Osa 1: Integroitu verkkofarmakologia ja seeprakalamalli Cistanche Tubulosan kaksivaikutteisten komponenttien tutkimiseksi sekä osteoporoosin että Alzheimerin taudin hoidossa
Mar 30, 2022
Ottaa yhteyttä:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Ying-Qi Li 1, Yi Chen 1, Jia-Yi Fang 1, Si-Qi Jiang 1, Ping Li 1, * ja Fei Li 1, 2, *
ABSTRAKTI
Etnofarmakologinen merkitys:Osteoporoosi (OP) ja Alzheimerin tauti (AD) ovat yleisiä geriatrisia samanaikaisia sairauksia, ja monet tutkimukset osoittavat niiden patogeneesin yhteyden. Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) on laajalti käytetty perinteinen kiinalainen lääketiede, ja sitä on käytetty laajasti OP:n ja AD:n hoitoon. Kuitenkin aktiiviset aineosat sekä samanaikaisiin sairauksiin samanaikaisesti että taustalla olevat mekanismit ovat rajalliset.
Tutkimuksen tavoite:Tämän työn tavoitteena oli luoda tehokas ja luotettava verkkoseulontamenetelmä kaksoisvaikutteisten yhdisteiden löytämiseksi TT:stä, jotka voivat suojata AD:tä ja OP:ta samanaikaisesti. Ja se tarjoaa uusia näkökulmia OP:n ja AD:n välisestä yhteydestä molekyylimekanismeihin.
Materiaali ja metodit:CT:n kaksoisvaikutuksia analysoitiin systemaattisesti integroimalla useita tietokantoja ja laajaa analyysia verkkofarmakologian tasolla. Luokiteltu lääke-kohdevuorovaikutusverkosto rakennettiin paljastamaan erot erityyppisten yhdisteiden välillä. Tämän verkon tehokkuuden osoittamiseksi valittiin joitain yhdisteitä varmennettavaksi seeprakalan esi-indusoidussa OP-mallissa ja AlCl3-indusoidussa AD-mallissa topologisten parametrien mukaan.
Avainsanat:Verkkofarmakologia; Osteoporoosi;Alzheimerin tauti; Cistanche tubulosa; Seeprakala.
Cistanchella on anti-Alzheimer-toiminto.
1. Esittely
Väestön ikääntymistaipumus lisää osteoporoosin (OP) ja Alzheimerin taudin (AD) esiintyvyyttä vuosien mittaan (Parnetti ym., 2019; Rizzoli, 2018). Nykyään sekä OP että AD on tunnustettu suuriksi uhiksi kansanterveydelle, koska ne voivat edetä ilman oireita ja tuoda mukanaan valtavia sosiaalisia rasitteita (Erkkinen ym., 2018; Jonsson ym., 2018). Ikääntymiseen liittyvinä sairauksina niiden nähdään usein esiintyvän kliinisessä käytännössä samanaikaisesti korkean vammaisuuden ja kuolleisuuden kanssa (Dengler-Crish ja Elefteriou, 2019). OP on systeeminen luuston sairaus, jolle on ominaista alhainen luumassa ja heikentynyt luukudoksen mikroarkkitehtuuri, lisääntynyt luun hauraus ja lisääntynyt murtumariski (Rizzoli, 2018). AD on yleisin aivojen rappeuma, jolle on ominaista etenevä muistin ja muiden kognitiivisten toimintojen menetys (Bondi et al., 2017). Toistaiseksi ei ole vieläkään olemassa riittävän tehokkaita vaihtoehtoja näiden kahden monimutkaisen etiologian ja patogeneesin sairauden ehkäisemiseksi tai parantamiseksi. Ja mikä pahinta on, että potilaalla on useammin sivuvaikutuksia (Brown, 2017; Huang ja Mucke, 2012).
Oireyhtymän erilaistumisen teoreettisen perustan (Sucher, 2013) perusteella perinteisillä kiinalaisilla lääkkeillä (TCM), joissa on useita komponentteja, jotka kohdistuvat useampaan kuin yhteen patofysiologiseen mekanismiin, on ainutlaatuinen ylivoima joidenkin tuttujen monimutkaisten sairauksien hoidossa. Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) on munuaisten tonisoiva yrtti, jota perinteiset kiinalaiset lääkärit käyttävät laajalti muistin menetystä ja luiden atrofista heikkenemistä vastaan (Fu et al., 2018). Perinteisen tehonsa lisäksi huomattavat tutkimukset osoittivat, että sillä oli erilaisia farmakologisia vaikutuksia, kuten kognitiivisten ja käyttäytymishäiriöiden lievittäminen (Wu et al., 2014), tulehdusta ehkäisevä (Fu et al., 2018), luun muodostumisen edistäminen ja luuston tukahduttaminen. resorptio (Li et al., 2013; Li et ai., 2012) sekä antioksidanttiaktiivisuus (Zhang et al., 2016). Mutta sen aktiivisten ainesosien ja aineenvaihduntaprosessin monimutkaisuus nosti vaikeuksia sekä ihmiskudosten kohteiden tutkimisessa että vaikutusmekanismin selvittämisessä.
Ennen kaikkea tarvitaan luotettava keskustelu OP/AD:n terapeuttisista kohteista. Varsinkin kun otetaan huomioon ajatus "samasta hoidosta eri sairauksille" TCM:issä ja "monikomponenttisen terapian, biologisen verkoston" verkoston sisäisen farmakologian menetelmiin, yrityksillä löytää merkittäviä yhteisiä kohteita molempien sairauksien välillä voi olla erityisen käytännöllinen. merkitys OP:n ja AD:n ehkäisyyn ja valvontaan liittyvien ohjeiden antamisessa. Seeprakalojen luuston fysiologia on vahvasti samankaltainen nisäkkäiden kanssa ja erittäin homologiset geenit ihmisten kanssa. Se on saatavilla oleva ja houkutteleva eläinmalli in vivo OP- ja AD-tutkimukseen (Bergen et al., 2019; Newman et al., 2014). Tämän verkostofarmakologisen tutkimuksen tavoitteena oli siis seuloa CT:n kaksivaikutteisia aktiivisia aineosia, tutkia OP:n ja AD:n yhteisiä potentiaalisia kohteita sekä paljastaa mahdollisuus käyttää CT:tä kahden sairauden hoitoon samanaikaisesti. Tässä tutkimuksessa kohteiden tiedot CT-aktiivisista aineista, genomeista ja OP:n ja AD:n proteomiikkatiedoista kerättiin eri tietokannoista vuorovaikutteisen verkoston luomiseksi, ja rikastusanalyysi rakennettiin CT:n synergististen mekanismien löytämiseksi OP:n ja AD:n hoitoon. . Lisäksi indusoimme OP- ja AD-seeprakalamalleja ja vangisimme verkon tärkeimmät yhdisteet varmistaaksemme niiden tehokkuuden ja tavoitteet kahdelle taudille.
Cistanche kiihdyttää sklerotiinin kasvua.
2. Materiaalit ja metodit
2.1 Reagenssit
Genisteiinin (GE), kversetiinin (QU), abietiinihapon (AA), -sitosterolin (BSS) (puhtaus suurempi tai yhtä suuri kuin 98 prosenttia) kemialliset standardit ostettiin Chroma Biotechnology Co., Ltd:ltä (Chengdu, Kiina). Viljelylevyt hankittiin yhtiöstä Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. (Wuxi, Kiina). Prednisoloni (Pre), etidronaattidinatrium (Ed), donepetsiili HCL (DPZ), AlCl3·6H2O ostettiin yhtiöltä Aladdin Reagent Inc. Seeprakalan alkalinen fosfataasi (ALP), tartraattiresistentti hapan fosfataasi (TRAP), asetyylikoliiniesteraasi (AChE) ja koliini asetyylitransferaasi (ChAT) -entsyymikytketty immunosorbenttimääritys (ELISA) -pakkauksen toimitti Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, Kiina). Trizol saatiin Nanjing KeyGen Biotechilta. Co., Ltd. (Nanjing, Kiina). Transtar Top Green qPCR SuperMix ostettiin TransGen Biotechilta. Co., Ltd. (Peking, Kiina).
cistanche-uute
2.2 Eläimet
Täysikasvuisia seeprakaloja (AB-kanta, 4 kuukautta vanha) pidettiin 28 asteessa 14/10 tunnin valo/pimeyden syklissä akvaariossa, jossa oli makean veden vaihto. Niitä pidettiin kaksi kertaa päivässä juuri kuoriutuneella suolavesikatkarapuruokavaliolla (Chen et al., 2018). Normaalisti hedelmöittyneet alkiot valittiin ja viljeltiin 3 päivää hedelmöityksen jälkeen (dpf) kevyessä kasvuinkubaattorissa. Kaikki eläinkokeet olivat laitoksen ja hallituksen eläinkokeita koskevien ohjeiden mukaisia.
2.3 Verkoston farmakologinen prosessi
2.3.1 Kemiallisen tilan laskenta ja kandidaattiyhdisteiden seulonta
Kaikki CT:n kemialliset ainesosat kerättiin Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform -tietokannasta. TCMSP on kiinalaisten kasviperäisten lääkkeiden systeemifarmakologinen alusta, joka kuvaa lääkkeiden, kohteiden ja sairauksien välisiä suhteita (Ru et al., 2014). Samaan aikaan TCMSP:ssä hankittiin neljä olennaista farmakologiaan liittyvää parametria pääkomponenttianalyysiä (PCA) varten, mukaan lukien molekyylipaino (MW), oktanolin ja veden välinen jakautumiskerroin (AlogP), vedyn luovuttajien määrä (Hdon) ja vetyakseptorimäärä ( Hacc). CT:n kemiallinen jakautuminen rakennettiin yllä olevilla parametreilla käyttämällä SIMCA-ohjelmistoa (versio 14.1, Umetrics). Ja DrugBankin AD/OP:lle hyväksytyt pienimolekyyliset lääkkeet käsiteltiin samalla kurssilla. CT:stä saadut ainesosat suodatettiin lääkemäisyyden (DL) mukaan. DL on laadullinen käsite, jota käytetään lääkesuunnittelussa arvioimaan, kuinka "lääkkeen kaltainen" mahdollinen yhdiste on. Tätä elintärkeää ominaisuutta käytetään perinteisten kiinalaisten yrttien "lääkkeen kaltaisten" yhdisteiden valintakriteerinä, ja se auttaa optimoimaan farmakokinetiikkaa ja farmaseuttisia ominaisuuksia (Tao et al., 2013). Kirjallisuuden ja TCMSP:n ehdotusten perusteella valitsimme suodatinehdoksi DL Suurempi tai yhtä suuri kuin 0.18. Tilan mukaiset ainesosat vietiin myöhempää analysointia varten. Niiden 2-ulotteiset (2D) ja 3D-rakenteet maalattiin ChemDraw Professional 16.0 -ohjelmistolla. Ja 3D-rakenteet optimoitiin energian minimoimisen avulla Chem3D 16.0:ssa.
2.3.2 OP ja AD Associated Targets Collection
Kaikki OP:n ja AD:n geeniyhdistykset kerättiin itsenäisesti DisGeNETistä ja GeneCardsista. DisGeNET-tietokanta on yksi suurimmista julkisesti saatavilla olevista ihmisen sairauksiin liittyvien geenien ja muunnelmien löytöalustoista (Pinero et al., 2017). GeneCards on integroitu tietokanta ihmisen geeneistä, joka sisältää genomista, transkriptomista, proteomista, geneettistä, kliinistä ja toiminnallista tietoa (Safran et al., 2010).
2.3.3 Yhdistettyjen kohteiden kerääminen ja käänteinen telakointiennustus
GeneCards-tietokanta ja Swiss TargetPrediction-tietokanta yhdistettiin CT:n aktiivisten ainesosien relevanttien kohteiden ennustamiseksi. GeneCards osoittaa yhdisteiden tunnetut aktiiviset kohteet, kun taas Swiss TargetPrediction -tietokanta pystyy arvioimaan pienten molekyylien todennäköisimpiä makromolekyylikohteita (Daina et al., 2019). Ennen ennustamista ehdokasmolekyylien rakenteet muunnettiin mol2-formaatista SMILES-muotoon Open Babelilla (versio 2.4.1).
2.3.4 Proteiini-proteiini-vuorovaikutusanalyysi
Tietokantaa STRING käytettiin CT-OP-AD:n jaettujen kohteiden ryhmän välisten vuorovaikutusten selvittämiseen. "Homo sapiens" -mallin alaisen haun jälkeen proteiini-proteiini-vuorovaikutusverkko (PPI) visualisoitiin Cytoscape-ohjelmistolla (versio 3.7.2). STRING on tietokanta tunnetuista ja ennustetuista PPI:istä, joka on johdettu genomisen kontekstin ennusteista, suuritehoisista laboratoriokokeista, (konservoituneesta) yhteisilmentämisestä, automaattisesta tekstinlouhinnasta ja aiemmasta tietokannoista saadusta tiedosta (Szklarczyk et al., 2017).
Cistanche on hyvä Alzheimerin taudille.
2.3.5 GO ja KEGG Pathway Enrichment Analysis
Gene Ontology (GO) -rikastusanalyysi suoritettiin Funrich-ohjelmistolla. FunRich (versio 3.1.3) on toiminnallinen ohjelmisto, jota käytetään pääasiassa geenien ja proteiinien rikastusanalyysiin (Pathan et al., 2015). Reitin rikastusanalyysin suorittamiseen käytettiin ConsensusPathDB-ihmistietokantaa. Saatu geenilista lähetettiin tietokantaan asetuksella "p-arvo cutoff" 0,01. Tulosten saamisen jälkeen vain nämä OP- ja/tai AD-polut valittiin ja jaettiin ryhmiin KEGG-toimintokategorioiden mukaan. CPDB on saumaton vuorovaikutusverkosto, joka sisältää binaarisia ja monimutkaisia proteiini-proteiini-, geneettisiä, metabolisia, signalointi-, geenisäätely- ja lääke-kohdevuorovaikutuksia sekä biokemiallisia reittejä Homo sapiensissa (Kamburov et al., 2013).
2.4 OP Seeprakalamallin kokeelliset menettelyt
2.4.1 Mallin ryhmittely
Seeprakalan toukat jaettiin useisiin ryhmiin: kontrolliryhmä, malliryhmä, malli plus Ed-ryhmä, malli plus yhdisteryhmät, joista jokainen sisälsi 30 toukkia. Kontrolliryhmää pidettiin väliaineessa, jossa oli 0,2 prosenttia DMSO:ta. Malliryhmää käsiteltiin Pre:llä (25 uM) 3 dpf - 8 dpf. Malli plus Ed -ryhmää käsiteltiin yhdessä Pre:llä ja Ed:llä (30 ug/ml).
2.4.2 Alizariininpunainen värjäys
5 päivän viljelyn jälkeen eri yhdisteillä toukat nukutettiin, kiinnitettiin ja valkaistiin vuorotellen. Alizariininpunaista käytettiin seeprakalan pääluiden värjäämiseen. 1 % KOH:ta ja glyserolia (suhteet 3:1, 1:1 ja 1:3) käytettiin vastaavasti ylimäärän poistamiseksi. Lopuksi käytettiin stereomikroskooppia (Olympus SZX16) ottamaan seeprakalavärjäytyskuvat makuuasennossa. Värjäysalue ja integroitu optinen tiheys (IOD) laskettiin Image-Pro Plus 6:lla.0.
2.4.3 ALP- ja TRAP-aktiivisuuden määritys
Seeprakalan toukkia 3 dpf:llä jatkoviljeltiin 6-kuoppalevyillä ja inkuboitiin Pre:n kanssa yhdisteiden läsnä ollessa tai ilman niitä 5 päivää. Sitten ne kerättiin ALP-aktiivisuuden mittaamista varten. ALP-aktiivisuus määritettiin käyttämällä seeprakalan ALP ELISA -sarjaa valmistajan protokollan mukaisesti. TRAP-aktiivisuuden arviointimenetelmä oli sama kuin ALP.
2.5 AD-seeprakalamallin koemenettelyt
2.5.1 Mallin ryhmittely
Seeprakalan toukat jaettiin useisiin ryhmiin: kontrolliryhmä, malliryhmä, malli plus DPZ-ryhmä, malli plus yhdisteryhmät, joista jokainen sisälsi 30 toukkia. Kontrolliryhmää pidettiin väliaineessa, jossa oli 0,2 prosenttia DMSO:ta. Malliryhmää käsiteltiin AlCl3:lla (150 uM, pH 5,8) 3 dpf:stä 6 dpf:iin. Malli plus DPZ-ryhmä käsiteltiin yhdessä AlCl3:lla ja DPZ:lla (8 uM).
2.5.2 Käyttäytymisanalyysi
Kolmen päivän lääketoimitusten jälkeen toukkien liikkeet kirjattiin ViewPoint-käyttäytymisanalysaattorilla (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.). Kaikki kokeet suoritettiin 60 minuutissa 28 °C:ssa, sisältäen 3 vaalean/pimeän faasin sykliä (10 min kukin valolle ja pimeydelle). Edellisessä raportissa esitettyjen menetelmien mukaisesti AD-lääkkeen tehokkuudeksi valitaan keskinopeus (AS), nopeuden muutos (∆S), dyskinesian palautumisnopeus (DRR, yhtälö a) ja vastetehokkuus (RE, yhtälö b). arviointiindeksi tässä mallissa (Pan et al., 2019; Wenhai et al., 2016).
AS (mm/s)=D / T, DRR (prosentti)=100 × (ASDrug - ASModel) / (ASControl - ASModel), a
missä D on seeprakalan liikematka 60 minuutin aikana, T on kokeellinen aika.
RE ( prosentti )=100 × (∆SDrug - ∆SMali) / (∆SControl - ∆SMali), b
missä ∆S on seeprakalan nopeuden muutos valon/pimeän jaksoissa.
2.5.3 AChE- ja chat-aktiivisuuden mittaus
Seeprakalan toukkia 3 dpf:llä jatkoviljeltiin 6-kuoppalevyillä ja inkuboitiin AlCl3:n kanssa yhdisteiden läsnä ollessa tai ilman niitä 3 päivää. Sitten ne kerättiin AChE-aktiivisuutta varten. AChE-aktiivisuus havaittiin käyttämällä seeprakalan AChE ELISA -sarjaa valmistajan protokollan mukaisesti. ChAT-aktiivisuuden arviointimenetelmä oli sama kuin AChE.
2.6 Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi
Seeprakalan toukat jaettiin OP- ja AD-ryhmiin. OP-ryhmät koostuivat kontrolliryhmästä, Pre-ryhmästä ja Pre plus -yhdisteryhmistä, joita viljeltiin 3 dpf - 8 dpf. AD-ryhmiin kuuluivat kontrolliryhmä, AlCl3-ryhmä ja AlCl3 plus yhdisteryhmät, joita viljeltiin välillä 3 dpf - 5 dpf. Jokainen ryhmä sisälsi 30 toukkaa. Kokonais-RNA uutettiin näistä seeprakalan toukinäytteistä Trizolilla. RNA-näytteet käänteistranskriptoitiin cDNA:ksi cDNA-sarjan valmistajan ohjeiden mukaisesti. mRNA:n ilmentymistaso havaittiin reaaliaikaisella fluoresoivalla kvantitatiivisella PCR:llä (Roche LightCycler96). Tulokset normalisoitiin -aktiiniekspressioon ja kvantifioitiin vertailumenetelmällä (2−∆∆Ct). Käytetyt eteenpäin- ja käänteisalukkeet syntetisoi Sangon Biotech (Shanghai, Kiina) ja lueteltiin lisätaulukossa S1.
cistanche ja Tongkat ali -jauheauttaa parantamaan vastustuskykyä.
Saat lisätietoja napsauttamalla tätä.
2.7 Tilastollinen analyysi
GraphPad Prism -versiota 8.00 käytettiin kuvaaviin tilastollisiin analyyseihin. Tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SD ja analysoitiin ANOVA-menetelmällä vaihtelevuuden testaamiseksi kunkin kokeen välillä pitäen P:tä pienempiä tai yhtä suuria kuin 0,05 merkitsevänä.
