Isän nikotiini parantaa pelkomuistia, vähentää nikotiinin antamista ja muuttaa aivotursoalueen geneettistä ja hermostoa jälkeläisissä

Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com

Lisa R. Goldberg1*|Dana Zeid1*|Munir Gunes Kutlu2|Robert D. Cole3|Valeria Lallai4|Aswathy Sebastian5|István Albert5|Christie D. Fowler4|Vinay Parikh6|Thomas J. Gould1

1 Biobehavioral Healthin laitos, Penn State University, University Park, Pennsylvania

2 Farmakologian laitos, Vanderbilt School of Medicine, Nashville, Tennessee

3 College of Pharmacy, University of Kentucky, Lexington, Kentucky

4 Neurobiologian ja käyttäytymisen laitos, Kalifornian yliopisto Irvine, Irvine, Kalifornia

5Bioinformatiikka, biokemia ja molekyylibiologia, Penn State University, University Park, PA

6 Psykologian laitos, Temple University, Philadelphia, Pennsylvania

Abstrakti

Nikotiinin käyttö on edelleen erittäin yleistä tupakka- ja sähkötupakkatuotteissa, joita kulutetaan maailmanlaajuisesti. Kuitenkin lisääntyvä näyttö sukupolvien välisestä epigeneettisestä periytymisestä viittaa siihen, että nikotiinin käyttö voi muuttaa käyttäytymistä ja neurobiologiaa seuraavilla sukupolvilla. Testasimme kroonisen isän nikotiinialtistuksen vaikutuksia C57BL6/J-hiirillä F1- ja F2-jälkeläisten pelon eheytymiseen sekä ehdolliseen pelon sukupuuttoon ja spontaaniin toipumiseen, nikotiinin itseantoon, hippokampuksen kolinergiseen toimintaan, RNA:n ilmentymiseen ja DNA-metylaatioon F1:ssä. jälkeläisiä. Isän nikotiinille altistuminen liittyi lisääntyneeseen kontekstuaaliseen ja vihjailevaan pelon hoitoon ja sammuneiden pelkomuistojen spontaaniin palautumiseen. Lisäksi nikotiinivahvistus väheni nikotiinin omistavilla hiirillä, kuten arvioitiin itseannostelun paradigmassa. Nämä käyttäytymisfenotyypit yhdistettiin muuttuneeseen reaktioon nikotiinille, lisääntyneeseen hippokampuksen nikotiiniasetyylikoliinireseptorin sitoutumiseen, vähentyneeseen hippokampuksen kolinergisiin virtoihin ja muuttuneeseen hippokampuksen geenien metylaatioon ja ilmentymiseen liittyen hermoston kehitykseen ja plastisuuteen. Geeniekspressio-analyysi viittaa useiden sukupolvien vaikutuksiin laajempiin geeniverkostoihin, jotka voivat olla mukana neuroplastisuudessa ja mielenterveyshäiriöissä. Muutokset pelon eheyttämisessä viittaavat samalla tavoin fenotyyppeihin, jotka ovat analogisia posttraumaattisen stressin kaltaisten ahdistuneisuushäiriöiden kanssa.

AVAINSANAT: kolinerginen, hippokampus, oppiminen, monisukupolvi, nikotiini, sukupolvien yli

cistanchen vaikutukset

1. ESITTELY

Kasaantuvat todisteet viittaavat siihen, että huumeille altistumisen vaikutukset ulottuvat yksilön ulkopuolelle ja vaikuttavat altistumattomien jälkeläisten fysiologisiin ja käyttäytymisfenotyyppeihin.{0}} Nikotiinin vaikutusten karakterisointi sukupolvien välillä on ratkaisevan tärkeää ottaen huomioon tupakkatuotteiden käytön4 yleisyyden ja dramaattisen kasvun. 5 Koska nikotiinille altistuminen vaikuttaa aivojen kolinergisiin järjestelmiin, se aiheuttaa merkittäviä muutoksia aivojen toiminnassa, mikä voi olla nikotiiniriippuvuuden taustalla ja lisätä riskiä psykiatrisille häiriöille, mukaan lukien masennus6 ja ahdistuneisuus.7 Epigeneettiset muutokset kolinergisen aktivaation jälkeen voivat mahdollistavat jatkuvat vaikutukset solujen ja piirien toimintaan.8,9 Viime aikoihin asti uskottiin, että nämä epigeneettiset modifikaatiot pyyhittiin pois ituradan muodostumisen yhteydessä ja siten eristettiin seuraavilta sukupolvilta. Yhdessä sukupolvessa hankitut epigeneettiset modifikaatiot, mukaan lukien DNA:n metylaatio, histonin posttranslationaaliset modifikaatiot ja ei-koodaavat RNA:t, voivat kuitenkin periytyä seuraavassa sukupolvessa.10,11 Nämä epigeneettiset modifikaatiot voivat välittää vanhempien nikotiinialtistuksen monisukupolvia ja sukupolvien välisiä vaikutuksia jälkeläisten käyttäytymiseen ja neurobiologiaan. .

Useiden riippumattomien laboratorioiden jyrsijätutkimukset ovat alkaneet tunnistaa vanhempien nikotiinialtistuksen useiden sukupolvien ja sukupolvien välisiä seurauksia. Tämä työ on tähän mennessä tunnistanut vanhempien nikotiinille altistumisen vaikutukset masennusta ja ahdistusta muistuttaviin fenotyyppeihin,1 kognitiiviseen joustavuuteen,2 tarkkaavaisuus-hyperaktiivisuushäiriön (ADHD) kaltaiseen käyttäytymiseen3 ja geeniekspressioon.1,2 nikotiinille altistuminen voi vaikuttaa endofenotyyppeihin, jotka liittyvät nikotiiniriippuvuuteen ja mielenterveyteen. Olemme esimerkiksi osoittaneet, että nikotiinille altistuminen moduloi kontekstuaalista pelon ehdollistamista, joka on malli hippokampuksesta riippuvaisesta pelon oppimisesta, joka liittyy haavoittuvuuteen mielenterveyshäiriöille, kuten posttraumaattiselle stressihäiriölle (PTSD) ja riippuvuudelle.12-14 Nikotiini Hippokampus moduloi vaikutuksia kontekstuaaliseen pelon oppimiseen.15,16 Olemme havainneet, että akuutti nikotiinialtistus tehostaa hippokampuksesta riippuvaista pelon oppimista,15,17 heikentää kontekstuaalisen pelon häviämistä,18,19 ja lisää kontekstuaalisen pelon spontaania toipumista. sukupuuttoon.18 Kuitenkaan isän nikotiinialtistuksen useiden sukupolvien ja sukupolvien välisiä vaikutuksia näihin fenotyyppeihin ei ole tutkittu. Lisäksi aiemmissa tutkimuksissa ei ole luonnehdittu nikotiinin useiden sukupolvien välisiä vaikutuksia kolinergiseen toimintaan. Monen sukupolven perinnöllä tarkoitetaan fenotyyppejä, jotka syntyvät välittömästi altistuneiden yksilöiden jälkeisessä sukupolvessa, kun taas sukupolvien välisellä perinnöllä tarkoitetaan epigeneettisen tiedon sukupolvien välistä sukupolvivälitteistä periytymistä ilman suoria ympäristövaikutuksia, jotka johtavat fenotyyppiseen vaihteluun.11 Tässä tarkastelimme molempia useiden sukupolvien välisiä vaikutuksia. ja isän nikotiinille altistumisen sukupolvien väliset vaikutukset kontekstuaaliseen ja vihjaiseen pelon oppimiseen F1- ja F2-sukupolvissa sekä nikotiinin itseantoon, hippokampuksen nikotiiniasetyylikoliinireseptorin (nAChR) sitoutumiseen, hippokampuksen kolinergiseen toimintaan, hippokampuksen geeniekspressioon ja metylaatioon hippokampuksen DNA:ssa F1-sukupolvi. Oletamme, että isän nikotiinille altistuminen vaikuttaa pelon hoitamiseen, hippokampuksen geenien ilmentymiseen ja toimintaan jälkeläisissä ja esijälkeläisissä.

cistanche-uutteen vaikutukset

2 MENETELMÄT JA MATERIAALIT

2.1 Aiheet

Koehenkilöt olivat uros- ja naaraspuolisia C57BL/6J-hiiriä (8-20 viikon ikäisiä, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Haaremikasvatusta lukuun ottamatta kaikki eläimet pidettiin ryhmässä 12 tunnin valo-/pimeäjaksolla ja ad libitum mahdollisuus saada ruokaa ja vettä. Itseannostelun aikana koehenkilöille annettiin ruokaa rajoitetusti 85-90 prosenttiin heidän vapaan ruokinnan saaneen ruumiinpainosta, ja vettä annettiin ad libitum. Kaikki käyttäytymistestit suoritettiin kello 9:00 ja 18:00 välisenä aikana. Kaikki menettelyt suoritettiin NIH:n laboratorioeläinten hoito- ja käyttöoppaan mukaisesti ja Penn State Universityn, Temple Universityn tai University of California Irvine IACUC-komiteoiden hyväksymät.

2.2 Isän nikotiinialtistus

Miehet (8 viikkoa) saivat 0,9 prosenttia steriiliä suolaliuosta tai nikotiinivetytartraattisuolaa (12,6 mg/kg/vrk, vapaa peruspaino – Fisher Scientific, Waltham, MA tai MP Biomedical, Santa Ana, CA) liuotettuna 0,9 prosenttia steriiliä suolaliuosta, toimitettuna ihonalaisesti osmoottisten minipumppujen kautta (Alzet, malli 1004, Durect, Cupertino, CA) 28 päivän ajan. Tämä annos tuottaa plasman nikotiini- ja kotiniinipitoisuudet, jotka ovat verrattavissa kohtalaisille tupakoitsijoille.20,21

2.3 F1- ja F2-hiirten sukupolvi

Nikotiinin puoliintumisaika hiirillä on noin 6 minuuttia.22 Aiemmin on osoitettu, että nikotiinin vieroitusvaikutukset häviävät 4 päivää nikotiinin poistamisen jälkeen.23-25 Tästä syystä nikotiinihoidon ja nikotiinihoidon välillä on 4 päivän viive. jalostus toteutettiin nikotiinin systeemisen eliminaation varmistamiseksi ennen jalostusta. Urospuoliset hiiret asetettiin häkkeihin kahden naiivin C57BL/6 J -naaraan (8-20 viikon ikäisen) kanssa 2 viikon ajaksi F1-jälkeläisten synnyttämiseksi. F2-hiiret luotiin parittelemalla naiivit urospuoliset F1-hiiret naiivien naaraiden kanssa.

2.4 Pelon ehdollistaminen

Pelon hoito- ja sammutusmenetelmiä on kuvattu yksityiskohtaisesti aiemmin.19 Lyhyesti sanottuna hiiriä koulutettiin ja testattiin melua vaimentavissa kammioissa (18,8 × 20 × 18,3 cm, 65 dB taustamelu; MED Associates, St. Albans, VT). F1- ja F2-hiiret olivat pelkoehdollisia kahdella ehdollisella ärsykkeellä (CS, 30 s, 85‐dB valkoinen kohina) - ehdollista ärsykettä (USA, 2 s, 0,57 mA jalkaiskut) parisuhteella 120 sekunnin välein. Nikotiinin akuutteja vaikutuksia pelon hoitamiseen F1- ja F2-hiirillä tutkitaan jälkeläiset saivat akuuttia nikotiinia (0,09 mg/kg, NIC vapaan peruspaino, ip; nikotiinivetytartraattisuolaa, Fisher Scientific) tai suolaliuosta (SAL) 2–4 minuuttia ennen koulutukseen ja testaukseen. Kaksikymmentäneljä tuntia harjoituksen jälkeen hiiret palautettiin harjoituskontekstiin 5 minuutiksi kontekstuaalisen jäätymisen arvioimiseksi. Kontekstikohtaisen testauksen jälkeen hiiret sijoitettiin erillisiin kammioihin arvioimaan vihjatun pelon oppimista. Kokeilijat, jotka olivat sokeutuneet olosuhteille, arvioivat jäätymisen, joka määritellään vapaaehtoisen liikkeen puuttumisena hengityksen lisäksi, käyttämällä puolueetonta aikanäytteenottomenetelmää.19 Mahdollisten kattovaikutusten tutkimiseksi cued-testauksen aikana erillinen F1-hiiriryhmä sai identtisen koulutuksen vain yhdellä CS‐US:lla. pariliitosta, kontekstuaalista pelon sammumista ja spontaania toipumista tutkittiin myös. Pelon sammuminen tapahtui viiden peräkkäisen istunnon aikana kontekstuaalisen ja vihjaisen pelkotestauksen jälkeisestä päivästä alkaen. Viimeisen ekstinktioistunnon jälkeen hiiret jätettiin häiritsemättä kotihäkkeihinsä 7 päiväksi ja testattiin sitten uudelleen harjoituskontekstissa spontaanin toipumisen varalta. Sen määrittämiseksi, johtuivatko havaitut erot pelon eheyttämisessä eroista shokkiherkkyydessä, ahdistuneisuudessa tai laajemmissa oppimisvajeissa, uros- ja naaraspuolisia NIC- ja SAL-Sired-eläimiä testattiin lisäksi avoimessa kentässä, shokkiherkkyyttä, kohonnutta plus sokkeloa ( EPM) ja uudet objektintunnistusparadigmat (katso tukitiedoista täydelliset menetelmät ja tulokset).

2.5 Ruoan ja suonensisäisen nikotiinin itseannostelu

A separate cohort of adult SAL‐Sired and NIC‐Sired F1 mice were used for food and nicotine self‐administration studies. Beginning at 6 weeks of age, male F1 mice were weighed, mildly food‐restricted to 85% to 90% of their free‐feeding body weight, and then trained to press a lever in an operant chamber (Med Associates) for food chow pellets (20 mg; TestDiet, Richmond, IN) under a fixed‐ratio 5, time out 20 seconds (FR5TO20 sec) schedule of reinforcement (see Supporting Information for full methods). Once stable responding was achieved (>25 pellettiä per istunto kolmen peräkkäisen istunnon aikana), koehenkilöt katetroitiin kaulalaskimossa isofluraanin (1 % - 3 %)/happihöyryanestesiassa, kuten aiemmin on kuvattu.26 Hiirten annettiin toipua leikkauksesta vähintään 72 tuntia ennen pääsyä vastata uudelleen ruokapalkkioon. Ruokavasteen palauttaminen varmistaa, että hiiret ovat toipuneet riittävästi suonensisäisen leikkauksen jälkeen ja niillä on normaali operanttivaste sen jälkeen, kun leikkauskammioihin pääsy on viivästynyt. Hiirten annettiin sitten itse antaa suonensisäistä (IV) nikotiinia 1 tunnin päivittäisissä istunnoissa 6–7 päivänä viikossa (nikotiinivetytartraattisuola liuotettuna 0,9-prosenttiseen steriiliin suolaliuokseen, {{1}{101} {12}}}}.03 mg/kg/infuusio, vapaa peruspaino; MP Biomedical, Santa Ana, CA). IV nikotiini toimitettiin Razel-ruiskupumpulla (Med Associates). Jokaisessa istunnossa oli kaksi sisäänvedettävää vipua (yksi aktiivinen, yksi ei-aktiivinen). Aktiivisen vivun vastekriteerien täyttäminen johti suonensisäisen nikotiini-infuusion antamiseen (0.{{20}}3 ml infuusiotilavuus; FR5TO20 sekunnin aikataulu). Ei-aktiivisen vivun vastaukset kirjattiin, mutta niillä ei ollut suunniteltuja seurauksia. Kahdeksan ottokerran jälkeen 0,03 mg/kg/infuusio, infuusioannos vaihtui 0,1 mg/kg/infuusiokerraksi kuudeksi jaksoksi. Jokaisen annoksen osalta tilastollisiin analyyseihin käytettiin kolmen viimeisen istunnon keskimääräistä saantia. Katetrit huuhdeltiin päivittäin fysiologisella steriilillä suolaliuoksella (0,9 % w/v), joka sisälsi hepariinia (100 USP yksikköä/ml). Katetrin läpinäkyvyys varmistettiin Brevitalilla (metoheksitalinatrium, Eli Lilly, Indianapolis, IN) nikotiinin itseannosteluvaiheen jälkeen. Uusiutumiseen liittyvän käyttäytymisen arvioimiseksi hiirillä testattiin himon inkubaatiota heti viimeisen 0,1 mg/kg/infuusioannoksen laskimonsisäisen nikotiiniannoksen jälkeen; tässä menettelyssä hiirten annetaan reagoida aktiivisella vivulla, mutta he eivät saa nikotiini-infuusioita. Ensimmäisessä perustason inkubaatioistunnossa (päivä 1) hiiret sijoitettiin operanttikammioihin FR5TO20 sek -aikataulun mukaisesti ehdollisen merkkivaloaktivoinnin kanssa. Sen jälkeen hiiriä pidettiin kotihäkeissä 20 päivän ajan. Abstinenssin päivänä 21 hiiret tutkittiin himon inkuboinnin varalta aktiivisen vipuvalon annettaessa FR5TO20 sek aikataulun mukaisesti. Tutkimukset suorittivat kokeet, jotka olivat sokeutuneet ryhmäolosuhteisiin, ja käyttäytymisvasteet kirjattiin automaattisesti MedAssociates-ohjelmistolla.

2.6 Nikotiiniasetyylikoliinireseptorin sitoutuminen

Radioligandin sitoutumismääritys16 suoritettiin käyttämällä hippokampeja 8 viikon ikäisistä NIC-Sired (5 M ja 10F) ja SAL-Sired (9 M ja 6F) F1-hiiristä. Näytteet homogenisoitiin käyttämällä lyysipuskuria (5 mM Tris plus 5 mM EDTA plus 5 mM EGTA), sentrifugoitiin 100 000 g 30 minuuttia 4 asteessa, suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin ja sentrifugoitiin uudelleen. Pelletit suspendoitiin uudelleen Tris/10 % sakkaroosipuskuriin ja inkuboitiin [3H]epibatidiinin ([3H]EB) kanssa (~2 nM perustuen 27,28:aan) (spesifinen aktiivisuus 54,1 Ci/mmol, PerkinElmer, Boston, MA) 1 tunnin ajan huoneenlämmössä. [3H]EB valittiin nAChR-sitoutumiseen, sillä aiemmat tulokset osoittivat, että aivotursohermoston heteromeeriset 4 2 nAChR:t välittävät nikotiinin vaikutuksia pelon hoitoon.17 Epäspesifinen sitoutuminen arvioitiin 300 µM nikotiinin (nikotiinivetytartraattisuolan) läsnä ollessa. liuotettuna Tris-puskuriin, vapaan emäksen pitoisuus). [3H]EB:hen sitoutuneet nAChR:t suodatettiin (24-kuoppainen solukeräin, Brandel Co, Gaithersburg, MD) ja nestetuikelaskija (Tri-Carb 2810 TR, Perkin Elmer, Boston, MA) mittasi suodattimen radioaktiivisuutta. Spesifinen sitoutuminen ilmaistuna fmol/mg kudosta laskettiin erotuksena kokonais- ja epäspesifisen sitoutumisen välillä.16

2.7 In vivo amperometriset kolinergiset tallenteet

Erillistä kohorttia naiiveja 10-20 viikon ikäisiä NIC-Sired- ja SAL-Sired F1-hiiriä käytettiin arvioimaan muutoksia hippokampuksen kolinergisessa transmissiossa amperometriaa käyttäen. Keraamiset mikroelektrodit (Center for Microelectrode Technology, Lexington, KY), joissa oli 4 (15 × 333 μm) platinatallennuskohtaa pareittain (ylempi ja alempi), päällystettiin koliinioksidaasilla (EC-numero 1.1.3.17; Sigma‐). Aldrich, St. Louis, MO), kuten aiemmin on raportoitu.29 Elektrodit sähköpolymeroitiin meta-fenyleenidiamiinilla (m-PD; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) selektiivisyyden lisäämiseksi koliinivirtojen havaitsemisessa. Mikroelektrodeja, joiden herkkyys oli suurempi tai yhtä suuri kuin 3 pA/μM ja havaitsemisraja alle tai yhtä suuri kuin 400 nM koliinille, käytettiin asetyylikoliinin (ACh) vapautumisen herkän indeksin saamiseksi.30 Eläimet nukutettiin uretaanilla (1,2-1,5). g/kg, ip) ja entsyymillä päällystetyt mikroelektrodit laskettiin stereotaksisesti dorsaalisiin (A/P -1,7 mm, M/L ± 1,5 mm, D/V -2,3 mm) tai ventraalisiin (A/P -3,1 mm, M /L ± 3,0 mm, D/V −4,3 mm) hippokampus. Ventraalinen ja dorsaalinen hippokampus arvioitiin erikseen, koska ne vaikuttavat eri tavalla kontekstuaaliseen pelon ehdollistumiseen: ventraalisella hippokampuksella (vHPC) on näkyvämpi rooli pelon assosiaatiossa ja ilmentymisessä, kun taas dorsaalinen hippokampus (DHCP) on kriittinen kontekstuaalisen muistin kannalta.31 Ag/ AgCl-referenssielektrodit istutettiin kontralateraaliseen rostraaliseen aivokuoreen.

Amperometriset tallennukset suoritettiin 2 Hz:llä käyttämällä kiinteää potentiaalia plus 0,7 V, ja tiedot digitoitiin (FAST-16 potentiostaatti, Quainton, Nicholasville, KY). Taustavirrat stabiloitiin 60 minuutin ajan, sitten lääkkeet laitettiin hippokampukseen käyttämällä elektrodiin kiinnitettyä lasikapillaaria (kärjen halkaisija: 15 μm). Depolarisaation aiheuttama ACh:n vapautuminen mitattiin käyttämällä joko lyhyitä kaliumpulsseja (KCl 70 mM; 100 NL) tai NIC-pulsseja (1 mM vapaa emäs, nikotiinitartraatti; 100 NL) 2-10 psi:llä joka 2. minuutti. Tallenteet tasapainotettiin aivotursoalueen (dorsaalinen tai ventraalinen) ja lääkkeen (kalium tai NIC) osalta. Koliinisignaalin amplitudit mitattiin entsyymillä päällystetyn kanavan virran muutoksella perusvirrasta ja muunnettiin koliinin μM ekvivalenteiksi in vitro -kalibroinnin perusteella. Itsereferenssi otettiin käyttöön artefaktien eliminoimiseksi vähentämällä virrat vartiokanavista.29 Mikroelektrodien sijoitus varmistettiin koronaalisten aivotursoosien Nissl-värjäyksellä (kuva S1). Tilastolliseen analyysiin käytettiin kahden vasteen keskiarvoja lääkekäsittelyä kohden eläintä kohti.

2.8 Tilastollinen analyysi

Tilastolliset vertailut suoritettiin käyttämällä SPSS:ää (IBM, Armonk, NY) tai GraphPad Prismia (La Jolla, CA, USA). Poikkeavat arvot määritettiin arvoilla, jotka ovat 2 keskihajontaa keskiarvon yläpuolella. Jos poikkeava poikkeama havaittiin, tiedot sisällytetään tulososaan. Merkittävyyden kriteeriksi asetettiin=,05. Tilastollinen analyysi suoritettiin alun perin mukaan lukien sukupuoli tekijänä kaikissa kokeissa, joissa testattiin sekä uros- että naarasjälkeläisiä. Analyysit romahtivat sukupuolen välillä, kun kolmi- tai kaksisuuntaisia ​​vuorovaikutuksia seksin kanssa ei havaittu (P > 0,05). Tiedot analysoitiin t-testillä, yksisuuntaisella tai 2-suuntaisella ANOVAlla tarpeen mukaan. Merkittäviä pää- tai vuorovaikutusvaikutuksia seurattiin LSD:n post hoc -vertailuilla. Toistettujen mittausten ANOVA-testejä seurasi Bonferroni post hoc -vertailu ja korjaus useiden vertailujen osalta. Jos havaittiin epäyhtenäisiä variansseja, käytettiin Welchin t-testiä epätasaisille varianssille ja vapausasteet pyöristettiin alaspäin.

2.9 RNA/DNA-eristys

Aikuiset F1-hiiret (8 viikkoa vanhat; n=3 M ja 3 F per ryhmä) lopetettiin kohdunkaulan dislokaatiolla. Hippokampit leikattiin nopeasti vatsa- ja selkäosiksi (suhteessa 1:1), yhdistettiin vasemmalta ja oikealta puolelta ja jäädytettiin nopeasti kuivajäällä. DNA ja RNA eristettiin yhdessä ja puhdistettiin käyttämällä AllPrep DNA/RNA Mini Kit -sarjaa (Qiagen, Valencia, CA). RNA- ja DNA-pitoisuus ja laatu arvioitiin käyttämällä NanoDrop2000:ta (NanoDrop, Wilmington, DE) ja Agilent Bioanalyzeriä (Agilent, Santa Clara, CA). RNA-uutoille pienin RNA-integriteettiluku (RIN) oli 8,5.

2.10 Transkriptioanalyysi kautta

RNA-sekvensointikirjastot valmistivat Huck Institutes of the Life Sciences Genomics Core Facility (Penn State University) 15 0 bp yksipään lukuja varten käyttämällä Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit -pakkausta (Illumina, San Diego, CA) ja sekvensoitu Illumina HiSeq 2500 -laitteessa pikakäyttötilassa (kolme peräkkäistä ajoa noin 10 miljoonaa lukua näytettä kohti). FASTQ-tiedostojen laatu tarkistettiin FASTQC:n avulla, ja niiden keskimääräiset lukukohtaiset Phred-laatupisteet olivat yli 30 (eli alle 0,1 prosentin sekvensointivirhe). FASTQ-tiedostot kohdistettiin hiiren referenssigenomiin (mm10; UCSC Genome Browser) käyttämällä TopHat (v2.1.0)32:ta Galaxy Project33:ssa. Kalvosinnappeja ja Cuffmerge (v2.2.1.0)34 käytettiin transkriptien kokoamiseen kartoitetuista lukemista ja transkriptiotiedostojen yhdistämiseen lopullista transkription kokoamista varten. FDR-korjatut P-arvot laskettiin differentiaalista geeniekspressiota varten NIC-Sired- ja SAL-Sired-näytteistä käyttäen Cuffdiffia (v2.2.1.3),34 ja FDR-standardin raja-arvo 0,05,35. Transkriptiotietojoukot talletettiin. Gene Expression Omnibusiin.

2.11 Rikastusanalyysi

Differentiaalisesti ekspressoituneet geenit analysoitiin käyttämällä kekseliäispolkuanalyysiä (IPA, ajettu joulukuussa 2018; www.qiagen.com/ingenuity; Qiagen, Redwood City, CA, USA)36 assosiatiivisten biologisten verkostojen mahdollisen rikastumisen paljastamiseksi. Ajoparametrit määrittelivät enintään 35 molekyyliä geeniverkkoa kohden ja rajoittivat analyysin nisäkkään keskushermostokudokseen tai -solulinjoihin. Tilastollinen merkitsevyys rikastamiselle määritettiin käyttämällä oikeansuuntaista Fisherin tarkkaa testiä, joka oli korjattu useilla testeillä.

2.12 Kohdennettu bisulfiittisekvensointi

DNA:ta, joka oli eristetty RNA:n kanssa (katso kohta 2.9), käytettiin DNA-metylaatioanalyysiin. RNA-seq tunnisti 952 ja 162 eri tavalla ilmentynyttä geeniä vHPC:ssä ja DHCP:ssä, vastaavasti. Näistä yhdistetyistä luetteloista 1010 ainutlaatuista geeniä valittiin rikastettaviksi bisulfiitti-seq:llä käyttämällä mukautettua SeqCap Epi Enrichment System -järjestelmää (Roche, Pleasanton, CA, USA; Taulukko S1).38 Kohdennettu bisulfiitti. sekvensointi suoritettiin Penn State Huck Institutes of the Life Sciences Genomics Core Facilityssä. Kirjastot rakennettiin käyttämällä KAPA Hyper Prep -pakkausta (Kapa Biosystems, Wilmington, MA). Natriumbisulfiitilla muunnetut kirjastot PCR-amplifioitiin ja rikastettiin valituille genomialueille käyttämällä mukautettua sieppauskoetinsarjaa (SeqCap Epi Choice Probes; Roche, Pleasanton, CA, USA). Siepattu DNA sekvensoitiin Illumina HiSeq 2500:lla käyttämällä 100 nt paripään lukuja. FASTQ-tiedostojen laatu tarkistettiin FASTQC:n avulla. Illumina-adapterisekvenssit poistettiin ja huonolaatuiset pohjat leikattiin Trimmomaticilla.39 Huonolaatuinen pohjan trimmaus suoritettiin liukuvalla ikkunalla, trimmattiin, kun neljän emäsparin ikkunan keskimääräinen laatu putosi alle 20:n kynnyksen. vähimmäislukupituus 35. Leikkauksen jälkeen FASTQ-tiedostot saivat keskimääräiset lukukohtaiset Phred-laatupisteet yli 30 (eli alle 0,1 prosentin sekvensointivirhe). Leikatut lukemat kartoitettiin hiiren referenssigenomiin (mm10) käyttämällä Bowtie240:tä, joka on toteutettu Bismarkissa.41 Bismarkin metyyli_-uutetta käytettiin CpG-metylaatiotietojen erottamiseen ja metylaatioraporttien luomiseen. MethylKit42:ta käytettiin differentiaalisesti metyloituneiden alueiden (DMR) analysointiin. Metylaatiosta tehtiin yhteenveto 500 emäsparin ei-päällekkäisistä ikkunoista ja suoritettiin differentiaalinen metylaatioanalyysi standardin FDR:n ollessa 0,05,35. Tietosarjat on talletettu Gene Expression Omnibusiin.

Cistanche-uutteen edut

3 TULOSTA

3.1 Isän nikotiini tehostaa kontekstuaalista pelkoa ja kumoaa akuutin nikotiinin lisääntyneen kontekstuaalisen pelon ehdottelun F1- ja F2-sukupolven hiirillä

NIC-Sired- ja SAL-Sired F1-uros- ja -naarashiiret olivat pelkokäsiteltyjä akuutin SAL- tai NIC-antamisen jälkeen (0.09 mg/kg ip, kuva 1A). Täydellinen analyysi lähtötilanteesta, CS:ää edeltävästä ja CS:n jäädyttämisestä sisältyy tukitietoihin. Kolmisuuntainen ANOVA kontekstuaalisesta jäätymisestä isähoidon, akuutin lääkehoidon ja sukupuolen tekijöinä paljasti merkittävän isä × akuutin lääkehoidon yhteisvaikutuksen (F(1,36)=32.75, P < .{{27="" }}01).="" koska="" sukupuolen="" ja="" isän="" tai="" akuutin="" lääkehoidon="" välillä="" ei="" ollut="" merkittävää="" yhteisvaikutusta,="" suoritettiin="" 2-suuntainen="" anova,="" joka="" romahti="" sukupuolen="" välillä="" ja="" paljasti="" merkittävän="" isähoidon="" ×="" akuutin="" lääkehoidon="" yhteisvaikutuksen="" (f(1,40)="20.96)." ,="" p="">< 0,001).="" post="" hoc="" -vertailut="" osoittivat,="" että="" suolaliuoksella="" käsitellyt="" nic-sired="" f1="" -hiiret="" osoittivat="" lisääntynyttä="" kontekstuaalista="" pelkoa="" verrattuna="" suolaliuoksella="" käsiteltyihin="" sal-sired="" f1="" -hiiriin="" (t20="2.73," p="">< 0,05).="" aiempien="" havaintojen="" mukaisesti="" 43="" akuutti="" nic="" annoksella="" 0,09="" mg/kg="" aiheutti="" lisääntynyttä="" kontekstuaalista="" pelkoa="" sal-sired-hiirillä="" (t22="2.99," p="">< .01).="" kuitenkin="" akuutti="" nic="" annoksella="" 0,09="" mg/kg="" heikensi="" kontekstuaalista="" pelkoa="" nic-siirteisillä="" hiirillä="" (t18="3.36," p="">< .01).="" kaiken="" kaikkiaan="" kontekstin="" jäädytystasot="" nic-sired="" nic-hiirillä="" olivat="" vertailukelpoisia="" sal-sired="" sal-hiirillä="" havaittuihin="" molemmilla="" annoksilla="" 0,09="" mg/kg="" (p=""> 0,05).

Lisäksi uros- ja naaraspuoliset NIC- ja SAL-Sired-eläimet testattiin iskunherkkyyden (kuva S2), kohonneen plus labyrintin (EPM, kuva S3), avoimen kentän ja uusien esineiden tunnistusparadigmien osalta (kuva S4, katso tukitiedot täydelliset menetelmät). ja tulokset). Lukuun ottamatta NIC-Sired-naaraita EPM:ssä (joilla esiintyi lisääntynyttä ahdistuneisuutta muistuttavaa käyttäytymistä) ja NIC-Sired-eläimiä sokkiherkkyydessä (joilla oli vähentynyt äänellinen reaktiivisuus sokkiin, mikä ei häiritsisi lisääntynyttä pelon oppimisen monisukupolvellista fenotyyppiä) havaittiin NIC- ja SAL-Sired-hiirten välillä.

KUVA 1 Isän nikotiini tehostaa kontekstuaalista pelon ehdollistamista ja vaimentaa akuuttia nikotiinivaikutusta pelon ehdoinnille. Kontekstuaalinen jäädytys oli huomattavasti korkeampi NIC-Sired plus SAL:ssa verrattuna SAL-Sired plus SAL -kontrolleihin. Akuutti nikotiini annoksella 0,09 mg/kg tehosti kontekstuaalista pelkoa SAL-Siredissä, mutta vähensi merkittävästi kontekstuaalista pelkoa NIC-Sired-eläimissä (n=10-12 ryhmää kohti). B, Kontekstuaalinen jäätyminen oli merkittävästi korkeampi NIC-grandsire plus SAL:ssa verrattuna SAL-grandsire plus SAL -kontrolleihin (n=9-11 ryhmää kohti). Virhepalkit osoittavat keskiarvon standardivirheen (SEM), *P <>

Sen määrittämiseksi, jatkuiko heikentynyt kontekstuaalinen pelkoehkäisy seuraavaan sukupolveen (F2), NIC-grandisre- ja SAL-grandisre-uros- ja -naaras F2-hiiret kasvatettiin naiiveista F1-uroshiiristä. Täydellinen analyysi lähtötilanteesta, CS:ää edeltävästä ja CS:n jäädyttämisestä sisältyy tukitietoihin. Kontekstuaalisen jäätymisen 3-suuntainen ANOVA suoritettiin käyttämällä grandsire-hoitoa, akuuttia lääkehoitoa ja sukupuolta riippumattomina tekijöinä (kuva 1B). Koska sukupuolen ja isän tai akuutin lääkehoidon välillä ei ollut merkittävää vuorovaikutusta, suoritettiin 2-suuntainen ANOVA, joka romahti sukupuolen välillä. Merkittävä päävaikutus isällä (F(1,37)=9.88, P < .01)="" havaittiin,="" ja="" post="" hoc="" -vertailut="" osoittivat,="" että="" nic-grandisre-hiirillä="" oli="" lisääntynyt="" kontekstuaalinen="" pelko="" ehdoin="" verrattuna="" verrattuna.="" sal-grandsire-hiirillä="" (t39="3,04," p="">< 0,01).="" lisäksi="" sal-grandsire-hiirillä,="" joille="" annettiin="" akuuttia="" nic:tä,="" oli="" parannettu="" kontekstuaalista="" pelkoa="" (t19="2.41," p="0.026)," mutta="" akuutti="" nic="" ei="" tehostanut="" kontekstuaalista="" pelkoa="">

KUVA 2 Isän antama nikotiini tehostaa vihjailevaa pelkoa ja spontaania pelkomuistin palautumista. Mahdollisten kattovaikutusten tutkimiseksi cued-testauksen aikana erillinen F1-hiiriryhmä sai identtisen koulutuksen vain yhdellä CS‐US-parilla. Sekä kontekstuaalinen että vihjattu pelko ehdittiin lisätä NIC-Sired-hiirillä verrattuna SAL-Sired-hiiriin, jotka oli koulutettu yhdellä CS-US-parilla (n=8-10 ryhmää kohti). B, Isän nikotiinille altistuminen ei vaikuttanut kontekstuaalisen pelon häviämiseen, mutta lisäsi pelkomuistin spontaania palautumista 7 päivää viimeisen sammutusistunnon jälkeen (n=8-10 ryhmää kohti). Virhepalkit osoittavat keskiarvon standardivirheen (SEM), *P <>

3.2 Isän nikotiini tehostaa F1-sukupolven hiirten ilmaistua pelkoa

Sen tutkimiseksi, estikö kattovaikutus ryhmäerojen havaitsemisen vihjaillun pelon ehdoinnille (katso tukitiedot), erillinen ryhmä F1-hiiriä koulutettiin yhdellä CS‐US-parilla. Tässä kohortissa kontekstuaalisen pelon ehdollistamisen (t7=3.21, P < 0,05)="" sekä="" vihjaisen="" pelon="" ehdollistamisen="" voimistumista="" havaittiin="" nic-sired-hiirillä="" (t6="2.41," p="">< .="" 05;="" kuva="">

3.3 Isän nikotiini parantaa kontekstuaalisen pelkomuistin spontaania palautumista F1-sukupolven hiirillä

F1-hiirten kohortti, joka sai yhden CS‐US-parin, testattiin myöhemmin sukupuuttoon ja kontekstuaalisen pelkomuistin spontaanin palautumisen suhteen. F1 NIC-Sired -hiirillä esiintyi normaalia pelon sukupuuttoon, mutta kontekstuaalisen pelkomuistin spontaani palautuminen SAL-Sired-hiiriin verrattuna (t7=3.38, P < 0.05;="" kuva="">

3.4 Isän antama nikotiini vähentää nikotiinin itseantoa

Ennen nikotiinin itseannostelukoulutusta koehenkilöistä analysoitiin heidän kykynsä oppia operanttitehtävä ruokapalkkion saamiseksi, eikä eroja havaittu (Tukitiedot, kuva S5). Isän nikotiinialtistuksen mahdollisten vaikutusten nikotiinin vahvistamiseen F1-jälkeläisissä testaamiseksi laskimonsisäisen nikotiinin itseannostelun hankkiminen (0,03 mg/kg/infuusio) arvioitiin 2-suuntaisessa sekasuunnittelussa ANOVA:ssa, jossa tunnistettiin. istunnon päävaikutus (F(7,119)=13.60, P < .001)="" ja="" istunto="" ×="" isähoidon="" vuorovaikutus="" (f(7,119)="5.00," p="">< .001).="" post="" hoc="" -testit="" eivät="" kuitenkaan="" paljastaneet="" tilastollisesti="" merkitseviä="" eroja="" ryhmien="" välillä="" kullakin="" kahdeksasta="" hankintaistunnosta="" (kuva="" 3a).="" tämän="" jälkeen="" analysoitiin="" aktiivisten="" ja="" ei-aktiivisten="" vivun="" painallusten="" lukumäärä="" sen="" määrittämiseksi,="" säilyttivätkö="" ryhmät="" koko="" istunnon="" suosituksen="" aktiiviselle="" vivulle="" hankinnan="" aikana="" (kuva="" 3b),="" mikä="" tunnisti="" istunnon="" päävaikutuksen="" (f(7,238)="" {{20}="" }.18,="" p="">< .001)="" ja="" istunto="" ×="" isähoidon="" vuorovaikutus="" (f(21="" 238)="11.40," p="">< .001).="" post="" hoc="" -analyysi="" paljasti,="" että="" ryhmät="" erosivat="" nikotiinin="" itseannostelun="" ensimmäisenä="" päivänä.="" nic-sired-ryhmä="" osoitti="" enemmän="" aktiivista="" vipupuristusta="" kuin="" sal-sired-ryhmä.="" tämä="" vaikutus="" voi="" joko="" edustaa="" suurempaa="" huumeiden="" etsintäkäyttäytymistä="" ensimmäisenä="" altistuspäivänä,="" sinnikkyyttä="" vastata="" ruokapalkkioon="" ja/tai="" heikentynyttä="" kognitiivista="" joustavuutta="" siirryttäessä="" reagoinnista="" ruoasta="" lääkkeeseen.="" tämä="" ero="" ei="" kuitenkaan="" säilynyt="" muiden="" istuntojen="" aikana.="" sal-sired-hiirillä="" oli="" johdonmukainen="" tilastollisesti="" merkitsevä="" suositus="" aktiiviselle="" vipulle="" verrattuna="" inaktiiviseen="" vipuun="" (post="" hoc="" p="">< 0,01),="" mutta="" nic-sired-hiirillä="" ei="" ollut="" tätä="" säilytettyä="" suosiota="" istunnoissa="">

KUVA 3 Isän antama nikotiini vähentää nikotiinin itseannostelua. NIC- ja SAL-sired-uroshiiret (n=9-10 ryhmää kohti) eivät eronneet kustakin istunnosta ansaittujen infuusioiden kokonaismäärässä hankintajakson aikana 0 0,03 mg/kg/infuusioannos. B, Hankinnan aikana aktiivisten ja ei-aktiivisten vivun painallusten määrä erosi merkittävästi ensimmäisessä istunnossa, ja NIC-Sired-hiirten nikotiini osoitti enemmän aktiivisia vipupainalluksia kuin SAL-Sired-hiirillä. Kuitenkin myöhemmissä istunnoissa NIC-Sired-hiirten vaste heikkeni, mikä ei johtanut merkittäviin eroihin niiden aktiivisten ja ei-aktiivisten vivun painallusten välillä istuntojen 3–8 välillä. Sitä vastoin SAL-Sired-eläimet osoittivat johdonmukaisesti tilastollisesti merkitsevää etusijaa aktiiviselle vipulle. niiden passiivisen vivun yli. C, Keskimääräinen nikotiiniinfuusioiden lukumäärä kolmen viimeisen hankintakerran aikana ei eronnut merkittävästi NIC- ja SAL-Sired-hiirten välillä. D, Kohtaisella annoksella 0,1 mg/kg/infuusio, NIC-Sired-hiiret antoivat itse huomattavasti pienemmän määrän nikotiiniinfuusioita. E, Inkubaatiohalun arviointi paljasti merkittävän lisääntyneen vasteen aiemmin aktiivisella vivulla 21 päivän raittiuden jälkeen - vain SAL-Sired-hiirillä. Virhepalkit osoittavat keskiarvon standardivirheen (SEM), *P <>

Mahdollisten ryhmien erojen tutkimiseksi edelleen samalla kun säädettiin vaihtelua hankinnan alkuvaiheessa, nikotiini-infuusioiden keskimääräinen määrä tutkittiin kolmen viimeisen istunnon aikana, jolloin koehenkilöt osoittivat johdonmukaisempia vasteita nikotiinille (kuvio 3C). Ryhmät eivät eronneet merkittävästi nikotiini-infuusioiden keskimääräisestä määrästä (P > .05). Sen jälkeen hiiret siirrettiin 0,1 mg/kg/infuusioannokseen nikotiinia, joka aiemmin osoitettiin olevan suositeltava aikuisilla C57BL6/J-hiirillä.44 Tällä annoksella NIC-Sired-hiiret antoivat itse pienemmän määrän infuusioita (t{ {7}},20, P < ,05;="" kuva="" 3d).="" himokäyttäytymisen="" inkubaatiossa,="" jota="" pidetään="" lisääntyneen="" huumeiden="" etsimisen="" mittana="" raittiuden="" aikana,="" 2-suuntainen="" sekamuotoinen="" anova,="" jossa="" oli="" istunto="" ja="" isähoito,="" tunnisti="" istunnon="" päävaikutuksen="" (f(1,17)="" {{16}="" },90,="" p="">< ,001).="" vaikka="" sal-sired-eläimet="" osoittivat="" inkubaatiovaikutusta="" suuremmilla="" vasteilla="" 21.="" pidättymispäivänä="" verrattuna="" päivään="" 1,="" nic-sired-hiirillä="" ei="" havaittu="" lisääntynyttä="" nikotiinia="" etsivää="" käyttäytymistä="" (p=""><>

3.5 Isän nikotiinialtistus muuttaa hippokampuksen kolinergistä sitoutumista ja toimintaa

Korkean affiniteetin hippokampuksen heteromeerinen nAChR-sitoutuminen lisääntyi NIC-Sired F1 -hiirissä (t28=2.14, P < .05;="" sal-sired="1.21" ±="" {{10}="" },043,="" nic-sired="1,34" ±="" 0,044).="" yksi="" koehenkilö="" (nic-sired)="" poistettiin,="" koska="" sitoutumisarvot="" olivat="" kaksi="" standardipoikkeamaa="" keskiarvon="">

Kaliumin ja nikotiinin aiheuttamien ACh-virtojen amperometriset tallenteet arvioitiin F1 dHPC:ssä ja vHPC:ssä. Sukupuolikohtaisten otoskokojen epätasaisuuden vuoksi sukupuolta ei otettu alustavaksi tekijäksi näissä analyyseissä. KCl-depolarisaation aiheuttamat kolinergiset signaalit eivät eronneet SAL- ja NIC-sired-hiirten välillä dHPC:ssä (P > 0,05; kuva 4A); paikallinen nikotiinin käyttö johti kuitenkin kolinergisten signaalien amplitudien merkittävään laskuun NIC-sired-hiirillä (t8=2.33, P < .05;="" kuva="" 4c).="" vhpc:ssä="" ach:n="" vapautuminen="" väheni="" nic-sired-hiirillä="" kcl:n="" (t8="2.60," p="">< .05;="" kuva="" 4b)="" tai="" nikotiinin="" (t8="2.98," p="">< .05)="" jälkeen.="" kuva="">

KUVA 4 Isän nikotiini vähentää kolinergistä signalointia hippokampuksessa. KCl:n aiheuttaman terminaalisen depolarisaation herättämät dHPC-populaation koliinisignaalit. Merkittäviä eroja ei havaittu NIC- ja SAL-Sired-eläinten välillä (n=5 ryhmää kohti). B, KCl-indusoidun terminaalisen depolarisaation aiheuttamat vHPC-populaation koliinisignaalit vähenivät NIC-sired-hiirissä. C, Nikotiinin aiheuttaman populaation dHPC-koliinisignaalit vähenivät NIC-Sired-hiirillä. D, Nikotiinin aiheuttaman populaation vHPC-koliinisignaalit vähenivät NIC-Sired-hiirillä. Sukupuolen vaikutuksia kolinergiseen signalointiin ei havaittu. Virhepalkit osoittavat keskiarvon standardivirheen (SEM), *P <>

3.6 Isän nikotiinialtistus muuttaa eri tavalla selän ja vatsan hippokampuksen geenin ilmentymistä

F1-hippokampuksen transkriptianalyysi RNA-sekvensoinnilla paljasti 952 eri tavalla ilmentynyttä geeniä vHPC:ssä (FDR=0.05; Taulukko S2). Näistä geeneistä 612 oli säädelty alaspäin ja 340 lisääntynyt NIC-Sired-hiirissä. DHPC:ssä vain 162 geeniä ekspressoitui eri tavalla NIC-Sired-hiirissä verrattuna SAL-Sired-hiiriin (FDR=0.05). Näistä 162 geenistä 86 oli säädelty alaspäin ja 76 geeniä lisääntynyt. Satakolme geeniä, joiden geeniekspressio oli muuttunut, oli päällekkäin vHPC:n ja dHPC:n välillä.

3.7 Isän altistuminen nikotiinille muuttaa transkriptioreittejä, jotka liittyvät hermoston kehitykseen

vHPC:ssä IPA-analyysi identifioi pääverkoston "Neurologiset sairaudet, organismivauriot ja poikkeavuudet, solukuolema ja eloonjääminen" (pisteet=41, taulukko S3) ja toiseksi suosituimman verkoston "Hermojärjestelmän kehitys ja toiminta, kudosmorfologia, neurologiset Sairaus" (pistemäärä=23). Viisi parasta molekyyli- ja solutoimintojen kategoriaa olivat: "Solumorfologia" (88 molekyyliä), "Solujen kokoonpano ja organisaatio" (79 molekyyliä), "Solujen kehitys" (96 molekyyliä), "Solujen toiminta ja ylläpito" (79 molekyyliä), ja "Cellular Growth and Proliferation" (87 molekyyliä). Parhaat fysiologisen järjestelmän kehitys ja toiminnot olivat "hermoston kehitys ja toiminta" (175 molekyyliä), ja eräitä tärkeimpiä sairauksien ja häiriöiden toimintoja ovat "neurologiset sairaudet" (toinen, 191 molekyyliä) ja "psykologiset häiriöt" (neljäs, 90 molekyyliä) ) (Taulukko S4).

IPA-tuloksia täydentävä rikastusanalyysi Enrichrillä tarjosi lisätodisteita solujen kasvun ja kehityksen muutoksista vHPC:ssä. GO-biologiset parhaat termit mukaan lukien "RNA-silmukointi", "vaste laskostumattomalle proteiinille" ja "solukasvun säätely" ja " proteiinin stabilointi" (taulukko S5). Vastaavasti "spliceosomaalinen kompleksi" tunnistettiin GO-solujen huipputermiksi. Enrichrin kautta suoritettu KEGG-reittianalyysi osoitti lisäksi splaissosomien toiminnan ja MAPK-signaloinnin mahdollisesti vaikuttavina reiteinä.

Huolimatta huomattavasti lyhyemmästä luettelosta eri tavalla ilmentyneistä geeneistä dHPC:ssä verrattuna vHPC:hen, samanlaisia ​​dHPC:llä rikastettuja reittejä ja termejä tunnistettiin (taulukot S3 ja S4). IPA-analyysi tunnisti ylimmän verkoston "Käyttäytyminen, neurologiset sairaudet, organismivauriot ja poikkeavuudet" (pistemäärä=24) ja toiseksi suurimman verkoston "Neurologiset sairaudet, organismivauriot ja poikkeavuudet sekä psykologiset häiriöt (pistemäärä=20)" .

dHPC:n viisi tärkeintä molekyyli- ja solutoimintojen luokkaa olivat "solujen kehitys" (29 molekyyliä), "solujen kasvu ja lisääntyminen" (29 molekyyliä), "solumorfologia" (27 molekyyliä), "solujen kokoonpano ja organisaatio" (23 molekyyliä). ja "Cellular Function and Maintenance" (25 molekyyliä). "Hermoston kehitys ja toiminta" tunnistettiin jälleen huippurikastetuksi termiksi fysiologisen järjestelmän kehitys ja toiminta -luokituksessa (toinen, 44 molekyyliä). Parhaat rikastetut termit taudit ja häiriöt -funktion luokituksessa sisälsivät "neurologiset sairaudet" (1., 51 molekyyliä) ja "Psykologiset häiriöt" (viides, 31 molekyyliä). Enrichriä käyttävä rikastusanalyysi tunnisti useita erilaisia ​​GO-biologisia termejä dHPC:lle verrattuna vHPC:hen, mukaan lukien "hermosolujen kuoleman säätely" ja "aivojen kehitys" (taulukko S5), joka täydentää IPA:n molekyyli- ja solutoimintoa "solukuolema ja eloonjääminen".

Jotta voitaisiin tutkia tarkemmin dHPC:n ja vHPC:n välillä päällekkäisten, eri tavalla ilmentyneiden transkriptien toiminnallista roolia, arvioitiin molemmille alueille yhteisiä differentiaalisesti ekspressoituneita geenejä (yhteensä 103). Päällekkäiset, eri tavalla ekspressoituneet transkriptit näiden kahden alueen välillä olivat kaikki alas- tai ylössäädeltyjä samaan suuntaan, mikä viittaa yhteisiin muutoksiin transkriptioreiteissä aivoalueiden välillä NIC-syötetyillä hiirillä. Viisi suurinta IPA:n tunnistamaa molekyyli- ja solutoimintojen luokkaa olivat "solujen kuolema ja selviytyminen" (17 molekyyliä), "soluliike" (10 molekyyliä), "solujen välinen signaali ja vuorovaikutus" (17 molekyyliä), "solujen kasvu" and Proliferation" (18 molekyyliä) ja "Cell Morphology" (17 molekyyliä) (taulukko S4)

DHPC:lle ja vHPC:lle ainutlaatuiset, eri tavalla ilmennetyt geenit analysoitiin myöhemmin erikseen IPA:ssa, jotta voidaan testata erilaisia ​​neurobiologisia adaptaatioita näiden kahden alueen välillä (taulukko S6). Yksikään rikastettu kanoninen reitti ei mennyt päällekkäin ainutlaatuisten vHPC-yksilöllisten dHPC-analyysien välillä. Suosituimmat rikastetut kanoniset, ainutlaatuiset vHPC:lle (yhteensä 44) sisälsivät "kalsiumsignaloinnin" ja "glukokortikoidireseptorisignaloinnin", kun taas suosituimpia dHPC:n kanonisia reittejä (yhteensä kahdeksan) olivat "Tyroidhormone Metabolism" ja "Retinoic acid Mediated Apoptosis Signaling". Rikastettuihin sairauksiin ja toimintoihin, jotka ovat ainutlaatuisia vHPC:lle (yhteensä 295), sisältyivät "[Hippokampuksen] Ammonin sarven muodostuminen" ja "Soluulokkeiden määrä", kun taas ainutlaatuisesti dHPC:llä rikastetut sairaudet ja toiminnot (yhteensä 111) sisälsivät "valkoisen aineen tulehdus" ja "demyelinaatio" ."

3.8 Isän nikotiinialtistus muuttaa hippokampuksen DNA:n metylaatiota

Kohdennettu DNA-metylaatioanalyysi suoritettiin sen määrittämiseksi, vaikuttiko muuttunut DNA-metylaatio vastaavilla säätelyalueilla NIC-Sired F1 -jälkeläisten differentiaaliseen geeniekspressioon. Kohteisiin kuului 1114 eri tavalla ilmentynyttä geeniä, jotka tunnistettiin joko dHPC:ssä tai vHPC:ssä. vHPC:ssä havaittiin 11 differentiaalisesti metyloitua aluetta (DMR), joista kahdeksan osoitti lisääntynyttä metylaatiota ja kolmessa vähentynyttä metylaatiota (taulukko 1). 11 DMR:stä 10 sijaitsi alueilla, jotka liittyivät geeniin, joka osoitti muuttunutta ilmentymistä vHPC:ssä. DHPC:ssä havaittiin 30 DMR:tä, joista 15 osoitti lisääntynyttä metylaatiota ja 15 osoitti vähentynyttä metylaatiota. 30 DMR:stä 29 sijaitsi alueilla, jotka liittyivät geeniin, joka osoitti muuttunutta ekspressiota dHPC:ssä.

BenCistanche echinacosidin hyöty

4. KESKUSTELU

Lisääntynyt ymmärrys epigeneettisistä prosesseista yhdessä viimeaikaisten tietojen kanssa, mukaan lukien nykyiset löydökset, on haastanut perinteisen perinnön ymmärtämisen. Pelkästään genotyypin ulkopuoliset tekijät voivat määrittää fenotyypit seuraavissa sukupolvissa, ja sukupolven sisäisiä altistuksia ei välttämättä eroteta jälkeläisistä. Tämä tutkimus viittaa siihen, että nikotiinille altistumisen haitalliset terveysvaikutukset voivat ylittää yksilöllisen altistuksen ja vaikuttaa seuraaviin sukupolviin. Tunnistamme C57BL/6J-hiirten ennakkokäsityksen aiheuttaman nikotiinialtistuksen useiden sukupolvien ja sukupolvien väliset vaikutukset Pavlovin pelon eheyttämiseen, mikä johti vahvempiin pelkomuistoihin F1- ja F2-jälkeläisillä. Isän nikotiinille altistuminen johti myös nikotiinin itseannostelun vähenemiseen ja uusiutumiseen liittyvien käytösten heikentämiseen, mikä viittaa voimakkaampaan vastenmielisyyteen nikotiinille. Näiden käyttäytymiserojen tueksi havaittiin useiden sukupolvien välisiä muutoksia hippokampuksen kolinergisessä toiminnassa ja epigeneettisissä prosesseissa. Yhdessä nämä tulokset viittaavat muutoksiin hermoston toiminnassa nikotiinille altistuneiden hiirten jälkeläisissä, mikä johtaa muuttuneisiin käyttäytymisfenotyyppeihin.

Nikotiinille altistuneiden uroshiirten F1- ja F2-jälkeläiset osoittivat parempaa kontekstuaalista ja vihjailevaa pelkoa. Huolimatta eroista kontekstuaalisessa pelon häviämisessä NIC- ja SAL-Sired F1 -hiirten välillä, NIC-Sired-hiiret osoittivat lisääntynyttä spontaania kontekstuaalisten pelkomuistojen palautumista. Tärkeää on, ettei NIC- ja SAL-Sired-hiirten iskuherkkyydessä havaittu eroja, jotka voisivat selittää lisääntynyttä pelkoa. Tehostettu pelon ehdollistaminen voi viitata yleiseen oppimisprosessien tehostamiseen verrattuna prosessien modulointiin, joka on spesifisempää oppimisen pelolle. NIC-Sired-hiirillä ei kuitenkaan havaittu muutoksia uusien esineiden tunnistamisessa, operanttiruokaharjoittelussa tai avoimessa kentässä liikkumisessa, vaikka NIC-Sired-naarashiirillä havaittiin lisääntyneen EPM:n avoimen käsivarren ajan sukupuolispesifinen vaikutus. Vaikka tämä ei sulje pois mahdollisia muutoksia muihin oppimisjärjestelmiin tai kognitiivisiin prosesseihin, nämä havainnot yhdessä viittaavat siihen, että pelkooppiminen voi olla herkempää isän nikotiinille altistumisen useille sukupolville ja sukupolvien välisille vaikutuksille. Lisäksi nämä havainnot viittaavat muuttuneeseen kolinergiseen toimintaan NIC-Sired-eläimillä. Nikotiini moduloi kontekstuaalista pelkoa. Akuutti nikotiini tehostaa kontekstuaalista pelkoa,15,45 kroonisesta nikotiinista vetäytyminen häiritsee kontekstuaalista pelkoa.16,21 Tässä tutkimuksessa akuutti nikotiini tehosti kontekstuaalista pelkoa F1- ja F2-hiirillä suolaliuoksella käsitellyistä hiiristä. Sitä vastoin akuutti nikotiini häiritsi kontekstuaalista pelkoa NIC-Sired-hiirillä, eikä sillä ollut vaikutusta NIC-grandsire-hiirillä, mikä saattaa viitata muuttuneeseen kolinergiseen toimintaan aivotursossa.

Isän nikotiinille altistumisen vaikutukset myöhempään nikotiinin itseantoon F1-sukupolvessa viittaavat myös häiriintyneeseen kolinergiseen toimintaan. IV nikotiinin itseannostelun hankinnan aikana pienemmällä annoksella ryhmät eivät eronneet nikotiini-infuusioiden määrässä, vaikka aktiivisten vivun painallusten määrä lisääntyi NIC-Sired-ryhmässä. Tämä viittaa siihen, että NIC-Sired-hiiret ovat saattaneet osoittaa sinnikkyyttä reagoidakseen ruokapalkkioon ja/tai heikentynyt kognitiivinen joustavuus siirtyessään reagoimaan ruoasta lääkkeeseen. On kuitenkin myös syytä huomata, että ryhmät eivät eronneet himon 1. inkubaatiopäivänä, joka edustaa sammutusjaksoa (esim. ei nikotiiniinfuusioita istunnon aikana), ja näin ollen tämä vaikutus näyttää olleen läsnä, kun vahvistimia on käytetty. kytketty, mutta ei vahvistimen puuttuessa sammutusistunnon aikana. NIC-Sired-hiirillä oli myös vähentynyt nikotiinin itseanto kohtalaisella annoksella, mikä vastaa viimeaikaista työtä, jossa havaittiin alkoholin, kokaiinin ja opioidien annon väheneminen, joka liittyy vanhempien alkoholi-, kokaiini- ja morfiinialtistumiseen (esim. Vassoler et al,46 as arvosteltu julkaisuissa Goldberg ja Gould47). Nikotiinin itseannostelun havaittu väheneminen voi johtua joko vähentyneestä herkkyydestä nikotiinin palkitseville vaikutuksille ja/tai lisääntyneestä herkkyydestä nikotiinin vastenmielisille vaikutuksille. Itse asiassa ryhmät erosivat kohtalaisella nikotiiniannoksella, mutta eivät pienemmällä nikotiiniannoksella, mikä tukee käsitystä lisääntyneestä vastenmielisyydestä suuremmalla annoksella. Mielenkiintoista on, että havaitsimme myös himon itämisen puutteen päivänä 21 NIC-Sired-hiirillä sen jälkeen, kun ne olivat antaneet itselleen kohtalaisen annoksen, mikä viittaa siihen, että vähentynyt nikotiinia etsivä käyttäytyminen voisi liittyä vastenmielisyyteen liittyvään nikotiinin muistiin. Vaikka erilaiset hermosubstraatit voivat olla näiden vaikutusten taustalla nikotiinin saannissa ja uusiutumiseen liittyvissä vasteissa, äskettäisessä tutkimuksessa havaittiin, että vähentynyt DNA-metyylitransferaasi hippokampuksen CA1-alueella vähensi morfiinin omaa antamista.48 Tämä havainto yhdessä kolinergisen aivotursotoiminnan tunnetun toiminnan kanssa oppimis- ja muistiprosessit, tukee edelleen käsitystä häiriintyneestä nikotiinivälitteisestä prosessoinnista NIC-Sired-hiirten hippokampuksessa.

Näillä linjoilla NIC-Sired-hiirillä oli lisääntynyt hippokampuksen korkea-affiniteettinen nAChR-sitoutuminen. Löysimme myös vähentymisen kaliumin aiheuttamassa ACh:n vapautumisessa vHPC:ssä sekä nikotiinin aiheuttamassa ACh:n vapautumisessa sekä dHPC:ssä että vHPC:ssä NIC-Sired-eläimissä. Muutokset depolarisaation aiheuttamassa ACh:n vapautumisessa heijastavat muuttunutta kolinergistä toimintaa reseptorin sitoutumisen jälkeen, kun taas muutokset nikotiinin aiheuttamassa ACh:n vapautumisessa heijastavat muuttunutta nAChR-toimintoa. Nämä tiedot ovat sopusoinnussa aikaisempien havaintojen kanssa korkean affiniteetin nAChR:n sitoutumisesta lisääntyneen nAChR-toiminnan seurauksena.49 Koska sekä kaliumin että nikotiinin aiheuttama ACh:n vapautuminen muuttui NIC-Sired-hiirten vHPC:ssä, vHPC voi olla herkempi isän nikotiinille altistumisen useiden sukupolvien vaikutukset. DHPC:n tiedetään moduloivan kontekstuaalista pelon ehdollistamista.31,50 vHPC:n esto häiritsee sekä ilmaistua että kontekstuaalista pelkotilaa,51,52 ja vHPC-kolinergiset leesiot heikentävät ohjattua pelkoa.53

Yrttisistanche

Olemme myös osoittaneet, että suora nikotiinin infuusio dHPC:hen tehostaa kontekstuaalisen pelon ehdollistamista, kun taas infuusio vHPC:hen häiritsee kontekstuaalisen pelon ehdollistamista.15 vHPC voi myös moduloida kontekstuaalisten pelkomuistojen spontaania palautumista, koska vHPC-prelimbisen piirin inaktivointi vähentää kontekstuaalisten pelkomuistojen spontaania palautumista. 54 Vaikka isän nikotiinille altistuminen voi vaikuttaa myös muihin aivoalueisiin, jotka osallistuvat pelon eheyttämiseen, kuten amygdala,55, nämä havainnot yhdessä nykyisten tietojen kanssa viittaavat siihen, että muutokset vHPC-toiminnassa voivat olla vastuussa muuttuneesta pelon ehdostamisesta NIC-Sired-hiirillä. . Oletimme, että isän nikotiinialtistuksen useiden sukupolvien vaikutukset voivat liittyä muutoksiin transkription efektoreissa, jotka toimivat näiden hermojärjestelmien ylävirtaan. F1-sukupolven hiirten genominlaajuinen transkription sekvensointi vHPC:ssä ja dHPC:ssä tunnisti 1114 eri tavalla ilmentynyttä geeniä NIC- ja SAL-Sired-hiirten välillä. Tämä ero oli suurempi vHPC:ssä (952) verrattuna dHPC:hen (162), mikä on linjassa vHPC:n suuremman muutoksen kanssa suhteessa dHPC:n kolinergiseen toimintaan ja muutoksiin sekä kontekstuaalisessa että vihjaillussa pelon ehdolla. Myöhempi reittianalyysi viittasi laajoihin muutoksiin transkriptioreiteissä, jotka liittyvät glukokortikoidisignalointiin ja hermoston kehitykseen/plastisuus molemmilla hippokampuksen alueilla.

Mahdollisten vHPC:lle spesifisten adaptaatioiden tunnistamiseksi polkuanalyysi suoritettiin käyttämällä vain jommallekummalle hippokampuksen alaalueelle spesifisiä transkriptejä. Mikään rikastettu kanoninen IPA-reitti ei mennyt päällekkäin vHPC:n ja dHPC:n välillä, jotka ovat toiminnallisesti erillisiä hippokampuksen osa-alueita.31 Kun dHPC:n ja vHPC:n välillä päällekkäiset geenit poistettiin, vHPC:lle ainutlaatuiset huippurikastetut kanoniset reitit sisälsivät "ainutlaatuisen glukokortikoidireseptorin signaalin", mikä viittaa , lisämuutos glukokortikoidien toiminnassa tällä alueella verrattuna dHPC:hen. Tavoitteena tunnistaa ylävirran epigeneettiset säätelijät, jotka voivat vaikuttaa geenien ilmentymiseen, suoritimme kohdistetun DNA-metylaatiosekvensoinnin käyttämällä koottua luetteloa dHPC- ja vHPC-sekvensoinnista tunnistetuista differentiaalisesti ekspressoituneista geeneistä. Yllättäen löysimme vain 11 DMR:tä vHPC:stä ja 30 DMR:tä dHPC:stä NIC- ja SAL-Sired-eläinten välillä. Vaikka tämä on odottamatonta, kun otetaan huomioon vHPC:ssä eri tavalla ilmentyneiden transkriptien paljon suurempi määrä, DNA:n metylaatio on vain yksi useista säätelytekijöistä, jotka voivat vaikuttaa geenien ilmentymiseen, ja DNA:n metylaatio ei johdonmukaisesti muutu muuttuneeksi geeniekspressioksi.56 11 vHPC DMR:stä seitsemän seitsemän osoitti metylaatiokuvioita, jotka olivat yhdenmukaisia ​​differentiaalisen transkription suunnan kanssa (vähentynyt transkriptio lisääntyneen DNA-metylaation kanssa ja lisääntynyt transkriptio vähentämällä metylaatiota). Erilaisesti metyloituja geenejä vHPC:ssä olivat Fkbp5, Ksr1 ja Pnpla2. Mielenkiintoista on, että Fkbp5- ja Ksr1-transkriptio häiriintyi yhdessä PTSD:n käyttäytymishiirimallissa57, jossa hiiret altistettiin sähköiselle jalkaiskulle ja esittivät sitten tilannemuistutuksia. Fkbp5 koodaa glukokortikoidireseptorin chaperonia, jonka toiminta on yhdistetty epämukavaan pitkittyneeseen stressivasteeseen henkilöillä, joilla on PTSD ja muut ahdistuneisuushäiriöt.58

Erityisesti ihmisillä tehdyt tutkimukset osoittavat, että Fkbp5-metylaatio ja transkriptio korreloivat PTSD-oireiden vakavuuden kanssa siten, että lisääntynyt metylaatio ja vähentynyt transkriptio ennustavat vakavampaa PTSD-oiretta.59,60 Fkbp5:n ilmentyminen moduloi HPA-akselin toimintaa, jonka uskotaan välittävän sen osallisuutta PTSD.59,61 Havaintomme lisääntyneestä spontaanista pelkomuistin palautumisesta yhdessä glukokortikoidisignalointiin liittyvien transkriptioreittien epäsäännöllisyyden kanssa NIC-Sired-eläimissä voi viitata lisääntyneeseen haavoittuvuuteen PTSD:n kaltaisille fenotyypeille. DHPC:ssä DMR-kuviot olivat suurelta osin ristiriidassa RNA-sekvensoinnilla löydetyn differentiaalisen transkription ilmentymisen suunnan kanssa, mikä viittaa siihen, että muutokset isän nikotiinialtistuksen tuottamassa vHPC DNA:n metylaatiossa ovat seuraukselisempia geenien ilmentymisen kannalta kuin dHPC:ssä. Tämä on linjassa sen kanssa, että tunnistamme suuremman määrän eri tavalla ilmentyneitä transkriptejä ja liioiteltuja muutoksia kolinergisessä transmissiossa NIC-sired vHPC:ssä dHPC:hen verrattuna. Kohdennettu sekvensointimenetelmämme on saattanut rajoittaa kykyä havaita mahdollista transkription säätelyä distaalisesti metyloiduilla sekvensseillä. Tulevat tutkimukset, mukaan lukien genomin laajuisen DNA:n metylaation, histonien modifikaatioiden ja pienen RNA:n ilmentymisen analyysi, tarjoavat täydellisemmän tulkinnan näistä löydöistä.

Nikotiinialtistuksen suunnittelumme mahdollinen rajoitus on keskittyminen isän nikotiinialtistukseen tutkiaksemme nikotiinialtistuksen useiden sukupolvien ja sukupolvien välistä vaikutusta. Vaikka muissa tutkimuksissa, joissa havaittiin usean/sukupolven välisiä fenotyyppejä isän huumealtistuksen jälkeen, mukaan lukien kokaiini46 ja morfiini62, ei havaittu eroja äidin hoidossa, on mahdollista, että isän nikotiinialtistus voi vaikuttaa äidin hoitoon. Tulevat tutkimukset, joissa selvitetään vaikutuksia äitiyshuoltoon, ovat perusteltuja. Koska tällä hetkellä keskitymme isän altistukseen, tulevassa työssä tulisi myös verrata isän ja äidin altistumisen vaikutuksia. Kaiken kaikkiaan nykyiset havainnot antavat uudenlaisen käsityksen nikotiinille altistumisen useiden sukupolvien ja sukupolvien välisistä vaikutuksista, joita tukee kasvava kirjallisuus, joka kuvaa lääkkeiden altistuksen useiden sukupolvien ja sukupolvien välisiä vaikutuksia (kuten Goldberg ja Gould on tarkastellut47). Tämä tutkimus oli ensimmäinen, joka testasi kontekstuaalista pelon ehdollistamista nikotiinille altistuneiden miesten F1- ja F2-jälkeläisissä ja tunnisti lisääntyneen pelkomuistin muodostumisen ja pelkomuistojen spontaanin palautumisen. Tämä tutkimus oli myös ensimmäinen, jossa tunnistettiin muuttunut nikotiinin itseannostelu ja himon hautominen F1-nikotiinille altistuneilla jälkeläisillä.

NIC-Sired-hiirillä havaittiin differentiaalista metylaatiota geeneissä, jotka liittyvät PTSD:hen ja HPA-akselin dysregulaatioon, sekä samanaikaisia ​​häiriöitä stressiin liittyvissä transkriptioreiteissä. Isän nikotiini liittyi myös heikentyneeseen hippokampuksen kolinergiseen toimintaan ja lisääntyneeseen hippokampuksen nAChR-sitoutumiseen. Mielenkiintoista on, että PTSD-potilaat, jotka eivät tupakoineet, osoittavat merkittävästi korkeampaa mesiotemporaalista aivokuoren korkeaaffiniteetistä nAChR-sitoutumista63, ja PTSD liittyy suurempaan pelon ehtymiseen ja sammuneiden pelkomuistojen spontaaniin palautumiseen.64 Yhdessä havainnot viittaavat siihen, että nikotiinille altistuminen voi vaikuttaa useisiin sukupolviin. lisääntyy jälkeläisten alttius PTSD:n kaltaisille oireille. Tämä havainto yhdessä muiden viimeaikaisten havaintojen kanssa, jotka osoittavat nikotiinialtistuksen usean sukupolven vaikutukset kognitiiviseen joustavuuteen2, viittaavat siihen, että nikotiinialtistuksen negatiiviset terveysvaikutukset ulottuvat laajemmalle kuin aiemmin uskottiin.

Cistanche-uute

VIITTEET

1 Dai J, Wang Z, Xu W, et ai. Isän nikotiinialtistus määrittelee erilaisen käyttäytymisen myöhemmässä sukupolvessa mmu-miR-15b:n hypermetylaation kautta. Sci Rep. 2017;7(1):7286.

2. McCarthy DM, Morgan TJ Jr, Lowe SE, et ai. Uroshiirten nikotiinialtistus aiheuttaa käyttäytymishäiriöitä useiden sukupolvien jälkeläisissä. PLoS Biol. 2018;16(10):e2006497.

3. Zhu J, Lee KP, Spencer TJ, Biederman J, Bhide PG. Hyperaktiivisuuden siirtyminen sukupolvien välillä ADHD:n hiirimallissa. J Neurosci. 2014;34(8):2768-2773.

4. Cummings KM, Proctor RN. Muuttuva yleinen mielikuva tupakoinnista Yhdysvalloissa: 1964-2014. Cancer Epidemiol Biomarkers Ed. 2014;23(1):32-36.

5. Huang LL, Kowitt SD, Sutfin EL, Patel T, Ranney LM, Goldstein AO. Sähkösavukkeiden käyttö lukiolaisten keskuudessa ja sen yhteys tupakan käyttöön ja tupakoinnin lopettamiseen, North Carolina Youth Tobacco Surveys, 2011 ja 2013. Prev Chronic Dis. 2016;13:E103.

6. Holliday ED, Nucero P, Kutlu MG, et ai. Kroonisen nikotiinin pitkäaikaiset vaikutukset emotionaaliseen ja kognitiiviseen käyttäytymiseen ja hippokampuksen solujen morfologiaan: vertailut aikuisten ja nuorten nikotiinialtistukseen. Eur J Neurosci. 2016;44:2818-2828.

7. Johnson JG, Cohen P, Pine DS, Klein DF, Kasen S, Brook JS. Tupakoinnin ja ahdistuneisuushäiriöiden yhteys murrosiässä ja varhaisessa aikuisiässä. JAMA. 2000; 284:2348-2351.

8. Jung Y, Hsieh LS, Lee AM, et ai. Epigeneettinen mekanismi välittää nikotiinin kehitysvaikutuksia hermosolujen rakenteeseen ja käyttäytymiseen. Nat Neurosci. 2016;19(7):905-914.

9. Gitik M, Holliday ED, Leung M, et ai. Koliini parantaa aikuisten oppimisen puutteita ja kumoaa nuorten nikotiinille altistumiseen liittyvien kromatiinin uudelleenmuotoilutekijöiden epigeneettisen muuntumisen. Neurobiol Learn Mem. 2018; 155:239-248.

10. Lintu A. Epigenetiikan käsitykset. Luonto. 2007; 447:396-398.

11. Skinner MK. Ympäristön epigeneettinen sukupolvien välinen perintö ja somaattinen epigeneettinen mitoottinen stabiilius. Epigenetiikka. 2011; 6:838-842.

12. Davis JA, Gould TJ. Assosiatiivinen oppiminen, hippokampus ja nikotiiniriippuvuus. Curr Drug Abuse Rev. 2008;1:9-19.

13. Kutlu MG, Parikh V, Gould TJ. Nikotiiniriippuvuus ja psykiatriset häiriöt. Int Rev Neurobiol. 2015; 124:171-208.

14. Parikh V, Kutlu MG, Gould TJ. nAChR-häiriö yleisenä skitsofrenian ja samanaikaisen nikotiiniriippuvuuden substraattina: nykyiset suuntaukset ja näkymät. Schizophr Res. 2016; 171:1-15.

15. Kenney JW, Raybuck JD, Gould TJ. Nikotiinireseptorit selässä ja ventraalisessa hippokampuksessa moduloivat eri tavalla kontekstuaalista pelkoa. Hippokampus. 2012;22:1681-1690.

16. Wilkinson DS, Turner JR, Blendy JA, Gould TJ. Geneettinen tausta vaikuttaa kroonisesta nikotiinista vetäytymisen vaikutuksiin oppimiseen ja korkean affiniteetin nikotiiniasetyylikoliinireseptorin sitoutumiseen dorsaalisessa ja vatsahippokampuksessa. Psykofarmakologia (Berl). 2013; 225(1): 201-208.

17. Davis JA, Gould TJ. DHBE:n ja MLA:n vaikutukset nikotiinin aiheuttamaan kontekstuaalisen pelon eheytymisen tehostumiseen C57BL/6-hiirillä. Psykofarmakologia (Berl). 2006; 184:345-352.

18. Kutlu MG, Zeid D, Tumolo JM, Gould TJ. Esi- ja murrosikäiset hiiret ovat vähemmän herkkiä akuutin nikotiinin vaikutuksille sukupuuttoon ja spontaaniin toipumiseen. Brain Res Bull. 2018; 138:50-55.

19. Kutlu MG, Gould TJ. Akuutti nikotiini viivyttää kontekstuaalisen pelon sammumista hiirillä. Behav Brain Res. 2014; 263:133-137.

20. Benowitz NL, Hukkanen J, Jacob P 3. Nikotiinikemia, aineenvaihdunta, kinetiikka ja biomarkkerit. Julkaisussa: Nicotine psychopharmacology. Berliini, Heidelberg: Springer; 2009: 29-60.

21. Davis JA, James JR, Siegel SJ, Gould TJ. Kroonisesta nikotiinin antamisesta luopuminen heikentää kontekstuaalista pelkoa C57BL/6-hiirissä. J Neurosci. 2005;25:8708-8713.

22. Petersen DR, Norris KJ, Thompson JA. Vertaileva tutkimus nikotiinin ja sen metaboliittien jakautumisesta kolmessa sisäsiittoisessa hiirikannassa. Drug Metab Dispos. 1984; 12:725-731.

23. Gould TJ, Portugal GS, Andre JM, et ai. Nikotiinin vieroittamiseen liittyvien puutteiden kesto kontekstuaalisessa pelon ehdolla vastaa muutoksia hippokampuksen korkean affiniteetin nikotiiniasetyylikoliinireseptorin noususäätelyssä. Neurofarmakologia. 2012;62:2118-2125.

24. Kutlu MG, Oliver C, Huang P, Liu‐Chen LY, Gould TJ. Kroonisen nikotiinin aiheuttama kontekstuaalisen pelon häviämisen heikkeneminen ja kroonisesta nikotiinista vetäytyminen liittyy hippokampuksen nAChR:n lisääntymiseen. Neurofarmakologia. 2016; 109:341-348. 25. Damaj MI, Kao W, Martin BR. Hiiren spontaanin ja saostuneen nikotiinin poistumisen karakterisointi. J Pharmacol Exp Ther. 2003; 307:526-534.

26. Fowler CD, Lu Q, Johnson PM, Marks MJ, Kenny PJ. Habenulaarinen alfa5-nikotiinireseptorin alayksikkösignalointi säätelee nikotiinin saantia. Luonto. 2011; 471:597-601.

27. Lomazzo E, MacArthur L, Yasuda RP, Wolfe BB, Kellar KJ. Heteromeeristen hermosolujen nikotiinireseptoreiden kvantitatiivinen analyysi rotan aivotursossa. J Neurochem. 2010; 115:625-634.

28. Turner JR, Castellano LM, Blendy JA. Rinnakkaiset anksiolyyttiset vaikutukset ja hermosolujen nikotiiniasetyylikoliinireseptorien säätely kroonisen nikotiinin ja varenikliinin jälkeen. Nicotine Tob Res. 2011; 13:41-46.

29. Parikh V, Ji J, Decker MW, Starter M. Prefrontaaliset beeta2-alayksikköä sisältävät ja alfa7-nikotiiniset asetyylikoliinireseptorit säätelevät differentiaalisesti glutamatergista ja kolinergistä signalointia. J Neurosci. 2010;30: 3518-3530.

30. Parikh V, Starter M. Etuaivojen kolinergiset järjestelmät ja kognitio: uusia oivalluksia, jotka perustuvat koliinipiikkien nopeaan havaitsemiseen entsyymipohjaisilla biosensoreilla. Julkaisussa: Microelectrode Biosensors. Totowa, NJ: Humana Press; 2013: 257-277.

31. Fanselow MS, Dong HW. Ovatko selkä- ja vatsahippokampus toiminnallisesti erillisiä rakenteita? Neuroni. 2010;65(1):7-19.

32. Kim D, Pertea G, Trapnell C, Pimentel H, Kelley R, Salzberg SL. TopHat2: transkriptomien tarkka kohdistus inserttien, deleetioiden ja geenifuusioiden läsnä ollessa. Genome Biol. 2013;14(4): R36.

33. Afgan E, Baker D, van den Beek M, et ai. Galaxy-alusta helppokäyttöisille, toistetuille ja yhteistoiminnallisille biolääketieteellisille analyyseille: 2016-päivitys. Nucleic Acids Res. 2016;44:W3‐w10.

34. Trapnell C, Williams BA, Pertea G, et ai. Transkriptien kokoaminen ja kvantifiointi RNA-Seq:llä paljastaa merkitsemättömät transkriptit ja isoformivaihdon solujen erilaistumisen aikana. Nat Biotechnol. 2010;28(5): 511-515.

35. Benjamini Y, Drai D, Elmer G, Kafkafi N, Golani I. Controlling the false discovery rate in behavior genetics research. Behav Brain Res. 2001; 125(1-2):279-284.

36. Kramer A, Green J, Pollard J Jr, Tugendreich S. Syy-analyysin lähestymistavat kekseliäisyyden polun analyysissä. Bioinformatiikka. 2014;30(4): 523-530.

37. Kuleshov MV, Jones MR, Rouillard AD, et ai. Enrichr: kattava geenijoukon rikastusanalyysin verkkopalvelin 2016 päivitys. Nucleic Acids Res. 2016;44(W1): W90-W97.

38. Wendt J, Rosenbaum H, Richmond TA, Jeddeloh JA, Burgess DL. Kohdennettu bisulfiittisekvensointi käyttämällä SeqCap epi -rikastusjärjestelmää. Menetelmät Mol Biol. 2018; 1708:383-405.

39. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: joustava trimmeri Illumina-sekvenssitiedoille. Bioinformatiikka. 2014;30(15):2114-2120.

40. Langmead B, Salzberg SL. Nopea aukkolukukohdistus Bowtie 2. Nat Methodsin kanssa. 2012;9(4):357-359.

41. Krueger F, Andrews SR. Bismark: joustava kohdistus- ja metylaatiokutsuja Bisulfite-Seq-sovelluksiin. Bioinformatiikka. 2011;27(11):1571-1572.

42. Akalin A, Kormaksson M, Li S, et ai. methylKit: kattava R-paketti genominlaajuisten DNA-metylaatioprofiilien analysointiin. Genome Biol. 2012;13(10): R87.

43. Gould TJ, Lommock JA. Nikotiini tehostaa kontekstuaalista pelon ehdollistamista ja parantaa etanolin aiheuttamia puutteita kontekstuaalisen pelon eheyttämisessä. Behav Neurosci. 2003;117(6):1276-1282.

44. Fowler CD, Kenny PJ. Suonensisäinen nikotiinin itseannostelu ja merkkien aiheuttama palautuminen hiirillä: nikotiiniannoksen vaikutukset, lääkeinfuusion nopeus ja aiempi instrumentaalinen koulutus. Neurofarmakologia. 2011;61(4):687-698.

45. Gould TJ, Wehner JM. Nikotiini lisää kontekstuaalista pelkoa. Behav Brain Res. 1999; 102(1-2):31-39.

46. ​​Vassoler FM, White SL, Schmidt HD, Sadri‐Vakili G, Pierce RC. Kokaiiniresistenssifenotyypin epigeneettinen perintö. Nat Neurosci. 2013;16(1):42-47.

47. Goldberg LR, Gould TJ. Isän huumeille altistumisen useiden sukupolvien ja sukupolvien väliset vaikutukset käyttäytymiseen ja hermotoimintoihin. Eur J Neurosci. 2018;50(3):2453-2466.

48. Zhang JJ, Jiang FZ, Zheng W, et ai. DNMT3a hippokampuksen CA1:ssä on ratkaisevan tärkeä morfiinin itseannostelussa rotilla. Addict Biol. 2019;▪:▪‐▪.

49. Schwartz RD, Kellar KJ. Nikotiinikolinergisten reseptoreiden sitoutumiskohdat aivoissa: säätely in vivo. Tiede. 1983; 220(4593):214-216.

50. Logue SF, Paylor R, Wehner JM. Hippokampuksen vauriot aiheuttavat oppimisvaikeuksia sisäsiittoisissa hiirissä Morris-vesilabyrintissä ja ehdollisissa pelkotehtävässä. Behav Neurosci. 1997; 111(1):104-113.

51. Zhang WN, Bast T, Feldon J. Ventraalinen hippokampus ja pelon eheytys rotilla: erilaiset anterogradiset pelon amnesiat N-metyyli-D-aspartaatin tai sen ei-kilpailevan antagonistin MK-801:n infuusion jälkeen vatsan hippokampukseen. Behav Brain Res. 2001;126(1-2):159-174.

52. Maren S, Holt WG. Hippokampuksen ja Pavlovin pelon ehdollistaminen rotilla: muskimol-infuusiot ventraaliseen, mutta ei dorsaaliseen hippokampukseen heikentävät ehdollisen jäätymisen saamista kuuloehdolliseen ärsykkeeseen. Behav Neurosci. 2004;118(1):97-110.

53. Staib JM, Della Valle R, Knox DK. Mediaalisen väliseinän ja Broca-kolinergisten projektioiden diagonaaliset nauhat vatsan hippokampukseen häiritsevät kuulopelon muistia. Neurobiol Learn Mem. 2018; 152:71-79.

54. Vasquez JH, Leong KC, Gagliardi CM, Harland B, Apicella AJ, Muzzio IA. Prelimbiseen aivokuoreen heijastuvien ventraalisten hippokampuksen solujen reittispesifinen aktivaatio vähentää pelon uusiutumista. Neurobiol Learn Mem. 2019; 161:63-71.

55. LeDoux JE, Cicchetti P, Xagoraris A, Romanski LM. Lateraalinen amygdaloidiydin: amygdalan sensorinen rajapinta pelon eheyttämisessä. J Neurosci. 1990;10(4):1062-1069.

56. Jones PA. DNA-metylaation toiminnot: saaret, aloituskohdat, geenikappaleet ja muut. Nat Rev Genet. 2012;13(7):484-492.

57. Tanaka M, Li H, Zhang X, et ai. Alueesta ja ajasta riippuvainen geenisäätely PTSD:n kaltaisen hiirimallin amygdalassa ja anteriorisessa cingulaattikuoressa. Mol Brain. 2019;12(1):25.

58. Sideaine EB. FKBP5:n, glukokortikoidireseptorin yhteissaperonin rooli mieliala- ja ahdistuneisuushäiriöiden patogeneesissä ja hoidossa. Psykoneuroendokrinologia. 2009;34 (lisäosa 1): S186-S195.

59. Sarapis C, Cai G, Bierer LM, et ai. Geneettiset markkerit PTSD-riskille ja kestävyydelle World Trade Centerin hyökkäyksistä selviytyneiden keskuudessa. Dis Markers. 2011;30(2-3):101-110.

60. Yehuda R, Daskalakis NP, Desarnaud F, et ai. Epigeneettiset biomarkkerit ennustajina ja korreloivat oireiden paranemista psykoterapian jälkeen taisteluveteraaneissa, joilla on PTSD. Etupsyk. 2013; 4:118.

61. Yehuda R, Cai G, Grolier JA et ai. Geenien ilmentymismallit, jotka liittyvät posttraumaattiseen stressihäiriöön World Trade Centerin hyökkäyksille altistumisen jälkeen. Biol Psychiatry. 2009; 66:708-711.

62. Li CQ, Luo YW, Bi FF, et ai. Ahdistuneisuutta muistuttavan käyttäytymisen kehittyminen hippokampuksen IGF-2-signaloinnin kautta vanhempien morfiinialtistuksen jälkeläisissä: rikastetun ympäristön vaikutus. Neuropsykofarmakologia. 2014;39(12):2777-2787.

63. Czermak C, Staley JK, Kasserman S, et ai. beeta2 Nikotiiniasetyylikoliinireseptorin saatavuus posttraumaattisessa stressihäiriössä. Int J Neuropsychopharmacol. 2008;11(3):419-424.

64. Milad MR, Pitman RK, Ellis CB, et ai. Neurobiologiset perusteet epäonnistumiselle ekstinktiomuistin palauttamiselle posttraumaattisessa stressihäiriössä. Biol Psychiatry. 2009;66(12):1075-1082.