Osa 1: Euphorbiae Ebracteolatae Radix -bakteerin kokonaisditerpenoidien pahanlaatuista askitesta estävä vaikutus johtuu akvaporiinien muutoksista munuaisten PKC-toiminnan estämisen kautta
May 18, 2022
Lisätietoja: ottaa yhteyttätina.xiang@wecistanche.com
Abstrakti: Tässä tutkimuksessa arvioitiin Euphorbiae ebracteolate Radixista (TDEE) uutettujen kokonaisditerpenoidien anti-askites vaikutus pahanlaatuisiin askiteisiin hiiriin ja selvitettiin sen taustalla olevaa mekanismia. TDEE uutettiin dikloorimetaanilla ja sille suoritettiin pylväskromatografia. Kuuden TDEE:stä eristetyn diterpenoidin puhtaudeksi määritettiin HPLC:llä 77,18 prosenttia. TDEE (3 ja 0,6 g raakayrttejä/kg, po) vähensi askitesta ja lisäsi virtsan eritystä. Sillä välin kasvainsolujen elinkelpoisuuden, syklin ja apoptoosin analyysi osoitti, että TDEE:llä ei ollutkasvainten vastainentoiminta. Lisäksi akvaporiinien (AQP) ilmentymistasot ja proteiinikinaasi C:n (PKC) ja PKC:n kalvotranslokaatiotasotmunuaisetja solut mitattiin. TDEE alensi AQP1-4-tasoja ja esti PKC:n ilmentymistä kalvofraktiossa. Neljä pääditerpenoidia, paitsi yhdiste 2, alensivat AQP1-tasoja ihmisen munuais-2-soluissa. Yhdisteet 4 ja 5 estivät AQP2-4-ilmentymistä hiiren sisäydinkeräyskanavasoluissa. Diterpenoidin aiheuttama AQP1-4:n ilmentymisen esto esti forbol-12-myristaatti-13-asetaatilla (PMA; PKC:n agonisti). TDEE:n diterpenoidit ovat tärkeimpiä askitesta estäviä komponentteja. Diterpenoidien askitesta estävä vaikutus saattaa liittyä munuaisten AOP:iden muutoksiin diureesin edistämiseksi. TDEE:n aiheuttama AOP1-4:n ilmentymisen esto liittyy PKC-aktivaation estämiseen.
Avainsanat: Euphorbia ebracteolate Hayata; diureesi; bioaktiiviset komponentit; terpenoidit; munuaissolut; PKC:n estäjä
Napsauta oppiaksesi cistanche-yrtin eduista
1. Esittely
Euphorbia ebracteolate Hayata (EEH) on Euphorbia-sukuun kuuluva Euphorbiaceae-heimon jäsen, ja sitä käytetään laajalti vatsan turvotuksen ja turvotuksen, loisinfektion, tuberkuloosin ja muiden perinteisen kiinalaisen lääketieteen (TCM) sairauksien hoidossa[1]. EEH:n (EER) juuri sisältää erilaisia terpenoideja, joita pidetään tehokkaina komponentteina. Viimeaikaisia terpenoideja koskevia tutkimuksia on tehty niiden määrittämiseksitulehdusta ehkäisevä, antiviraalinen,antituberkuloosia ja muita vaikutuksia in vitro [2-5]. Perustutkimukset EER:n perinteisistä vaikutuksista vatsan turvotuksen ja turvotuksen hoidossa ovat kuitenkin rajallisia. TCM:n teorian mukaan EER voi poistaa nopeasti vatsan turvotuksen ja turvotuksen edistämällä virtsaamista ja ripulia [6]. Aiemmat tutkimuksemme ovat osoittaneet, että EER:n (TDEE) kokonaisditerpenoidit voivat aiheuttaa ripulia säätelemällä akvaporiinin (AQP)-1 ja AQP3:n ekspressiota [7]. Toistaiseksi EER:n askites-lääkkeiden tehokkaat aineet ovat kuitenkin edelleen epäselviä.
Vatsan turvotusta ja turvotusta kuvataan nykyaikaisessa lääketieteessä askitekseksi. Askites on patologinen vatsakalvon nesteen kerääntyminen [8]. Askiteksen muodostumiseen on monia syitä, kuten kirroosi, kasvain, sydämen vajaatoiminta ja nefroottinen oireyhtymä [9]. Vesivatsan esiintyminen liittyy portaalihypertensioon, joka johtaa splanchniseen valtimoiden verisuonten laajenemiseen, tehokkaan verenkierron pienenemiseen, endogeenisten vasokonstriktorijärjestelmien aktivoitumiseen ja innokkaaseen vedenpidätykseen munuaisissa [10]. AQP:t ovat nopeita veden kalvokuljettajia, jotka ylittävät epiteelin ja endoteelin esteet, ja niillä on siten perustavanlaatuinen rooli vesitasapainon ylläpitämisessä [11]. Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että AQP:llä on keskeinen rooli askiteksen muodostumisessa ja häiriöissä [12-15]. Munuaisissa on monenlaisia AQP:itä, kuten AQP1, AQP2, AQP3 ja AQP4[16]. Koska TDEE voi säädellä AQP:iden ilmentymistä suolistossa [7], ehdotamme, että TDEE:tä voidaan käyttää askiteksen hoidossa säätelemällä AQP:itä munuaisissa.
AQP:illä on kriittinen rooli virtsan muodostumisessa, mutta AQP:n ilmentymisen säätelymekanismeja munuaisissa ei ole selvitetty. Tällä hetkellä vain rajoitettu määrä raportteja osoittaa, että AQP:itä säätelevät proteiinikinaasi C(PKC)- ja proteiinikinaasi A(PKA) -reitit [17-20]. Joillakin Euphorbiasta eristetyillä terpenoideilla (esim. tuki ja ingenoli 3-angelaatti) on sääteleviä vaikutuksia PKC:hen. TDEE voi säädellä AQP:n ilmentymistä munuaisissa PKC-reitin kautta.
Tässä tutkimuksessa loimme TDEE:n ja arvioimme sen askitesta estävän vaikutuksen sekä analysoidut AQP:n ilmentymät, PKC- ja PKA-aktiivisuudet askiteshiirten munuaisissa. Sitten eristimme ja puhdistimme tärkeimmät diterpenoidit TDEE:stä tutkiaksemme sen vaikutuksia AQPs-proteiinin ja mRNA:n ilmentymistasoihin kahdessa eri muodossa.munuaissolut(ihmisen munuais-2-solut (HK-2) ja hiiren sisäydinkeräyskanavasolut (mIMCD3)). Lopuksi valitsemme diterpenoidiyhdisteen (eufebrakteolatiini A), käyttämällä forbol-12-myristaatti-13-asetaattia (PMA; PKC:n agonisti) aktivoimaan PKC-reitin, jotta voidaan selvittää, onko AQP:iden ilmentyminen munuaisissa säädelty. PKC-reitillä. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli määrittää TDEE:n askitesta estävä vaikutus EER:ssä ja luoda perusta EER:n kliiniselle soveltamiselle sekä diureesia ja askitesta estäviä vaikutuksia koskevien ehdokaslääkkeiden tunnistamiseen.
2. Tulokset
2.1. TDEE:n vaikutukset askitisen nesteen painoon, virtsan painoon ja ulosteen vesipitoisuuteen
Askiittisten hiirten käsittely EER:n (TEER) ja TDEE:n kokonaisuutteella (3 ja 0,6 g raakayrttejä/kg, po) ja furosemidilla (positiivinen lääke) vähensi merkittävästi askitesnesteen painon nousua malliin verrattuna. ryhmä (kuva 1A). Kuva 1C osoitti, että virtsa painaa merkittävästi (s<0.05, compared="" to="" the="" model="" group)increased="" in="" ascitic="" mice="" pretreated="" with="" teer,="" tdee,="" and="" furosemide.="" in="" addition,="" in="" the="" teer="" and="" tdee="" groups="" at="" a="" dose="" of="" 3="" g="" raw="" herbs/kg,="" a="" significant="" increase="" in="" fecal="" water="" content="" was="" observed="" compared="" with="" the="" model="" group="" (figure="" 1d).="" however,="" the="" non-diterpenoid="" fraction="" of="" eer(ntdee)="" groups="" showed="" no="" significant="" influence="" on="" ascites="" weight,="" urine="" weight,="" and="" fecal="" water="" content="" compared="" to="" the="" model="">
2.2. TDEE:n vaikutukset seerumin albumiinitasoihin askititisilla hiirillä
Seerumin albumiini on runsain proteiini selkärankaisten plasmassa ja voi ylläpitää veren osmoottista painetta ja säädellä veden kuljetusta. Kuvio 1B osoitti, että askiteksen tuotanto mallihiirillä aiheutti seerumin albumiinin merkittävän laskun normaaliin ryhmään verrattuna. Furosemidilla, TEER:llä ja TDEE:llä (3 ja 0,6 g raakayrttejä/kg, po) käsittelyn jälkeen seerumin albumiinitasot palautuivat tehokkaasti malliryhmään verrattuna. Tässä indeksissä ei havaittu parannusta NTDEE-ryhmissä.
2.3.TDEE:n vaikutukset kasvainsolujen elinkelpoisuuteen, kiertoon ja apoptoosiin askitesissa hiirissä
Pahanlaatuisessa askiteksessa kasvainsolut kelluvat askitesnesteessä. Arvioimme, liittyykö askiteksen väheneminen TEER:n ja TDEE:n syövänvastaiseen aktiivisuuteen. Tulokset osoittivat, että nämä lääkkeet eivät estäneet kasvainsolujen elinkelpoisuutta (kuvio 2A) eivätkä johtaneet solusyklin pysähtymiseen (kuvio 2B) ja apoptoosiin (kuvio 2C, D).
2.4. TDEE:n vaikutukset AQP:n ilmentymiseen askitisten hiirten munuaisissa
Munuaiset ovat tärkeä elin veden imeytymiselle ja virtsan keskittymiselle. AQP-vesikanavat välittävät nopeaa veden kuljetusta munuaisissa. Siten tutkimme AQP:iden ilmentymistä munuaisissa. Kuva 3 osoitti, että askiteksen voimistumisella oli vähän vaikutusta AQPsexpressioon munuaisissa verrattuna normaaliryhmään. TEER:llä ja TDEE:llä käsiteltynä AQP1-, AQP2-, AQP3- ja AQP4-proteiinien ilmentyminen oli useimmilla annoksilla huomattavasti alhaisempaa kuin malliryhmässä. TEER johti merkittävään laskuun AQP2:n, AQP3:n ja AQP4:n ilmentymisessä annoksilla 3.0 ja {{10}},6 g raakayrttejä/kg, kun taas AQP1:n ilmentyminen väheni vain pieni annos (0,6 g raakayrttejä/kg). Erityisesti TDEE:llä oli samat estävät vaikutukset AQP3:n ja AQP4:n ilmentymiseen kuin TEER:llä kahdella annoksella. Ero TDEE:n ja TEER:n välillä on, että TDEE esti AQP1:n ja AQP2:n ilmentymistä vain suurella annoksella (3 g raakayrttejä/kg). NTDEE:llä oli heikko vaikutus munuaisten AQP-tasoihin, ja se sääteli AQP4-proteiinin ilmentymistä vain annoksella 3 g raakayrttejä/kg.
2.5. TDEE:n vaikutukset PKC:n ja PKA:n aktivaatioon askitisten hiirten munuaisissa
Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että AQP:n ilmentymistä voidaan säädellä PKC- ja PKA-aktivaatiolla. Tutkimme TDEE:n vaikutuksia PKC-a-, PKC- ja PKA-aktivaatioon. PKC-aktivaatio mitattiin sen translokaatiolla sytosolista solukalvolle. Kuten kuvioista 4A ja B esitetään, PKC-proteiinin ilmentymistaso kalvofraktiossa oli merkittävästi alentunut TDEE-ryhmissä, kun taas PKC-membraaniproteiinin ilmentymistasoon ei ollut merkittävää vaikutusta. Fosfolipaasi C(PLC) on tärkeä ylävirran signalointimolekyyli, joka välittää PKC:n aktivaatiota. TDEE-käsittelyllä ei ollut mitään vaikutusta fosforyloidun ja kokonais-PLC:n tasoihin (kuvio 4D). PKA on heterotetrameeri, joka koostuu kahdesta katalyyttisestä alayksiköstä, jotka on sitoutunut kahteen säätelyalayksikköön. Katalyyttisten alayksiköiden vapautuminen on PKA-aktivaation tunnusmerkki. Kuvassa 4C TDEE ei vaikuttanut PKA-katalyyttisten alayksiköiden ilmentymiseen.
2.6.Kuuden diterpenoidin pitoisuuden määrittäminen TDEE:ssä korkean suorituskyvyn nestekromatografialla (HPLC)
Eläinkokeiden tulokset osoittivat, että TDEE oli EER:n tärkein tehokas fraktio. Eristimme kuusi diterpenoidia (yhdisteiden 1 - 6 rakenteet on esitetty kuvassa 5; spektritiedot lisättiin täydentävään materiaaliin) TDEE:stä ja käytimme näitä yhdisteitä standardeina määrittämään diterpenoidipitoisuutta TDEE:ssä. TDEE:n HPLC-kromatogrammit ja kuuden diterpenoidistandardin HPLC-kromatogrammit on esitetty kuvassa 6. Yhdisteiden 1-6 pitoisuus oli 1,07 prosenttia ,12.00 prosenttia ,12,69 prosenttia, 9,15 prosenttia, 39,26 prosenttia ja 3,02 prosenttia. 77,18 prosenttia TDEE:stä.
2.7. TDEE:stä peräisin olevien diterpenoidien vaikutukset AQP:n ilmentymiseen munuaissoluissa
TDEE oli EER:n aktiivinen fraktio, joka esti askitesta vähentämällä AQP1:n, AQP2:n, AQP3:n ja AQP4:n ilmentymistä munuaisissa. Samaan aikaan TDEE vähensi myös merkittävästi AQP1:n, AQP2:n, AQP3:n ja AQP4:n proteiini- ja mRNA-ilmentymistä ihmisen munuais-2-soluissa (HK-2) ja hiiren sisäydinkeräyskanavasoluissa (mIMCD3) (Kuva 7). TDEE:n pääkomponentit ovat diterpenoidit. Vertailimme TDEE:n ja diterpenoidiseoksen vaikutuksia (kuusi eristettyä diterpenoidia sekoitettiin TDEE:ssä olevan sisällön mukaan). Tulokset osoittivat, että diterpenoidiseoksen ja TDEE:n estävät vaikutukset AQP1:n, AQP2:n, AQP3:n ja AQP4:n ilmentymiseen olivat samanlaiset (kuva 7). TDEE:n neljän pääditerpenoidin aktiivisuudet arvioitiin in vitro. Kuvat 8 ja 9 osoittivat, että yhdisteet 3, 4 ja 5 alensivat merkittävästi AQP1:n proteiini- ja mRNA-ilmentymistasoja HK-2-soluissa. Käsittely yhdisteellä 2 ei indusoinut huomattavaa AOP1:n laskua proteiinissa ja mRNA:ssa. tasot. Näille yhdisteille yhdiste 3 (ent-abietaanityyppinen diterpenoidi) oli aktiivisempi kuin muut yhdisteet. mlMCD3-soluissa neljä diterpenoidiyhdistettä indusoi eri astetta AQP2-, AQP3- ja AQP4-ilmentymisen estoa. Proteiinin ja geenin ilmentymisen tulokset on esitetty kuvioissa 8 ja 9. Yhdisteillä 4 ja 5 oli voimakkaita AQP2:ta, AQP3:a ja AQP4:ää estäviä vaikutuksia verrattuna kontrolliryhmään geeni- ja proteiinitasoilla. Yhdisteet 2 ja 3 osoittivat vain erilaisia vaikutuksia Aqp2-, Aqp3- ja Aqp4-mRNA-ilmentymiseen.
2.8. PKC:n aktivaattorin vaikutukset diterpenoidin aiheuttamaan AQP:iden estoon
Eläinkokeiden tulokset osoittivat, että TDEE esti samanaikaisesti PKC-aktiivisuutta ja AQP:n ilmentymistä H22-kasvainsoluja kantavien hiirten munuaisissa. Sen selvittämiseksi, säätelikö PKC AQP:iden ilmentymistä munuaissoluissa, PKC-agonisti (PMA) esikäsiteltiin HK-2- ja mIMCD3-soluissa 1,5 tuntia ennen diterpenoidi- (Euphebracteolatin A) -stimulaatiota. Kalvon PKC:n, AOP1:n, AOP2:n, AOP3:n ja AOP4:n ilmentymisen muutos havaittiin. Western Bolt -tulokset osoittivat, että eufebrakteolatiini A saattoi vähentää kalvon PKC:n, AOP1:n, AOP2:n, AOP3:n ja AOP4:n proteiiniekspressiota, ja vaikutuksia voitiin heikentää PMA-esikäsittelyllä (kuvio 10).
