Osa 1: Geranioli parantaa doksorubisiinin välittämää munuaisvauriota muuttamalla antioksidanttitilan, tulehduksen ja apoptoosin: NF-kB:n ja Nrf2/Ho:n mahdolliset roolit-1

Lisätietoja: ottaa yhteyttätina.xiang@wecistanche.com

Abstrakti: Doksorubisiini-välitteinenmunuaisten vajaatoimintaon vakava ongelma syövän hoidossa. Näin ollen tämä työ tutki geraniolin kykyä moduloida doksorubisiinin aiheuttamaamunuaisvauriokäyttäen rottamallia. Rotat jaettiin satunnaisesti neljään ryhmään: kontrolli, doksorubisiini (20 mg/kg, intraperitoneaalinen, ip), doksorubisiini plus 100 mg/kg geraniolia ja doksorubisiini plus 200 mg/kg geraniolia. Yksittäinen doksorubisiini-injektio laukaisi munuaisten vajaatoiminnan, mistä on osoituksena muuttuneet seerumin kreatiniini-, veren ureatyppi- ja albumiiniarvot; se aiheutti myös histologisia muutoksia munuaisten arkkitehtuurissa. Lisäksi doksorubisiini tehosti lipidien peroksidaatiota samalla kun se alensi glutationin, katalaasiaktiivisuuden ja glutationiperoksidaasin ja superoksididismutaasin ilmentymistä. Mielenkiintoista on, että esikäsittely geraniolilla pelasti doksorubisiinin aiheuttamat muutokset munuaisten antioksidanttiparametreissa, entsymaattisissa aktiivisuuksissa sekä tulehdus- ja apoptoosia välittävien geenien ja proteiinien ilmentymisessä. Lisäksi profylaktinen geraniolihoito säilytti suurimman osan munuaisten histologisista ominaisuuksista annosriippuvaisella tavalla. Nämä havainnot tukevat sitä, että geranioli voisi suojata doksorubisiinivälitteiseltämunuaisten toimintahäiriö. Lisätutkimusta tarvitaan kuitenkin geraniolin doksorubisiinivälitteisen munuaisten vajaatoiminnan vastaisten suojavaikutusten mekanismien selvittämiseksi.

Avainsanat: doksorubisiini; tulehdus; oksidatiivista stressiä; apoptoosi; munuaisvaurio; geranioli

1. Esittely

Antrasykliinisyöpälääkettä doksorubisiinia (Dox) on käytetty laajasti kiinteitä kasvaimia ja hematologisia pahanlaatuisia kasvaimia vastaan ​​sen keksimisen jälkeen. Yksi sen yleisimmistä sivuvaikutuksista on munuaistoksisuus, jota kuvataan munuaisten toimintahäiriöksi, johon liittyy vähentynyt suodatus, reabsorptio ja erittyminen, mikä liittyy merkittävään sairastuvuus- ja kuolleisuusriskiin. Noin 60 prosentille kemoterapiaa saavista syöpäpotilaista kehittyy nefrotoksisuutta, mikä rajoittaa Doxin terapeuttista tehoa[5,6]. Vaikka perusprosessit, jotka aiheuttavat Dox-välitteisen nefrotoksisuuden, ovat edelleen tuntemattomia, kirjallisuus viittaa siihen, että todennäköisiä vaikuttajia ovat mm.oksidatiivista stressiä, tulehdus, jaapoptoosi. Erityisesti todisteet osoittavat, että vähentää Dox-assosioitunuttaoksidatiivista stressiä, tulehdus, ja apoptoottiset tapahtumat voivat auttaa vähentämään lääkkeen munuaistoksisuutta.

Ydintekijä (erytroidiperäinen 2) kaltainen 2 (Nrf2) on redox-herkkä transkriptiotekijä, jolla on antioksidanttisia, anti-inflammatorisia ja sytoprotektiivisia ominaisuuksia, jotka ylläpitävät solujen puolustusjärjestelmiä. Oksidatiivisessa stressissä Nrf2 vapauttaa sytoplasman estäjäproteiininsa, joka tunkeutuu tumaan ja aktivoi useita geenejä, jotka osallistuvat antioksidanttipuolustukseen, kuten hemioksygenaasi-1(Ho-1), glutationiperoksidaasi (GPx), katalaasi( CAT) ja superoksididismutaasi (SOD) [14-19]. Dox-hoidon on osoitettu vähentävän sekä Nrf2:n mRNA- että proteiiniekspressiota ja siten myös alavirran antioksidanttigeenien ja -proteiinien ilmentymistä, mikä johtaa munuaistoksisuuteen.

Ydintekijä-kB (NF-kB) on transkriptiotekijä, joka säätelee monien tulehdusgeenien ilmentymistä; NF-kB-reitin keskeisenä hahmona, jonka reaktiiviset happilajit (ROS) aktivoivat, se voi laukaista tulehdusvasteen ja siitä johtuvan kudosvaurion [8,22,23]. Lukuisat tutkimukset ovat raportoineet Doxin aiheuttavan tulehdusta ja lisäävän tulehdusta edistävien sytokiinien, kuten interleukiini-6(IL-6), interleukiini-1 beeta (L-1 ), tuotantoa. ja tuumorinekroositekijä-alfa (TNF-)[11,13]. Lisäksi lisääntyneen ROS-tuotannon Dox-välitteisen munuaisvaurion jälkeen on osoitettu olevan avainrooli sisäisen apoptoottisen reitin aktivoinnissa mitokondrioiden epävakauden kautta. Tämän reitin avaintekijät ovat mitokondrioihin liittyvät proteiinit Bax ja Bcl-2; tasapainoinen Bcl-2:n ja Baxin välinen suhde estää apoptoosia, kun taas epätasapaino johtaa lisääntyneeseen kalvon läpäisevyyteen ja sytokromi c:n vuotamiseen sytosoliin, mikä aktivoi kaspaasin-9(Casp-9) ja kaspaasin{ {21}} (Casp-3). Tällainen aktivaatio johtaa yleensä DNA:n fragmentoitumiseen ja solukuolemaan.

On erittäin mielenkiintoista maksimoida kemoterapeuttisten lääkkeiden kliininen käyttö ja minimoida niiden negatiiviset vaikutukset. Tästä syystä on ryhdytty tutkimuksiin eri aineiden käytön tutkimiseksi yhdessä Doxin kanssa sen haittavaikutusten lievittämiseksi [13,30,31]. Yrttiuutteet ja niiden bioaktiiviset ainesosat on jo pitkään tunnustettu kyvystään vähentää lääkevälitteistä toksisuutta. Geranioli on asyklinen monoterpeenialkoholi, jota löytyy melkein kaikista eteerisistä öljyistä, kuten inkivääristä, ruususta, appelsiinista, laventelista ja sitruunasta [32,33]. Lukuisat tutkimukset ovat raportoineet geraniolilla olevan erilaisia ​​hyödyllisiä ominaisuuksia, kuten haavaumia, syöpää ehkäiseviä [35], masennuslääkkeitä [36], tulehdusta ehkäiseviä [33], ja lisäksi se voi helpottaa diabeettista nefropatiaa [37]. .

Tietojemme mukaan ei ole tällä hetkellä erityistä tietoa geraniolin ennaltaehkäisevistä vaikutuksista Dox-välitteistä nefrotoksisuutta vastaan. Siksi tutkimme geraniolin vaikutuksia ja todennäköisiä mekanismeja Doxin aiheuttamiin vaurioihin NF-kB- ja Nrf2/Ho-1-signalointireittien kautta Wistar-rottien munuaisissa.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1. Eläimet

Urospuoliset Wistar-rotat hankittiin King Saud Universityn (KSU) eläinhoitokeskuksesta Riadista Saudi-Arabiasta. Eläimiä pidettiin kontrolloiduissa olosuhteissa, kuten niitä pidettiin huoneenlämmössä (25 ± 1 aste) 12 tunnin valo/pimeyden syklillä, ja niillä oli rajoittamaton pääsy vedelle ja normaaliruokavalioon KSU:n paikallisen instituution tutkimuksen eettisen komitean hyväksymänä. (REC) valtuutusnumerolla KSU-SE-19-122.

2.2. Kokeellinen suunnittelu

Tässä tutkimuksessa tutkittiin yhteensä 32 urospuolista Wistar-rottaa, jotka painoivat 190-210 g ja jotka oli jaettu neljään ryhmään. Rotille annettiin viikko sopeutua ympäristöön ennen tutkimusta. Vehikkeliryhmä, joka tunnetaan myös kontrolliryhmänä, koostui rotista, joille annettiin normaalia suolaliuosta suun kautta. Ryhmä II koostui rotista, joille annettiin Doxia (20 mg/kg ip kerta-annos) päivänä 17 [11]. Ryhmän ⅢI ja IV rotille annettiin profylaktiset annokset geraniolia (suun kautta) 100 ja 200 mg/kg, vastaavasti, 18 päivän ajan, ja päivänä 17 altistettiin samoin Doxille (20 mg/kg, ip). Päivänä 18 rotat lopetettiin käyttämällä ketamiini/ksylatsiini-yhdistelmää kontrolloidussa ympäristössä. Veri kerättiin ja seerumi eristettiin, ja molemmat munuaiset poistettiin ja pakastettiin välittömästi nestetypessä. Jäädytetyille kudoksille suoritettiin biokemialliset, geeni- ja proteiiniekspressiomääritykset. Histologista tutkimusta varten munuaiskudosnäytteet pestiin PBS:ssä ja säilytettiin sitten 4-prosenttisessa formaldehydiliuoksessa. Koko tutkimuksen aikana ei ollut viitteitä ahdistuksesta tai kuolemasta koe-eläimessä.

2.3. Munuaisten toimintamerkkien määrittäminen

Seerumin eristämiseksi teurastuksen yhteydessä kerätystä verestä verinäytteitä sentrifugoitiin 10 minuuttia 2000 x g:ssä esijäähdytetyssä sentrifugissa. Saatu seerumi analysoitiin sitten albumiinin, veren ureatypen (BUN) ja kreatiniinin kvantifioimiseksi. Arvotmunuaisten toimintamarkkerit laskettiin käyttämällä Siemens Autoanalyzer Dimension RXL MAXTM -laitetta, Siemens, Washington, DC, USA.

2.4. Lipidiperoksidaatioiden arviointi

Lipidiperoksidaatio arvioitiin munuaiskudoksissa, kuten Ohkawa et ai. ovat aiemmin kuvanneet, pienin muutoksin.

2.5. Vähennetyn glutationin kvantifiointi

Pelkistyneen glutationin (GSH) tasot munuaisten post-mitokondriaalisessa supernatantissa (PMS) mitattiin Sedlakin ja Lindsayn kuvaaman menetelmän mukaisesti pienin muutoksin.

2.6. Katalaasin aktiivisuuden kvantifiointi

CAT:n aktiivisuus munuaisten PMS:ssä määritettiin Claibornen kuvaaman menetelmän mukaisesti pienin muutoksin.

2.7. Geeniekspressioanalyysi (RT-qPCR)

TRIzolTM-reagenssia (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) käytettiin kokonais-RNA:n uuttamiseen munuaiskudoksista valmistajan ohjeiden mukaisesti. Uutettujen RNA-näytteiden puhtaus ja määrä määritettiin käyttämällä NanoDropTM 8000 Spectrophotometer -laitetta (Thermo Scientific, USA). Eristetty RNA käänteiskopioitiin sitten cDNA:ksi käyttämällä cDNA Synthesis SuperMixiä (Bimake, Houston, TX, USA), ja geenin ilmentyminen kvantifioitiin SYBR Green Master Mixillä (Bimake, Houston, TX, USA) Applied Biosystems 7500 Fast Real-laitteella. Aika PCR-järjestelmä. AACt-lähestymistapaa käytettiin sitten eri geenien suhteellisen ilmentymisen määrittämiseen ryhmien kesken, ja GAPDH:ta käytettiin taloudenhoitogeeninä. Taulukossa 1 luetellaan tässä tutkimuksessa käytetyt alukesekvenssit (IDT, Leuven, Belgia).

2.8. Immunoblot-analyysi

Western blot -analyysi suoritettiin Alasmari et ai. [41]. Lyhyesti sanottuna eristetyt proteiinit (30-50 ug) elektroforeesittiin SDS-PAGE-geeleillä ja siirrettiin sitten PVDF-kalvoille. 5-prosenttisella rasvattomalla maidolla 60 minuutin eston jälkeen blotteja tutkittiin yön yli 4 asteessa valikoivilla primäärisillä vasta-aineilla (Ho-1, Nrf2, TNF-, I6, NF-kB-p65, pilkottu kaspaasi{{ 14}}, Bcl-2, Bax ja GAPDH, laimennus 1:1000). Tämän jälkeen kalvot pestiin, sitten inkuboitiin 60 minuuttia huoneenlämpötilassa sopivien HRP-konjugoitujen sekundaaristen vasta-aineiden kanssa (laimennus: 1:5000). ECL-reagenssipakkausta ja geelikuvauslaitteistoa (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) käytettiin proteiinien läsnäolon havaitsemiseen kalvolla.

2.9. Histopatologiset tutkimukset

Munuaiskudokset jälkikiinnitettiin 4-prosenttisessa formaldehydissä ja käsiteltiin sitten parafiinileikkausta ja värjäystä varten. Mikrotomia käytettiin parafiinileikkeiden leikkaamiseen 3 μm:n paksuudella. Leikatut osat käsiteltiin sitten vahan poistamiseksi ja värjättiin käyttämällä hematoksyliini plus eosiini (H&E) -väriä histopatologista tutkimusta varten. Munuaisten histologiset kuvat otettiin käyttämällä DP72-kameraa, joka oli kytketty Olympus BX -mikroskooppiin.

2.10. Tietojen analyysi

Aineisto analysoitiin tietokonepohjaisella Graph Pad Prism 5 -ohjelmalla (San Diego, CA, USA) ja tulokset esitetään keskiarvoina ja keskihajontana (keskiarvo ± SD). Ryhmien väliset erot arvioitiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVA:ta ja sen jälkeen Tukeyn vertailutestiä p-arvon ollessa alle 0,05, mikä osoittaa tilastollisen merkitsevyyden (p).<>