Osa 4: Epigenomisen ja transkriptomisen vuorovaikutuksen kartoittaminen muistin muodostumisen ja palauttamisen aikana hippokampusengrammiyhtyeessä

ali.ma@wecistanche.com

Pls klikkaa tästä päästäksesi osaan 3

Pls napsauta tästä päästäksesi osaan 5

RNA-seq

ul nukleaasivapaata vettä), 30 minuuttia 37 °C:ssa kevyesti keinuttamalla. Lisätyt DNA-fragmentit monistettiin ja viivakoodattiin käyttämällä PCR-reaktiota (1 sykli; 5 min - 72 c, 30 s - 98 c, 10 sykliä; 15 s - 98 c, 30 s - 60 c, 3 min - 72 c). Valmistajan ohjeiden mukaisesti monistettu DNA puhdistettiin ja puhdistettiin käyttämällä 1,8x AMPure-helmiä (AmpureXP-helmiä, Beckman Coulter, A63880). Kirjaston koon ja jakelun bioanalyysin QC:n jälkeen kirjastot sekvensoitiin Illumina Nextseq 550 -alustalla MIT BioMicro Centerissä.

Cistanche ja Cistanches muistin parantamiseen

ATAC-seq-analyysi – 40-bp parillisen pään sekvensointilukemien fastq-raakadata kohdistettiin hiiren mm9-viitegenomiin käyttämällä Bowtie 2:ta.0 paripään tilassa50. Samtools-kokoelmaa51 käytettiin PCR-kopioiden lajitteluun, poistamiseen (rmdup), BAM-tiedostojen indeksointiin (indeksi) ja kirjastotilastojen laskemiseen (flagstat, katso lisätaulukko 13). BAM-tiedostot laskettiin näytteet oikein kohdistetuista, pareillisista ja yksilöllisistä lukumääristä 50 miljoonaan. Avoimet kromatiinihuiput analysoitiin käyttämällä MACS252-ohjelmistoa Diffbind v1.16.353 tunnisti differentiaalisesti saavutettavissa olevat alueet (DAR:t) oletusparametreilla ja -asetuksilla DESeq2:n käyttöä varten (raja; FDR < 0,01;="" kertaiset="" muutokset=""> 1,5). DiffBind-paketti haki normalisoitujen lukumäärien täydellisen matriisin (RPKM54). Bigwig-raitojen sukupolvelle luotiin biografiamuotoisia pileup-signaalitiedostoja (fragmenttipileup miljoonaa lukua kohti) käyttämällä MACS2-puhelun huippufunktiota -B –SPMR-lippujen kanssa. Sitten luotiin normalisoitu taittorikastus (FE) syötettävien lambda-raitojen yli käyttämällä MACS2:n bdgcmp-toimintoa asetuksella - m FE. Sitten bedGraph-tiedostot muutettiin bigwig-muotoon.

Bigwig-tiedostojen visualisointiin käytettiin IGV55-työkaluja. ChromHMM56:ta käytettiin kromatiinin tilamallin luomiseen kahdesta riippumattomasta tutkimuksesta, joissa käytettiin massahippokampuksen kudosta ennen jalkojen shokkia ja sen jälkeen21,22 ja määritettiin DAR:ien rikastuminen tilamalliin verrattuna. Motiivirikastusanalyysi57,58 ja piikkien annotaatio suoritettiin HOMER59-työkaluilla. Kaikki koodit ovat saatavilla täydentävän ohjelmistotiedoston RNA:n erottamisessa ja kirjaston valmistelussa – Välittömästi kiinnityksen ja lajittelun jälkeen (katso kudosvalmistelu) 4 ul proteaasia lisättiin digestiopuskuriin (RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE, Life Technologies, AM1975) . Näytteitä inkuboitiin lämpölohkoissa 15 minuuttia 50 asteessa, sitten 15 minuuttia 80 asteessa. Seuraavaksi jokaiseen näytteeseen lisättiin 0,75 ml Trizol LS:ää (TRIzol™ LS Reagent, Thermo Fisher Scientific, 10296028) ja 0,2 ml fenoli:kloroformiliuosta (fenoli:kloroformi: isoamyylialkoholi, 1-faasi, VWR International, K169) ja sen jälkeen. ravistamalla voimakkaasti 5 minuuttia huoneenlämpötilassa (RT). Suspensio laitettiin Phase lock -geeliputkiin (PLG, 5 Prime, 2302830) ja sentrifugoitiin 13, 000 rpm 5 minuutin ajan. Vesifaasi, jossa oli nukleiinihappoja, uutettiin putkista tuoreeseen Eppendorf-putkeen samalla määrällä 100-prosenttista etanolia. RNA-puhdistus suoritettiin Direct-zol™ RNA MicroPrep -pakkauksella (Zymo Research, R2060) RNA:n puhdistamiseksi valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA eluoitiin (10 ul, DEPC) ja säilytettiin sitten -80 asteessa. SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian (Clontech, 635006) käytettiin kirjaston valmisteluun ja monistamiseen. Kirjaston valmisteluun käytettiin 3 biologista kopiota (N=3). Kirjastot valmistettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti ilman ylimääräistä fragmentointivaihetta (FFPE, vaihtoehto 2, katso käsikirja), ribosomaalisen cDNA:n tyhjennyksellä ja lopullisella PCR-amplifikaatiolla (15 sykliä). Kirjastot sekvensoitiin Illumina HiSeq 2000 -alustalla MIT BioMicro Centerissä.

RNA-seq-analyysi – Raaka fastq-tiedot kohdistettiin hiiren mm9-viittaukseen

genomi käyttämällä Bowtie 2:ta.0. Geenikappaleiden kartoitetut lukemat (mukaan lukien eksonien ja intronien lukemat) käsiteltiin Cufflinks 2.260:lla ja DEseq261:llä UCSC mm9 -viitegeenimerkinnällä transkriptien runsauden arvioimiseksi. Differentiaalinen geeniekspressio ja alavirran analyysit suoritettiin käyttämällä DEseq2:ta ja mukautettuja R-skriptejä. Transkriptien suhteellinen runsaus mitattiin fragmenteilla eksonin kiloemästä kohti miljoonaa kartoitettua fragmenttia (FPKM).

Transkriptio-ohjelmien analysointia varten kunkin geenin ilmentyminen arvioitiin eri tavallamuistivaiheet (aktivoitu -varhainen, aktivoitu - myöhään, uudelleen aktivoitu) log2-kertaisen muutoksen (log2FC) perusteella perustilasta. 1095 differentiaalisesti ekspressoitunutta geeniä (DEG) läpäisi rajakriteerit, joissa havaitsimme ainakin yhdessä P-arvon vertailussa.< 0.01="" and="" log2(fc)="" >="" 1.="" then,="" genes="" were="" unbiasedly="" clustered="" by="" k-mean="">

Cistanche voi parantaa muistia

Kromosomien konformaation sieppaus (Hi-C)

Kiinteistä soluista saadut tumat (katso kudosvalmisteet) lajiteltiin 1,5 ml:n Eppendorf-putkiin, jotka sisälsivät 500 ul tuoretta jääkylmää lyysipuskuria (10 mM Tris pH=8, 10 mM NaCl, 0,2 % Igepal CA{{ 9}}, Pi- ja PCR-luokan vesi) ja pakastettiin kuivajäällä ja säilytettiin -80 °C:ssa, kunnes niitä käytettiin. Hi-C-kirjastot valmistettiin 100 000 solusta/ryhmä (kerätty kahdesta eläimestä) kahdessa biologisessa rinnakkaiskappaleessa käyttäen Dovetail™ Hi-C -sarjan käsikirjaa (v.1.03, Dovetail Genomics, Chicago, USA). Kuusi Hi-C-kirjastoa sekvensoitiin (pariliitospää) Illumina Nextseq 500 -alustalla. HOMER Hi-C -putkilinjaa käytettiin kokeellisten artefaktien, kuten kiertokirjeen, itseligaatioiden ja PCR-kopioiden suodattamiseen. Suodatetut lukemat kohdistettiin vertailuhiiren genomiin (mm9) ja prosessoitiin edelleen käyttämällä HOMER HI-C -putkilinjaa.

HOMERin Hi-C-työkaluja käytettiin pääkomponenttianalyysin (PCA) suorittamiseen Hi-C-datalle ydinosan osien (A ja B) tunnistamiseksi 50 kb:n resoluutiolla (katso lisäohjelmisto). Osastokytkinanalyysiä varten vähennimme ensin PC1-arvot ryhmien välillä. Seuraavaksi tunnistimme suurimmat BtoA-siirtymät alueiksi, joissa PC1 muuttuu 90. prosenttipisteen yläpuolella, ja suurimmat AtoB-siirtymät alueiksi, joissa PC1 muuttuu 10. prosenttipisteen alapuolella. Koska osaydinosastoja säädellään useiden satojen kiloemästen yksiköinä, yhdistimme peräkkäiset 50 kb:n AtoB- tai BtoA-segmentit, jotka olivat 100 kb:n etäisyydellä toisistaan. Yhdistetyt verkkotunnukset, joiden kokonaiskoko oli alle 200 kt, hylkäsimme. Osaston vaihtoa harkittiin vain, jos negatiivinen arvo muutettiin positiiviseksi (ja päinvastoin). Lopuksi verrattiin ensimmäisen komponentin positiivisia ja negatiivisia arvoja kaikkien kolmen neuronipopulaation välillä (perus, aktivoitu - varhainen ja aktivoitu - myöhäinen).

Promoottorin sieppaus Hi-C

Seuraa kiinnitystä ja lajittelua (katso kudoksen valmistus) solut lajiteltiin 1,5 ml:n Eppendorf-putkiin, jotka sisälsivät 500 ul tuoretta jääkylmää lyysipuskuria (10 mM Tris pH=8, 10 mM NaCl, 0,2 % Igepal CA{ {9}}, Pi- ja PCR-luokan vesi), jäädytetty kuivajäällä ja säilytetty -80 asteessa, kunnes niitä käytettiin. Hi-C-kirjastot valmistettiin 10,000 solusta /ryhmää kohden (N=3–4), kuten aiemmin kuvattiin62, tietyin muutoksin. Näytteet sentrifugoitiin (4 astetta, 1 600 g 20 minuuttia) ja pelletti suspendoitiin uudelleen 400 ul:aan 1,2x Cutsmart-puskuria (New England Biolabs,

USA). Ensimmäinen restriktiohajotus suoritettiin alkuperäisessä protokollassa kuvatulla tavalla 1 500 U:lla HindIII:a (R3104L, New England Biolabs, USA) 6-perusleikkurina (alkuperäisen protokollan BglII:n sijasta). Biotiinileimauksen ja yön yli tapahtuvan ligaation jälkeen (katso yksityiskohdat alkuperäisestä protokollasta), näytteet sentrifugoitiin (4 astetta, 1 600 x g 15 minuuttia) ja pelletti suspendoitiin uudelleen 25 ul:aan PBS:ää. Suspensiota inkuboitiin 65 °C:ssa 3 ul:n kanssa proteinaasi K:ta 12–16 tuntia. Hi-C DNA:n puhdistus suoritettiin alkuperäisessä protokollassa kuvatulla tavalla 100 ul:lla streptavidiinihelmiä (Dynabeads M-280-streptavidin, Life Technologies, 11205D). Toiseen restriktioentsyymiin käytimme 4-perusleikkuria Hpych4V (10 U/näytettä kohti, R0620S, New England Biolabs, USA). A-pyrstöreaktion jälkeen (katso yksityiskohdat alkuperäisestä protokollasta) näytteet monistettiin käyttämällä PCR:ää (17 sykliä) ja puhdistettiin AMPure XP -helmillä. Hi-C-kirjastot eluoitiin 20 ul:ssa 10 mM Tris-HCl:a (pH 8,5). Syötinsieppausjärjestelmän suunnittelu Promoter Capture Hi-C:lle – Luettelo 5000 hiiren geenipromoottorista saatiin aiemmin Schoenfelderissä julkaistusta protokollasta. Et ai. 29. Luettelo sisältää vain transkriptit, joissa on proteiinia koodaavien alueiden biotyyppi ja HindIII-restriktiofragmenttikohdat. Suunniteltiin kaksi 120 bp:n sieppauskoetinta, yksi fragmentin kumpaankin päähän. Agilent Technologies syntetisoi koettimet SureSelect-kohderikastusjärjestelmän (Agilent Technologies) mukaisesti.

Promoottorin sieppaus Hi-C-kirjaston valmistelu ja sekvensointi – Promoottorisekvenssejä sisältävien Hi-C-ligaatiotuotteiden sieppaamiseksi käytimme aiemmin julkaistua protokollaa29. Lyhyesti sanottuna hybridisaation estoaineita (Agilent Technologies) lisättiin Hi-C DNA-kirjastoihin. Hybridisaatiopuskuri ja sieppaussyötin RNA valmistettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti (SureSelect Target Enrichment, Agilent Technologies). Seuraavaksi Hi-C-kirjaston DNA/hybridisaation estäjiä kuumennettiin 5 minuuttia 95 asteessa, ennen kuin lämpötila laskettiin 65 asteeseen. Hi-C-kirjaston DNA sekoitettiin hybridisaatiopuskuriin (esilämmitetty 5 minuutiksi 65 asteeseen) ja sen jälkeen räätälöityyn sieppaussyöttijärjestelmään (esilämmitetty 3 minuutiksi 65 asteeseen), joka koostui 10,000 biotinyloidusta RNA:t, jotka kohdistuvat 5 000 hiiren geenipromoottorin Hindlll-restriktiofragmenttien päihin (Agilent Technologies, katso lisämateriaali sieppaussyötin suunnittelusta). 24 tunnin jälkeen 65 asteessa PCR-koneessa biotiinin pudotus (MyOne Streptavidin T1 Dynabeads; Life Technologies) ja pesut suoritettiin SureSelect Target -rikastusprotokollan (Agilent Technologies) mukaisesti. Viimeisen pesun jälkeen helmet suspendoitiin uudelleen 30 µl:aan NEBuffer 2:ta ilman aiempaa DNA-eluointia, ja sieppauksen jälkeinen PCR (neljä amplifikaatiosykliä käyttäen illuminyuniversaalialukkeita) suoritettiin DNA:lle, joka oli sitoutunut helmiin biotinyloidun RNA:n kautta. Capture Hi-C -kirjastot sekvensoitiin pariksi (Nextseq 500, Illumina).

Promoottorin sieppauksen Hi-C-analyysi – HiCUP-putkilinjaa63 käytettiin käsittelemään raaka fastq-sekvensointilukemat. Tätä putkistoa käytettiin lukuparien kartoittamiseen hiiren (mm9) genomia vastaan, kokeellisten artefaktien suodattamiseen (kuten ympyrämuotoiset lukemat ja uudelleenligaatiot) ja kaksoislukemien poistamiseen. PC-HiC-tietojen osalta tuloksena saaduista BAM-tiedostoista näytteistettiin ja käsiteltiin CHiCAGO-versiolla 1.2.064 noudattaen oletusasetuksia kutsuakseen merkittäviä vuorovaikutuksia. Täydelliset tiedot tästä putkistosta ovat saatavilla Babraham Bioinformaticsilta

Cistanche voi parantaa muistia

Stereotaksinen adenosiin liittyvä virusinjektio

ArcCreERT2-hiiret nukutettiin avertiinilla ja AAV9-EF1a-DIO-hChR2-EYFP (serotyyppi 5, saatu UNC viral core) -virusinfuusiolla. Ensin kalloon tehtiin pieni reikä selkähippokampuksen yläpuolelle (suhteessa Bregmaan: anterior-posterior −2.0 ja mediolateraalinen ± 1,5), Hamilton-ruisku, jossa oli 33-mittaneula, laskettiin alas. -1,8 DV:iin ja 500 µl virusta infusoitiin virtausnopeudella 50 µl minuutissa kumpaankin aivotursoon. Neula vedettiin pois 10 minuutin injektion jälkeisen jakson jälkeen ja hiirten annettiin toipua 4 päivää.