja kohdun sytologian tietojen varianssin homogeenisuutta ei voitu saavuttaa logaritmisen muunnoksen jälkeen, nämä muuttujat testattiin käyttämällä Kruskal-Wallis-yksisuuntaista ANOVAa Dunnin moninkertaisilla vertailuilla. Hedelmällisyystiedot testattiin Wilcoxon-menetelmällä. Kaikissa tapauksissa merkitsevyyden katsottiin olevan p < 0,05.

5. Johtopäätökset

Tämä tutkimus tukee aikaisempaa työtä, jossa osoitetaan selkeitä yhteyksiä varhaisen laktaation aikana olevien lehmien metabolisen tilan ja immuunitoiminnan välillä. Useimmat aiemmat tutkimukset, joiden tarkoituksena on parantaa synnytyksen jälkeistä terveyttä paremman ravitsemuksen avulla, ovat keskittyneet synnytystä edeltävään ajanjaksoon ja osoittaneet, että yliruokinta ja korkea BCS tällä hetkellä edistävät myöhempää lipidien mobilisaatiota ja lisääntynyttä tulehdusvastetta synnytyksen aikana [34]. Olemme sen sijaan arvioineet, onko mahdollista muuttaa immuunitoimintaa poikimisen jälkeen muuttamalla laktaatioruokavaliota. Havaitsimme, että vaste lisätiivisteelle, joka tarjosi ravinnon, joka oli muotoiltu vastaamaan eläimen energia- ja proteiinitarpeita, tuotti erilaisia ​​vaikutuksia leukosyyttitranskriptomiin MP- ja PP-lehmillä. MP-lehmillä HC-ruokavaliosta oli selkeästi hyötyä, koska LC-lehmän leukosyyteissä oli komplementti- ja hyytymiskaskadin säätely ja synnynnäiset immuunipuolustusmekanismit patogeeneja vastaan. Sitä vastoin HC-ruokavaliolla olevien PP-lehmien leukosyytit osoittivat suurempia immuuni-/tulehdusvasteita ja niillä oli korkeampi PMN:UEC-suhde, mikä viittaa lisääntyneeseen leukosyyttien migraatioon kohtuun. Näillä lehmillä oli myöhemmin pidempi poikimisaika hedelmöittymiseen, mikä osoitti heikompaa hedelmällisyyttä. Lisätyöskentely suurempien lehmämäärien kanssa on perusteltua, jotta voidaan vahvistaa havainnot ravinnon vaikutuksesta hedelmällisyyteen ja ymmärtää paremmin, kuinka synnytyksen jälkeisen ruokavalion metaboliset vasteet eroavat nuoremmilla eläimillä.

Viitteet

1. Mallard, BA; Dekkers, JC; Irlanti, MJ; Leslie, KE; Sharif, S.; Vankampen, CL; Wagter, L.; Wilkie, BN Muutos immuunivasteessa synnytyksen aikana ja sen vaikutus lypsylehmän ja vasikan terveyteen. J. Dairy Sei. 1998, 81, 585–595. [CrossRef] [PubMed]

2. Wathes, DC; Cheng, Z.; Chowdhury, W.; Fenwick, MA; Fitzpatrick, R.; Morris, DG; Patton, J.; Murphy, JJ Negatiivinen energiatasapaino muuttaa globaalia geeniekspressiota ja immuunivasteita synnytyksen jälkeisten lypsylehmien kohdussa. Physiol. Genom. 2009, 39, 1–13. [CrossRef]

3. Ingvartsen, KL; Moyes, K. Maitokarjan ravitsemus, immuunitoiminta ja terveys. Animal 2013, 7 (liite 1), 112–122. [CrossRef] [PubMed]

4. Kehrli, ME, Jr.; Nonnecke, BJ; Roth, JA Muutokset naudan neutrofiilien toiminnassa synnytyksen aikana. Olen. J. Vet. Res. 1989, 50, 207–214. [PubMed]

5. Ster, C.; Loiselle, MC; Lacasse, P. Poikimisen jälkeisen seerumin esteröimättömien rasvahappojen pitoisuuden vaikutus naudan immuunisolujen toiminnallisuuteen. J. Dairy Sei. 2012, 95, 708–717. [CrossRef] [PubMed]

6. Lacetera, N.; Scalia, D.; Bernabucci, U.; Ronchi, B.; Pirazzi, D.; Nardone, A. Lymfosyyttien toiminta ylikunnostetuilla lehmillä synnytyksen aikana. J. Dairy Sei. 2005, 88, 2010–2016. [CrossRef] [PubMed]

7. Nonnecke, BJ; Kimura, K.; Goff, JP; Kehrli, ME, Jr. Maitorauhasen vaikutukset syntymäaikaisten lehmien veren mononukleaaristen leukosyyttipopulaatioiden toimintakykyyn. J. Dairy Sei. 2003, 86, 2359–2368. [CrossRef]

8. Habel, J.; Sundrum, A. Epäsopivuus glukoosin allokaatiossa eri elämäntoimintojen välillä lypsylehmien siirtymäkaudella. Eläimet 2020, 10, 1028. [CrossRef]

9. Horst, EA; Kvidera, SK; Baumgard, LH Kutsuttu katsaus: Immuuniaktivaation vaikutus siirtymälehmän terveyteen ja suorituskykyyn - Kriittinen arvio perinteisistä dogmeista. J. Dairy Sei. 2021, 104, 8380–8410. [CrossRef]

10. Wathes, DC; Becker, F.; Buggiotti, L.; Crowe, MA; Ferris, C.; Foldager, L.; Grelet, C.; Hostens, M.; Ingvartsen, KL; Marchitelli, C.; et ai. Verenkierron IGF-1-pitoisuuksien, sairauden tilan ja leukosyyttitranskription väliset yhteydet varhaisen laktaation lypsylehmien välillä. Märehtijät 2021, 1, 147–177. [CrossRef]

11. Dimeloe, S.; Burgener, AV; Grahlert, J.; Hess, C. T-solujen aineenvaihdunta, joka ohjaa aktivaatiota, proliferaatiota ja erilaistumista; modulaarinen näkymä. Immunology 2017, 150, 35–44. [CrossRef] [PubMed]

12. Loftus, RM; Finlay, DK Immunometabolismi: Solujen aineenvaihdunta muuttaa immuunivasteen säätelijäksi. J. Biol. Chem. 2016, 291, 1–10. [CrossRef] [PubMed]

13. Bauman, DE; Currie, WB Ravinteiden jakautuminen raskauden ja imetyksen aikana: Katsaus homeostaasiin ja homeoreesiin liittyvistä mekanismeista. J. Dairy Sei. 1980, 63, 1514–1529. [CrossRef] [PubMed]

14. Drackley, JK ADSA Foundation Scholar Award. Lypsylehmien biologia siirtymäkauden aikana: viimeinen raja? J. Dairy Sei. 1999, 82, 2259–2273. [CrossRef] [PubMed]

15. Jabbour, HN; Myynti, KJ; Catalano, RD; Norman, JE Tulehdukselliset reitit naisten lisääntymisterveydessä ja -sairauksissa. Reproduction 2009, 138, 903–919. [CrossRef]

16. Pascottini, OB; LeBlanc, SJ Immuunitoiminnan modulaatio naudan kohdun peripartumissa. Theriogenology 2020, 150, 193–200. [CrossRef]

17. Sheldon, IM; Lewis, GS; LeBlanc, S.; Gilbert, RO Nautakarjan synnytyksen jälkeisen kohdun taudin määrittely. Theriogenology 2006, 65, 1516–1530. [CrossRef]

18. Kuhla, B. Katsaus: Pro-inflammatoriset sytokiinit ja hypotalamuksen tulehdus: Vaikutukset siirtymävaiheen lypsylehmien riittämättömään rehun saantiin. Eläin 2020, 14, s65–s77. [CrossRef]

19. Ingvartsen, KL; Moyes, KM Lypsylehmän immunosuppressioon vaikuttavia tekijöitä synnytyksen aikana. Jpn. J. Vet. Res. 2015, 63 (lisäosa 1), S15–S24.

20. Wathes, DC; Cheng, Z.; Salavati, M.; Buggiotti, L.; Takeda, H.; Tang, L.; Becker, F.; Ingvartsen, KI; Ferris, C.; Hostens, M.; et ai. Lypsylehmien maksan ja leukosyyttien aineenvaihduntaprofiilien ja geeniekspression väliset suhteet alkulaktaation aikana. J. Dairy Sei. 2021, 104, 3596–3616. [CrossRef]

21. Pinedo, P.; Melendez, P. Lypsylehmien metaboliseen epätasapainoon liittyvät maksahäiriöt. Vet. Clin. N. Am. Ruoka Anim. Harjoittele. 2022, 38, 433–446. [CrossRef] [PubMed]

22. Fenwick, MA; Fitzpatrick, R.; Kenny, DA; Diskin, MG; Patton, J.; Murphy, JJ; Wathes, DC Negatiivisen energiatasapainon (NEB) ja IGF-säätelyn väliset suhteet lypsävien lypsylehmien maksassa. Kotimainen. Anim. Endokrinol. 2008, 34, 31–44. [CrossRef] [PubMed]

23. Kobayashi, Y.; Boyd, CK; Bracken, CJ; Lamberson, WR; Keisler, DH; Lucy, MC Vähentynyt kasvuhormonireseptorin (GHR) lähettiribonukleiinihappo synnytyksen jälkeisen nautakarjan maksassa johtuu GHR 1A:n spesifisestä laskusäätelystä, joka liittyy insuliinin kaltaisen kasvutekijä I:n vähenemiseen. Endocrinology 1999, 140, 3947–3954. [CrossRef]

24. Kvidera, SK; Horst, EA; Abuajamieh, M.; Mayorga, EJ; Fernandez, MV; Baumgard, LH Aktivoidun immuunijärjestelmän glukoositarpeet imettävillä holstein-lehmillä. J. Dairy Sei. 2017, 100, 2360–2374. [CrossRef] [PubMed]

25. Cheng, Z.; Wylie, A.; Ferris, C.; Ingvartsen, KL; Wathes, DC; Gplus, EC Ruokavalion ja esteröimättömien rasvahappotasojen vaikutus globaaleihin transkriptomisiin profiileihin kiertävien perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa varhaisen laktaation lypsylehmien lypsylehmistä. J. Dairy Sei. 2021, 104, 10059–10075. [CrossRef]

26. Wathes, DC; Fenwick, M.; Cheng, Z.; Bourne, N.; Llewellyn, S.; Morris, DG; Kenny, D.; Murphy, J.; Fitzpatrick, R. Negatiivisen energiatasapainon vaikutus korkeatuottoisen lypsylehmän syklisyyteen ja hedelmällisyyteen. Theriogenology 2007, 68 (liite 1), S232–S241. [CrossRef]

27. Santos, JE; Bisinotto, RS; Ribeiro, ES Anovulaaristen lypsylehmien hedelmällisyyden laskun taustalla olevat mekanismit. Theriogenology 2016, 86, 254–262. [CrossRef]

28. Pascottini, OB; Leroy, J.; Opsomer, G. Sopeutuminen siirtymäkauteen ja seuraukset lypsylehmien hedelmällisyyteen. Reprod. Dom. Anim. 2022, 57 (liite 4), 21–32. [CrossRef]

29. Leroy, JL; Valckx, SD; Jordaens, L.; De Bie, J.; Desmet, KL; Van Hoeck, V.; Britt, JH; Marei, WF; Bols, PE Ravitsemus ja äidin aineenvaihduntaterveys suhteessa munasolujen ja alkioiden laatuun: Kriittisiä näkemyksiä siitä, mitä opimme lypsylehmämallista. Reprod. Hedelmällinen. Dev. 2015, 27, 693–703. [CrossRef]

30. Coffey, MP; Hickey, J.; Brotherstone, S. Holstein-friisiläisten lypsylehmien kasvun geneettiset näkökohdat syntymästä kypsyyteen. J. Dairy Sei. 2006, 89, 322–329. [CrossRef]

31. Wathes, DC; Cheng, Z.; Bourne, N.; Taylor, VJ; Kahvi, MP; Brotherstone, S. Erot alkusyntyneiden ja moniparisten lypsylehmien välillä aineenvaihdunnan ominaisuuksien, maidontuotannon ja kehon kuntopisteiden välisissä suhteissa synnytyksen jälkeisellä kaudella. Kotimainen. Anim. Endokrinol. 2007, 33, 203–225. [CrossRef] [PubMed]

32. Pikku, MW; Wylie, ARG; O'Connell, NE; Welsh, MD; Grelet, C.; Bell, MJ; Gordon, A.; Ferris, CP Heinän säilörehupohjaisessa ruohorehupohjaisessa ruokavaliossa tiivistepitoisuuden muuttamisen immunologiset vaikutukset varhaisen laktaation holstein-friisiläisille lehmille. Eläin 2019, 13, 799–809. [CrossRef] [PubMed]

33. Buggiotti, L.; Cheng, Z.; Salavati, M.; Kellot, CD-levyt; Genotype plus Environment, C. Transkriptomin vertailu kiertävien leukosyyttien varhaisessa laktaatiossa alku- ja monisikijöillä lehmien välillä tarjoaa todisteita ikään liittyvistä muutoksista. BMC Genom. 2021, 22, 693. [CrossRef] [PubMed]

34. Cardoso, FC; Kalscheur, KF; Drackley, JK Symposium-katsaus: Ravitsemusstrategiat terveyden, tuotannon ja hedelmällisyyden parantamiseksi siirtymäkauden aikana. J. Dairy Sei. 2020, 103, 5684–5693. [CrossRef] [PubMed]

35. Ingvartsen, KL Ruokintaan ja hoitoon liittyvät sairaudet siirtymälehmässä. Anim. Feed Sci. Technol. 2006, 126, 175–213. [CrossRef]

36. Ferris, CP; Gordon, FJ; Patterson, DC; Mayne, CS; McCoy, MA Lyhytaikainen vertailu neljän niittypohjaisen maidontuotantojärjestelmän suorituskyvystä syksyllä poikiville lypsylehmille. Grass Forage Sci. 2003, 58, 8. [CrossRef]

37. Taylor, VJ; Cheng, Z.; Pushpakumara, PG; Beever, DE; Wathes, DC Suhteet insuliinin kaltaisen kasvutekijä I:n plasmapitoisuuksien välillä lypsylehmillä ja niiden hedelmällisyydellä ja maitotuotolla. Vet. Rec. 2004, 155, 583–588. [CrossRef]

38. LeBlanc, SJ Aineenvaihdunnan, tulehduksen ja lisääntymisterveyden vuorovaikutus lypsykarjan synnytyksen jälkeisellä kaudella. Reprod. Domc. Anim. 2012, 47 (liite 5), 18–30. [CrossRef]

39. Vailati-Riboni, M.; Kanwal, M.; Bulgari, O.; Meier, S.; Priest, NV; Burke, CR; Kay, JK; McDougall, S.; Mitchell, MD; Walker, CG; et ai. Kehon kuntopisteet ja ravinnon taso ennen synnytystä vaikuttavat laiduntavien lypsylehmien aineenvaihdunnan ja tulehduksen rasvakudoksen transkription säätelijöihin siirtymäkauden aikana. J. Dairy Sei. 2016, 99, 758–770. [CrossRef]

40. Trevisi, E.; Minuti, A. Synnynnäisen immuunivasteen arviointi synnytystä edeltävällä lehmällä. Res. Vet. Sci. 2018, 116, 47–54. [CrossRef]

41. Druker, SA; Sicsic, R.; van Straten, M.; Goshen, T.; Kedmi, M.; Raz, T. Sytologinen endometriitin diagnoosi primiporous vs. multiparous lypsylehmiä. J. Dairy Sei. 2022, 105, 665–683. [CrossRef] [PubMed]

42. Hamzeh-Cognasse, H.; Laradi, S.; Osselaer, JC; Cognasse, F.; Garraud, O. Amotosalen-HCl-UVA-patogeenin vähentäminen ei muuta liukoisen CD40-ligandin, Ox40-ligandin ja interkeukiinin-27 varastoinnin jälkeistä metaboliaa. Sytokiinit liittyvät yleensä vakaviin haittatapahtumiin. Vox Sang. 2015, 108, 205–207. [CrossRef] [PubMed]

43. de Greeff, A.; Zadoks, R.; Ruuls, L.; Toussaint, M.; Nguyen, TK; Downing, A.; Rebel, J.; Stockhofe-Zurwieden, N.; Smith, H. Varhainen isännän vaste maitorauhasessa kokeellisen Streptococcus uberis -haasteen jälkeen hiehoilla. J. Dairy Sei. 2013, 96, 3723–3736. [CrossRef] [PubMed]

44. Cheng, Z.; Chauhan, L.; Barry, AT; Abudureyimu, A.; Oguejiofor, CF; Chen, X.; Wathes, DC Akuutti naudan virusripulivirusinfektio estää interferoni taun stimuloimien geenien ilmentymistä naudan endometriumissa. Biol. Reprod. 2017, 96, 1142–1153. [CrossRef]

45. Schoggins, JW Interferonistimuloidut geenit: mitä ne kaikki tekevät? Annu. Pastori Virol. 2019, 6, 567–584. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Ohto, U. Rakennebiologiaan perustuvien NOD-tyyppisten reseptorien aktivointi- ja säätelymekanismit. Edessä. Immunol. 2022, 13, 953530. [CrossRef]

47. Cheng, Z.; Palma-Vera, S.; Buggiotti, L.; Salavati, M.; Becker, F.; Werling, D.; Wathes, DC; Gplus, EC Verenkierron leukosyyttien transkriptominen analyysi, joka on saatu toipumisen aikana Escherichia colin aiheuttamasta kliinisestä utaretulehduksesta Holstein-lypsylehmillä. Eläimet 2022, 12, 2146. [CrossRef]

48. Loria, V.; Dato, I.; Graziani, F.; Biasucci, LM Myeloperoksidaasi: Uusi tulehduksen biomarkkeri iskeemisessä sydänsairaudessa ja akuutissa sepelvaltimotaudissa. Mediat. Inflamm. 2008, 2008, 135625. [CrossRef]

49. Olivera, A.; Beaven, MA; Metcalfe, DD Mastsolut viestivät merkityksestään terveydelle ja sairauksille. J. Allergy Clin. Immunol. 2018, 142, 381–393. [CrossRef]

50. Dickinson, SE; Griffin, BA; Elmore, MF; Kriese-Anderson, L.; Elmore, JB; Dyce, PW; Rodning, SP; Biase, FH Transkriptomiprofiilit ääreisveren valkosoluissa keinosiemennyshetkellä erottavat naudan hiehot, joilla on erilainen hedelmällisyyspotentiaali. BMC Genom. 2018, 19, 129. [CrossRef]

51. Van Meulder, F.; Van Coppernolle, S.; Borloo, J.; Rinaldi, M.; Li, RW; Chiers, K.; Van den Broeck, W.; Vercruysse, J.; Claerebout, E.; Geldhof, P. Granulysiinin ja grantsyymi B:n raeeksosytoosi mahdollisena avainmekanismina rokotteen aiheuttamassa immuniteetissa karjassa Ostertagia ostertagi -sukkulamadoa vastaan. Tartuttaa. Immun. 2013, 81, 1798–1809. [CrossRef] [PubMed]

52. Taylor, JL; Brown, BL Rakenteellinen perusta aminolevuliinihapposyntaasin säätelyhäiriöille ihmisen taudeissa. J. Biol. Chem. 2022, 298, 101643. [CrossRef] [PubMed]

53. Trapani, JA; Sutton, VR Granzyme B: Pro-apoptoottiset, antiviraaliset ja kasvainten vastaiset toiminnot. Curr. Opin. Immunol. 2003, 15, 533–543. [CrossRef] [PubMed]

54. Campanile, G.; Baruselli, PS; Limone, A.; D'Occhio, MJ Sytokiinien ja immuunisolujen paikallinen toiminta konseptuksen ja kohdun välisessä viestinnässä alkion varhaisen kehityksen, kiinnittymisen ja istutuksen kriittisenä aikana – Vaikutukset alkion eloonjäämiseen nautakarjassa: Katsaus. Theriogenology 2021, 167, 1–12. [CrossRef] [PubMed]

55. Bougarne, N.; Weyers, B.; Desmet, SJ; Deckers, J.; Ray, DW; Staels, B.; De Bosscher, K. PPARalfan molekyylivaikutukset lipidiaineenvaihdunnassa ja tulehduksessa. Endocr. Rev. 2018, 39, 760–802. [CrossRef]

56. Sobolev, VV; Tchepourina, E.; Korsunskaya, IM; Geppe, NA; Chebysheva, SN; Soboleva, AG; Mezentsev, A. Transkriptiotekijä PPAR-gamman rooli psoriaasin, ihosolujen ja immuunisolujen patogeneesissä. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 9708. [CrossRef]

57. Song, S.; Attia, RR; Connaughton, S.; Niesen, MI; Ness, GC; Elam, MB; Hori, RT; Cook, GA; Park, EA Peroksisomiproliferaattorilla aktivoitu reseptori alfa (PPARalpha) ja PPAR-gamma-koaktivaattori (PGC-1alpha) indusoivat karnitiinipalmitoyylitransferaasi IA:ta (CPT-1A) itsenäisten geenielementtien kautta. Mol. Cell. Endokrinol. 2010, 325, 54–63. [CrossRef]

58. Ziouzenkova, O.; Plutzky, J. Retinoidiaineenvaihdunta ja tumareseptorivasteet: Uusia näkemyksiä PPAR-RXR-kompleksin koordinoituun säätelyyn. FEBS Lett. 2008, 582, 32–38. [CrossRef]

59. Espenshade, PJ; Hughes, AL Sterolisynteesin säätely eukaryooteissa. Annu. Rev. Genet. 2007, 41, 401–427. [CrossRef]

60. Van Meer, G.; Voelker, DR; Feigenson, GW Membraan lipidit: missä ne ovat ja miten ne käyttäytyvät. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2008, 9, 112–124. [CrossRef]

61. Aguilar-Ballester, M.; Herrero-Cervera, A.; Vinue, A.; Martinez-Hervas, S.; Gonzalez-Navarro, H. Kolesterolin aineenvaihdunnan vaikutus immuunisolujen toimintaan ja ateroskleroosiin. Nutrients 2020, 12, 2021. [CrossRef] [PubMed]

62. Mamedova, LK; Yuan, K.; Laudick, AN; Fleming, SD; Mashek, DG; Bradford, BJ Toll-tyyppinen reseptori 4 signalointia tarvitaan glukoneogeenisen geenin ilmentymisen indusoimiseksi palmitaatilla ihmisen maksakarsinoomasoluissa. J. Nutr. Biochem. 2013, 24, 1499–1507. [CrossRef] [PubMed]

63. Soto-Heredero, G.; Gomez de Las Heras, MM; Gabande-Rodriguez, E.; Oller, J.; Mittelbrunn, M. Glykolyysi-Avaintekijä tulehdusvasteessa. FEBS J. 2020, 287, 3350–3369. [CrossRef] [PubMed]

64. Kominsky, DJ; Campbell, EL; Colgan, SP Metaboliset muutokset immuniteetissa ja tulehduksissa. J. Immunol. 2010, 184, 4062–4068. [CrossRef]

65. Afacan, NJ; Yeung, AT; Pena, OM; Hancock, RE Isännän puolustuspeptidien terapeuttinen potentiaali antibioottiresistenteissä infektioissa. Curr. Pharm. Des. 2012, 18, 807–819. [CrossRef]

66. Auvynet, C.; Rosenstein, Y. Monitoimiset isäntäpuolustuspeptidit: Antimikrobiset peptidit, pienet mutta suuret toimijat synnynnäisessä ja mukautuvassa immuniteetissa. FEBS J. 2009, 276, 6497–6508. [CrossRef]

67. Hilchie, AL; Wuerth, K.; Hancock, RE Immuunimodulaatio monitahoisilla kationisilla isäntäpuolustuksilla (antimikrobisilla) peptideillä. Nat. Chem. Biol. 2013, 9, 761–768. [CrossRef]

68. Cheng, Z.; Buggiotti, L.; Salavati, M.; Marchitelli, C.; Palma-Vera, S.; Wylie, A.; Takeda, H.; Tang, L.; Crowe, MA; Wathes, DC; et ai. Verenkierrossa olevien leukosyyttien globaalit transkriptominen profiilit varhaisen laktaation lehmillä, joilla on kliininen tai subkliininen utaretulehdus. Mol. Biol. Tasavalta 2021, 48, 4611–4623. [CrossRef]

69. Foley, C.; Chapwanya, A.; Callanan, JJ; Whiston, R.; Miranda-CasoLuengo, R.; Lu, J.; Meijer, WG; Lynn, DJ; O'Farrelly, C.; Meade, KG Integroitu analyysi paikallisista ja systeemisistä muutoksista, jotka edeltävät synnytyksen jälkeisen sytologisen endometriitin kehittymistä. BMC Genom. 2015, 16, 811. [CrossRef]

70. Machado, VS; Silva, TH Mukautuva immuniteetti synnytyksen jälkeisessä kohdussa: Rokotteiden mahdollinen käyttö metriitin hallinnassa. Theriogenology 2020, 150, 201–209. [CrossRef]

71. Ley, K.; Hoffman, HM; Kubes, P.; Cassatella, MA; Zychlinsky, A.; Hedrick, CC; Catz, SD Neutrophils: Uusia oivalluksia ja avoimia kysymyksiä. Sci. Immunol. 2018, 3, eaat4579. [CrossRef] [PubMed]

72. Wahl, SM; Feldman, GM; McCarthy, JB Leukosyyttien adheesion ja signaloinnin säätely tulehduksissa ja sairauksissa. J. Leukoc. Biol. 1996, 59, 789-796. [CrossRef] [PubMed]

73. Schubert, K.; Polte, T.; Bonisch, U.; Schader, S.; Holtappels, R.; Hildebrandt, G.; Lehmann, J.; Simon, JC; Anderegg, U.; Saalbach, A. Thy-1 (CD90) säätelee leukosyyttien ekstravasaatiota tulehduksen aikana. euroa J. Immunol. 2011, 41, 645–656. [CrossRef] [PubMed]

74. Dreymueller, D.; Pruessmeyer, J.; Schumacher, J.; Fellendorf, S.; Hess, FM; Seifert, A.; Babendreyer, A.; Bartsch, JW; Ludwig, A. Metalloproteinaasi ADAM8 edistää leukosyyttien kerääntymistä in vitro ja akuutissa keuhkotulehduksessa. Olen. J. Physiol. Keuhkosolu. Mol. Physiol. 2017, 313, L602–L614. [CrossRef]

75. Kostelnik, KB; Barker, A.; Schultz, C.; Mitchell, TP; Rajeeve, V.; valkoinen, IJ; Aurrand-Lions, M.; Nourshargh, S.; Cutillas, P.; Nightingale, TD JAM-C:n dynaaminen salakuljetus ja vaihtuvuus on välttämätöntä endoteelisolujen migraatiolle. PLoS Biol. 2019, 17, e3000554. [CrossRef] [PubMed]

76. Stillie, R.; Farooq, SM; Gordon, JR; Stadnyk, AW Toiminnallinen merkitys kahden IL-8-reseptorityypin ilmentämisessä PMN:ssä. J. Leukoc. Biol. 2009, 86, 529–543. [CrossRef]

77. Bouton, AH; Riggins, RB; Bruce-Staskal, PJ Adapteriproteiinin Cas toiminnot: Signaalin konvergenssi ja soluvasteiden määrittäminen. Oncogene 2001, 20, 6448–6458. [CrossRef]

78. Chen, X.; Cheng, Z.; Zhang, S.; Werling, D.; Wathes, DC Yhdistämällä genomin laajuiset assosiaatiotutkimukset ja differentiaaliset geeniekspressiotietoanalyysit tunnistavat ehdokasgeenit, jotka vaikuttavat kahden eri patogeenin aiheuttamaan utaretulehdukseen lypsylehmässä. Avaa J. Anim. Sci. 2015, 5, 358–393. [CrossRef]

79. Chang, GW; Hsiao, CC; Peng, YM; Vieira Braga, FA; Kragten, NA; Remmerswaal, EB; van de Garde, MD; Straussberg, R.; Konig, GM; Kostenis, E.; et ai. Adheesio-G-proteiiniin kytketty reseptori GPR56/ADGRG1 on inhiboiva reseptori ihmisen NK-soluissa. Cell. Rep. 2016, 15, 1757–1770. [CrossRef]

80. Bi, J.; Tian, ​​Z. NK-solujen toimintahäiriö ja tarkistuspiste-immunoterapia. Edessä. Immunol. 2019, 10, 1999. [CrossRef]

81. Minuti, A.; Gallo, A.; Lopreiato, V.; Bruschi, S.; Piccioli-Cappelli, F.; Uboldi, O.; Trevisi, E. Poikuekoon vaikutus prepartum metaboliseen ja aminohappoprofiiliin kaniinissa. Eläin 2020, 14, 2109–2115. [CrossRef] [PubMed]

82. Crookenden, MA; Moyes, KM; Kuhn-Sherlock, B.; Lehnert, K.; Walker, CG; Loor, JJ; Mitchell, MD; Murray, A.; Dukkipati, VSR; Vailati-Riboni, M.; et ai. Verenkierron neutrofiilien transkriptominen analyysi metabolisesti stressaantuneilla laiduntavilla laidunlehmillä. J. Dairy Sei. 2019, 102, 7408–7420. [CrossRef] [PubMed]

83. Sharma, JN; Al-Omran, A.; Parvathy, SS Typpioksidin rooli tulehdussairauksissa. Inflammopharmacology 2007, 15, 252–259. [CrossRef] [PubMed]

84. Martino, MR; Gutierrez-Aguilar, M.; Yiew, NKH; Lutkewitte, AJ; Laulaja, JM; McCommis, KS; Ferguson, D.; Liss, KHH; Yoshino, J.; Renkemeyer, MK; et ai. Alaniinitransaminaasi 2:n vaimentaminen diabeettisessa maksassa heikentää hyperglykemiaa vähentämällä aminohappojen glukoneogeneesiä. Cell Rep. 2022, 39, 110733. [CrossRef] [PubMed]

85. Tall, AR; Yvan-Charvet, L. Kolesteroli, tulehdus ja synnynnäinen immuniteetti. Nat. Rev. Immunol. 2015, 15, 104–116. [CrossRef]

86. Wathes, D.; Cheng, Z.; Mareiy, W.; Fouladi-Nasht, A. Monityydyttymättömät rasvahapot ja hedelmällisyys naarasnisäkkäillä: Päivitys. CABI Rev. 2013, 8, 1–14. [CrossRef]

87. Alipour, A.; van Oostrom, AJ; Izraeljan, A.; Verseyden, C.; Collins, JM; Frayn, KN; Plokker, TW; Elte, JW; Castro Cabezas, M. Leukosyyttien aktivaatio triglyseridirikkailla lipoproteiineilla. Valtimotauti. Thromb. Vasc. Biol. 2008, 28, 792–797. [CrossRef]

88. Castoldi, A.; Monteiro, LB; van Teijlingen Bakker, N.; Sanin, DE; Rana, N.; Corrado, M.; Cameron, AM; Hassler, F.; Matsushita, M.; Caputa, G.; et ai. Triasyyliglyserolin synteesi tehostaa makrofagien tulehdustoimintoa. Nat. Commun. 2020, 11, 4107. [CrossRef]

89. Bell, AW Orgaanisen ravinneaineenvaihdunnan säätely siirtymisen aikana myöhäisestä raskaudesta varhaiseen imetykseen. J. Anim. Sci. 1995, 73, 2804–2819. [CrossRef]

90. Moore, DAPSU; Varga, G. BUN ja MUN: Urea typen testaus lypsykarjassa. Compendium 1996, 18, 712–720.

91. Wathes, DC; Bourne, N.; Cheng, Z.; Mann, GE; Taylor, VJ; Coffey, MP Monien aineenvaihdunta- ja endokriinisten profiilien korrelaatioanalyysit hedelmällisyyden kanssa alku- ja monisikijöillä. J. Dairy Sei. 2007, 90, 1310–1325. [CrossRef] [PubMed]

92. Abe, R.; Donnelly, SC; Peng, T.; Bucala, R.; Metz, CN Perifeerisen veren fibrosyytit: Erilaistumisreitti ja migraatio haavakohtiin. J. Immunol. 2001, 166, 7556–7562. [CrossRef] [PubMed]

93. Schreier, S.; Triampo, W. Veressä kiertävä harvinaisten solujen populaatio. Mikä se on ja mihin se sopii? Cells 2020, 9, 790. [CrossRef] [PubMed]

94. Lynn, AK; Yannas, IV; Bonfield, W. Kollageenin antigeenisyys ja immunogeenisyys. J. Biomed. Mater. Res. 2004, 71, 343–354. [CrossRef]

95. Roche, JR; Burke, CR; Crookenden, MA; Heiser, A.; Loor, JL; Meier, S.; Mitchell, MD; Phyn, CVC; Turner, SA Hedelmällisyys ja siirtymälypsylehmä. Reprod. Hedelmällinen. Dev. 2017, 30, 85–100. [CrossRef]

96. Galvao, KN; Flaminio, MJ; Brittin, SB; Sper, R.; Fraga, M.; Caixeta, L.; Ricci, A.; Vartija, CL; Butler, WR; Gilbert, RO Kohdun sairauden ja neutrofiilien ja systeemisen energiatilan indikaattoreiden välinen yhteys imettävillä holstein-lehmillä. J. Dairy Sei. 2010, 93, 2926–2937. [CrossRef]

97. Dahl, MO; Maunsell, FP; De Vries, A.; Galvao, KN; Risco, CA; Hernandez, JA Todisteet siitä, että utaretulehdus voi aiheuttaa tiineyden menetyksen lypsylehmillä: Systemaattinen katsaus havainnointitutkimuksiin. J. Dairy Sei. 2017, 100, 8322–8329. [CrossRef]

98. Hansen, PJ; Soto, P.; Natzke, RP Mastiitti ja nautakarjan hedelmällisyys - mahdollinen tulehduksen tai immuuniaktivaation osallisuus alkiokuolleisuuteen. Olen. J. Reprod. Immunol. 2004, 51, 294–301. [CrossRef]

99. Malinowski, E.; Gajewski, Z. Mastiitti ja hedelmällisyyshäiriöt lehmillä. Pol. J. Vet. Sci. 2010, 13, 555–560.

100. Edmonson, AJ; Lean, IJ; Weaver, LD; Farver, T.; Webster, GA Holsteinin lypsylehmien ruumiinkunnon pisteytyskaavio. J. Dairy Sei. 1989, 72, 11. [CrossRef]

101. Larsen, T.; Rontved, CM; Ingvartsen, KL; Vels, L.; Bjerring, M. Entsyymiaktiivisuus ja akuutin vaiheen proteiinit maidossa, joita käytettiin akuutin kliinisen E. coli LPS:n aiheuttaman utaretulehduksen indikaattoreina. Animal 2010, 4, 1672–1679. [CrossRef] [PubMed]

102. Krogh, MA; Hostens, M.; Salavati, M.; Grelet, C.; Sorensen, MT; Wathes, DC; Ferris, CP; Marchitelli, C.; Signorelli, F.; Napolitano, F.; et ai. Holstein-lehmien veren ja maidon biomarkkereiden välinen ja lauman sisäinen vaihtelu alkulaktaation aikana. Animal 2020, 14, 1067–1075. [CrossRef] [PubMed]

103. Buggiotti, L.; Cheng, Z.; Wathes, DC; Gplus, EC Naudan RNA-Seq-tietojen kartoittamattomien lukemien louhinta paljastaa naudan herpesviruksen-6 esiintyvyyden eurooppalaisissa lypsylehmissä ja siihen liittyvät muutokset niiden fenotyypissä ja leukosyyttitranskriptomissa. Virukset 2020, 12, 1451. [CrossRef] [PubMed]

104. Beltman, ME; Forde, N.; Furney, P.; Carter, F.; Roche, JF; Lonergan, P.; Crowe, MA Kohdun limakalvon geenin ilmentymisen ja aineenvaihduntaparametrien karakterisointi naudan hiehoilla, jotka tuottavat elinkelpoisia tai elottomattomia alkioita 7. päivänä keinosiemennyksen jälkeen. Reprod. Hedelmällinen. Dev. 2010, 22, 987–999. [CrossRef] [PubMed]