saadaksesi lisää information:ali.ma@wecistanche.com

Keskustelu

Engrammien muodostumisen molekyyliset perusteet ovat olleet erittäin kiinnostava alue. Tässä hyödynnämme TRAP-hiirimallia selvittääksemme kromatiinin saavutettavuuden, 3D-genomisen arkkitehtuurin ja geenien ilmentymisen dynamiikan engrammisolun koko elinkaaren ajan. Ensinnäkin osoitamme suoraan, ettämuistikoodauksella on laaja ja pitkäkestoinen vaikutus kromatiinin saavutettavuuteen. Kun tämä kromatiinitila on määritetty, myöhemmät tapahtumat, kutenmuistikonsolidoinnilla ja takaisinvedolla näyttää olevan vähäinen vaikutus kromatiinimaisemaan. On mahdollista, että valittu palautusajankohta ei välttämättä täysin vastaa uudelleenaktivoitujen solujen kromatiinitapahtumia ja että myöhemmät kromatiinimuutokset voivat liittyämuistiuudelleensyntyminen tai sukupuutto8. Tärkeää on, että edellisten julkaisujen12, 13,23 mukaisesti tietomme viittaavat siihen, ettämuistimuodostuminen on suurelta osin tehostajavetoinen ilmiö.

Napsauta Cistanche UK: een saadaksesi muistia

Toiseksi tutkimuksemme tarjoaa ensimmäisen kattavan maiseman 3D-genomiarkkitehtuurista eri vaiheissamuistimuodostuminen, kuten osoitimme suurten kromatiinisegmenttien ja spesifisten promoottori-tehostajavuorovaikutusten uudelleen lokalisoinnin, joka on dynaaminen näissä osastoissa, mikä mahdollistaa eri transkriptio-ohjelmien hienosäädön. Lisäksi osoitamme, että alassäädeltyjen geenien promoottorit ovat useammin vuorovaikutuksessa tehostajien kanssa, joissa on transkription repressoreita, ja päinvastoin.

Lopuksi työmme tarjoaa ensimmäiset todisteet toiminnallisesta pohjustustapahtumasta, jolle on ominaista tehostajan saavutettavuuden alkuperäinen lisääntyminen koodauksen aikana ilman odotettuja transkriptiomuutoksia. Analyysimme paljasti, että uudelleenaktivoinnin myötä engrammin neuronit käyttävät denovopromoter-enhancer-vuorovaikutusten osajoukkoa, jossa pohjustetut tehostajat saatetaan kosketuksiin vastaavien promoottoriensa kanssa säätelemään mRNA:n kuljetukseen ja paikalliseen proteiinien translaatioon osallistuvia geenejä synaptisissa osastoissa. Nämä muutokset vastasivat odotettuja morfologisia ja toiminnallisia muutoksia. Yhdessä näyttää siltä, että engrammisolut on merkitty epigeneettisellä tasolla ja kromatiinin saavutettavuuden, 3D-genomiarkkitehtuurin ja promoottori-tehostajavuorovaikutusten välinen vuorovaikutus kuvaa hyvin koordinoitua järjestelmää, joka johtaa viivästyneeseen transkription nousuun engrammin uudelleenaktivoinnin aikana.

Kuten minkä tahansa työn kohdalla, tutkimuksessa oli useita rajoituksia. Tamoksifeenista riippuvaisten TRAP-hiirten käyttö mahdollistaa ajallisen resoluution, mutta avaa noin 12 tunnin merkintäikkunan, mikä voi johtaa epäspesifiseen neuronien merkitsemiseen, jotka eivät ole osa CFC-kokemusta. Lisäksi, kuten aiemmin ehdotettiin37, Arc-merkityt neuronit voivat olla heterogeenisiä ja sisältää erilaisia yhtyeitä, jotka säätelevät molempiamuistisyrjintä ja yleistys. Lisäksi mikään aikapiste ennen 1,5–2 tuntia (varhainen) ei riitä sieppaamaan DNA-rekombinaation aiheuttamia transkriptio- ja translaatiotapahtumia eli cre-rekombinaasin ilmentymistä ja eYFP-geenin lopullista ilmentymistä5. Siksi uskomme, että monet varhaisen ohimenevät DEG-klusterit jäivät väliin, koska aiemmin osoitettiin, että monet IEG: t palaavat lähtötasolle 2 tunnin kuluttua (paitsi Arc46). Lopuksi, vaikka tutkimuksemme keskittyi hippokampukseen, rakenteellinen ja synaptinen plastisuus on yhdistetty tiedon pitkäaikaiseen varastointiin muilla aivoalueilla, kuten prefrontaalisessa aivokuoressa, amygdala2: ssa. Tulevissa tutkimuksissa tulisi selvittää, voivatko nämä epigeneettiset muutokset edustaa maailmanlaajuista kriittistä prosessia, joka liittyy muistojen pitkäaikaiseen muodostumiseen ja säilyttämiseen, vai onko se ainutlaatuinen hippokampuksen piireille.

Menetelmät

Hiiret ja käyttäytyminen

Kuten aiemmin on kuvattu6, ArcCreERT2(+) -hiiret kasvatettiin R26R-STOP-floksoidulla- keltaisella fluoresoivalla proteiinilla (eYFP) homotsygoottisella linjalla. ~140 seuraavaa urospuolista jälkeläistä genotyypitettiin Jackson Laboratoryn genotyypitysprotokollalla. Hiirillä oli neljästä viiteen häkkiä kohden 12 tunnin (06.00–18.00) vaalean pimeän yhdyskunnan huoneessa 22 °C:ssa 40–60 %:n kosteudessa. Ruokaa ja vettä tarjottiin ad libitum. Käyttäytymistestaus suoritettiin valovaiheen aikana. 1h ennen käyttäytymistestiä hiiret saivat yhden annoksen 4-Hydroksiatomoksifeeniä (4- OHT, H6278, Sigma-Aldrich), joka avaa ~ 12 tunnin merkintäikkunan5. Epäspesifisen eYFP-merkinnän minimoimiseksi päivää ennen käyttäytymistehtävää (esim. CFC) hiiret sijoitettiin 24 tunnin pimeään/pimiöön. Lisäksi ahdistustasojen vähentämiseksi häkkiin lisättiin putki suojaa ja pesimistä varten. Seuraavana päivänä hiirille injektoitiin TAM 1h ennen CFC:tä. Käyttäytymistehtävän jälkeen hiiret joko lopetettiin 1,5–2 tunnin kuluttua ja aivot kerättiin. tai sijoitettu takaisin pimiöön seuraavaksi 48 tunniksi. Kun hiiret oli otettu pois pimeästä, ne palautettiin normaaliin 12 tunnin (06:00–18:00) vaalean ja pimeän sykliin samassa huoneessa. 3 päivää myöhemmin (yhteensä 5 päivää CFC: n jälkeen) puolet hiirikohortista lopetettiin ja aivot kerättiin, kun taas toinen puoli palasi testaushuoneeseen, jossa he altistuivat pelkoa aiheuttavalle vihjeelle (sävy ja konteksti). Kaikki hiirityöt hyväksyi Massachusetts Institute of Technologyn vertailevan lääketieteen osaston eläintenhoitokomitea. Cistanche voi parantuamuisti.

Cistanche voi parantaa muistia

Kontekstuaalinen pelon ehdollistaminen

Kontekstuaalinen pelkokäsittelylaite (CFC) ja hankintaohjelma olivat TSE-järjestelmistä. Hiiret vietiin CFC-kammioon 3 minuutin ensimmäisen tottumuksen jälkeen 3 kilon Hz: n sävy 80 DB: n intensiteetillä esiteltiin 30 sekunnin ajan, ja ne lopetettiin yhdessä 0,7 mA: n jalkaiskulla 1 sekunnin ajan. 5 päivää myöhemmin hiiret vietiin alkuperäiseen ilmastoituun kontekstiin yhdistettynä sävyyn ja jäätymistasot mitattiin 3 minuutin ajan (TSE-ohjelmiston oletusparametrit, joita käytetään jäätymiskäyttäytymisen seuraamiseen), kontekstuaalisen arvioinnin arvioimiseksimuisti. Konteksti B oli muokattu konteksti A. Ruostumattomasta teräksestä valmistetut tangot peitettiin valkoisella muovisella insertillä, kammioiden ulkoseinät peitettiin ilmastointiteipin muodoilla kammion ulkonäön muuttamiseksi. Kammio tuoksui vaniljalla, huoneen valaistus oli paljon kirkkaampi ja hiiret kuljetettiin laitteeseen eri kärryssä kontekstista A.

Huumeet

Rekombinaatio ArcCreERT2: ssa × R26R-STOP-floksed-EYFP-siirtogeeniset hiiret indusoitiin käyttäen 4-Hydroxytamoxifenia (4-OHT, H6278, Sigma-Aldrich). 4-OHT liuotettiin 2,5 ml:aan EtOH:ta /100 % ja keinutettiin ravistimella 30 minuutin ajan. Seuraavaksi lisättiin 5 ml maissiöljyä ja keinutettiin ravistimella 1 tunti. Lopuksi putket asetettiin 30 minuutiksi 60 ° C: seen, jotta EtOH haihtui kokonaan. Kertainjektio 50 mg/kg injektoitiin vatsaontelonsisäisesti (i.p.).

Immunohistokemia (IHC)

Hiirille perfusoitiin transkardiaalisesti jääkylmällä 25 ml:lla fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), jota seurasi 40 ml 40 ml paraformaldehydiä PBS:ssä. Aivot poistettiin ja kiinnitettiin 4%: n PFA: ssa yön yli 4 ° C: ssa ja siirrettiin PBS: ään leikkaamiseen asti. Aivot asennettiin vibratomivaiheeseen (Leica VT1000S) superliimalla ja ja jaettiin viipaleen paksuudella 40 μm. Viipaleet pestiin PBS:llä ja estettiin käyttäen 1 %:a naudan seerumialbumiinia (BSA), joka on valmistettu PBS:ssä ja joka sisältää 0,1 % Triton-X100:aa (PBST) 2 tunnin ajan huoneenlämmössä. Estopuskuri imettiin ulos ja viipaleet inkuboitiin sopivalla primaarisella vasta-aineella (lisätaulukko 11) yön yli 4 °C:ssa ravistimella. Viipaleet pestiin sitten kolme kertaa 15 minuuttia kukin estopuskurilla, ja sitten inkuboitiin Alexa Fluor 488: lla, 594: llä tai 647 konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineella 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kolmen pesun jälkeen 15 minuuttia estopuskurilla ja yhden viimeisen pesun jälkeen PBS: llä 10 minuutin ajan, viipaleet asennettiin fluromount-G: llä (elektronimikroskooppiset tieteet). Cistanche voi parantuamuisti.

In Situ -hybridisaatio (RNAscope®)

Näytteet valmistettiin valmistajan RNAscope® multiplex fluoresoivan v2-määrityksen (Advanced cell diagnostics, USA) valmistajan ohjeiden perusteella muutamalla muunnoksella ja yhdistettiin Immunohistokemian (IHC) protokollaan. Ensinnäkin näytteet värjättiin primaarisille (Arc ja GFP) ja sekundaarisille (Alexa Fluor 488 ja 594) vasta-aineille (kuten edellä IHC-protokollassa on kuvattu). Aivoviipaleet upotettiin lasiliukumäelle ja

dehydratoidaan 30 minuutin ajan RT: ssä. Seuraavaksi jokaisen osan ympärille piirrettiin este Immedge-hydrofobisella™ kynällä ja näytteitä käsiteltiin RNAscope® Hydrogen Peroxide -menetelmällä 10 minuutin ajan RT: ssä (kohdehakua ja proteaasikäsittelyä ei käytetty). Valmistajan ohjeiden perusteella osat altistettiin koettimen hybridisaatiolle (RNAscope® Probe- Mm-Gria1, 26241, Advanced cell diagnostics), monistukselle ja HRP-C1-signaalin kehittämiselle TSA® Plus Cyanine 5 -kanavalla. Cistanche voi parantaa muistia.

Kuvantamisen analyysi

Kuvat hankittiin LSM 710- tai LSM 880 -konfokaalimikroskoopeilla (Zeiss), joissa oli 10×, 20×, 40× tai 63× tavoitteet identtisillä asetuksilla kaikissa olosuhteissa. Kuvat kvantifioitiin käyttäen ImageJ 1.42q tai Imarisx64 8.1.2 (Bitplane, Zürich, Sveitsi). Kvantifiointiin käytettiin viittä koronaleikkausta vähintään viidestä eläimestä. Cistanche voi parantaa muistia.

Merkittyjen solujen kvantifiointi – Pintamoduulia käytettiin Arc+- ja eYFP+-solujen havaitsemiseen. Kaksoispositiiviset solut (Arc+/eYFP+:n rinnakkaislokalisointi) laskettiin sitten Käyttämällä Surface-To-Surface Xtension -moduulia. Kun pinta-alasuodatinta (>6 μM) oli käytetty epäspesifisten merkintöjen poistamiseksi, kaksoispositiivisten solujen kvantifiointi suoritettiin CA1: ssä, CA3: ssa ja DG: ssä. Cistanche voi parantaa muistia.

Eif- ja Gria1-proteiinien/mRNA:n kvantifiointi – Pintamoduulia käytettiin neuronien aksonien havaitsemiseen ja 3D-renderöintiin GFP-signaalin perusteella. EiF2a, Eif4E, Eif3E ja Gria1 -positiiviset välimerkit laskettiin sitten pistemoduulin avulla. Lopuksi Spots Close - To -Surface Xtension -moduuli ajettiin etsimään pisteiden osajoukko, joka on lähempänä pintaobjekteja kuin määritelty 1uM-kynnys, ja suljettiin pois täplät, jotka kuuluvat tämän alueen ulkopuolelle.

Piikkien morfologia - Piikit luokiteltiin kolmeen tyyppiin selkärangan pituuden (L), pään halkaisijan (Dh) ja kaulan halkaisijan (Dn) mukaan. Stubby-piikit - Dn = L, ohuet piikit - L > Dn ja Dh ≥ Dn, Sienipiikit - Dh ≥ 2Dn, laajentuneet sienipiikit - Dh ≥ 2Dn.Cistanche voi parantaa muistia.

Cistanche voi parantaa muistia

Kudosten valmistelu

Hippokampuksen kudos uutetaan ja salama jäädytettiin. Uuttamisen jälkeen näytteet homogenoitiin välittömästi 0,5 ml:ssa jääkylmää PBS:ää proteaasin estäjillä (Pi) (11836170001, Roche). Lajitteluvaikutuksen lieventämiseksi mahdollisimman paljon vain NC-RNAseq- ja sieppaus-HiC-kokeissa suspensio kiinnitettiin 1 %:lla (NC-RNAseq/HiC:lle) tai 2 %:lla (pc-HiC) paraformaldehydillä 10 minuutin ajan, sammutettiin Glycine 2,5M:llä 5 minuutin ajan ja pestiin kahdesti 5 ml:lla PBS:ää. Tämä prosessi säilyttää transkriptio- ja kromatiinimaiseman ja minimoi lajitteluharhan. ATACseq: n, RNAseqin ja capture-HiC: n osalta suspensiota sentrifugoitiin 1200 g: ssa, 4 ° C: ssa 5 minuutin ajan ja pelletti suspendoitiin uudelleen 5 ml: n NF-1-hypotonisessa puskurissa (0,5% Triton X-100/ 0,1 M Sakkaroosia / 5 mM MgCl2 / 1 mM EDTA / 10mM Tris-HCl, pH 8.0, Pi). Seuraavaksi suspensio dounce-homogenisoitiin (survin A) 30 iskulla ja survin pestiin ylimääräisellä 5 ml: n NF-1-puskurilla yhteensä 10 ml: n ajan. Suspensio kerättiin kaikki 15 ml: n kartiomaiseen putkeen, suodatettiin 70 μm: n verkkosuodattimella (08–771-2, Falcon) ja inkuboitiin jäällä 30 minuutin ajan. Pelletoidut ytimet (kaikki sentrifugit olivat 4 °C, 1 600 × g 15 minuutin ajan) suspendoitiin uudelleen 10 ml:ssa PBS+1%BSA+Pi ja inkuboitiin jäällä 1 tunnin ajan. Ytimet pyöristettiin alas ja pelletti suspendoitiin uudelleen 1 ml:n PBST+1%:n BSA+Pi:ssä ja inkuboitiin NeuN-, Arc- ja GFP-primaarisilla vasta-aineilla yön yli 4 °C:ssa. Sitoutumattomat vasta-aineet pestiin pois kahdesti 5 ml: lla PBS: ää ja lopulta suspendoitiin uudelleen 1 ml: n PBS + 1%: n BSA + Pi: ssä ja sekundaarisissa vasta-aineissa 2–4 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Kahden pesun jälkeen ytimet suspendoitiin uudelleen 0,5 ml:ssa (PBS+1%BSA+Pi) ja suodatettiin 40 μm:n verkkosuodattimella FACS-lajittelua varten. 4′,6-Diamidiini-2′-fenyyliindolidihydrokloridi (DAPI) lisättiin suoraan FACS-putkiin (1:5000, 10236276001, Sigma-Aldrich). Cistanche voi parantuamuisti.

Virtauksen sytometria

Virtaussytometriaa varten ytimet aidattiin ensin käyttäen eteen- ja sivusirontapulssin pinta-alaparametreja (FSC-A ja SSC-A) roskia lukuun ottamatta, minkä jälkeen suljettiin pois aggregaatit pulssin leveydellä (FSC-W ja SSC-W). Sitten isotyypin ohjausvärjäystä käytettiin NEUN+-, ARC+- ja GFP+-porttien asettamiseen. Homogeenisen hermosolujen populaation turvaamiseksi NeuN+ -populaatio aidattiin ennen ARC +: n ja GFP + -fluoresenssin perusteella populaatioita. Lajittelimme neljä eri populaatiota kolmesta eri aikapisteestä; Noin 1,5–2 tuntia FS:lle altistumisen jälkeen i) NeuN+/GFP+ ii) NeuN+/GFP-. Viiden päivän kuluttua, ilman hakua, keräsimme iii) NeuN+/GFP+. Eri kohortissa hiiret altistettiin uudelleen ehdolliselle ärsykkeelle. 1,5–2 tuntia uudelleenaltistuksen jälkeen keräsimme iv) NeuN+/ARC+/GFP+. Kaikki ytimet lajiteltiin 1,5 ml: n Eppendorf-putkiin, jotka sisälsivät; 500 μl PBS+1%BSA+Pi ATCAseqille, 200 μl ruoansulatuspuskuria (RecoverAll™ Nukleiinihapon kokonaiseristyspakkaus FFPE:lle, Kissa. AM1975, Invitrogen) RNAseqille, 500 μl tuoretta jääkylmälyysipuskuria (10mM Tris pH =8, 10mM NaCl, 0,2% Igepal CA-630, Pi ja PCR-luokan vettä) Hi-C/capture-HiC:lle. Data-analyysi suoritettiin Flowjolla (v10).

ChIP-qPCR

Välittömästi seuraavan lajittelun jälkeen 10 000 kennoa pelletoitiin 4 °C:ssa, 1 600 × g:ssa 15 minuutin ajan ja suspendoitiin uudelleen käyttöturvallisuustiedotteen lyysipuskuriin. ChIP suoritettiin valmistajan ohjeiden perusteella ChIP-IT High Sensitivity® (HS) Kitille (luettelo nro 53040, Active Motif, USA) käyttäen H3K4me1:n (Abcam, ab8895, 1:100) ja anti-H3K27ac(Abcam, ab4729, 1:100) vasta-aineita. ChIP-määritykset suoritettiin Bio-Rad CFX96 connect -reaaliaikaisessa PCR-yksikössä käyttäen SsoFast™ EvaGreen® qPCR -reagenssisekoitusta (Bio-Rad, 172–5202). Näytteet määriteltiin kolmena kappaleena ja tulokset normalisoitiin syöttöä varten. ChIP–qPCR-määritysten pohjustusparien sekvenssit on lueteltu lisätaulukossa 12.

Cistanche voi parantaa muistia

ATAC-seq

kirjastojen valmistelu—ATAC seq -kirjastot valmistettiin edellä kuvatulla tavalla 49 kuvatulla tavalla pienin muutoksin. 10 000 solua kustakin ryhmästä, vedettiin 8–10 eri hiirestä ja niitä pidettiin N=1:nä. Kirjaston valmisteluun käytettiin 3–4 biologista replikaattia (N=3–4). Heti seuraavan lajittelun jälkeen solut pyöristettiin alas (4 °C, 1 600 × g 15 minuutin ajan) ja suspendoitiin uudelleen tuoreessa 50 ul kylmälyysipuskurissa (0,15% NP-40 Igpalin sijaan) ja keinuttiin jäällä 10 minuutin ajan. Seuraavaksi segmentointireaktio (Nextera DNA -näytteen valmistelusarja 24 reaktiota, FC-121–1030, Illumina) suoritettiin 25 ul-tilavuudessa (12,5 μl TD, 1,25 μl TDE1, 11,25 μl nukleaasivapaata vettä) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa lempeällä keinumisella. Lisätyt DNA-fragmentit monistettiin ja viivakoodittiin PCR-reaktiolla (1 sykli; 5min - 72c, 30sec - 98c, 10 sykliä; 15sec - 98c, 30sec - 60c, 3min - 72c). Valmistajan protokollan mukaisesti vahvistettu DNA puhdistettiin ja puhdistettiin käyttäen 1,8-kertaisia AMPure-helmiä (AmpureXP-helmiä, Beckman Coulter, A63880). Kirjaston koon ja jakelun bioanalysaattorin QC: n jälkeen kirjastot sekvensoitiin MIT BioMicro Centerin Illumina Nextseq 550 -alustalle. Cistanche voi parantaa muistia。

ATAC-seq-analyysi– 40 bp:n parillisten sekvensointilukemien raaka fastq-data kohdistettiin hiiren mm9-referenssigenomiin käyttäen Bowtie 2.0:aa parinpään tilassa50. Samtools-kokoelmaa51 käytettiin LAJITTELEMAAN, poistamaan PCR-kaksoiskappaleita (punainen ylös), indeksoimaan BAM-tiedostoja (hakemisto) ja laskemaan kirjastotilastoja (flagstat, katso täydentävä taulukko 13). BAM-tiedostot otettiin alas oikein kohdistetuista, pariliitetuista ja ainutlaatuisista lukemista 50 miljoonaan. Avoimet kromatiinihuiput analysoitiin käyttäen MACS252-ohjelmistoa Differentiaalisesti saatavilla olevat alueet (DAR) tunnistettiin Diffbind v1.16.353: lla oletusparametreilla ja asetuksilla DESeq2: n käyttämiseksi (katkaisu; FDR< 0.01;="" fold="" changes="">1.5). DiffBind-paketti haki normalisoitujen lukujen koko matriisin (RPKM54). Bigwig-raitojen sukupolvelle paalutussignaalitiedostot (fragmenttien kasaus miljoonaa lukukertaa kohti) biografiamuodossa rakennettiin käyttämällä MACS2-puhelun huipputoimintoa -B -SPMR-lippujen kanssa. Sitten normalisoitu taittorikastelu (FE) tulo-lambda-raitojen yli luotiin käyttämälläMACS2: n bdgcmp-toimintoa asetuksella - m FE. Sitten bedGraph-tiedostot muunnettiin bigwig-muotoon. Cistanche voi parantaa muistia

IGV55-työkaluja käytettiin bigwig-tiedostojen visualisointiin. ChromHMM56: ta käytettiin kromatiinitilamallin luomiseen kahdesta itsenäisestä tutkimuksesta, joissa käytettiin irtotavarana hippokampuksen kudosta ennen jalkaiskua ja sen jälkeen21,22, ja määrittämään taittorikastustarjoukset tilamallin yli. Motifin rikastusanalyysi57,58 ja huippujen merkinnät suoritettiin HOMER59-työkaluilla. Kaikki koodit ovat saatavilla täydentävässä ohjelmistotiedostossa