Ennusta LncRNA:n rooli munuaisten ikääntymisessä RNA-sekvensoinnin perusteella Ⅱ

LncRNA Gm43360:n ja sen mahdollisten kohde-mRNA:iden korrelaatio

LncRNA Gm43360 valittiin tutkimukseen, koska se yhdisti kaksi lncRNA-mRNA-koekspressioverkkoa. Adra1a:n ekspressiotaso korreloi positiivisesti (rho=0.8650, p=0.026) Gm43360:n kanssa, Csnk1a1 (kaseiinikinaasi 1A1) korreloi negatiivisesti (rho{{12). }}.8084, p=0.0084) (kuva 5a). Tässä tutkimuksessa suunniteltiin lncRNA Gm43360:n yliekspressioplasmidi lncRNA Gm43360:n ja sen mahdollisten kohde-mRNA:iden Adra1a:n ja Csnk1a1:n korrelaation vahvistamiseksi edelleen. Csnk1a1:n ilmentyminen väheni odotetusti, ja myös Adra1a:n ilmentyminen väheni, mutta ei merkittävästi. Seuraavaksi pudotimme lncRNA Gm43360:n siRNA:lla havaitaksemme, vaikuttiko sen kohde-mRNA:iden ilmentyminen. Kuten odotettiin, Csnk1a1 lisääntyi lncRNA Gm43360 knockdown -soluissa verrattuna siRNA-negatiiviseen kontrolliryhmään (kuvio 5b). Kymmenen, havaitsimme lncRNA Gm43360:n roolin solusyklissä. Solulaskentasarjan-8 (CCK-8) tulokset osoittivat, että lncRNA Gm43360 lisäsi solujen elinkelpoisuutta (kuvio 5c). Tulokset osoittivat, että lncRNA Gm43360 lisäsi S-vaiheen solujen prosenttiosuutta ja vähensi G1-vaiheen solujen prosenttiosuutta negatiiviseen kontrolliin verrattuna (kuvio 5d). Te p53- ja p21-proteiinit osallistuivat solusyklin säätelyyn ja olivat siten solujen ikääntymisen merkkejä. P53:n ja p21:n ilmentymistasot alenivat merkittävästi yli-ilmentyneessä ryhmässä verrattuna kontrolliryhmään. p53:n ja p21:n ilmentymistasot kasvoivat merkittävästi siRNA-ryhmässä verrattuna siRNA-kontrolliryhmään (kuvio 5e). LncRNA Gm43360:n yli-ilmentyminen vähensi SA- -gal-positiivisten solujen määrää, ja -gal-positiivisten solujen määrä lisääntyi transfektoituneen Gm43360:n ryhmässä (kuvio 5f). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että lncRNA Gm43360 esti munuaisten tubulusepiteelisolujen vanhenemistaestävät Csnk1a1:n ilmentymisen.

NAPSAUTA TÄSTÄ SAADAksesi LUONNOLLISTA ORGAANIISTA KISTANKSIUUTEtta, JOKA SISÄLTÄ 25 % KINAKOOSIDEA JA 9 % AKTEOSIDIA MUUNAISTEN TOIMINTAAN

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa arvioimme nuorten ja vanhojen hiiren munuaisten mRNA-ilmentymistietoja ja suoritimme biotietoanalyysejä, jotka paljastivat poikkeavasti ilmentyneiden mRNA:iden toiminnot. Havaitsimme 347 ylössäädeltyä mRNA:ta ja 355 alasäädeltyä mRNA:ta sekä 130 ylössäädeltyä lncRNA:ta ja 91 alassäänneltyä lncRNA:tavanhat hiiren munuaiset verrattuna nuorten hiiren munuaisiin. Lisäksi näiden mRNA:iden osoitettiin osallistuvan ikääntymiseen liittyviin reitteihin, kutenoksidatiivinen fosforylaatio, AMPK-signalointireitti, Wnt-signalointireitti, Rap1-signalointireitti ja ikään liittyvä sairaus, jotka osoittivat differentiaalisesti ekspressoituneiden mRNA:iden toiminnot munuaisten ikääntymisen patogeneesissä.

Pitkä ei-koodaava RNA NEAT1 on suojaava tekijä munuaisfibroosin etenemisessä munuaisten tubulusepiteelisoluissa [21]. Sattumalta sekvensointituloksissamme lncRNA NEAT1 ekspressoitui alhaisemmilla tasoilla ikääntyneiden hiirten munuaisissa kuin nuorilla hiirillä, mikä on yhdenmukaista aiempien havaintojen kanssa. LincRNA-Gm4419 nopeuttaa tulehdusta ja fibroosia NF-kB/NLRP3-tulehdusvälitteisten mekanismien avulla diabeettisessa nefropatiassa [22]. Sekvensointituloksissamme havaitsimme myös, että Gm4419:n ilmentyminen oli korkeampaa ikääntyneiden hiirten munuaisissa kuin nuorilla hiirillä, mutta merkittävää eroa ei ollut. LncRNA Gm43360 sijaitsee kromosomissa 5 (Chr5: 122494022–122 494 908, 2 887 bp). UCSC Genome Browserin mukaan Gm43360 sijaitsee proteiinia koodaavan geenin Atp2a2 intronissa. Tähän mennessä ei kuitenkaan ole raportoitu lncRNA Gm43360:n osallisuudesta sairauksiin. Tässä tutkimuksessa lncRNA Gm43360:n tuhoutuminen edisti munuaistiehyiden epiteelisolujen vanhenemista. Lisäksi tunnistimme sekvensointituloksista monia eri tavalla ekspressoituneita lncRNA:ita ja tutkimme niitä.

LncRNA:t luokiteltiin cis-säätelyyn tai transsäätelyyn lncRNA:n säätelymekanismien perusteella. Cis-toimivat lncRNA:t voivat vaikuttaa viereisten geenien ilmentymiseen riippumalla cis-toimivista elementeistä, kuten promoottoreista, tehostajista ja säätelysekvensseistä, jotka ovat alle 100 kb:n etäisyydet lncRNA:iden ja mRNA:iden välillä. Trans-toimivat lncRNA:t viittaavat lncRNA:ihin, jotka lähtevät transfektiopaikasta ja toimivat kaukaisissa paikoissa (eli lncRNA:iden ja mRNA:iden välinen etäisyys on yli 100 kb) [23]. LncRNA MAAT lisää viereisen geenin Mbnl1 ilmentymistä cis-säätelymoduulin kautta [24]. LncRNA Pnky näyttelee roolia trans-aktiivisena säätelijänä aivokuoren kehityksessä [25]. Tässä tutkimuksessa lncRNA Gm43360:n ja Csnk1a1:n välillä oli transsäätelysuhde. Csnk1a1 on kasvainsuppressorigeeni [26], joka koodaa proteiinia, joka osallistuu solusykliin ja solun jakautumisprosessiin [27]. Csnk1a1-alassäätely indusoiikääntymiseen liittyvä tulehdusvaste kasvun pysähtymisellä kolorektaalisissa kasvaimissa [26]. Csnk1a1 säädettiin alas, kun Gm43360:tä säädettiin ylös; näin ollen on todennäköistä, että lncRNA Gm43360 osallistuumunuaisten ikääntyminenkirjoittajasäätelevät Csnk1a1-ilmentymistä.

Johtopäätökset

Tutkimuksemme lncRNA-mRNA-koekspressioverkostosta vuonnamunuaisten ikääntyminenpaljasti, että lncRNA, lncRNA Gm43360, voi olla suojaava rooli munuaisten ikääntymisessä ja laajensi ymmärrystämmemunuaisten ikääntyminen

Materiaalit ja menetelmät

Näytteet Nuoret (3-kuukauden ikäiset) ja vanhat (24-kuukauden ikäiset) urospuoliset C57BL/6J-hiiret hankittiin Xiamenin yliopiston Experimental Animal Centeristä ja kasvatettiin normaaliympäristössä. Kaikilla hiirillä oli vapaa pääsy ruokaan ja veteen. Hiiret totutettiin uuteen tilaan kuukauden ajan ennen kuin ne lopetettiin. Hiiret nukutettiin uretaanilla intraperitoneaalisella injektiolla annoksella 750 mg/kg ennen näytteenottoa. Nuoret ja vanhat hiiret lopetettiin samana päivänä.Jäljelle jäänyt hiiren munuainenkudosta käytettiin sekvensointiin kussakin määrityksessä. RNA-seq ja histopatologia suoritettiinerilliset munuaisetsamasta hiirestä. Munuaiskudosta kerättiin hiiristä. Yksi munuainen upotettiin välittömästi 10 % neutraaliin puskuroituun formaliiniin myöhempää leikkeen upottamista varten, ja toinen munuainen jaettiin useisiin kudoksiin ja asetettiin välittömästi nestetyppeen ja säilytettiin sitten -80 asteessa. Tutkimusta tuki Xi'an Jiaotong -yliopiston (Shaanxi, Kiina) ensimmäisen osasairaalan eettinen komitea (nro 2018-G-164). Kaikki menetelmät suoritettiin eläinten eettisten ohjeiden ja määräysten mukaisesti. Tämä tutkimus tehtiin ARRIVEn ohjeiden mukaisesti.

Munuaisten histopatologia

Nuorten ja vanhojen hiirten munuaiskudosnäytteet kiinnitettiin 10-prosenttisessa paraformaldehydiliuoksessa yön yli. Kymmenen leikkeistä oli kuivattu, parafiini upotettu ja leikattu 4-µm:n paksuudella. PAS ja Massonin trikromaattinen värjäys suoritettiin käyttäen standardiprotokollia. Kuvat otettiin kameralla ja värjäytymispositiivinen alue mitattiin. Histopatologisten kamerakuvien pinta-ala laskettiin Image-Pro Plus 6.0:lla.

SA-gal värjäys

SA{{0}}gal-aktiivisuus analysoitiin käyttämällä SA- -gal-värjäyssarjaa (Cell Signaling Technology #9860) valmistajan protokollan mukaisesti. Positiivisen värjäytymisen pinta-ala mitattiin ja SA- -gal-positiiviset solut laskettiin käyttämällä Image-Pro Plus 6.0:aa.

RNA-uuttokirjaston rakentaminen ja sekvensointi

Samples (each 5 mice in young and old mice) were used for lncRNA and mRNA expression analyses. Young mice were numbered 3M1, 3M2, 3M3, 3M4, and 3M5, and old mice were numbered 24M1, 24M2, 24M3, 24M4, and 24M5. Total RNA was extracted using Trizol reagent (thermofsher, 15,596,018) following the manufacturer's instruction. The total RNA quantity and purity were analyzed of Bioanalyzer 2100 and RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent, CA, USA, 5067−1511), and high-quality RNA samples with RIN number>7.{1}} käytettiin järjestyskirjaston rakentamiseen. Kokonais-RNA:n uuttamisen jälkeen mRNA puhdistettiin kokonais-RNA:sta (5 ug) käyttämällä Dynabeads Oligoa (dT) (Thermo Fisher, CA, USA) kahdella puhdistuskierroksella. Puhdistuksen jälkeen mRNA jaettiin lyhyiksi fragmenteiksi käyttämällä kaksiarvoisia kationeja korkeissa lämpötiloissa (Magnesium RNA Fragmentation Module (NEB, luettelo e6150, USA) alle 94 asteen 5-7 min). Sitten pilkotut RNA-fragmentit käänteiskopioitiin cDNA:n saamiseksi SuperScript™ II -käänteiskopioijaentsyymillä (Invitrogen, luettelo 1 896 649, USA), joita käytettiin seuraavaksi U-leimattujen toisjuosteisten DNA:iden syntetisoimiseen E. colin DNA-polymeraasi I:n kanssa ( NEB, cat.m0209, USA), RNase H (NEB, cat.m0297, USA) ja dUTP-liuos (Termo Fisher, cat.R0133, USA). A-emäs lisättiin sitten kunkin juosteen tylppoihin päihin valmistaen ne ligaatioon indeksoituihin sovittimiin. Jokainen adapteri sisälsi T-emäksen ylityksen sovittimen liittämiseksi A-häntäfragmentoituun DNA:han. Kaksoisindeksiadapterit ligoitiin fragmentteihin ja koon valinta suoritettiin AMPureXP-helmillä. U-leimattujen toisjuosteisten DNA:iden lämpölabiilin UDG-entsyymin (NEB, cat.m0280, USA) käsittelyn jälkeen ligatoidut tuotteet monistettiin PCR:llä seuraavissa olosuhteissa: alkuperäinen denaturaatio 95 asteessa 3 minuuttia; 8 denaturointisykliä 98 asteessa 15 s, hehkutus 60 asteessa 15 s ja pidennys 72 asteessa 30 s; ja sitten lopullinen pidennys 72 asteessa 5 min. Keskimääräinen inserttipituus lopullisille cDNA-kirjastoille oli 300 ± 50 bp. Lopuksi suoritimme 2 × 150 bp:n paritetun pään sekvensoinnin (PE150) Illumina Novaseq™ 6000:lla (LC-Bio Technology CO., Ltd., Hangzhou, Kiina) valmistajan protokollan mukaisesti [28].

Bioinformatiikan analyysi Puhtaiden lukemien sekvenssi ja suodatus

cDNA-kirjasto, joka on rakennettu teknologialla yhdistetystä RNA:sta, joka on peräisinmunuaisnäytteethiiristä sekvensoitiin ja ajettiin Illumina NovaseqTM 6000 -sekvenssialustan kanssa. Käyttämällä Illumina-paripään RNA-seq-lähestymistapaa sekvensoimme transkription, jolloin saatiin yhteensä miljoonan 2 × 150 bp:n parillisen pään lukuja. Sekvensointilaitteista saadut lukemat sisältävät sovittimia tai huonolaatuisia pohjaa sisältäviä raakalukemia, jotka vaikuttavat seuraavaan kokoonpanoon ja analysointiin. Siksi Cutadapt [29] (https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/, version:cutadapt-1.9) suodatti lukemat edelleen korkealaatuisten puhtaiden lukemien saamiseksi. Parametrit olivat seuraavat:

1) sovittimia sisältävien lukujen poistaminen;

2) polyA:n ja polyn sisältävien lukujen poistaminen;

3) yli 5 % tuntemattomia nukleotideja (N) sisältävien lukujen poistaminen;

4) poistamalla huonolaatuisia lukuja, jotka sisältävät yli 20 % heikkolaatuisia (Q-arvo pienempi tai yhtä suuri kuin 20) emäksiä.

Kymmenen sekvenssin laatu varmistettiin käyttämällä FastQC:tä [30] (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/, 0.11.9). mukaan lukien puhtaiden tietojen Q20-, Q30- ja GC-sisältö. Sen jälkeen tuotettiin yhteensä G bp puhdistettua, pariliitospään lukemia. Raakasekvenssitiedot on toimitettu NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) -tietosarjoihin, joiden talletusnumero on GSE154223.

Viitegenomi/merkintä oli Mus{0}}musculus.GRCm38. Analyyseihin käytetyn geenimerkinnän lähde ja versio oli Ensembl_v88.

Literaattien kokoonpano

Ensinnäkin Cutadapt [29] käytettiin poistamaan lukemat, jotka sisälsivät adapterin kontaminaatiota, huonolaatuisia emäksiä ja määrittelemättömiä emäksiä. Kymmenen sekvenssin laatua syötettiin erittäin käyttämällä FastQC:tä (//www.bioinformatics.Babra ham.ac.uk/projects/fastqc/). Käytimme Bowtie2:ta [31] ja Hisat2:ta [32] kartoittaaksemme lukuja hiiren genomiin. Kunkin näytteen kartoitetut lukemat koottiin StringTie:llä [33]. Kymmenen, kaikki tekstitykset kohteestamunuaisnäytteetyhdistettiin kattavan transkriptin rekonstruoimiseksi Perl-skripteillä. Kun lopullinen transkripti oli luotu, StringTie [33] ja edgeR [34] käytettiin arvioimaan kaikkien transkriptien ekspressiotasoja.

LncRNA-tunnistus

Ensinnäkin transkriptit, jotka olivat päällekkäisiä tunnettujen mRNA:iden ja alle 200 bp:n transkriptien kanssa, hylättiin. Sitten käytimme CPC [35] ja CNCI [36] ennustaaksemme transkriptejä, joilla oli koodauspotentiaalia. Kaikki transkriptit CPC-pisteillä<-1 and CNCI score<0 were removed. The remaining transcripts were considered as lncRNAs.

Differentiaalisesti ilmennettyjen analyysigeenien (DGE:t) analyysi

StringTie [33] was used to perform expression levels for mRNAs and lncRNAs by calculating FPKM [37]. Genes differential expression analysis was performed by DESeq2 software between two different groups (and by edgeR between two samples) [34, 38]. The genes with the parameter of q value below 0.6 and absolute fold change>2:ta pidettiin erilailla ilmentyneinä geeneinä.

Kohdegeenin ennustaminen ja lncRNA:iden toiminnallinen analyysi

LncRNA:iden toiminnan tutkimiseksi ennustimme lncRNA:iden cis-kohdegeenit. LncRNA:illa voi olla cis-rooli toimiessaan viereisiin kohdegeeneihin. Tässä tutkimuksessa koodaavat geenit 100, 000 ylä- ja alavirtaan valittiin Perl-skriptillä. Sitten näytimme lncRNA:iden kohdegeenien toiminnallisen analyysin käyttämällä skriptejä BLAST2GO [39]. Täydellinen komentolinkki julkiseen verkkotunnukseen oli Jie-Li/README.md osoitteessa main · dandan-li/Jie-Li (github.com).

Geeniontologian (GO) luokat ja Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) -analyysi

RNA-sekvensoinnin bioinformatiikka-analyysi suoritettiin OmicStudio-työkaluilla (http://www.omicsudio.cn/tool). Gene Ontologyn (GO) toiminnallinen rikastusanalyysi ja Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) [37–39] -rikastusanalyysi käytettiin analysoimaan ennustettujen kohdegeenien biologisia toimintoja. GO-analyysi selventää tärkeimpiä biologisia prosesseja kolmen näkökohdan kautta: solukoostumus, molekyylitoiminnot ja biologiset prosessit (http://www.geneontology.org/). Analyysi ensin sijoittaa kaikki eri tavalla ilmentyvät geenit ja taustageenit GO-tietokantaan. Jokainen kohde kartoitetaan, kunkin kohteen geenien lukumäärä lasketaan ja hypergeometristä jakaumaa käytetään hypoteesitestaukseen rikastustuloksen P-arvon saamiseksi. Mitä pienempi P-arvo, sitä merkittävämpi on rikastustulos. KEGG on tietokantaresurssi, joka analysoi geneettisen biologian eri tavoin ilmentyviä mRNA:ita tutkiakseen tärkeitä kohdegeeneihin liittyviä polkuja (https://www.genome.jp/kegg/). Tulokset ilmaistaan ​​p-arvoilla; Mitä pienempi p-arvo, sitä merkittävämpi on rikastustulos.

qRT-PCR

GAPDH:ta käytettiin endogeenisenä kontrollina. Sitten laskettiin tuntemattomien geenien suhteelliset ilmentymistasot. Kaikki alukkeet suunniteltiin ja syntetisoitiin erityisesti tätä koetta varten. GAPDH:n alukkeet on kaupallistettu. Adra1a- ja Csnk1a1-alukkeiden spesifisyys tunnistettiin sulamiskäyrän yksittäisen piikin perusteella.

Rakenna mRNA-lncRNA-koekspressioverkko

Transregulaatio perustui tutkimukseen ja sitten transenergia laskettiin. Mitä pienempi transenergia oli, sitä suurempi on sitoutumisen mahdollisuus. Sitten laskettiin myös mRNA-lncRNA:n korrelaatiokerroin. mRNA-lncRNA-verkko rakennettiin valitsemalla Spearman-korrelaatiokerroin, joka ylitti 0,9. mRNA-lncRNA-koekspressioverkko rakennettiin käyttämällä Cytoscape-ohjelmistoa (v3.7.1).

Soluviljely

Hiiren munuaisten proksimaalisia tubulaarisia epiteelisoluja (MRPT-EpiC:t) viljeltiin eläimen epiteelisoluväliaineessa (EpiCM-a, luettelonro 4131), joka sisälsi 2 % naudan sikiön seerumia (FBS, luettelonro 0010) ja epiteelisolujen kasvulisä-eläintä. (EpiCGS-a, luettelo #4182) ilman antibiootteja kostutetussa inkubaattorissa 37 asteessa ja 5 % CO2:ssa. Elatusaine vaihdettiin 2-3 päivän välein. Logaritmisen kasvuvaiheen solut aliviljeltiin, kun kasvu saavutti 90 %. Trypsiinillä pilkottu solususpensio kylvettiin 6-kuoppalevyille, joissa kussakin kuoppassa oli 2*104 -5*104 solua. Transfektioon käytetyt solut olivat kaikki sukupolvien 2 ja 5 välillä.

Plasmidin rakentaminen ja solujen transfektio

LncRNA Gm43360 yliekspressioplasmidin konstruoi GeneChem (Shanghai, Kiina). Plasmidirunko oli GV658, ja CMV-promoottori ohjasi lncRNA:n ilmentymistä. Kloonattu nukleotidisekvenssi on lisämateriaalissa. lncRNA Gm43360 knockdownissa kolmen lncRNA ENS:n PITÄÄ00000197656-kohdistaa siRNA:ta (lncRNA Gm43360- siRNA1, 5'-CCUUCACUCCAGCUGGUAATT-3'; lncRNA Gm43360-siRNA2, 5'-CCCU UGAAGUUTT-3' ja lncRNA Gm43360-siRNA3, 5'-GGUCAAAUAACUCAAUGGGTT-3') suunniteltiin ja syntetisoitiin GenePharmassa (Shanghai, Kiina). Valmistajan ohjeen mukaan solut transfektoitiin 2500 ng:lla plasmidia tai 100 pmolilla siRNA:ta 6 ul:lla Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent -reagenssia (Invitrogen, USA) kuoppaa kohti. RNA:n ja proteiinin ilmentymistasot havaittiin 48 tuntia transfektion jälkeen, ja jokainen koe toistettiin vähintään kolme kertaa. Reaaliaikaista kvantitatiivista PCR:ää käytettiin validoimaan lncRNA Gm43360:n yli-ilmentymisen ja knockdownin tehokkuus.

Western blot -analyysi

Viljellyt solut pestiin jääkylmällä PBS:llä, lisättiin 120 ui RIPA-puskuria (Heart, Kiina) ja proteaasi-inhibiittoria ja PMSF:ää (Heart, Kiina) lisättiin 30 minuutin ajaksi jäillä. Sen jälkeen kun solut oli kerätty eri mikrosentrifugiputkiin, proteiinipitoisuus määritettiin kvantitatiivisesti. Latauspuskuri lisättiin jokaiseen näytteeseen ja keitettiin sitten 7 minuuttia. Kolmekymmentä mikrogrammaa näytettä erotettiin 12 % SDS-PAGE:lla (Beyotime, Kiina) ja siirrettiin sähköisesti PVDF-kalvoille (Thermo Fisher, USA). Sitten kalvot tukkettiin 5 % maidolla. Kalvoja inkuboitiin spesifisten primääristen vasta-aineiden kanssa: anti-p21 (1:1000, Abcam, ab109199), anti-p53 (1:1000, Proteintech, 10442-1-AP) ja anti-GAPDH (1:3000, Profintech). , 60004-1-Ig) yön yli 4 asteessa. TBST:llä pesun jälkeen kalvoja inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Proteiinijuovia tarkkailtiin käyttämällä kemiluminesenssipakkausta (Millipore, USA). GAPDH:n ilmentämistä käytettiin normalisoimaan proteiinitasoja.

Solujen lisääntymismääritys

Solujen lisääntymiskyky määritettiin solulaskentasarja-8 (CCK-8) -määrityksellä. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen kuhunkin kuoppaan lisättiin 90 µl uutta elatusainetta ja 10 µl CCK{5}}-liuosta (Beyotime, C0042). Soluja inkuboitiin 1–4 tuntia 37 asteessa 5 % CO2:ssa ja mitattiin 450 nm:ssä yleisellä mikrolevylukijalla (Bio-Tek, USA).

Virtaussytometrinen analyysi

Solut maljattiin 6-kuoppalevyille päivää ennen transfektiota. 48 tuntia transfektion jälkeen solut trypsinoitiin ja sentrifugoitiin nopeudella 1000 rpm 5 minuuttia. Sitten solut kiinnitettiin 70-prosenttisessa etanolissa 4 asteessa vähintään 4 tunnin ajan. Sentrifugoinnin jälkeen soluihin lisättiin RNaasi A:n ja propidiumjodidin (PI) värjäysliuosta, ja sitten soluja inkuboitiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa pimeässä. Te-värjätyt solut analysoitiin käyttämällä ACEA NovoCytea (Biosciences, USA).

Tilastollinen analyysi

Mittaustiedot normaalijakauman mukaan esitetään keskiarvona ±SD. Kahden eri ryhmän välinen ero määritettiin käyttämällä kaksisuuntaisia ​​parittomia Studentin t-testejä, ja p-arvoa < 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevänä. Kaikki laskelmat suoritettiin käyttämällä GraphPad Prism 8:aa (GraphPad Software, Inc., USA).

Viitteet

1. Docherty MH, O'Sullivan ED, Bonventre JV, Ferenbach DA. Solujen vanheneminen munuaisissa. J Am Soc Nephrol. 2019;30(5):726–36.

2. Partridge L, Deelen J, Slagboom PE. Ikääntymisen globaaleihin haasteisiin vastaaminen. Luonto. 2018;561(7721):45–56.

3. Pan JX. LncRNA H19 edistää ateroskleroosia säätelemällä MAPK- ja NF-kB-signalointireittejä. Eur Rev Med Pharmacol Sei. 2017;21(2):322–8.

4. Wasson CW, Abignano G, Hermes H, Malaab M, Ross RL, Jimenez SA, Chang HY, Feghali-Bostwick CA, Del Galdo F. Pitkä ei-koodaava RNA HOTAIR ajaa EZH2-riippuvaista myofibroblastien aktivaatiota systeemisessä skleroosi NOTCH:n miRNA 34a:sta riippuvaisen aktivaation kautta. Ann Rheumatic Dis. 2020;79(4):507–17.

5. Luo J, Wang K, Yeh S, Sun Y, Liang L, Xiao Y, Xu W, Niu Y, Cheng L, Maity SN, et ai. LncRNA-p21 muuttaa antiandrogeenienzalutamidin aiheuttamaa eturauhassyövän neuroendokriinista erilaistumista moduloimalla EZH2/STAT3-signalointia. Nat Commun. 2019;10(1):2571.

6. Wang Y, Yang L, Chen T, Liu X, Guo Y, Zhu Q, Tong X, Yang W, Xu Q, Huang D, et ai. Uusi lncRNA MCM3AP-AS1 edistää hepatosellulaarisen karsinooman kasvua kohdistamalla miR-194-5p/FOXA1-akseliin. Mol Syöpä. 2019;18(1):28.

7. Wu YY, Kuo HC. Ei-koodaavien RNA:iden toiminnalliset roolit ja verkostot neurodegeneratiivisten sairauksien patogeneesissä. J Biomed Sci. 2020; 27(1):49.

8. Li Z, Wang Z. Munuaisten ikääntyminen ja ikääntymiseen liittyvät sairaudet. Adv Experiment Med Biol. 2018; 1086:169–87.

9. Wang X, Vrtiska TJ, Avula RT, Walters LR, Chakkera HA, Kremers WK, Lerman LO, Rule AD. Ikä, munuaisten toiminta ja riskitekijät liittyvät eri tavalla munuaisten aivokuoren ja medullaaristen tilavuuksien kanssa. Kidney Int. 2014;85(3):677–85.

10. Lin Q, Hou S, Dai Y, Jiang N, Lin Y. LncRNA HOTAIR kohdistaa miR-126-5p:n edistämään Parkinsonin taudin etenemistä RAB3IP:n kautta. Biol Chem. 2019;400(9):1217–28.

Wecistanchen tukipalvelu - Kiinan suurin vesisäiliön viejä:

Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Puhelin:+86 15292862950

Osta lisätietoja teknisistä tiedoista:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop