Osa 2: Magnesiumin ulosvirtaus Drosophila Kenyon -soluista on kriittistä normaalille ja ruokavaliolla tehostetulle pitkäkestoiselle muistille

lisätietoja:ali.ma@wecistanche.com

Pls napsauta häntä osaan 1

Pls napsauta häntä osaan 3

NapsautaCistanche tubulosa -jauhe muistiin

Uexin rooli sieniruumiissa

uex:n paikallistamiseksi aivoissa hyödynsimme ensin VT23256-GAL4-siirtogeenisiä kärpäsiä, joissa GAL4:ää ohjaa 853 bp:n sekvenssi uex:n ensimmäisestä intronista (Kvon et al., 2014). VT23256-ohjattu UAS-EGFP paljasti rajoittuneen ilmentymisen ab-KC:issä ja erityisen vahvan leiman ab-ytimen (abc) neuroneissa (kuva 3A). Käytimme myös CRISPR:ää C-terminaalisen HA-epitooppitunnisteen lisäämiseen uex:n avoimeen lukukehykseen (kuva 3 – kuvan lisäosa 1A). Nämä kärpäset olivat elinkelpoisia homotsygootteina, mikä osoitti, että tuloksena oleva UEX::HA-fuusioproteiini säilyttää toimintansa. Immunovärjäytyvät kärpäset, jotka sisältävät tämän uex:::n HA-lokuksen anti-HA-vasta-aineella, paljastivat kaikkien tärkeimpien KC-luokkien näkyvän leiman MB:ssä sen lisäksi, että ekspressio oli pienempi koko aivoissa (kuvio 3B). Tätä uex-ilmentymisprofiilia tukevat myös yksisoluiset sekvensointianalyysit (kuva 3 – kuvan liite 1B; Croset et al., 2018; Davie et al., 2018). Ottaen huomioon ab KC:n vakiintuneen roolin haju-LTM:ssä (Pascual ja Pre´at, 2001; Yu et al., 2006; Krashes et ai., 2007; Krashes ja Waddell, 2008), päätimme, että UEX:n muistiollinen rooli voi sisältää ilmaisu KC:ssä.

Seuraavaksi käytimme RNAi:n GAL4-ohjattua ilmentymistä testataksemme, onko 24 hmuistisuorituskykyä vaaditaan uex MB:ssä. Kärpäset, jotka ilmentävät uexRNAi:ta (Perkins et al., 2015) kaikissa ab KC:issa (c739-GAL4; Yang et al., 1995; Perisse ym., 2013) tai vain abc KC:issa (NP7175- GAL4; Tanaka et ai., 2008) osoitti normaalia välitöntämuistimutta heikensi merkittävästi 24 tunnin muistia (kuva 3C). Sitä vastoin uexRNAi:n ilmentyminen ab-pinnassa (abs, 0770-GAL4; Parisse et al., 2013) tai a0 b0 KC:ssa (c305a-GAL4; Krashes et al., 2007) ei muuttanut merkittävästi välitöntä tai LTM:n suorituskykyä. Normaali 24 h ruokahaluinenmuistisuorituskyky on siksi erityisen herkkä uex-ilmentymiselle abc-hermosoluissa. Vähentääksemme todennäköisyyttä, että uexRNAi:hen liittyvä muistivika johtuu kehityksen seurauksista, rajoitimme myös UAS-uexRNAi:n ilmentymisen aikuisikään käyttämällä GAL80ts-välitteistä ajallista kontrollia (McGuire et al., 2003). Sallitussa 18 ˚C:ssa GAL80ts sitoutuu GAL4:ään ja estää sen transkription aktivaattoritoiminnon. Rajoitavassa 30 ˚C:ssa GAL80ts ei voi enää sitoutua GAL4:ään, mikä vapauttaa GAL4:n ohjaamaan UAS-uexRNAi-siirtogeenin ilmentymistä. Kärpäsiä kasvatettiin kehityksen aikana 18 ˚C:ssa ja siirrettiin 30 ˚C:een eklosion jälkeen. UAS-uexRNAi:n ilmentymisen rajoittaminen ab KC:iin aikuisilla kärpäsillä käyttämällä c739-GAL4:ää GAL80ts:n kanssa tuotti samanlaisen 24 tunnin spesifisenmuistivika verrattuna siihen, joka havaittiin, kun UAS-uexRNAi ekspressoitiin ilman ajallista kontrollia (kuva 3D – F). Arvioimme UAS-uexRNAi-knockdownin tehokkuuden käyttämällä merkittyä uex::HA-lokusta. Heterotsygoottisten uex::HA-kärpästen aivot, jotka ilmentävät uexRNAi:ta ab:ssa ja g KC:itä MB247-GAL4:n kanssa (Zars et ai., 2000), immunovärjättiin käyttämällä anti-HA-vasta-ainetta. Vertaamalla immunoleimauksen intensiteettiä aivoissa uex::HA:sta; MB247-GAL4/uexRNAi lentää uex::HA:n kanssa; MB247-GAL4/ plus kärpäset osoittivat, että uexRNAi:n ilmentyminen vähensi merkittävästi anti-HA-signaalia ab- ja g-KC:issa (kuvio 3G ja H). Tämä tulos osoittaa uexRNAi-siirtogeenin tehokkuuden ja CRISPR/Cas9-muokatun uex::HA-lokuksen hyödyllisyyden.

Seuraavaksi testasimme, voisiko ilmentyminen UAS-uex-siirtogeenin spesifisissä KC:issä palauttaa 24 tuntiamuistikapasiteetti uexMI01943 lentää.MuistiuexMI{{10}}1943-perhojen suorituskyky, joka ilmaisee UAS-uex:n ab- ja g-KC:issä (MB247-GAL4; Zars et al., 2000) tai vain ab-KC:issä (c{{5). }}GAL4) oli merkittävästi parempi kuin uexMI01943-perhoissa, ja se oli tilastollisesti mahdoton erottaa kontrolleista, joissa oli ehjä uex-lokus (kuva 4A). Sitä vastoin UAS-uex-ilmentyminen a0 b0 -, abc- tai abs-KC:issä ei palautunutmuistisuorituskyky uexMI01943-perhoille, ja uex:n yli-ilmentyminen villityypin kärpästen ab KC:issä ei lisännyt 24 tunnin muistia (kuvio 4A ja B). Normaali 24hmuistisuorituskyky voitaisiin palauttaa myös uexMI01943-perhoille, jos UAS-uex-ilmentyminen rajoittuisi c739-GAL4-hermosoluihin (kaikki ab KC:t) aikuisiässä käyttämällä GAL80ts-välitteistä ajallista kontrollia (kuvat 4C ja D). Yhdessä nämä funktionaalisten RNAi- ja palautuskokeet osoittavat, että UEX:llä on tärkeä rooli aikuisilla

Kuva 3. Uex-ilmentymisen kumoaminen ab Kenyon -soluissa (KC) heikentää LTM:ää. (A) Uex-promoottorifragmentti-GAL4 ohjaa GFP:n ilmentymistä abc-KC:issä. anti-GFP-immunovärjätty uex-GAL4 (VT23256); UAS-EGFP-linja. (B) CRISPR/Cas{9}}muokattu uex::HA-lokuksen sisältävien aivojen anti-HA-immunovärjäys

osoittaa vahvan UEX-merkinnän kaikissa sienikappaleen (MB) pääosastoissa. Mittakaavat 20 mm. (C) RNAi:n uex:n knockdown kaikissa ab (c739- GAL4) tai vain abc (NP7175-GAL4) KC:issa, jotka ovat erityisesti heikentyneet 24 tuntiamuisti. abs ({{0}}GAL4) tai a0 b0 (c305a-GAL4) KC-lausekkeella ei ollut vaikutusta (p<0.05, figure="" 3="" continued="" on="" next-figure="" 3="">

ANOVA, n=6–10 välittömälle ja n=8–14 24 tunnillemuisti). (D) Viallinen LTM havaittiin, jos uexRNAi:n ilmentyminen rajoittui aikuisten kärpästen ab KC:iin käyttämällä GAL80ts-välitteistä ajallista kontrollia. (E) LTM-suorituskyky ei muuttunut, jos uexRNAi pidettiin estettynä koko ajan ja (F) LTM-suorituskyky palautui normaalille tasolle, jos uexRNAi:n ilmentymistä estettiin uudelleen 3 päivän ajan (p<0.05, anova,="" n="6" for="" immediate="" and="" n="8" for="" 24="" hr="" memory).="" (g)="" immunostaining="" shows="" the="" effectiveness="" of="" uexrnai.="" fluorescence="" intensity="" in="" the="" ab="" and="" globes="" of="" uex::ha="" flies="" decreased="" significantly="" when="" uas-uexrnai="" was="" expressed="" with="" mb247-gal4.="" scale="" bars="" 20="" mm.="" (h)="" quantification="" of="" fluorescence="" intensity="" in="" g=""><0.05, t-test,="" n="6–8)." the="" online="" version="" of="" this="" article="" includes="" the="" following="" figure="" supplement(s)="" for="" figure="">

Kuvan lisäys 1. Rakennekaavio uex::HA-linjalle ja uex-lausekkeen tSNE-kuvaajille.

ab KCs. Havaittaessa, että uex:n abc RNAi:n pudotus tuottaa amuistivika (kuva 3C), mutta UAS-uex-ilmentyminen abc:ssä ei pelasta uexMI01943-mutanttivirhettä (kuva 4A) viittaa siihen, että UEX-toiminto abc:n KC:issä on välttämätön ruokahaluiselle LTM:lle, kun taas sekä abc- että abs-KC:illä on oltava toimiva UEX tukeakseen LTM. Lisäksi UAS-uexin kyky palauttaa suorituskyky uexMI0194-perhoille tarjoaa lisätukea, että uex on vastuussamuistiuexMI01943-perhojen heikkeneminen.

uex-lauseke MB:ssä tukee Mg2 plus -parannettuamuisti

Seuraavaksi tutkimme, voisiko Mg2 plus ruokinta (4 päivää 80 mM MgCl2:lla) parantaamuistisuorituskyky kärpäsissä, joissa uex-toiminto on heikentynyt. Kärpät, jotka kantavat uexMI01943-alleelin (kuva 4F) tai UAS-uexRNAi:ta ekspressoivat ab KC:t, joissa on c739-GAL4 (kuva 4E), eivät osoittaneet parantumistamuistikun niitä ruokittiin 80 mM MgCl2:lla, verrattuna kärpäsiin, joita ruokittiin 1 mM MgCl2:lla. Lisäksi Mg2 plus -parannettu muisti saatiin talteen uexMI01943-mutanttikärpäsissä, kun uex-ilmentyminen palautettiin ab KC:iin (kuvio 4F). Kaikki kontrolliperhot (c739-GAL4, UAS-uexRNAi ja UAS-uex), joilla oli häiriintynyt uex-ilmentyminen, paranivat merkittävästimuistikun sitä syötettiin 80 mM:lla verrattuna 1 mM MgCl2:een. UAS-uex:n yli-ilmentyminen ab KC:ssä c739-GAL4:n kanssa kärpäsissä, joilla on villityyppinen geneettinen tausta eikä tehostettu säännöllistä 24 tuntiamuisti(kuvio 4B) tai kärpäsissä, joita ruokittiin 4 päivää 40 tai 80 mM MgCl2:lla (kuvio 4G). Testasimme myös, paransiko 4 päivää 80 mM MgCl2:n lisäravinteena 24 tunnin muistin suorituskykyä vastenmielisen jaksotetun harjoituksen jälkeen. Jälleen,muistivillityypin mutanttiperhoissa, mutta ei uexMI01943-mutanttiperhoissa, havaittiin voimistumista (kuva 4 – kuvan lisäys 1). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että optimaalinenmuistiparannus Mg2 plus -syötöllä vaatii ja voi täysin tukea ab KC:n UEX-toimintoa.

UEX on toiminnallisesti säilynyt magnesiumkuljetusaine

Ottaen huomioon UEX:n vahvan sekvenssin säilymisen nisäkkään CNNM2/4:n kanssa testasimme, voisiko CNNM2 toiminnallisesti korvata UEX:n ja palauttaa uexMI01943-perhojen LTM-vian. Useita CNNM2:n pistemutaatioita on tunnistettu ihmispotilailla, joilla on hypomagnesemia, joka liittyy aivojen epämuodostumaan ja älylliseen vammaan (Arjona et al., 2014). Vastaavien mutaatioiden lisääminen hiiren CNNM2:een (CNNM2E357K, CNNM2T568I, CNNM2S269W ja CNNM2E122K) osoitti, että nämä potilasperäiset leesiot heikentävät magnesiumin kuljetusta (Arjona et al., 2014). Rakensimme kärpäsiä, jotka kantavat villityypin ja tämän mutanttivariantin UAS-CNNM2-siirtogeenejä (kuvio 5A). Assosioituneen C-terminaalisen HA-tunnisteen värjäys paljasti kaikkien UAS-CNNM2::HA-varianttien selkeän ilmentymisen ab-hermosoluissa, kun niitä ohjattiin c739-GAL4:llä (kuva 5 – kuvan lisäys 1). Kuitenkin vain villityypin CNNM2:n ilmentyminen, ei pistemutanttimuotojen ilmentyminen uexMI01943:n ab KC:ssä

mutanttikärpäsiä palautettiin 24 tuntiamuistisuorituskykyä (kuva 5B).

Testasimme myös, voiko UEX välittää Mg2:ta plus suulakepuristusta. Plasmakalvolle lokalisoiduissa HEK293-soluissa ja soluissa, jotka oli ladattu Mg2 plus:lla ja Mg2 plus -indikaattorilla Magnesium Green, ekspressoitunut UEX osoitti nopeaa Mg2 plus -virtausta (kuva 5 – kuvan lisäys 2 ja video 1) verrattuna soluihin, jotka oli transfektoitu tyhjällä vektorilla. UEX:n ohjaama Mg2 plus -ekstruusio oli huomattavasti vähemmän tehokas kuin soluissa, jotka ekspressoivat ihmisen CNNM4:ää (kuva 5 – kuvan lisäys 2), jolla tiedetään olevan samanlainen tehokkuus kuin CNNM2:lla (Hirata et al., 2014). Emme kuitenkaan tiedä, ovatko UEX- ja CNNM4-lausekkeet vastaavat. Siitä huolimatta lajien välisen komplementaation ja Mg2 plus ulosvirtausaktiivisuuden osoittaminen määrittelee UEX:n nisäkkään CNNM2/4:n toiminnalliseksi homologiksi.

Kuva 4. UexMI01943-perhojen LTM-vian pelastaminen. UAS-uex:n ilmentymisen palauttaminen ab- ja g-soluissa (MB247-GAL4) tai ab Kenyon-soluissa (KC:t) pelastettu 24 tuntiamuistiuexMI01943-perhojen suorituskyky, kun taas abc:n, abs:n tai a0 b0 KC:n lauseke ei (p<0.05, anova="" and="" t-test,="" n="8–12)." (b)="" overexpression="" of="" uas-uex="" in="" ab="" kcs="" did="" not="" enhance="" 24="" hr="">muistisuorituskyky villityypin kärpäsissä (ANOVA, n=8–12). (C) Viallinen LTM pelastettiin, jos UAS-uex-ilmentyminen rajoittui aikuisten kärpästen ab KC:iin käyttämällä GAL80ts-välitteistä ajallista kontrollia (p<0.05, anova,="" n="6" for="" immediate="" and="" n="8" figure="" 4="" continued="" on="">

24 tunnin ajanmuisti), mutta (D) pysyi viallisena, jos UAS-uex-ilmentymistä ei vapautettu. (E)MuistiUEX tukee ab KC:n tehostamista ravinnon Mg2 plus:lla. UAS-uexRNAi:ta ab KC:issa ilmentävien kärpästen muistia ei voida parantaa Mg2 plus -ruokimalla (t-testi, n=8). (F) UexMI01943-mutanttikärpästen muistia ei voida parantaa Mg2:lla plus ruokinnassa, mutta vahvistuminen palautettiin ekspressoimalla UAS-uex ab KC:issä (p<0.05, t-test,="" n="8–12)." (g)="" the="" memory="" of="" wild-type="" flies="" was="" not="" sensitized="" to="" mg2+="" enhancement="" by="" overexpressing="" uas-uex="" in="" ab="" kcs.="">Muistiparantui, jos kärpäsiä ruokittiin 80 mM MgCl2:lla, mutta ei suboptimaalisella 40 mM MgCl2:lla (p<0.05, anova,="" n="">

Tämän artikkelin online-versio sisältää seuraavat lisäykset kuvaan 4:

Kuvan lisäys 1. Mg2 plus ruokinta tehosti LTM:ää vastenmielisen väliharjoittelun jälkeen villityypin mutanttiperhoissa, mutta ei uexMI01943.

Koskematon CNBH-verkkotunnus vaaditaanmuisti

Ottaen huomioon cAMP-signaloinnin vakiintunut roolimuisti- relevantti plastisuus selkärangattomissa ja nisäkkäissä (Kandel, 2012), testasimme CNBH-verkkotunnuksen merkitystä UEX:ssä. Rakensimme kärpäsiä, jotka kantavat pistemutatoitua CNBH UAS-uexR622K -siirtogeeniä (Kuvio 6A). Vastaava R622K-aminohapposubstituutio poistaa cAMP-sitoutumisen cAMP-riippuvaisen proteiinikinaasin, PKA:n, säätelyalayksikössä (Bubis et ai., 1988). UAS-uexR622K:n ilmentäminen ab-hermosoluissa c739-GAL4:llä ei palauttanut 24 tunnin muistin suorituskykyä tai muuttanut välitöntämuistiuexMI01943 mutanttiperhojen suorituskyky (Kuvio 6B).

Käytimme myös CRISPR:ää yrittäessämme viedä R622K-mutaation natiivin uex-lokuksen CNBH:hen (Bassett ym., 2013; Gratz ym., 2013; Yu ym., 2013). Yllättäen tämä lähestymistapa ei ottanut käyttöön R622K-substituutiota, vaan sen sijaan korvasi T626:n CNBH:ssa NRR:llä. Onneksi tälle uexT626NRR-alleelille homotsygoottiset kärpäset olivat elinkelpoisia aikuisina, toisin kuin uexD:n homotsygoottiset kärpäset, mikä viittaa siihen, että uexT626NRR-koodattu UEX säilyttää toimintansa. Kuitenkin uexT626NRR:n suhteen homotsygoottiset tai heterotsygoottiset uexT626NRR/uexMI01943 kärpäset osoittivat vahvaa 24 tuntiamuistivika (Kuva 6C). Välitönmuistioli myös heikentynyt homotsygoottisissa uexT626NRR-perhoissa, toisin kuin kärpäsissä, jotka kantavat kaikkia muita uex-alleeliyhdistelmiä. LisäksimuistiuexT626NRR kärpäsiä ei voitu parantaa Mg2 plus -syötöllä (Kuva 6D). Siksi uexT626NRR-mutaatio irrottaa olennaisen

Kuva 5. uex koodaa evoluutionaalisesti konservoitunutta Mg2 plus -kuljettajaa. (A) CNNM2-proteiinirakenteen malli, joka osoittaa kliinisesti merkittäviä pistemutaatioita.

Mukautettu ja muokattu julkaisusta Arjona et al., 2014. (B) Villityypin, mutta ei mutantin CNNM2:n yli-ilmentyminen ab Kenyon -soluissa pelastaamuistiuexMI01943-mutanttiperhojen vika (s<0.05, anova,="" n="6–8" for="" immediate="" and="" n="8–12" for="" 24="" hr="">

Tämän artikkelin online-versio sisältää seuraavat lisäykset kuvaan 5:

Kuvan lisäys 1. CNNM2:n mutanttivarianttien siirtogeeninen ilmentyminen.

Kuvan lisäys 2. UEX-riippuvainen Mg2 plus ulosvirtaus HEK293-soluissa.

uexin rooli funktiosta sisäänmuistija ehdottaa, että syklinen nukleotidisäädelty aktiivisuus on kriittistä UEX:lle normaalin ja Mg2 plus -parannetun tukemiseksimuisti. Vaikka vahvistimme Western blot -menetelmällä, että täyspitkä proteiini ekspressoituu uexT622NRR-perhoissa (kuva 6E), vasta-aineemme ei antanut meille mahdollisuutta varmistaa, että UEXT626NRR-proteiini lokalisoituu asianmukaisesti aivoihin. Tämän vuoksi tarvitaan lisätyötä tämän serendipitoisen uexT626NRR-alleelin koodaaman proteiinin solulokalisoinnin, cAMP-sitoutumisen ja Mg2- ja Mg2-kuljetusfunktion karakterisoimiseksi.

Krooninen cAMP-manipulaatio muuttaa UEX-paikannusta KC:issä

Testasimme, voisiko cAMP muuttaa akuutisti UEX-aktiivisuutta levittämällä forskoliinia UEX-ilmentyviin HEK293-soluihin. Kuitenkaan ei havaittu ilmeistä muutosta UEX-riippuvaisessa Mg2- ja ulosvirtausdynamiikassa (tietoja ei ole esitetty). Siksi testasimme, muuttuiko UEX:: HA:n KC-ilmentyminen kärpäsissä, joilla oli kroonisia muutoksia

cAMP-aineenvaihdunta, ottamalla käyttöön oppimisen kannalta tärkeitä mutaatioita rutabaga-koodaamassa Ca2 plus -stimuloidussa adenylaattisyklaasissa tai duncen koodaamassa cAMP-spesifisessä fosfodiesteraasissa. Aivojen anti-HA-immunovärjäys rut2080:sta; uex::HA ja dnc1; uex::HA-perhot paljastivat silmiinpistävän muutoksen UEX-lokalisoinnissa (kuvat 7A ja B sekä videot 2–4). Kun UEX::HA havaitaan yleensä kaikkien KC:iden lohkoissa suurin piirtein vastaavalla tasolla villityypin kärpäsissä, leimaus oli vähäisempi MB g -lohkossa ja selvempi abc-KC:issä rut2080- ja dnc1-mutanttitaustalla (kuva 7C). , vaikka UEX::HA:n yleinen MB-ilmentyminen on samanlainen villityypin ja mutanttikärpästen välillä (kuvio 7D). Lisäksi näiden kärpästen päistä uutetun proteiinin Western blot -analyysit eivät paljastaneet merkittävää eroa yleisissä UEX::HA-ekspressiotasoissa (tietoja ei ole esitetty). Nämä tiedot ovat siksi yhdenmukaisia ​​cAMP:n säätelevän UEX-toimintoa ja kenties sen solulokalisointia KC:issä.

UEX tarvitaan ylläpitämään vaihtelevaa [Mg2 plus ]i ab KC:ssä

Vaikka MagFRET voi raportoida [Mg2 plus ], se ei reagoi tarpeeksi nopeasti tallentaakseen ärsykkeiden aiheuttamia signaaleja. Siksi rakensimme UAS-siirtogeenejä sisältäviä kärpäsiä kahdelle uudemmalle geneettisesti koodatulle Mg2 plus -sensorille, MagIC (ei-FRET-pohjainen; Koldenkova et al., 2015) ja MARIO (FRET-pohjainen; Maeshima et al., 2018). Emme pystyneet havaitsemaan UAS-MARIO-ilmentymistä kärpäsen aivoissa ja siksi pystyimme käyttämään vain UAS-MagIC:tä. MagIC:n ilmoitettiin reagoivan voimakkaimmin Mg2 plus -annokseen, mutta myös vähemmässä määrin Ca2 plus:iin (Koldenkova et al., 2015). Siksi varmistimme ensin MagIC-vasteiden spesifisyyden solujen läpäisevässä ex vivo kärpäsaivovalmisteessa. Aivot poistettiin kärpäsistä, jotka ilmensivät UAS-MagIC:tä ab KC:ssä c739-GAL4:llä (kuva 8A), inkuboitiin maljassa suolaliuoksen kanssa (Barnstedt et al., 2016) ja fluoresenssin muutoksia seurattiin ennen ja jälkeen kylpysovelluksen. - kemikaalien käyttö. Kun MgCl2:n käyttö aiheutti annoksesta riippuvan lisäyksen MagIC-vasteessa, Mg2 plus:n kelatoituminen EDTA:lla aiheutti annoksesta riippuvan laskun (kuvio 8B ja videot 5 ja 6). Vertailun vuoksi CaCl2 rekisteröi vain lievän nousun korkeimmilla pitoisuuksilla, kun taas Ca2 plus -selektiivisemmällä kelataattorilla EGTA:lla oli vain vähän vaikutusta (kuvio 8B). Nämä tulokset osoittavat, että UAS-MagIC voi tarkkailla [Mg2 plus]i:tä ab KC:ssä kärpäsaivoissa.

Lisääntyvän intrasellulaarisen cAMP:n on osoitettu saavan aikaan Mg2:n plus virtauksen nisäkässoluista (Romani ja Scarpa, 2000; Vormann ja Gu¨nther, 1987; Jakob et ai., 1989; Romani ja Scarpa, 1990b; Romani ja Scarpa, Vormann ja 1990a Gu¨nther, 1987; Gu¨nther et ai., 1990; Howarth et ai., 1994). Koska kokeemme osoittivat myös, että cAMP saattaa säädellä UEX:ää, testasimme seuraavaksi, voisiko cAMP-synteesin stimulointi forskoliinilla (FSK) muuttaa MagIC-signaaleja ab:ssa.

Kuva 6. UEX:n syklistä nukleotidia sitovaa homologiaa (CNBH) tarvitaan muistiin. (A) Kaavio, joka esittää UEX:n CNBH-domeenin sekvenssin yksityiskohdat ja uexR622K:ssa ja uexT626NRR:ssä tehdyt aminohappomuutokset. (B) UAS-uexR622K-siirtogeenin ilmentäminen ab Kenyon -soluissa ei pelastanut uexMI01943-mutanttikärpästen LTM-virhettä (p<0.05, anova,="" n="8)." immediate="" memory="" was="" also="" unaffected.="" (c)="" flies="" homozygous="" for="" uext626nrr="" have="" defective="" short-="" and="" long-term="" memory,="" while="" trans-heterozygous="" uext626nrr/uexmi01943="" flies="" only="" exhibit="" impaired="" ltm=""><0.05, anova,="" n="8)." figure="" 6="" continued="" on="" next="">

Kuva 6 jatkuu

(D) Ruokavalion Mg2 plus ei parantanut homotsygoottisten uexT626NRR/uexT626NRR-perhojen muistia (p<0.05, t-test,="" n="8)." (e)="" western="" blot="" analysis="" of="" uex="" protein="" expression="" in="" fly="" head="" extracts.="" genotype="" from="" left="" to="" right:="" wild-type,="" uext626nrr/uext626nrr,="" uext626nrr/+,="" uext626nrr/uexmi01943,="" uexmi01943/+.="" the="" blot="" was="" first="" probed="" with="" anti-uex="" antibody="" (upper="" panel),="" and="" then="" stripped="" and="" re-probed="" with="" anti-tubulin="" antibody="" (lower="" panel)="" as="" a="" loading="">

KCs. Näihin kokeisiin käytimme jälleen ex vivo -aivovalmistetta, mutta tällä kertaa solut eivät olleet läpäiseviä. 30 mM FSK:n on osoitettu saavan aikaan cAMP-huippulisäyksen KC:issä, joka on suunnilleen ruokahaluisen ehdottelun jälkeen havaittu (Louis et al., 2018). 30 mM FSK:n lisääminen c739-GAL4:ään; UAS-MagIC-aivot herättivät johdonmukaisen dynamiikan MagIC-fluoresenssissa. Jyrkän alkunousun jälkeen vasteet hiipuivat hitaasti takaisin lähtötasolle ennen kuin nousivat jälleen hitaasti pisteeseen, jossa signaali alkoi vaihdella. (Kuva 8C ja D sekä video 7). Tämän vasteen tärkeimmät allekirjoitukset tallennettiin vain Mg2 plus -herkkään Venus-signaaliin (kuvio 8D). Sitä vastoin mCherryn fluoresenssi ei vaihdellut, vaan väheni tasaisesti tallennuksen ajan kuluessa (todennäköisesti valonvalkaisun seurauksena), mikä osoittaa, että Venus-signaalin vaihtelu ei ole liikeartefaktti (kuva 8E). Tärkeää on, että FSK:n aiheuttamat MagIC-vasteet olivat suurempia kuin suolaliuoksen levittämisen jälkeen (kuva 8 – kuvan lisäys 1A). Kuitenkin vaihteleva vaste kehittyi myös suolaliuoksen levittämisen jälkeen (kuva 8 – kuvan lisäys 1B), mikä viittaa siihen, että rytminen MagIC-signaali voi olla yleinen vaste [Mg2 plus ]i:n kasvuun, joka seuraa solujen häiriöitä.

Drosophila MB:n on aiemmin raportoitu osoittavan hidasta (0,004 Hz) Ca2 plus -värähtelyä ex vivo -aivoissa, kun taas paljon nopeamman 20 Hz:n värähtelyn aiheuttavat heinäsirkka MB:n haju (Laurent ja Naraghi, 1994; Rosay et ai., 2001). Vaikka alkuperäinen MagIC:n karakterisointi kärpäsen aivoissa osoitti ensisijaisen vasteen Mg2 plus:lle (kuva 8B), testasimme kuitenkin eksplisiittisesti, aiheuttiko FSK ab KC:n [Ca2 plus]i:n vaihtelua käyttämällä UAS-GCaMP6f:n ilmentymistä (Chen et). al., 2013). FSK aiheutti GCaMP-vasteen viivästyneen kasvun, mutta selkeää värähtelyaktiivisuutta ei havaittu (kuva 8 – kuvan lisäys 1C–E).

Lopuksi testasimme, olivatko havaitut MagIC-vasteet herkkiä uex-geenin tilalle. Loimme uexMI01943-perhoja, joissa oli myös c379-GAL4 ja UAS-MagIC, ja vertasimme niiden FSK- ja suolaliuoksen aiheuttamia MagIC-vasteita villityypin uex-lokuksen omaaviin kärpäsiin. UexMI01943-mutanttikärpäset osoittivat lisääntynyttä FSK-vastetta villityypin kärpäsiin verrattuna, kun taas suolaliuoksen aiheuttamat vasteet olivat erottamattomia (kuvio 8F ja G). Inaktiivisen FSK-analogin, ddFSK:n, herättämät vastaukset eivät myöskään olleet herkkiä uex:n tilalle (kuva 8 – kuvan lisäys 1F). Siksi uex:n mutaatio lisää selektiivisesti keskimääräisiä FSK:n aiheuttamia MagIC-vasteita.

Huomasimme myös, että uex-mutanttikärpästen MagIC-jäljet ​​eivät osoittaneet vaihtelevaa signaalia (kuva 8H ja kuva 8 – kuvan lisäys 1G). Tämän eron kvantifioimiseksi laskemme uexMI{11}}1943:n ja FSK:lla tai suolaliuoksella käsiteltyjen villityypin kärpästen jälkien keskimääräisen tehospektritiheyden (PSD). Molemmissa olosuhteissa keskimääräinen PSD siirtyi merkitsevästi vasemmalle kohti alhaisempia frekvenssejä uexMI01943-mutanteissa verrattuna villityypin kontrolleihin (kuvio 8I). Villityypin kärpäsaivoilla oli huomattavasti enemmän värähtelyaktiivisuutta 0,015 Hz:n ympärillä kuin uexMI01943-mutanttien aivoissa. Nämä tiedot viittaavat siksi siihen, että UEX:tä tarvitaan KC:n [Mg2 plus]i:n hitaaseen rytmiseen ylläpitoon. Tärkeää on, että MagIC-signaalien kohoaminen ja muuttuminen uex-mutanteissa vahvistaa, että havaitut MagIC-vasteet ovat Mg2 plus -riippuvaisia. Lisäksi he ehdottavat, että KC:n ilmaisema UEX rajoittaa Mg2:ta plus kertymistä, mikä on yhdenmukainen suulakepuristuksen roolin kanssa.

Keskustelu

Havainto LTM-suorituskyvyn parantui, kun kärpäsiä ruokittiin 4 päivää ennen harjoittelua ravinnolla, jota oli täydennetty 80 mM [Mg2 plus]:lla. Tämä tulos muistuttaa rotilla raportoitua, vaikka pitkiä ruokintajaksoja vaadittiin nostaakseen aivot [Mg2 plus] muistia parantaville tasoille (Slutsky et al., 2010). Ero optimaalisessa ruokintaajassa voi heijastaa eläimen kokoa ja ehkä ravinnon Mg2 plus:n suurempaa biologista hyötyosuutta Drosophilassa. Vaikka Mg2 plus -L-treonaatti (MgT) oli tehokkaampi tapa kuljettaa Mg2 plus -ainetta kuin magnesiumkloridi rotilla (Slutsky et al., 2010), havaitsimme samanlaisen muistisuorituskyvyn paranemisen, kun kärpäsiä ruokittiin magnesiumkloridilla. , magnesiumsulfaatti tai MgT (tietoja ei ole esitetty).

Kuva 7. Kenyonsolun (KC) uex-ilmentyminen on muuttunut rutabaga- ja dunce-mutanttikärpäsissä. (A) Anti-HA-värjätyt aivot paljastavat, että UEX::HA-proteiinin lokalisaatio on muuttunut rut2080:ssa; uex::HA ja dnc1; uex::HA lentää ja tulee näkyvämmäksi abc KC:issä (nuolet). Mittakaavat 20 mm. (B) Suurennettuja kuvia sienikappaleista (MBs), jotka korostavat abc KC -ilmentymistä rut2080- ja dnc1-mutanttiperhoissa verrattuna villityypin uex::HA-perhoihin. Mittakaavat 20 mm. (C) Fluoresenssin intensiteetin kvantifiointi. Vasemmalla, mikrokuva, jossa mittausviiva keilan kärjen läpi ja suorakaiteen muotoiset ROI:t g-keilan ja kontrollialueen osalta. Keskimmäiset suhteelliset fluoresenssin intensiteettiprofiilit keilan kärjen poikki osoittavat merkittävästi korkeampaa signaalia rut2080- ja dnc1-mutanttikärpäsissä ab-ytimen KC:iden miehittämillä keskialueella (*p<0.05, anova,="" n="6–10)." right,="" the="" relative="" intensity="" in="" the="" g="" lobe="" was="" significantly="" lower="" in="" rut2080="" and="" dnc1="" mutant="" flies,="" as="" compared="" to="" wild-type="" controls=""><0.05, anova,="" n="6–10)." scale="" bars="" 10="" mm.="" (d)="" left,="" micrograph="" showing="" circular="" rois.="" right,="" figure="" 7="" continued="" on="" quantification.="" total="" intensity="" over="" all="" six="" rois="" on="" the="" mbs="" was="" not="" significantly="" different="" between="" the="" rut2080,="" dnc1,="" and="" wild-type="" brains="" (p="">0.13; ANOVA, n=6–10).

[Mg2 plus]e:n kohoaminen rotan aivoissa johtaa NMDAR:n NR2B-alayksikön ilmentymisen kompensoivaan lisääntymiseen ja siten postsynaptisten NR2B:tä sisältävien NMDAR:ien osuuden kasvuun. Tällä NMDAR-luokalla on pidempi avautumisaika (Chen et al., 1999; Erreger et al., 2005), mikä viittaa siihen, että tämä alayksikön koostumuksen vaihto edustaa homeostaattista plastisuusmekanismia (Turrigiano, 2008), joka mukautuu lisääntyneeseen NMDAR-estoon, jonka aiheuttaa kasvava [Mg2 plus ]e. Lisäksi NR2B:n yli-ilmentyminen hiiren etuaivoissa voi tehostaa synaptista helpotusta ja oppimista jamuistisuorituskyky (Tang et al., 1999), mikä tukee NR2B:n kasvua, joka on tärkeä tekijä Mg2 plus -tehostetussamuisti. Kuitenkin jopa alkuperäisessä in vitro -tutkimuksessa Mg2 plus -tehostetusta synaptisesta plastisuudesta (Slutsky et al., 2004), havaittiin, että NMDAR-virrat eivät riittäneet selittämään täysin havaittuja muutoksia.

NMDAR-alayksiköiden toimintahäiriötutkimuksemme Drosophila KC:ssä eivät heikentäneet säännöllistä tai Mg2 plus -tehostepitoisuuttamuisti. Emme myöskään havainneet ilmeistä muutosta glutamaattireseptorin alayksiköiden aivojen laajuisen ilmentymisen tasoissa Mg2 plus -syötetyissä kärpäsissä. Vaikka NMDAR-aktiivisuus on aiemmin liitetty Drosophilan hajuunmuisti, vaikutusten katsottiin enimmäkseen toimivan MB:n ulkopuolella (Xia et al., 2005; Wu et al., 2007). Lisäksi Nmdar1:n yli-ilmentyminen kaikissa neuroneissa tai erityisesti kaikissa KC:issä ei muuttanut STM:ää tai LTM:ää. Kohdunulkoinen yli-ilmentyminen NMDARN631Q-version MB:ssä, jota Mg2 plus ei voi estää, heikensi LTM:ää (Miyashita et al., 2012). Tämä mutaatio kuitenkin sallii ligandiin perustuvan Ca2:n plus pääsyn ilman korreloivaa hermosolujen depolarisaatiota, mikä voi häiritä KC:n toimintaa odottamattomilla tavoilla. On ehkä huomionarvoisinta, että oppimisen kannalta merkityksellistä synaptista masennusta MB:ssä voivat ohjata dopaminergiset opetussignaalit, jotka välitetään kolinergisiin lähtösynapseihin hajuherkistä KC:istä tiettyihin MBONeihin (Claridge-Chang et al., 2009; Aso et al., 2012). Burke ym., 2012; Liu ym., 2012; Owald ym., 2015; Hige ym., 2015; Barnstedt ym., 2016; Parisse ym., 2016; Aso ym., 2014; Owald ja Waddell, 2015; Handler et ai., 2019). On mahdollista, että KC:t saavat glutamaattia lähteestä, jota ei ole vielä tunnistettu, mutta tällä hetkellä MB-verkossa ei ole selvää paikkaa NMDAR-riippuvaiselle plastisuudesta. Tästä syystä todisteet viittaavat siihen, että normaali ja Mg2 plus -tehostettu Drosophila LTM on riippumaton NMDAR-signaloinnista KC:issä. Lisäksi MagFRET-mittauksemme osoittavat, että Mg2 plus -syöttö lisää myös ab KC:n [Mg2 plus ]i:tä noin

vastaavasti 50 mM.

Tunnistamme roolin uex:lle, yksikärpäiselle ortologille evoluutionaalisesti konservoituneesta CNNM-tyypin Mg2- ja ulosvirtauskuljettajien perheestä (Ishii et al., 2016). Hiirillä ja ihmisillä on neljä erillistä CNNM-geeniä, C. elegansissa viisi ja seeprakalassa kaksi (Ishii et al., 2016; Arjona et al., 2013). Uex-lokus tuottaa neljä vaihtoehtoisesti silmukoitua mRNA-transkriptiä, mutta kaikki koodaavat samaa 834 aa:n proteiinia. CNNM-proteiinien tarkka rooli Mg2 plus -kuljetuksessa on jonkin verran kiistanalainen (Funato et al., 2018a; Arjona ja de Baaij, 2018; Funato et al., 2018b; Gime´nez-Mascarell et al., 2019). Jotkut ehdottavat, että CNNM-proteiinit ovat suoria Mg2 plus -kuljettajia, kun taas toiset kannattavat niiden toimimista solunsisäisen Mg2 plus -konsentraation [Mg2 plus]i ja/tai muiden Mg2 plus -kuljettajien säätelijöinä. Havaitsimme, että Drosophila UEX:n ektooppinen ilmentyminen tehostaa Mg2 plus effluksia HEK293-soluissa ja että endogeeninen UEX rajoittaa [Mg2 plus]i:tä ab KC:issä kärpäsen aivoissa. Siksi, jos UEX ei ole itse Mg2 plus -kuljettaja, sen täytyy olla

pystyy olemaan tehokas vuorovaikutuksessa ihmisen Mg2 plus effluksikuljettajien kanssa ja vaikuttamaan Mg2 plus ekstruusioon Drosophilassa. Koska UEX on ainoa CNNM-proteiini kärpäsessä, se voi palvella kaikkia neljän yksittäisen nisäkäs-CNNM:n rooleja. Kuitenkin kyky hiiren CNNM2 palauttaamuistikyky uex-mutanttikärpäsiin viittaa siihen, ettämuisti- relevantti UEX-toiminto voidaan korvata CNNM2:lla.

Mielenkiintoista on, että mikään sairauden kannalta merkityksellisistä CNNM2-varianteista ei kyennyt täydentämäänmuistiuex-mutanttiperhojen vika. CNNM2 T568I -variantti korvaa yhden aminohapon toisessa CBS-domeenissa (Arjona et al., 2014). PRL-perheen (regeneroivan maksan fosfataasi) -perheen onkogeeniset proteiinityrosiinifosfataasit sitoutuvat CNNM2:n ja CNNM3:n CBS-domeeneihin ja voivat estää niiden Mg2- ja kuljetustoimintoja (Hardy et al., 2015; Gime´nez-Mascarell et al., 2017). Zhang et ai., 2017). Siksi on mielenkiintoista testata UEX CBS -verkkotunnusten roolia ja sitä, sääteleekö fly PRL{10}} UEX-toimintaa.

RNA-seq-analyysi paljastaa, että uex ilmentyy voimakkaasti toukkien ja aikuisten kärpästen ruoansulatuskanavassa ja hermostossa sekä munasarjoissa (Gelbart ja Emmert, 2010; Croset et al., 2018; Davie et al., 2018), mikä viittaa siihen, että monet uex-mutaatiot ovat pleiotrooppisia. UexD-alleelimme, joka poistaa 272 aminohappoa (mukaan lukien osan toisesta CBS-alueesta ja koko CNBH-domeenista) UEX:n C-päästä, johtaa kehityskuolleisuuteen homotsygoottisena, mikä osoittaa, että uex on välttämätön geeni. Nisäkkään CNNM4 on paikantunut suoliston epiteelisolujen basolateraaliseen kalvoon (Yamazaki et al., 2013). Siellä sen uskotaan toimivan transsellulaarisessa Mg2:ssa plus kuljetuksessa vaihtamalla solunsisäistä Mg2 plus:a solunulkoiseen Na plus:aan sen jälkeen, kun apikaalinen sisäänpääsy on tapahtunut TRPM7-kanavien kautta. Drosophilan kuolleisuus voi siksi johtua kyvyttömyydestä imeä riittävästi Mg2 plus -pitoisuutta toukkien suolen kautta. Kuitenkin uexRNAi:n hermoston rajoitettu ilmentyminen elav-GAL4:n kanssa johtaa myös toukkien kuolleisuuteen (tietoja ei esitetty), mikä viittaa siihen, että UEX:llä on lisärooli hermoston varhaisessa kehityksessä, kuten CNNM2:lla ihmisillä ja seeprakalalla (Arjona et al., 2014; Accogli et ai., 2019). Ehkä yllättäen kärpäsillä, jotka kantavat homotsygoottisia tai transheterotsygoottisia useiden hypomorfisten uex-alleelien yhdistelmiä, on puutteellinen ruokahalu ja vastenmielisyys.muistisuorituskykyä, mutta ne eivät kuitenkaan vaikuta muutoin.

Uex-lokuksen geneettinen muokkaaminen C-terminaalisen HA-tunnisteen lisäämiseksi UEX-proteiiniin antoi meille mahdollisuuden paikallistaa sen ilmentymisen aivoissa. Merkinnät ovat erityisen näkyvästi esillä kaikissa tärkeimmissä KC-luokissa. uex-lausekkeen knockdownin rajoittaminen kaikkiin aikuisten kärpästen ab KC:iin tai jopa vain abc-alajoukkoon toisti LTM-vian. LTM:n heikkeneminen oli ilmeistä, jos uexRNAi ilmeni ab-hermosoluissa

Kuva 8. UEX rajoittaa [Mg2 plus ]i:n nousua ja tukee hidasta värähtelyä ab Kenyon -soluissa (KC). (A) C739-GAL4:n ohjaama UAS-MagIC:tä ilmentävä kärpäsaivot. Yläpaneeli, laajakentän vaihekontrastinäkymä; keskipaneelit, fluoresenssinäkymät Venus- ja mCherry-kanavista; alempi paneeli, konfokaalinen osa KC somatan tasolla, joka näyttää Venus- ja mCherry-kanavat. Mittakaavat 20 mm. (B) MagIC reagoi selektiivisesti KC:n [Mg2 plus ]i:n muutoksiin. MagIC-suhteen jälkiä 10, 20 tai 40 mM MgCl2:n tai CaCl2:n kylvyn levittämisen jälkeen; 5, 10 tai 20 mM EDTA tai EGTA. (C) Kuvaa 8 edustava jälki jatkui seuraavassa -Kuva 8 jatkui

MagIC-suhde FSK:n käytön jälkeen osoittaa alkuaallon, jota seuraa asteittainen nousu ja hitaan värähtelyn kehittyminen. (D) Ensisijaiset vasteet johtuvat muutoksista Mg2 plus -herkässä Venus-signaalissa. (E) mCherry-signaali vaimenee tasaisesti. (F) FSK:n aiheuttamat MagIC-vasteet ovat suurempia uex-mutanttiperhoissa. Keskimääräiset MagIC-vasteet osoittavat, että FSK indusoi merkittävästi enemmän uexMI{10}}1943-mutantteja kuin villityypin kärpäsissä. (G). Keskimääräiset suolaliuoksen aiheuttamat MagIC-vasteet eivät muuttuneet merkittävästi uex-mutanttiperhoissa. (H) Yksittäiset Venus- (vihreä) ja mCherry (punainen) -kanavajäljet ​​osoittavat, että hidas värähtely on ilmeistä vain villityypin, mutta ei uex-mutanttiperhojen Venus-kanavassa. (I) Tehospektritiheyden (PSD) analyysi aikasarjoista 200–900 s kaikista tiedoista osoittaa, että villityypin kärpäsjäljillä on huomattavasti enemmän värähtelyaktiivisuutta, jonka keskipiste on noin 0,015 Hz, kuin uex-mutanttikärpästen jäljillä.

Tämän artikkelin online-versio sisältää seuraavat lisäykset kuvaan 8:

Kuvaliite 1. Yksittäiset jäljet ​​MagIC- ja GCaMP-kuvaukseen.