Osa Ⅰ Ravinnon proteiini- ja kuitupitoisuuden vaikutukset kasvukykyyn, kihdin esiintymiseen, suoliston mikrobiyhteisöihin ja hankkien poikien suolen munuaisakselin immunosäätelyyn

Abstrakti

Nykyisessä tutkimuksessa arvioitiin ravinnon proteiini- ja kuitupitoisuuksien vaikutuksia hanhenpoikien kasvukykyyn, kihdin esiintymiseen, suoliston mikrobiyhteisöihin ja immunosäätelyyn. Täysin satunnaistettu 2 £ 3 tekijämalli otettiin käyttöön kahdella CP-tasolla (180 [18 CP] ja 220 [22 CP] g/kg) ja 3 raakakuitutasolla (CF) (30 [matala CF], 50 [keskimääräinen CF], ja 70 [korkea CF] g/kg). Korkea CP tai matala CF-ruokavalio altisti hanhenpoikaset kihtiin. Proteiinipitoiset ruokavaliot heikensivät munuaisten toimintaa; seerumin UA- ja Cr-pitoisuudet sekä XOD-aktiivisuus 9-vuorokauden ikäisillä hanhenpoikailla, joita ruokittiin 22 prosentin CP-ruokavaliolla, lisääntyivät merkittävästi. Vaikka CF-tasot 3–7 prosentista eivät vaikuttaneet suoraan munuaisten terveyteen, CF-tasojen kohoaminen saattaa nopeuttaa probioottien lisääntymistä hanhenpoikien umpisuolessa ja estää pahanlaatuisia bakteereja, mikä lievittää proteiinipitoisen ruokavalion aiheuttamaa suoliston dysbioosia. Umpisuolen mikrobiotan analyysi 16Sr-RNA-sekvensoinnilla paljasti, että Enterococcus-bakteerin runsaus 22CP-ryhmässä oli suurempi kuin 18CP-ryhmässä, mutta väheni CF-tasojen noustessa 9. päivänä. Lactobacillus-bakteerin runsaus lisääntyi CF-tasojen noustessa. Lisäksi korkeammat seerumin LPS- ja proinflammatoriset sytokiinipitoisuudet ja lisääntyneet mRNA:n ilmentymistasot umpisuolessa, nielurisoissa ja munuaiskudoksissa osoittivat, että runsasproteiininen ruokavalio voisi aktivoida TLR4/MyD88/NFkB-reitin ja indusoida sekä suolisto- että munuaistulehdusta nuorilla hanhenpoikailla. Seerumin LPS-pitoisuuksien havaittiin laskevan päivänä 9. CF:n lisääntyessä, vaikka ruokavalion CF-tasojen muuttaminen ei suoraan vaikuttanut hanhenpoikien seerumin immuuni-indekseihin. Yhteenvetona voidaan todeta, että korkea CP-ruokavalio vaikutti negatiivisesti kihdin esiintymiseen, mikrobiyhteisöihin ja immuunisäätelyyn hanhenpoikien suolen ja munuaisen akselilla, kun taas asianmukaisesti kohonneet ravintokuitupitoisuudet auttoivat ylläpitämään suoliston tasapainoa ja alentamaan seerumin LPS-pitoisuutta. Ehdotamme 18 prosentin CP-ruokavaliota yhdistettynä 5 prosentin CF:ään optimaalisena yhdistelmänä hanhenpoikien ruokinnassa.

Avainsanat

raakakuitu, proteiini, hanhenpoika kihti, suoliston mikrobiyhteisöt, suoli-munuaisakseli,Cistanchen edut.

Napsauta tätä saadaksesi tietäämitkä ovat Cistanchen vaikutukset munuaisiin

Johdanto

Hanhet, jotka ovat kasvinsyöjiä, ovat riippuvaisia ​​ravintokuidusta normaalin toiminnan suorittamiseksi. Kohtuullisen raakakuitupitoisuuden (CF) ruokavaliossa tiedetään lisäävän taudin vastustuskykyä ja edistävän siipikarjan kasvua moduloimalla suoliston mikroekologista tasapainoa ja tehostamalla immuunitoimintoja (Jha ja Mishra, 2021) Wils-Plotz et al. (2013). raportoivat, että ravinnon pektiinin sisällyttäminen säätelee IL- 12-ilmentymistä sykkyräsuolen limakalvolla ja lisäsi interferoni-g:n tuotantoa umpisuolen risoissa. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että alhainen CF-ruokavalio vähentää mikrobien monimuotoisuutta sekä hyödyllisen mikrobiotan suhteellista runsautta hanhen umpikalvossa 70. päivänä, mikä vaikuttaa negatiivisesti näiden hanhien kasvukykyyn, ravinteiden hyödyntämiseen ja suolen limakalvojen immuniteettiin (Li et al., 2017; Li et ai., 2018a). Ruokavalion CF voi auttaa ylläpitämään suoliston estetoimintoa vahvistamalla limakalvon rakennetta ja toimintaa sekä lisäämällä kommensaalibakteerien populaatiota ja monimuotoisuutta maha-suolikanavassa. Vielä tärkeämpää on, että nuoret linnut ovat herkempiä ravinnon ravintoaineiden ja suoliston mikrobiyhteisöjen muutoksille kuin aikuiset (Gao et al., 2017). Tutkimuksia ravinnon CF-tasojen vaikutuksesta suoliston mikrobiotaan ja hanhenpoikien tautien vastustuskykyyn on kuitenkin vähän.

Lintujen kasvukyky on vähemmän herkkä proteiinipitoisuuden muutoksille kuin rehun ravinnon energian muutoksille, jotta ne tyydyttävät niiden alkuperäisen tahdonvoiman (Shi et al., 2006). On raportoitu, että merkittävää eroa painonnousussa ei havaittu hanhilla, joiden ravinnon proteiinitasot vaihtelivat välillä 16-22 prosenttia, mikä vaikuttaa liian yleiseltä (Summers et al., 1986). Sitä vastoin ravinnon proteiinipitoisuudet vaikuttavat voimakkaasti siipikarjan suolistoflooran tasapainoon ja tautien vastustuskykyyn (Lee et al., 2020). Viskeraalinen kihti, jota esiintyy pääasiassa linnuilla, on aineenvaihduntasairaus, joka johtuu munuaisten vajaatoiminnasta, jota seuraa uraattikiteiden kerääntyminen eri elimiin (Zhang et al., 2018). Aiempi tutkimuksemme osoitti, että proteiinipitoiset ruokavaliot liittyivät munuaisvaurioihin ja suoliston mikrobiotan dysbioosiin, joka liittyy kihtiin hanhenpoikailla (Xi et al., 2020a). Tämän tutkimuksen tulokset osoittivat, että verrattuna hanhenpoikaisiin, joille ruokittiin 16- ja 18-prosenttista raakaproteiinia (CP) sisältävää ruokavaliota, 22-prosenttisella CP-ruokavaliolla ruokitut hanhenpoikaset kärsivät suoliston epiteelisoluvauriosta ja umpisuolen mikrobiotosta johtuvasta dysbioosista, mikä johti munuaisvaurioon tai jopa hanhen kihtiin. Ruoansulatuskanavan mikrobiotalla ja sen metaboliiteilla näyttää olevan keskeinen rooli siipikarjan suolen ja munuaisen akselin immuniteetin vahvistamisessa (De Cesare et al., 2019; Xi et al., 2020b). Siten sopivan ravitsemusohjelman tunnistaminen, joka keskittyy ruokavalion CF- ja CP-tasojen vaikutuksiin, voi auttaa minimoimaan kihdin esiintyvyyttä ja parantamaan immuniteettia ylläpitämällä suolen mikroekologista tasapainoa ja parantamalla suhteellista immuunisäätelyä hanhipoikailla.

Suoliston mikrobiomi vaikuttaa syvästi suoliston immuunijärjestelmän säätelyyn, mikä vaikuttaa systeemiseen immuniteettiin ja edistää immuunitasapainoa. Muutokset ruokavalion koostumuksessa, mukaan lukien CP- ja CF-tasot, vaikuttavat suolistoympäristöön mukautuvan mikrobiotan koostumukseen ja aineenvaihduntatoimintoihin (Liu et al., 2014). Siipikarjalla mikä tahansa mikrobiomin häiriö voi aiheuttaa systeemisen immuniteetin epätasapainon, mikä osaltaan heikentää taudin vastustuskykyä. Aiemmassa tutkimuksessamme havaitsimme, että suoliston mikrobiotan dysbioosi lisäsi hanhenpoikien viskeraalisen kihdin riskiä lisäämällä tulehdusta sekä suolistosta peräisin olevan lipopolysakkaridin (LPS) siirtymistä suoliston ja munuaisen akselilla. Tässä monimutkaisessa kaskadissa LPS-ligaatio aktivoi tumatekijän, aktivoitujen B-solujen (NF-kB) -reitin kappa-kevytketjun tehostajan ja proinflammatoristen sytokiinien, kuten interleukiini 1b:n (IL1b) ja tuumorinekroositekijän tuotannon. a (TNFa), mikä edistää immunologisen toleranssin kehittymistä sekä hanhenpoikien suolistossa että munuaisissa (Xi et al., 2019). Tässä tutkimuksessa keskityttiin eri CP- ja CF-tasoilla ruokittujen hanhenpoikien umpisuolessa asuvien mikrobiyhteisöjen tutkimiseen ja mitattiin muutoksia kihdin esiintymisessä analysoimalla suolen ja munuaisen akselilla indusoituneita immunosäätely- ja tulehdusvasteita.

Standardoitu Cistanche

Materiaalit ja menetelmät

1. Eettinen hyväksyntä

Tutkimuksen hyväksyi Jiangsun maataloustieteiden akatemian tutkimuskomitea, ja se suoritettiin koeeläinten hallinnon määräysten mukaisesti (Jiangsu Academy of Agricultural Sciencen määräys nro 63 8.7.2014). Kaikki kokeet suoritettiin ARRIVEn (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) -ohjeiden mukaisesti.

2. Kokeellinen suunnittelu

Tämä tutkimus suoritettiin 2.–17. marraskuuta 2020 Jiangsun maataloustieteiden akatemian koeeläinkeskuksessa (Nanjing, Kiina). Yhteensä 1,620 yhden päivän ikäistä Taizhoun hanhetta (Anser domestica, 100 prosenttia ,), jotka toimitti Tianzhijiao Breeding Geese Limited Company (Chuzhou, Kiina), määrättiin satunnaisesti 6 koeryhmää. Jokaisessa käsittelyssä oli 6 toistoa, ja jokainen toisto sisälsi 45 lintua. Kokeessa käytettiin täysin satunnaistettua 2 £ 3:n tekijämallia. Valmistettiin kuusi ruokavaliota 2 CP-tasolla ja kolmella CF-tasolla (taulukko 1). 2 CP-tasot olivat 180 (18 CP) ja 220 (22 CP) g/kg ja kolme CF-tasoa olivat 30 (matala CF), 50 (keskipainoinen CF) ja 70 (korkea). CF) g/kg. Kaikki hanhenpoikaset kasvatettiin termostaattitalossa, jossa oli samankokoiset ruostumattomasta teräksestä valmistetut häkit (1,20 £ 1,00 £ 0,50 m3, 9 hanhenpoikaa häkissä, eläintiheys: 7,5 lintua/m2), jotka sijoitettiin 0,50 m maanpinnan yläpuolelle. Hanhenpoikia ruokittiin normaaleissa hoito-olosuhteissa pellettirehulla ja ad libitum vedellä. Riippuvien ruokinta- ja nännijuojien määrä kussakin häkissä oli riittävä koko tutkimuksen ajan. Ympäristön lämpötila pidettiin 30 asteessa d 0 - 3, 29 asteessa d 4 - 6, 28 asteessa d 7 - 9 ja 26 asteessa d 10 kokeen loppuun asti. Suhteellinen kosteus koko 21-d-koejakson aikana oli noin 60 prosenttia. Valonlähteet (valkoinen valo, 400–760 nm) tasattiin valaistusvoimakkuuteen 15 § 0,3 luksia linnunpään tasolla, valaistusohjelmalla 22 h valoa d 0 - 3, 18 h valoa d:stä. 4–14 ja 16 tuntia valoa päivästä 15–21 24-h jaksolla.

The basal diet was formulated to meet or exceed National Research Council (NRC, 1994) nutrient requirements for growing geese. The composition of experimental diets is presented (Table 1). Dietary samples (>1 prosentti tuoretta rehua), jotka oli hankittu satunnaisesti viidestä paikasta, sekoitettiin analysointia varten. CP ja CF mitattiin standardien GB/T6432 (Kiinan kansallinen standardi: Raakaproteiinin määritys rehussa) ja GB/T6434 (Kiinan kansallinen standardi: Raakakuidun määritys rehussa) mukaisesti.

Hanhenpoikien ADFI ja BW (elopaino) mitattiin elektronisella vaa'alla (YP60001, Hengji, Shanghai, Kiina) ennen ruokintaa testin aikana ja ADG ja rehun muunnossuhde (FCR) laskettiin kokeen lopussa. Lisäksi koejakson jälkeen laskettiin yhteen kaikkien replikaattien (jokainen replikaatti sisälsi 45 lintua) kihdin kumulatiivinen sairastuvuus eri hoitojen välillä. Kihdin valintastandardi määriteltiin hanhenpoikaksi, jolla oli vakavia munuaisvaurioita ja seerumin virtsahappopitoisuus (UA) yli uraattien ylikyllästymisen raja-arvon (uros, 416 mmol/l ja naaras, 357 mmol/l). Tyypilliset vallitsevat munuaisten karkeat leesiot ovat vaaleita, täpliä ja turvonneita, ja munuaisten tubulukset ja virtsanjohtimet ovat laajentuneet ylimääräisellä uraateilla (Xi et al., 2020a).

Herba Cistanche

3. Seerumin metaboliitin mittaus

Kolmekymmentäkuusi hanhenpoikaa (n=6 hanhenpoikaa/hoito) valittiin satunnaisesti välitöntä verenottoa varten (5 ml/hanhenpoika) pään poistamisen jälkeen verenkeräysputkien kautta ilman antikoagulanttia päivänä 9 ja 18, vastaavasti. Kaikkia verinäytteitä inkuboitiin 37 asteessa 2 tuntia keräämisen jälkeen ja sentrifugoitiin 1,5{{10}}0 £ g 15 minuutin ajan. Saadut seerumit säilytettiin 0,6 ml:n Eppendorf-putkissa 80 asteessa jatkoanalyysiin asti. Seerumin UA-tasot määritettiin käyttämällä fosfovolframihappokolorimetriaa. Kreatiniinin (Cr) ja ureatypen (UN) pitoisuudet sekä ksantiinioksidaasin (XOD) aktiivisuus määritettiin entsymaattisen kolorimetrian avulla käyttämällä mikrolevyspektrofotometriä (Promega Corporation, Madison, WI). Nämä sarjat toimitti Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kiina); koodit olivat C012 (UA), C011-2 (Cr), C013-2 (UN) ja A002 (XOD). Seerumin IgM-, IgA- ja IgG-pitoisuudet kokeellisissa hanhissa mitattiin käyttämällä hanhen immunoglobuliinin ELISA-pakkauksia, jotka ostettiin Shanghai J&I Biotechnology Co., Ltd:ltä (Shanghai, Kiina). Seerumin verenkierrossa olevat immuunikompleksit (CIC), IL-1b- ja TNF-a-pitoisuus määritettiin käyttämällä kaupallista hanhen ELISA-sarjaa (Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kiina). Diamiinioksidaasin (DAO) aktiivisuus mitattiin entsymaattisella kolorimetrialla käyttämällä automaattista biokemiallista analysaattoria (Hitachi, Tokio, Japani). Seerumin LPS mitattiin käyttämällä perinteistä Limulus-määritystä (Limulus Assay Biotechnology Company Ltd., Xiamen, Kiina). LPS:n havaitsemisalueet Limulus-määrityksessä vaihtelivat välillä 0,015 - 0,6 EU/ml. Kaikki veren keräämiseen ja endotoksiinien mittaamiseen käytetyt materiaalit olivat pyrogeenivapaita. Kaikki määritykset suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Seeruminäytteet testattiin kolmena rinnakkaisena. Määritysten sisäiset ja kokeiden väliset variaatiokertoimet olivat<10% and <15%, respectively.

4. Histomorfologinen havainnointi

36 hanhenpojan (n=6 hanhenpoikaa/hoito) umpisuoli (pituus {0} cm) kerättiin 9. ja 18. päivänä otetun verinäytteiden jälkeen histologista analyysiä varten. Hanhenpoikailta kerätyt näytteet kiinnitettiin 4-prosenttisessa paraformaldehydissä, upotettiin parafiiniin ja leikattiin (viipaleen paksuus: 3 mm; 4 viipaletta per hanhenpoika). Patologisia muutoksia umpisuolessa (noin 7 cm distaalisesti pylorisen sulkijalihaksesta) tutkittiin valomikroskoopilla (OLYMPUS, Tokio, Japani) hematoksyliini- ja eosiinivärjäyksen (HE) jälkeen. Umpisuolen kynsien korkeus ja kryptan syvyys mitattiin ImageJ-ohjelmistolla (versio 1.8.0; National Institutes of Health, Bethesda, MD). Kahdeksan mittausta eri ehjistä villistä viipaletta kohti kirjattiin (8 mittausta 3 peräkkäisessä näkökentässä). Histologisten mittausten tilastolliset analyysit suoritettiin perustuen keskimäärin 32 mittaukseen hanhenpoikaa kohti (4 siivua hanhenpoikaa kohti ja 8 mittausta siivua kohti). Pikarisolutiheys laskettiin pikarisolujen lukumääränä jaettuna vastaavalla villun pituudella, josta laskettiin sitten keskiarvo ja ilmaistiin pikarisolujen lukumääränä 100 mm villun pituutta kohti.

Cistanche tubulosa

5. Umpisuolen sisällön 16S-rRNA-sekvensointi

Gohenpoikien umpisuolen sisältö (6 hanhenpoikaa/hoito £ 6 ryhmää £ näytteenotto kahdesti=72 hanhenpoikasta) kerättiin päivällä 9 ja 18 2 ml:n steriileihin, sisäkierteitettyihin kryogeenisiin pulloihin ja varastoitiin välittömästi nestetypessä 16S rDNA -analyysiä varten. . DNA uutettiin umpisuolen sisältönäytteistä käyttämällä MicroElute Genomic DNA Kit -sarjaa (D3096-01, Omega Biotek Inc., Norcross, GA) noudattaen valmistajan ohjeita. Käyttämättömistä vanupuikoista koostuvat näytteenottonäytteet käsiteltiin DNA-uutolla, ja ne tarkastettiin, etteivät ne tuottaneet 16S-amplikonia. Kokonais-DNA eluoitiin 50 ml:ssa eluointipuskuria käyttämällä valmistajan (QIAGEN, Düsseldorf, Saksa) kuvaamaa modifioitua menetelmää ja säilytettiin 80 °C:ssa.

Käyttämällä näytteiden kokonais-DNA:ta templaattina ja 16S-rDNA-alukkeita (343F - 50 - TACGGRAGGCAGCAG -30; 798R - 50 - AGGGTATCTAATCCT-30 ) monistimme bakteerin V3-V4-alueen 16S rRNA. Kaikki reaktiot suoritettiin 25 ml:n (kokonaistilavuus) seoksessa, joka sisälsi 25 ng genomista DNA-uutetta, 12,5 ml PCR-esisekoitusta, 2,5 ml kutakin aluketta ja PCR-laatuista vettä tilavuuden säätämiseksi. PCR-tuotteet normalisoitiin käyttämällä AxyPrep Mag PCR Normalizer -laitetta (Axygen Biosciences, Union City, CA), mikä mahdollisti kvantifiointivaiheen ohituksen sekvensointiin lähetetystä PCR-tilavuudesta riippumatta. Amplicon-poolit valmistettiin sekvensointia varten käyttämällä AMPure XT -helmiä (Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA; suorittanut OebioTech Co., Ltd, Shanghai, Kiina). Amplikonikirjaston koko ja määrä arvioitiin käyttämällä LabChip GX:tä (Perkin Elmer, Waltham, MA) ja Kapa Library Quantification Kit for Illumina (Kapa Biosciences, Woburn, MA), vastaavasti. PhiX Control -kirjasto (v3) (Illumina) yhdistettiin amplikonikirjastoon (oletettu olevan 30 prosenttia). Kirjasto ryhmiteltiin tiheyteen noin 570 K/mm2. Kirjastot sekvensoitiin 300PE MiSeq-ajoilla, joissa yksi kirjasto sekvensoitiin molemmilla protokollilla käyttämällä tavallisia Illumina-sekvensointialukkeita, mikä eliminoi kolmannen (tai neljännen) indeksin lukemisen tarpeen. Lukemat suodatettiin käyttämällä kvantitatiivisia näkemyksiä mikrobiekologian (QIIME;) laatusuodattimista. CDHIT-putkilinjaa käytettiin operatiivisten taksonomisten yksiköiden (OTU) valintaan laatimalla OTU-taulukko. Sekvenssejä, joiden samankaltaisuus oli 97 prosenttia, määritettiin OTU:ille. Edustavat sekvenssit valittiin kullekin OTU:lle, ja taksonomiset tiedot määritettiin sitten kullekin edustavalle sekvenssille käyttämällä Ribosomal Database Project (RDP) -luokitinta. Näiden OTU-nukleotidisekvenssien GenBank-talletusnumero on SAMN21014082. Alfa-diversiteetin arvioimiseksi OTU-taulukkoa harvennettiin ja laskettiin seuraavat 4 mittaria: Chao1-metriikka rikkauden arvioimiseksi; havaittu lajimetriikka näytteestä löydettyjen ainutlaatuisten OTU:iden lukumääränä; Shannon-indeksi; ja Simpson-indeksi.

6. Reaaliaikainen PCR

poikia (n {{0}} hanhenpoikaa/hoito) kerättiin päivällä 9 ja 18 reaaliaikaista PCR-analyysiä (RT-PCR) varten. Kokonais-RNA uutettiin kudoksista käyttämällä TRIzol-reagenssia (Life Technologies, Grand Island, NY) ja käänteiskopioitiin käyttämällä Reverse Transcription Levels -pakkausta (TaKaRa, Dalian, Kiina) valmistajan protokollan mukaisesti. b-aktiinia käytettiin muuttumattomana kontrollina. Alukkeet suunniteltiin käyttäen Primer Premier 5.0 -ohjelmistoa ja niiden sekvenssit on lueteltu (taulukko 2). RT-PCR suoritettiin käyttämällä SYBR Premix Ex Taqia (Roche, Basel, Sveitsi). Kaikki RT-PCR:t suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Kohdegeenien suhteelliset ilmentymistasot määritettiin käyttämällä 2 DDCt -menetelmiä.

7. Tietojen analyysi

Kuudesta toistosta hoitoa kohden johdetut kokeelliset tiedot analysoitiin käyttämällä IBM SPSS Statistics 16 -ohjelmaa (IBM Corporation, Somers, NY). Jokaista toistoa pidettiin kokeellisena yksikkönä ja käytetty tilastollinen menettely oli monimuuttuja varianssianalyysi käyttäen yleistä lineaarista mallimenettelyä (GLM). Kun merkittävät erot määritettiin, hoitoarvot erotettiin ja verrattiin käyttämällä Duncanin monialuetestiä. Kaksisuuntaista testiä pidettiin tilastollisesti merkitsevänä alle 5 prosentin todennäköisyystasolla (P < 0,05).

Yumeng Xi *, Yuanpi Huang, y Yue Li *, Yunmao Huang #, Junshu Yan * ja Zhendan Shi *.

* Maatalous- ja maaseutuministeriön viljely- ja eläintuotannon avainlaboratorio, Animal Husbandry Institute, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, Kiina;

# Eläintieteen korkeakoulu, Zhongkain maatalous- ja tekniikan yliopisto, Guangzhou 510000, Kiina.