Esikäsittelyllä aktivoitu AKT säätelee hermoston toleranssia iskemialle MDM2-p53-reitin kauttaⅡ

3. Keskustelu

Tuloksemme osoittavat, että IPC-välitteinen PI3K/AKT-signalointireitin aktivaatio laukaisee hermosolujen IT:n säätelemällä MDM2–p53-kompleksia primaarisissa aivokuoren neuroneissa. Vahvistimme ensin esikäsittelyn tehokkuuden hermosolujen suojauksen kannalta [33,39–41] validoidulla IPC-kokeellisella mallilla.

Napsauta nähdäksesi Neuronin cistanche tubulosa sivuvaikutukset

Havaitsimme, että kokeellinen IPC, jonka indusoi lyhyt (20 min) happi- ja glukoosipuute (OGD), jota seurasi 2 tunnin uudelleenhapetus, johti hermosolujen suojaamiseen, mikä osoittaa sekä hermosolujen apoptoosin että kaspaasi-3-aktivaation estymisen, jonka aiheutti pitkäaikainen käyttö. OGD (90 min), jota seurasi 4 tunnin uudelleenhapetus (OGD/R). Osoitamme, että IPC vähentää kaspaasin-3 aktivaatiota aivokuoren hermosoluissa, mikä korreloi pienemmän apoptoosin kanssa myöhemmän ja vakavamman iskeemisen vamman jälkeen.

Pro- ja antiapoptoottisten signaalien välinen tasapaino on olennaista hermosolujen selviytymisen varmistamiseksi iskemian jälkeen [3,33,38,42–44]. Vaikka tällaisten tapahtumien merkitys on osoitettu sekä verenvuoto- että iskeemisissä in vivo -halvausmalleissa [43,45], näitä signalointireittejä sääteleviä mekanismeja ei vielä täysin ymmärretä iskeemisen toleranssin yhteydessä. Antiapoptoottisen AKT:n ja siihen liittyvien reittien roolia on tutkittu laajasti syöpäsoluissa [46,47] ja aivokudoksessa [38,48]; kuitenkin toistaiseksi AKT/MDM2–p53-signalointireitin rooli IPC-välitteisessä hermosolutoleranssissa iskeemistä vauriota vastaan ​​on edelleen vaikeasti havaittavissa.

Tässä havaitsimme, että IPC:n aiheuttama PI3K/AKT-signalointireitin aktivaatio edistää MDM2:n fosforylaatiota Ser166:ssa, mikä laukaisee sen tuman translokaation ja proteiinin stabiloitumisen, mikä estää p53-indusoidun apoptoosin kaspaasin-3 aktivoitumisen kautta. iskemian jälkeen. AKT:n aktivoituminen fosforylaation kautta edistää hermosolujen eloonjäämistä [24,49] ja voi myötävaikuttaa IT:n induktioon [25,50]. Tuloksemme osoittavat, että AKT-proteiinin suhteellinen runsaus on muuttumaton iskeemisten tai esikäsittelyärsykkeiden vaikutuksesta. Mielenkiintoista on, että havaitsimme, että AKT:n varhainen PI3K-välitteinen fosforylaatio Ser473:ssa estää iskemian aiheuttaman p53:n stabiloitumisen esikäsitellyissä neuroneissa.

Vaikutus ei johtunut p53-mRNA-tasojen muutoksista [33, 34, 44], vaan alentuneista p53-proteiinitasoista, jotka johtuivat IPC:stä ennen OGD/R:ää. Koska MDM2 on p53-stabiloinnin pääsäätelijä ja myös AKT:n suora kohde, tuloksemme osoittavat AKT/MDM2–p53-signalointireitin roolin hermosolujen iskemian sietokyvyssä. MDM2-mRNA lisääntyy nopeasti OGD:n jälkeen [34], mutta MDM2-aktiivisuutta säätelevät pääasiassa translaation jälkeiset modifikaatiot, erityisesti fosforylaatio [51]. Hyvässä yhteisymmärryksessä tämän kanssa havaitsimme, että kun AKT on aktivoitu fosforylaatiolla IPC:n jälkeen, se puolestaan ​​​​fosforyloi MDM2:n tähteessä Ser166, joka sijaitsee lähellä tuman lokalisointisignaalia [52], ja tämä vaikutus säilyy OGD/R-vaurion jälkeen.

Tuloksemme osoittavat, että MDM2:n fosforylaatio Ser166:ssa on riittävä IPC-välitteisen neuroprotektiivisen vaikutuksen aikaansaamiseksi p53-destabiloinnin kautta. Siten tässä tunnistimme AKT / MDM2-p53-reitin ajasta riippuvan aktivaation iskeemisen vaurion jälkeen, ja todellakin osoitamme, että IPC-aktivoitu AKT laukaisi ektooppisen MDM2:n tuman translokaation sekä endogeenisen proteiinin stabiloitumisen.

Lisäksi AKT pysyy aktiivisena ytimessä, jossa PI3K voi myös siirtyä vasteena oksidatiiviselle stressille ja ottaa sitten huomioon AKT:n fosforylaation [53]. AKT:n tai AKT knockdownin PI3K-välitteisen fosforylaation esto edistää MDM2-proteiinin pysymistä sytoplasmassa ja estää MDM2:n Ser166-fosforylaatiota sekä IPC-välitteisen hermosuojan iskemian aiheuttamaa hermosolujen apoptoosia vastaan. Päinvastoin, osoitimme, että aktiivinen AKT sitoutuu tuman MDM2-proteiiniin.

Tämän seurauksena aktiivinen AKT edistää sekä MDM2:n fosforylaatioita että sen tuman stabiloitumista, mikä edistää IPC-välitteistä hermosolujen suojausta. Tuloksemme paljastavat, että IPC:n edistämä hermosuojaus oli riippuvainen PI3K-välitteisestä AKT-aktivaatiosta, joka fosforyloi MDM2:n Ser166:ssa edistäen MDM2:n tuman kertymistä iskeemisen vamman jälkeen.

Vastaavasti PI3K/AKT:n estäminen wortmanniinilla tai AKT:n ehtyminen siRNA:lla poisti IPC:n edistämän hermosuojan, mikä johti p53:n stabiloitumiseen ja sitä seuraavaan hermosolujen apoptoosiin iskemian jälkeen. Näin ollen tuloksemme auttavat selventämään IPC-riippuvaisen AKT-MDM2-reitin aktivoitumisen olennaista roolia hermosolujen selviytymisessä iskeemistä vauriota vastaan.

P53-proteiini osallistuu hermosolujen kuoleman/eloonjäämisen säätelyyn, mikä määrittää ennusteen aivohalvauspotilailla [34, 42, 54] sekä TIA-potilailla [3]. P53-stabilointi vaarantaa esihoitovälitteisen hermosuojan iskemialle/reperfuusiovauriolle [33]. MDM2–p53-vuorovaikutus on siksi kriittinen hermosolujen selviytymiselle tässä yhteydessä [34] ja IPC-välitteiselle iskeemisen vaurion sietokyvylle [33].

Thus, the control of such interaction will also have an impact on stroke outcomes. In this context, we recently found that a single-nucleotide polymorphism (SNP) 309T>G MDM2-promoottorissa määrää MDM2:n ilmentymisen ja puolestaan ​​moduloi aivohalvauksesta kärsivien potilaiden toipumista [34].

Lisäksi havaitsimme, että Tp53-geenin SNP (rs1042522) moduloi mitokondrioiden p53-stabiloitumista ja hermosolujen toleranssia iskemialle, samalla kun se ennustaa TIA:sta ennen aivohalvausta kärsivien potilaiden toiminnallista paranemista [3]. Siksi p53:n apoptoottisten reittien hallinta on välttämätöntä IPC:n hermoja suojaavan vaikutuksen varmistamiseksi.

Nämä tulokset tarjoavat translatiivisen lähestymistavan tutkimukseen, joka voitaisiin toteuttaa tulevaisuudessa potilaiden hyödyksi, ja ne asettavat PI3K/AKT-MDM2-p53-signalointireitin olennaiseksi kohteeksi esihoitoa edistäville IT-strategioille iskeemisessä aivohalvauksessa. Yhteenvetona osoitamme, että IPC:llä tehostettu PI3K/AKT-signalointireitti edistää MDM2:n fosforylaatiota Ser166:ssa, mikä johtaa MDM2:n tuman translokaatioon ja sen stabiloitumiseen, mikä laukaisee hermosolujen IT:n edistämällä p53:n destabiloitumista ja myöhempää iskeemisen vamman jälkeen aiheutetun apoptoottisen kuoleman inaktivaatiota.

Tuloksemme korostavat AKT:n varhaisen aktivoitumisen mahdollisia etuja IPC-välitteisessä hermosolutoleranssissa, joka säätelee MDM2–p53-apoptoottista reittiä iskeemisen vaurion aikana. Nämä havainnot korostavat mahdollisuutta ymmärtää mekanismeja, jotka säätelevät hermosolujen AKT-MDM2-p53-signalointireittiä, jotta voidaan kehittää uusia neuroprotektiivisia strategioita IT-sairauksiin.

4. Materiaalit ja menetelmät

4.1. Kortikaalisten neuronien primäärikulttuurit

Neuronaaliset viljelmät valmistettiin C57Bl/6J- tai p53-null (Tp53−/−, B6.129S2, The Jackson Laboratory) hiiren alkion (14.5E) aivokuoresta. Neuronit kylvettiin tiheydellä 1,8 × 105 solua/cm2 Neurobasal-elatusaineeseen, jota oli täydennetty 2 prosentilla B27:llä ja 2 mM glutamiinilla (Invitrogen, Madrid, Espanja) ja inkuboitiin 37 ◦C:ssa kostutetussa 5 prosenttia CO2-pitoisessa ilmakehässä [ 55].

4.2. Happiglukoosivaje ja esihoitomallit

9–1{{10}} päivän in vitro (DIV) jälkeen hermosolut altistettiin hapen ja glukoosin puutteelle (OGD) inkuboimalla soluja 37 ◦C:ssa 90 minuuttia inkubaattorissa. varustettu ilmalukolla ja kaasutettu jatkuvasti 95 prosentilla N2/5 prosentilla CO2:lla. Inkubointialusta (puskuroitu Hanksin liuos ilman glukoosia: 5,26 mM KCl, 0,43 mM KH2PO4, 132,4 mM NaCl, 4,09 mM NaHC03, 0,33 mM Na2HPO4, 2 mM CaCl2, ja pH oli aiemmin kaasutettu 9-prosenttisesti 9-prosenttisella HEPES:llä. /5 prosenttia CO2:ta 30 minuutin ajan. Näissä olosuhteissa happipitoisuudet inkubointiväliaineessa olivat 6,7 ± 0,5 µM Clark-tyyppisellä happielektrodilla mitattuna [56,57].

Kun osoitettiin, neuronit altistettiin iskeemiselle esikäsittelylle (IPC; lyhyt OGD 20 minuutin ajan, jota seurasi 2 tunnin uudelleenhapetus) ennen myöhempää pitkittynyttä iskemiaa (OGD, 90 min) ja 4 tunnin uudelleenhapetusta (IPC plus OGD/R) (kuva S1B) ). Samanaikaisesti hermosoluja inkuboitiin normoksiassa (Nx) 37 ◦C:ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 95 prosenttia ilmaa/5 prosenttia CO2:ta tai iskeemisessä esikäsittelyssä (IPC). Kun osoitettiin, neuroneja inkuboitiin 30 minuuttia ennen IPC:tä puskuroidussa Hanksin liuoksessa (pH 7,4) wortmanniinin (100 nmol/L) poissa tai läsnä ollessa, kuten aiemmin on kuvattu [19].

4.3. Solutransfektiot

Neuronit (8 DIV) tai HEK-293T-solut transfektoitiin plasmidivektorilla, joka ekspressoi YFP-merkittyä Mdm2:ta ihmisen MDM2-promoottorista. MDM2p/Mdm2-YFP oli lahja Uri Alonilta & Galit Lahavilta (Addgene-plasmidi # 53962, Watertown, MA, USA) [58]. Tarvittaessa käytettiin tyhjää vektoria (pYFP) kontrollina samoissa olosuhteissa. Plasmiditransfektio suoritettiin käyttämällä Lipofectamine® LTX:ää (Invitrogen, Carlsbad, MA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solut transfektoitiin 1,5 ug/ul:lla plasmidivektoreita ja käytettiin 24 tunnin kuluttua.

AKT-knockdown 6 DIV-hermosolussa saavutettiin transfektoimalla pienillä häiritsevillä kaksijuosteisilla ribonukleotideilla (siRNA). Kohdistetut sekvenssit olivat seuraavat: 50–CUCAAGUACUCAUUCCAGAtt–30, antisense: 5 0–UCUGGAAUGAGUACUUGAGgg–30 (hiiri, s62216, vastaa nukleotideja 1006–1025, GenBank-talletusnumero NM{59}}. Negatiivisena kontrollina käytimme Silencer™ Select Negative Control No. 1 siRNA:ta (siControl). Kaikki siRNA:t ostettiin yhtiöiltä Ambion®, Invitrogen® ja Thermo Fischer Scientific (Offenbach, Saksa). Proteiinin tyrmäyksen asteen mukaan siRNA:n transfektion tehokkuuden arvioitiin olevan 70–80 prosenttia 3 päivää transfektion jälkeen. Vaimennuskokeita varten neuronit transfektoitiin siRNA:lla (10 nM) käyttämällä Lipofectamine® RNAiMAXia (Invitrogen) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Neuroneja inkuboitiin edelleen Neurobasal-väliaineessa 72 tuntia ennen niiden käyttöä.

4.4 Apoptoottisten solujen kuoleman virtaussytometrinen havaitseminen

Neuronit irrotettiin varovasti levyiltä käyttämällä 1 mM EDTA-tetranatriumsuolaa PBS:ssä (pH 7,4) ja värjättiin anneksiini V/APC:llä ja 7-AAD:llä, suoritettiin täsmälleen kuten aiemmin on kuvattu [55].

4.5. Kaspaasi-3 aktiivisuusmääritys

Kaspaasi-3-aktiivisuus arvioitiin solulysaateissa [33] ja valmistajan ohjeiden mukaisesti käyttämällä SIGMA:n fluorimetric Assay -kittiä CASP3F ja luettu emissiolla 405 nm:n aallonpituudella. Menetelmä perustuu fluoresoivan 7-amino4-metyylikumariiniosan (AMC) vapautumiseen. AMC-pitoisuus lasketaan käyttämällä AMC-standardia.

4.6. Immunoblottit ja yhteisimmunosaostusmääritys

Neuronit hajotettiin puskurissa, joka sisälsi 1 % SDS, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 12,5 mM Na2HPO4 ja 1 % Triton X-100 (NP40: 1 % NP40, EDTA diK plus 5 mM, Tris pH{13). }} mM, NaCl 135 mM ja 10 prosenttia glyserolia) täydennettynä fosfataasin estäjillä (1 mM Na3VO4 ja 50 mM NaF) ja proteaasi-inhibiittoreilla (100 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 50 µg/ml anti-papaiinia, 50 µg/ml pestatiinia, 50 µg/ml µg/ml amastatiinia, 50 µg/ml leupeptiiniä, 50 µg/ml bestatiinia ja 50 µg/ml soijapavun trypsiini-inhibiittoria), säilytettiin jäissä 30 minuuttia ja keitettiin 5 minuuttia. Lisoitujen uutteiden alikvootit altistettiin SDS-polyakryyliamidigeelille (MiniProtean®, Bio-Rad) ja blotattiin vasta-aineilla yön yli 4 °C:ssa. Käytetyt vasta-aineet olivat anti-AKT (9272), anti-p(Ser473)AKT (9271), katkaisun vastainen kaspaasi-3 (Asp175, 9661) (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), anti-p53 ( 554157, BD Biosciences), anti-MDM2 (2A10, ab-16895), anti- (Ser166)MDM2 (ab131355), anti-GFP (ab290; havaitsee myös YFP:n) (Abcam, Cambridge, UK), anti-LAMIN B (sc-374015, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Saksa) ja antiGAPDH (Ambion, Cambridge, UK) yön yli 4 ◦C:ssa. Piparjuuriperoksidaasilla konjugoidun vuohen anti-kanin IgG:n (Pierce, Thermo Scientific) tai vuohen anti-hiiri-IgG:n (Bio-Rad) kanssa inkuboinnin jälkeen kalvoja inkuboitiin välittömästi tehostetulla kemiluminesenssilla SuperSignal West Dura (Pierce) 5 minuutin ajan ennen altistamista Kodakille. XAR-5-filmiä 1-5 minuuttia ja autoradiogrammit skannattiin. Kaistan intensiteetit määritettiin käyttämällä ImageJ 1.48v -ohjelmistoa, kuten aiemmin on kuvattu [60].

Koimmunosaostusmääritystä varten neuronit hajotettiin jääkylmässä puskurissa, joka sisälsi 50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 % NP-40) ​​täydennettynä yllä kuvatuilla fosfataasin estäjillä. Sen jälkeen, kun roskat oli puhdistettu sentrifugoimalla, hermosolulysaatteja (100 mg) inkuboitiin 1 mg:n vasta-aineen kanssa 24 tuntia 4 °C:ssa, minkä jälkeen lisättiin 10 ml proteiini A-agaroosia (GE Healthcare Life Sciences) 2 tunnin ajan 4 °C:ssa. ◦C. Immunosaostumat pestiin perusteellisesti lyysipuskurilla ja erotettiin SDS-PAGE:lla ja immunoblotattiin osoitetuilla vasta-aineilla [61]. Proteiinien suhteellinen runsaus on esitetty kuvassa S1. Täydelliset blotit ja geeliskannaukset sisältyvät kuvaan S3.

4.7. Immunosytokemia ja kuva-analyysi

Neuroneja kasvatettiin lasisilla peitelaseilla ja kiinnitettiin 4-prosenttisella (w/v, PBS:ssä) paraformaldehydillä 30 minuutin ajan ja immunovärjättiin kanin anti-fosfoAKT:llä (Ser473; 9271; Cell Signaling, MA, USA), hiiren anti-MDM2:lla (2A10, ab-16895), hiiren anti-MAP2 (1:500; M#1406, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) [55], hiiren anti-p53 (1:200; 554157, BD Pharmingen , San Diego, CA, USA) ja anti-GFP (1:1000; ab290; myös validoitu YFP:n havaitsemiseen). Immunoleimaus havaittiin käyttämällä sekundaarisia vasta-aineita kanin IgG-Cy3- tai anti-hiiri-IgG-Cy2-vasta-aineilla (1:500; Jackson ImmunoResearch. Cambridge, UK).

Tumat värjättiin 40,6-diamidino-2-fenyyli-indolilla (DAPI; D9542, Sigma-Aldrich). Peitinlasit pestiin, kiinnitettiin SlowFade valossa haalistumista estävässä reagenssissa (Invitrogen) lasilevyille ja tutkittiin mikroskoopilla (Nikon Inverted microscope Eclipse Ti-E, (NY, USA), joka oli varustettu 40-kertaisella objektiivilla, esikeskitetty Nikon Intensilight -kuituvalaisin. C-HGFI ja mustavalkoinen latauskytketyn laitteen digitaalikamera Hamamatsu ORCAER tai pyyhkäisevä laserkonfokaalinen mikroskooppi ("Spinning Disk" Roper Scientific Olympus IX81, Tokio, Japani), jossa on kolme laseria 405, 491 ja 561 nm, varustettu 40×, 63× ja 100× PL Apo öljyimmersioobjektiivilla korkearesoluutioiseen kuvantamiseen ja laitteen digitaalikamera Evolve Photometrics.

Kaikki mikroskoopin asetukset asetettiin keräämään fluoresoivia kuvia kylläisyyden alapuolella ja pidettiin vakiona kaikissa kokeessa otetuissa kuvissa. Kuvat analysoitiin ImageJ 1.48v -ohjelmistolla (National Institutes of Health). P(Ser473)AKT plus- ja p53 plus -neuronien prosenttiosuus ja p(Ser473)AKT:n ja p53:n maksimaalisen proteiinin fluoresenssin intensiteetin kvantifiointi on esitetty kuviossa S2A. MDM2-GFP-transfektoiduissa neuroneissa MDM2-GFP:n nukleosytoplasminen jakautuminen laskettiin nukleosytoplasman keskimääräisen fluoresenssin ja endogeenisen MDM2:n sytoplasmisen keskifluoresenssin suhteena, mitattuna 24 neuronissa (kuusi neuronia per tila neljässä eri hermosoluviljelmässä) (kuva S2B) [62].

Endogeenisen MDM2-värjäyksen ja pSer473AKT:n enimmäistuman fluoresenssin intensiteetin kvantifioimiseksi mitattiin 40 neuronia (10 neuronia per tila neljässä eri viljelmässä) (kuva S2C), kuten aiemmin on kuvattu [44]. Kuvassa 5B esitetyissä edustavissa poikkileikkausintensiteettiprofiileissa kunkin tilan alla osoitettu p(Ser473)AKT:n ja MDM2:n prosenttiosuus kvantifioitiin ydinkeskimääräisenä fluoresenssina. Kaikissa tapauksissa ytimet tunnistettiin DAPI-värjäyksellä. Suurin tuman MDM2-fluoresenssin intensiteetti wortmanniinilla tai siAktilla käsitellyissä neuroneissa on esitetty kuvassa S2D.

4.8 Tilastollinen analyysi

Kokeelliset tulokset arvioitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä, jota seurasi Bonferroni post hoc -testi, jota käytettiin useiden ryhmien arvojen vertaamiseen. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM. Kahden arvoryhmän vertailussa käytettiin Studentin t-testiä. Kaikissa tapauksissa p < 0.05 katsottiin merkitseväksi (* p < 0,05 vs. Nx; # p<0.05 versus OGD). Statistical analyses were performed using SPSS Statistics 24.0 for Macintosh (IBM).

Miten Cistanche suojaa hermosoluja?

On olemassa todisteita siitä, että Cistanche voi suojata hermosoluja vähentämällä apoptoosia (ohjelmoitua solukuolemaa) ja edistämällä hermosolujen eloonjäämistä. Apoptoosi on luonnollinen prosessi, joka tapahtuu kehossa vaurioituneiden tai ei-toivottujen solujen poistamiseksi, mutta se voi olla haitallista, jos sitä tapahtuu liikaa tai sopimattomasti. Cistanchen on havaittu estävän apoptoosia laboratoriotutkimuksissa, ja tämä vaikutus voi auttaa suojaamaan hermosoluja vaurioilta.

Lisäksi Cistanche sisältää useita bioaktiivisia yhdisteitä, joilla on osoitettu olevan hermostoa suojaavia vaikutuksia. Se sisältää esimerkiksi ekinakosidia, jonka on osoitettu suojaavan hermosoluja oksidatiiviselta stressiltä ja tulehdukselta. Se sisältää myös akteosidia, jolla on todettu olevan anti-inflammatorisia ja antioksidanttisia ominaisuuksia.

Viitteet

1. Emberson, J.; Lees, KR; Lyden, P.; Blackwell, L.; Albers, G.; Bluhmki, E.; Brott, T.; Cohen, G.; Davis, S.; Donnan, G.; et ai. Hoidon viivästymisen, iän ja aivohalvauksen vaikeusasteen vaikutus suonensisäisen trombolyysin vaikutuksiin alteplaasilla akuutissa iskeemisessä aivohalvauksessa: yksittäisten potilastietojen meta-analyysi satunnaistetuista tutkimuksista. Lancet 2014, 384, 1929–1935. [CrossRef]

2. Wang, W.-W.; Chen, D.-Z.; Zhao, M.; Yang, X.-F.; Gong, D.-R. Aikaisemmilla ohimenevillä iskeemisillä kohtauksilla voi olla neuroprotektiivinen vaikutus potilailla, joilla on iskeeminen aivohalvaus. Kaari. Med. Sci. 2017, 5, 1057–1061. [CrossRef] [PubMed]

3. Ramos-Araque, ME; Rodriguez, C.; Vecino, R.; Garcia, EC; Alfonso, MDL; Barba, MS; Colàs-Campàs, L.; Purroy, F.; Arenillas, JF; Almeida, A.; et ai. Neuronaalinen iskeeminen toleranssi on ehtona Tp53 Arg72Pro -polymorfismille. Käännös Stroke Res. 2019, 10, 204–215. [CrossRef] [PubMed]

4. Iadecola, C.; Anrather, J. Aivohalvaustutkimus risteyksessä: Suuntien kysyminen aivoilta. Nat. Neurosci. 2011, 14, 1363–1368. [CrossRef] [PubMed]

5. Zhao, C.; Jiang, M.; Zhang, L.; Hu, Y.; Hu, Z.; Zhang, M.; Qi, J.; Su, A.; Lou, N.; Xian, X.; et ai. Peroksisomiproliferaattorin aktivoima reseptori gamma osallistuu iskeemisen esikäsittelyn indusoiman aivojen iskeemisen toleranssin hankkimiseen gliaglutamaattikuljettajan 1 kautta in vivo ja in vitro. J. Neurochem. 2019, 151, 608–625. [CrossRef]

6. Rodriguez, C.; Agulla, J.; Delgado-Esteban, M. Refocusing the Brain: New Approaches in Neuroprotection against ischemic Injury. Neurochem. Res. 2021, 46, 51–63. [CrossRef] [PubMed] 7. Stenzel-Poore, MP; Stevens, SL; Xiong, Z.; Lessov, NS; Harrington, AC; Mori, M.; Meller, R.; Rosenzweig, HL; Sietää.; Shaw, ET; et ai. Iskeemisen esikäsittelyn vaikutus genomiseen vasteeseen aivoiskemialle: Samankaltaisuus hermostoa suojaavien strategioiden kanssa lepotilassa ja hypoksiaa sietävissä tiloissa. Lancet 2003, 362, 1028–1037. [CrossRef]

8. Gidday, JM Aivojen esikäsittely ja iskeeminen toleranssi. Nat. Rev. Neurosci. 2006, 7, 437–448. [CrossRef] [PubMed]

9. Stetler, RA; Leak, R.; Gan, Y.; Li, P.; Zhang, F.; Hu, X.; Jing, Z.; Chen, J.; Zigmond, MJ; Gao, Y. Preconditioning tarjoaa hermosuojan CNS-sairauksien malleissa: Paradigmat ja kliininen merkitys. Prog. Neurobiol. 2014, 114, 58–83. [CrossRef] [PubMed]

10. Koch, S.; Della Morte, D.; Dave, KR; Sacco, RL; Perez-Pinzon, AM Biomarkkerit iskeemiseen esihoitoon: Respondereiden löytäminen. Br. J. Pharmacol. 2014, 34, 933–941. [CrossRef]

11. La Russa, D.; Frisina, M.; Secondo, A.; Bagetta, G.; Amantea, D. Modulation of Cerebral Store-operated Calcium Entry-Regulatory Factor (SARAF) ja Peripheral Orai1 Focal Cerebral Ischemia and Preconditioning in Mice. Neuroscience 2020, 441, 8–21. [CrossRef]

12. Sisalli, MJ; Annunziato, L.; Scorziello, A. Novel Cellular Mechanisms for Neuroprotection in Ischemic Preconditioning: A View from Inside Organelles. Edessä. Neurol. 2015, 6, 115. [CrossRef]

13. Durukan, A.; Tatlisumak, T. Preconditioning-induced ischemic toleranssi: Ikkuna endogeeniseen aivosuojaukseen. Exp. Käännös Stroke Med. 2010, 2, 2. [CrossRef]

14. Broughton, BR; Reutens, D.; Sobey, CG; Sims, K.; Politei, J.; Banikazemi, M.; Lee, P. Apoptoottiset mekanismit aivoiskemian jälkeen. Stroke 2009, 40, 788–794. [CrossRef]

15. Zhao, H.; Sapolsky, RM; Steinberg, GK Phosphoinositide-3-Kinaasin/Akt:n selviytymissignaalireitit vaikuttavat neuronien eloonjäämiseen aivohalvauksen jälkeen. Mol. Neurobiol. 2006, 34, 249–270. [CrossRef]

16. Uzdensky, AB Apoptoosin säätely penumbrassa iskeemisen aivohalvauksen jälkeen: Pro- ja antiapoptoottisten proteiinien ilmentyminen. Apoptosis 2019, 24, 687–702. [CrossRef] [PubMed]

17. Fukunaga, K.; Kawano, T. Akt on molekyylikohde signaalinsiirtohoitoon aivojen iskeemisissä vaurioissa. J. Pharmacol. Sci. 2003, 92, 317–327. [CrossRef] [PubMed]

18. Zhao, EY; Efendizade, A.; Cai, L.; Ding, Y. Akt:n (proteiinikinaasi B) ja proteiinikinaasi C:n rooli iskemia-reperfuusiovauriossa. Neurol. Res. 2016, 38, 301–308. [CrossRef] [PubMed]

19. Delgado-Esteban, M.; Martín-Zanca, D.; Andres-Martin, L.; Almeida, A.; Bolanos, JP PTEN-inhibitio peroksinitriitillä aktivoi fosfoinositidi-3-kinaasi/Akt-hermostoa suojaavan signalointireitin. J. Neurochem. 2007, 102, 194–205. [CrossRef]

20. Manning, BD; Toker, A. AKT/PKB Signaling: Navigointi verkossa. Cell 2017, 169, 381–405. [CrossRef] [PubMed]

21. Diez, H.; Garrido, JJ; Wandosell, F. Akt iso -muotojen erityisroolit apoptoosissa ja aksonin kasvun säätelyssä neuroneissa. PLoS ONE 2012, 7, e32715. [CrossRef]

22. Santi, SA; Lee, H. Akt-isoformit ovat läsnä erillisissä subsellulaarisissa paikoissa. Olen. J. Physiol. Physiol. 2010, 298, C580–C591. [CrossRef]

23. Yang, C.; Talukder, MH; Varadharaj, S.; Velayutham, M.; Zweier, JL Varhainen iskeeminen esikäsittely vaatii Akt- ja PKA-välitteisen eNOS-aktivoinnin seriini1176-fosforylaation kautta. Cardiovasc. Res. 2012, 97, 33–43. [CrossRef] [PubMed]

24. Ouyang, Y.-B.; Tan, Y.; Comb, M.; Liu, C.-L.; Martone, ME; Siesjö, BK; Hu, B.-R. Eloonjäämistä ja kuolemaa edistävät tapahtumat ohimenevän aivoiskemian jälkeen: Akt:n fosforylaatio, sytokromi C:n vapautuminen ja kaspaasin kaltaisten proteaasien aktivaatio. Br. J. Pharmacol. 1999, 19, 1126–1135. [CrossRef] [PubMed]

25. Li, S.; Hafeez, A.; Noorulla, F.; Geng, X.; Shao, G.; Ren, C.; Lu, G.; Zhao, H.; Ding, Y.; Ji, X. Preconditioning in neuroprotection: From hypoksia to iskemia. Prog. Neurobiol. 2017, 157, 79–91. [CrossRef] [PubMed]

26. Mayo, LD; Donner, DB Fosfatidyyli-inositoli-3-kinaasi/Akt-reitti edistää Mdm2:n siirtymistä sytoplasmasta tumaan. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 11598–11603. [CrossRef]

27. Ashcroft, M.; Ludwig, RL; Woods, DB; Copeland, TD; Weber, HO; Macrae, EJ; Vousden, KH HDM2:n fosforylaatio, Akt. Oncogene 2002, 21, 1955–1962. [CrossRef]

28. Zhou, BP; Liao, J.; Xia, W. HER-2/neu indusoi p53:n ubikvitinaation Akt-välitteisen MDM2-fosforylaation kautta. Nat. Cell Biol. 2001, 3, 973–982. [CrossRef]

29. Grossman, SR; Perez, M.; Kung, AL; Joseph, M.; Mansur, C.; Xiao, Z.-X.; Kumar, S.; Howley, P.; Livingston, DM p300/MDM2-kompleksit osallistuvat MDM{4}}välitteiseen p53:n hajoamiseen. Mol. Cell 1998, 2, 405-415. [CrossRef]

30. Toth, A.; Nickson, P.; Qin, LL; Erhardt, P. Cardiomyocyte Survivalin ja hypertrofian differentiaalinen säätely MDM2:lla, E3-ubikitiiniligaasilla. J. Biol. Chem. 2006, 281, 3679–3689. [CrossRef]

31. Hausenloy, DJ; Tsang, A.; Mocanu, MM; Yellon, DM Iskeeminen esikäsittely suojaa aktivoimalla prosurvival-kinaaseja reperfuusion aikana. Olen. J. Physiol. Circ. Physiol. 2005, 288, H971–H976. [CrossRef] [PubMed]

32. Mocanu, MM; Yellon, DM p53:n alasäätely: Uusi molekyylimekanismi, joka osallistuu iskeemiseen esikäsittelyyn. FEBS Lett. 2003, 555, 302–306. [CrossRef]

33. Vecino, R.; Burguete, MC; Jover-Mengual, T.; Agulla, J.; Bobo-Jiménez, V.; Salom, JB; Almeida, A.; Delgado-Esteban, M. MDM2-p53-reitti liittyy esihoitoon indusoimaan hermosolujen toleranssiin iskemialle. Sci. Rep. 2018, 8, 1610. [CrossRef] [PubMed]

34. Rodriguez, C.; Ramos-Araque, M.E.; Domínguez-Martínez, M.; Sobrino, T.; Sánchez-Morán, I.; Agulla, J.; Delgado-Esteban, M.; Gómez-Sánchez, J.C.; Bolaños, J.P.; Castillo, J.; et al. Single-Nucleotide Polymorphism 309T>G MDM2-promoottorissa määrittää toiminnallisen tuloksen iskun jälkeen. Stroke 2018, 49, 2437–2444. [CrossRef]

35. Feng, J.; Park, J.; Cron, P.; Hess, D.; Hemmings, BA PKB/Akt-hydrofobisen motiivin Ser-473-kinaasin tunnistaminen DNA-riippuvaiseksi proteiinikinaasiksi. J. Biol. Chem. 2004, 279, 41189–41196. [CrossRef]

36. Lai, TW; Zhang, S.; Wang, YT Eksitotoksisuus ja aivohalvaus: Uusien kohteiden tunnistaminen hermosuojalle. Prog. Neurobiol. 2014, 115, 157–188. [CrossRef] [PubMed]

37. Constantino, LC; Binder, LB; Vandresen-Filho, S.; Viola, GG; Ludka, FK; Lopes, MW; Leal, RB; Tasca, CI. Fosfatidyyli-inositolin-3 kinaasireitin rooli NMDA:n esikäsittelyssä: Erilaiset mekanismit kouristuskohtauksille ja kinoliinihapon indusoima hippokampuksen hermoston rappeuma. Neurotox. Res. 2018, 34, 452–462. [CrossRef]

38. Xie, R.; Cheng, M.; Li, M.; Xiong, X.; Daadi, M.; Sapolsky, RM; Zhao, H. Akt Isoformit suojaavat eri tavalla aivohalvauksen aiheuttamalta hermovauriolta säätelemällä mTOR-toimintaa. Br. J. Pharmacol. 2013, 33, 1875–1885. [CrossRef]

39. Soriano, FX; Papadia, S.; Hofmann, F.; Hardingham, NR; Bading, H.; Hardingham, GE Esikäsittelyannokset NMDA:ta edistävät hermosolujen suojausta tehostamalla hermosolujen kiihottumista. J. Neurosci. 2006, 26, 4509–4518. [CrossRef]

40. Grabb, MC; Choi, DW:n iskeeminen toleranssi hiiren aivokuoren soluviljelmässä: kriittinen rooli NMDA-reseptoreille. J. Neurosci. 1999, 19, 1657–1662. [CrossRef]

41. Chen, M.; Lu, T.-J.; Chen, X.-J.; Zhou, Y.; Chen, Q.; Feng, X.-Y.; Xu, L.; Duan, W.-H.; Xiong, Z.-Q. NMDA-reseptorialatyyppien erilaiset roolit iskeemisessä neuronaalisessa solukuolemassa ja iskeemisessä toleranssissa. Stroke 2008, 39, 3042–3048. [CrossRef]

42. Gomez-Sánchez, JC; Esteban, MD; Rodriguez-Hernandez, I.; Sobrino, T.; De La Ossa, NP; Reverte, S.; Bolaños, JP; Gonzalez Sarmiento, R.; Castillo, J.; Almeida, A. Ihmisen Tp53 Arg72Pro -polymorfismi selittää erilaiset toiminnalliset ennusteet aivohalvauksessa. J. Exp. Med. 2011, 208, 429–437. [CrossRef]

43. Xu, W.; Gao, L.; Li, T.; Zheng, J.; Shao, A.; Zhang, J. Mesencephalic Astrocyte-Dived Neurotrofic Factor (MANF) suojaa hermosolujen apoptoosilta aktivoimalla Akt/MDM2/p53-signalointireitin aivojen sisäisen verenvuodon rottamallissa. Edessä. Mol. Neurosci. 2018, 11, 176. [CrossRef] [PubMed]

44. Sánchez-Morán, I.; Rodríguez, C.; Lapresa, R.; Agulla, J.; Sobrino, T.; Castillo, J.; Bolaños, JP; Almeida, A. Nuclear WRAP53 edistää hermosolujen selviytymistä ja toiminnallista palautumista aivohalvauksen jälkeen. Sci. Adv. 2020, 6, eabc5702. [CrossRef]

45. Burmistrova, O.; Olias-Arjona, A.; Lapresa, R.; Jimenez-Blasco, D.; Eremeeva, T.; Shishov, D.; Romanov, S.; Zakurdaeva, K.; Almeida, A.; Fedichev, PO; et ai. PFKFB3:n kohdistaminen lievittää aivoiskemia-reperfuusiovauriota hiirillä. Sci. Tasavalta 2019, 9, 1–13. [CrossRef]

46. ​​Tu, Y.; Kim, E.; Gao, Y.; Rankin, GO; Li, B.; Chen, YC Theaflavin-3, 30 -gallaatti indusoi apoptoosia ja G2-solusyklin pysähtymistä Akt/MDM2/p53-reitin kautta sisplatiiniresistenttien munasarjasyövän A2780/CP70-soluissa. Int. J. Oncol. 2016, 48, 2657–2665. [CrossRef] [PubMed]

47. Wan, W.; Hou, Y.; Wang, K.; Cheng, Y.; Pu, X.; Joo, X. LXR-623--indusoitu pitkä ei-koodaava RNA LINC01125 estää rintasyöpäsolujen lisääntymistä PTEN/AKT/p53-signalointireitin kautta. Cell Death Dis. 2019, 10, 248. [CrossRef] [PubMed]

48. Tao, J.; Cui, Y.; Duan, Y.; Zhang, N.; Wang, C.; Zhang, F. Puerarin vaimentaa liikkumis- ja kognitiivisia puutteita sekä aivotursohermosolujen vaurioita PI3K/Akt1/GSK-3-signalointireitin kautta aivoiskemian in vivo -mallissa. Oncotarget 2017, 8, 106283–106295. [CrossRef] [PubMed]

49. Janelidze, S.; Hu, B.-R.; Siesjö, P.; Siesjö, BK Akt1:n (PKB) ja p70S6K:n muutokset ohimenevässä fokaalisessa iskemiassa. Neurobiol. Dis. 2001, 8, 147–154. [CrossRef] [PubMed]

50. Pignataro, G.; Boscia, F.; Esposito, E.; Sirabella, R.; Cuomo, O.; Vinciguerra, A.; Di Renzo, G.; Annunziato, L. NCX1, ja NCX3: Kaksi uutta viivästyneen esikäsittelyn vaikuttajaa aivoiskemiassa. Neurobiol. Dis. 2012, 45, 616–623. [CrossRef]

51. Li, J.; Kurokawa, M. MDM2-stabiilisuuden säätely DNA-vaurion jälkeen. J. Cell. Physiol. 2015, 230, 2318–2327. [CrossRef]

52. Olson, DC; Marechal, V.; Momand, J.; Chen, J.; Romocki, C.; Levine, AJ Useiden mdm-2-proteiinien ja mdm-2-p53-proteiinikompleksien tunnistaminen ja karakterisointi. Oncogene 1993, 8, 2353–2360. [PubMed]

53. Uranga, RM; Katz, S.; Salvador, GA Tehostetulla fosfatidyyli-inositoli-3-kinaasilla (PI3K)/Akt-signaalilla on pleiotrooppisia kohteita hippokampuksen hermosoluissa, jotka ovat alttiina raudan aiheuttamalle oksidatiiviselle stressille. J. Biol. Chem. 2013, 288, 19773–19784. [CrossRef] [PubMed]

54. Almeida, A.; Sánchez-Morán, I.; Rodríguez, C. Mitokondrio-nukleaarinen p53-kauppa ohjaa hermosolujen herkkyyttä aivohalvauksessa. IUBMB Life 2021, 73, 582–591. [CrossRef] [PubMed]

55. Delgado-Esteban, M.; Garcia-Higuera, I.; Maestre, C.; Moreno, S.; Almeida, A. APC/C-Cdh1 koordinoi neurogeneesiä ja aivokuoren kokoa kehityksen aikana. Nat. Commun. 2013, 4, 2879. [CrossRef] [PubMed]

56. Constantino, LC NMDA-reseptorien rooli aivoresistenssin kehittämisessä esi- ja jälkikäsittelyn kautta. Aging Dis. 2014, 5, 430–441. [CrossRef]

57. Almeida, A.; Esteban, MD; Bolaños, JP; Medina, JM Hapen ja glukoosin puute aiheuttaa mitokondrioiden toimintahäiriöitä ja oksidatiivista stressiä hermosoluissa, mutta ei astrosyyteissä primääriviljelmässä. J. Neurochem. 2002, 81, 207–217. [CrossRef]

58. Lahav, G.; Rosenfeld, N.; Sigal, A.; Geva-Zatorsky, N.; Levine, AJ; Elowitz, MB; Alon, U. P53-Mdm2-palautesilmukan dynamiikka yksittäisissä soluissa. Nat. Genet. 2004, 36, 147–150. [CrossRef]

59. Li, J.; Karaplis, AC; Huang, DC; Siegel, PM; Camirand, A.; Yang, XF; Muller, WJ; Kremer, R. PTHrP ajaa rintakasvaimen alkamista, etenemistä ja etäpesäkkeitä hiirillä ja on mahdollinen terapeuttinen kohde. J. Clin. Tutki. 2011, 121, 4655–4669. [CrossRef]

60. Maestre, C.; Esteban, MD; Gomez-Sanchez, JC; Bolaños, JP; Almeida, A. Cdk5 fosforyloi Cdh1:n ja moduloi sykliini B1:n stabiilisuutta eksitotoksisuuden suhteen. EMBO J. 2008, 27, 2736–2745. [CrossRef]

61. De Tudela, MV-P.; Esteban, MD; Maestre, C.; Bobo-Jiménez, V.; Jiménez-Blasco, D.; Vecino, R.; Bolaños, JP; Almeida, A. Mitokondriaalisen sykliini B1-Sykliiniriippuvaisen kinaasin-1 Bcl-xL-ATP-syntaasivuorovaikutuksen säätely määrittää hermosolujen selviytymisen. J. Neurosci. 2015, 35, 9287–9301. [CrossRef] [PubMed]

62. Bobo-Jiménez, V.; Esteban, MD; Angibaud, J.; Sánchez-Morán, I.; de la Fuente, A.; Yajeya, J.; Nägerl, UV; Castillo, J.; Bolaños, JP; Almeida, A. APC/CCdh1-Rock2-reitti ohjaa dendriittien eheyttä ja muistia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2017, 114, 4513–4518. [CrossRef] [PubMed]