Osa 1: Cistanche Tubulosa fenyylietanoidiglykosidit indusoivat hepatosellulaaristen karsinoomasolujen apoptoosia ja tehostavat kasvainten vastaista vaikutusta

Ota yhteyttä: ali.ma@wecistanche.com

Pengfei Yuan, BSc1, Changshuang Fu, MSc1, Yi Yang, PhD1, Aipire Adila, PhD1, Fangfang Zhou, MSc1, Xianxian Wei, MSc1, Weilan Wang, PhD1, Jie Lv, PhD1, Yijie Li, PhD1, PhD1 ja Jinyao Li, PhD1

Abstrakti

Cistanche tubulota on eräänlainen kiinalainen kasviperäinen lääke, ja sillä on erilaisia ​​biologisia toimintoja. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet senCistanche tubulosa fenyylietanoidiglykosidit(CTPG) osoittavat kasvainten vastaisia ​​vaikutuksia erilaisiin kasvainsoluihin. CTPG:n kasvaimia estävät vaikutukset HepG2- ja BEL-7404-hepatosellulaarisiin karsinoomasoluihin (HCC) ovat kuitenkin edelleen vaikeasti havaittavissa. Tutkimuksemme osoitti, että CTPG esti merkittävästi HepG2- ja BEL-7404-solujen kasvua indusoimalla solusyklin pysähtymistä ja apoptoosia, mikä liittyi MAPK-reittien aktivaatioon, jolle on tunnusomaista p38:n, JNK:n ja ERK1/2 ja mitokondrioista riippuvainen reitti, jolle on tunnusomaista mitokondrioiden kalvopotentiaalin väheneminen. Sytokromi c:n vapautuminen ja kaspaasin-3, -7, -9 ja PARP:n pilkkoutuminen lisääntyivät myöhemmin CTPG-hoidolla. Lisäksi CTPG tukahdutti merkittävästi HepG2:n migraatiota alentamalla matriksin metalloproteinaasin-2 ja verisuonten endoteelin kasvutekijöiden tasoa. Mielenkiintoista on, että CTPG ei vain lisännyt pernasolujen lisääntymistä, vaan myös vähensi sisplatiinin indusoimaa pernasolujen apoptoosia. H22-kasvainhiirimallissa CTPG yhdistettynä sisplatiiniin esti edelleen H22-solujen kasvua ja vähensi sisplatiinin sivuvaikutuksia. Kaiken kaikkiaan CTPG esti HCC:n kasvua suoran antituumorivaikutuksen ja epäsuoran immunotehokkuuden kautta ja paransi sisplatiinin kasvainten vastaista tehoa.

Avainsanat Cistanche tubulosa fenyylietanoidiglykosidit, apoptoosi, MAPK-reitti, mitokondrioista riippuvainen reitti, sisplatiini, immuunivahvistus

Cistanchella on kasvaimia estävä vaikutus.

Klikkaa nähdäksesi Cistanche-tuotteet ja Cistanches

Johdanto

Maksasyövän ennustettiin olevan kuudenneksi yleisin syöpä ja neljänneksi yleisin syöpäkuolemien syy maailmanlaajuisesti vuonna 2018. Kaakkois-Aasiassa (Mongoliassa, Kambodžassa ja Vietnamissa) todettiin vuosittain noin 841 000 uutta tapausta ja 782 000 kuolemaa. .1 Kiinassa maksasyövä oli kolmanneksi yleisin syöpään liittyvien kuolemien syy vuonna 2015.2 Yli 90 prosenttia primaarisista maksasyövistä on hepatosellulaarista karsinoomaa (HCC) kaikkialla maailmassa. Tällä hetkellä hepatektomia, maksansiirto ja perkutaaninen ablaatio ovat tärkeimmät menetelmät HCC:n hoidossa. Valitettavasti nämä hoidot ovat tehokkaita 30 prosentille potilaista, joilla on diagnosoitu varhainen maksasyövä, kun taas potilaiden, joilla on diagnosoitu pitkälle edennyt maksasyövä (osuus 40 prosenttia), on turvauduttava palliatiiviseen hoitoon eloonjäämisajan pidentämiseksi.3,4 Sorafenibi yhdistettynä maksasyöpään. valtimoiden kemoembolia on tärkeä ja yleinen palliatiivinen hoito useimmille potilaille, joilla on pitkälle edennyt HCC Aasian ja Tyynenmeren alueella.5 Sorafenibi, jonka FDA hyväksyi vuonna 2006 pitkälle edenneen maksasyövän hoitoon, on moninkertainen kinaasi-inhibiittori, joka estää kasvainsolujen lisääntymistä ja verisuonia. tuotantoa ja edistää kasvainsolujen apoptoosia. Sorafenibi pidentää merkittävästi potilaan eloonjäämisaikaa 3–5 kuukaudella, mutta sillä on vakavia sivuvaikutuksia ja se liittyy läheisesti lääkeresistenssin esiintymiseen.6 Siksi on kiireellisesti kehitettävä uusia lääkkeitä tai strategioita HCC:tä varten.

Perinteistä kiinalaista lääketiedettä (TCM) yksinään tai yhdessä muiden strategioiden kanssa on käytetty HCC:n hoitoon, ja se on osoittanut kliinisiä etuja, mukaan lukien pidempi eloonjäämisaika, parantunut elämänlaatu, vähentynyt haittavaikutus ja niin edelleen.7,8Cistancheon TCM, joka sisältää fenyylietanoidiglykosideja (PhG:itä), iridoideja, ligniiniä ja polysakkarideja, jolla on erilaisia ​​biologisia toimintoja, kuten hapettumisen esto, tulehdusta, ikääntymistä estävä, muistia ja immuunijärjestelmää vahvistavia toimintoja.9 PhG:tä on pidetty Cistanchen tärkeimmät aktiiviset komponentit, ja niillä on useita toimintoja, mukaan lukien hapettumisen esto, tulehdusta, apoptoosia estävä, hepato- ja hermosuojaus.{7}} Ryhmämme oli raportoinut, ettäCistanchetubulosa fenyylietanoidiglykosidit(CTPG) voisi estää melanooma B16-F10-solujen, ruokatorven karsinooma Eca-109 -solujen ja HCC H22 -solujen kasvua ulkoisten tai sisäisten signalointireittien kautta in vitro tai in vivo; lisäksi CTPG:llä oli immunostimuloiva vaikutus.13-15

Tässä tutkimuksessa tutkimme CTPG:n kasvainten vastaista vaikutusta ja mekanismia HepG2- ja BEL-7404-soluihin in vitro, analysoimme CTPG:n immunomodulatorista toimintaa in vitro ja in vivo ja arvioimme edelleen CTPG:n terapeuttista vaikutusta yhdistettynä kemoterapiaan. sisplatiinia HCC H22 -kasvainhiirillä in vivo. Havaitsimme, että CTPG voi estää HepG2- ja BEL{4}}-solujen kasvua mitokondrioista riippuvaisen apoptoosin ja MAPK-signalointireitin kautta. CTPG esti merkittävästi HepG2-solujen migraatiota alentamalla matriksin metalloproteinaasin-2 (MMP-2) ​​ja verisuonten endoteelikasvutekijän (VEGF) tasoja. Lisäksi CTPG edisti immuunisolujen lisääntymistä ja aktivaatiota ja paransi hiirten immuniteettia. Tärkeää on, että CTPG yhdistettynä sisplatiiniin voi edelleen estää H22-solujen kasvua in vivo ja vähentää sisplatiinin sivuvaikutuksia.

Cistanche parantaa vastustuskykyä.

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet

Noin 6–8 viikon ikäiset urospuoliset BALB/c-, Kunming-hiiret ja naaraspuoliset C57BL/6-hiiret ostettiin Xinjiangin lääketieteellisen yliopiston Animal Laboratory Centeristä (Urumqi, Xinjiang, Kiina) ja sijoitettiin Xinjiangin yliopiston eläinlaitokseen huoneenlämpötilassa. (RT) 25±3 astetta ja 12/12 tunnin valo-pimeä jakso.

Solulinjat ja soluviljelmä

Hiiren H22-solut ostettiin yhtiöltä Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Kiina) ja ihmisen HCC HepG2- ja BEL{2}} -solut hankittiin Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering -laboratoriosta, Xinjiangin yliopistossa (Urumqi, Xinjiang, Kiina) ja viljelty RPMI 1640 -elatusaineessa (Gibco, USA) tai Dulbeccon modifioidussa Eagle's mediumissa (DMEM) (Gibco), joka sisältää 10 prosenttia lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (MRC, Kiina), 1 prosenttia L- glutamiinia (100 mM), 100 U/ml penisilliiniä ja 100 ug/ml streptomysiiniä 37 asteessa kostutetussa ilmakehässä, jossa on 5 % CO2.

Korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC)

CTPG:n tärkeimmät yhdisteet (Upbio Tech Co., Ltd., Shanghai, Kiina) pätevöitiin ja kvantifioitiin HPLC:llä, kuten aiemmin on raportoitu.13 Käytettiin ZORBAX SB-C18 -kolonnia (250 × 4,6 mm; 5 μm). ja liikkuva faasi koostui 0,2 % muurahaishappoliuoksesta ja metanolista gradientilla 23 % - 31 %. Yhteensä 10 µl näytettä injektoitiin ja havaittiin 330 nm:ssä. CTPG:n komponenttien analysointiin käytettiin ekinakosidi- ja akteosidistandardeja (Yuanye, Shanghai, Kiina).

ekinakosidi

Solujen elinkelpoisuuden analyysi

CTPG:n kasvaimia estävät vaikutukset HepG2- ja BEL-7404-soluihin arvioitiin käyttämällä MTT:tä (3-(4, 5-dimetyyli-2-tiatsolyyli)-2, {{7 }}difenyyli-2-H-tetratsoliumbromidi). HepG2- ja BEL{11}}-solut maljattiin 96-kuoppalevyille (5 × 104 solua/kuoppa) ja käsiteltiin 0, 200, 400 ja 600 ug/ml CTPG:tä 24 ja 48 tunnin ajan, vastaavasti, 24 tunnin inkuboinnin jälkeen 37 asteessa. Noin 35 ug/ml sisplatiinia (Yuanye) käytettiin positiivisena kontrollina. Sitten kuhunkin kuoppaan lisättiin 100 µl MTT:tä (0,5 mg/ml, laimennettuna väliaineella ilman FBS-elatusainetta) ja viljeltiin 3 tuntia 37 asteessa ja 5 prosentin CO2:ssa. Inkuboinnin jälkeen levyjä sentrifugoitiin nopeudella 1200 rpm 7 minuuttia, väliaine poistettiin ja kuhunkin kuoppaan lisättiin 200 ug/ml DMSO:ta muodostuneiden formatsaanikiteiden liuottamiseksi. OD490-arvot mitattiin 96-kuoppamikrolevylukijalla (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). CTPG:n pernasoluihin kohdistuvien vaikutusten arvioimiseksi solut eristettiin C57BL/6-hiiristä ja maljattiin 96-kuoppalevyille tiheydellä 1 × 105 solua/kuoppa. Splenosyyttejä käsiteltiin 0, 200, 400 ja 600 ug/ml 24, 48 ja 72 tunnin ajan, vastaavasti. Solujen elinkelpoisuus laskettiin seuraavalla kaavalla: Solujen elinkelpoisuus (prosentti)=(OD-käsitelty/OD-käsittelemätön) × 100 prosenttia.

Kiin havaitseminen-67

Ki{{0}}:n havaitseminen tehtiin aiemman tutkimuksemme mukaisesti.16 Lyhyesti sanottuna BEL-7404-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla (0, 200, 400 ja 600 ug/ml) CTPG:tä. tai sisplatiinia (35 ug/ml). 24 tunnin kuluttua solut kerättiin ja pestiin PBS:llä, sitten kiinnitettiin ja permeabilisoitiin Foxp3 Staining Buffer Setillä (eBioscience, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solunsisäinen värjäys suoritettiin käyttämällä FITC-konjugoitua Ki{10}}-vasta-ainetta (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Näytteet analysoitiin virtaussytometrialla (BD FACSCalibur, CA, USA).

Solujen apoptoosin ja solusyklin analyysi

HepG2- ja BEL-7404-soluja ympättiin tiheydellä 2,5 x 105 solua/malja ja inkuboitiin 37 asteessa yön yli. Solut trypsinoitiin ja kerättiin sentrifugoimalla sen jälkeen, kun niitä oli käsitelty eri pitoisuuksilla CTPG:tä tai esikäsitelty kaspaasin estäjillä (Z-VAD-FMK) tai kaspaasin -3 estäjillä (Ac-DEVD-CHO) (Beyotime, Kiina) 2 tuntia ennen CTPG-hoito. 24 tunnin kuluttua apoptoosi havaittiin virtaussytometrialla. Lyhyesti sanottuna kerätyt solut pestiin kylmällä PBS:llä (Gibco) ja suspendoitiin uudelleen anneksiinia sitovaan puskuriin, jossa oli 2,5 µl Annexin V-FITC:tä ja 5 µl PI-PE värjäysliuosta (Solarbio, Peking, Kiina), ja sitten soluja inkuboitiin huoneenlämpötilassa. pimeässä 15 minuuttia. Solusyklin jakautumisen analysointia varten solut kerättiin talteen CTPG-käsittelyn jälkeen ja kiinnitettiin kylmässä 70-prosenttisessa etanolissa 4 asteessa 30 minuutin ajan. Solut värjättiin PI:llä (BD Biosciences) pimeässä 30 minuuttia. Näytteet analysoitiin virtaussytometrillä (BD FACSCalibur). Soluapoptoosin ja sykliin liittyvien proteiinien ilmentymistasot havaittiin Western blot -menetelmällä.

Western Blot

Western blot tehtiin edellisen tutkimuksemme mukaisesti.17HCC:tä käsiteltiin CTPG:llä 24 tunnin ajan. Pesun jälkeen jääkylmällä PBS:llä kahdesti, kaikki kiinnittyneet ja kelluvat solut kerättiin ja lyysattiin RIPA-lyysipuskurissa (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) 2 0 minuuttia jäillä. Kun oli sentrifugoitu 12 000 rpm 4 astetta 10 minuuttia, proteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä Bicinchoninic Acid Assay Kit -sarjaa (Thermo Fisher Scientific, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sama proteiinikonsentraatio erotettiin 12-prosenttisella SDS-PAGE:lla ja siirrettiin PVDF-kalvoille. PBST-puskurilla (PBS, jossa on 0,05 prosenttia Tween{11}}) pesun jälkeen kalvot suojattiin 5-prosenttisella rasvattomalla maidolla 37 asteessa 1 tunnin ajan ja inkuboitiin sitten primääristen vasta-aineiden kanssa (Cell Signaling Technology, MA, USA). oikeilla laimennuksilla yön yli 4 asteessa. Kolmen PBST:llä pesun jälkeen kalvoa inkuboitiin vastaavien HRP-konjugoitujen sekundaaristen vasta-aineiden (eBioscience) kanssa 2 tuntia 37 asteessa. Kohdeproteiinit havaittiin käyttämällä ECL-määrityspakkausta (Beyotime). Harmaasävyskannaustiedot saatiin Image J:llä.

Mitokondrioiden kalvopotentiaalin (Δψm) analyysi

Δψm määritettiin kalvoa läpäisevällä JC-1-väriaineella (Beyotime). Lyhyesti sanottuna HepG2- ja BEL-7404-soluja käsiteltiin eri konsentraatioilla CTPG:tä (0, 200, 400 ja 600 ug/ml) 24 tunnin ajan. Kaikki solut kerättiin ja pestiin JC-1 pesupuskurilla. Solut värjättiin JC-1-fluoresoivalla koettimella valmistajan ohjeiden mukaisesti 20 minuuttia huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen kahdesti PBS:llä, kaikki näytteet analysoitiin virtaussytometrialla (BD FACSCalibur).

Hoechst 33342 värjäys

Hoechst 33342 -värjäys tehtiin aikaisemman tutkimuksemme mukaisesti.16 Tumien morfologisia muutoksia tutkittiin käyttämällä kalvoa läpäisevää DNA:ta sitovaa väriainetta Hoechst 33342 (Beyotime). Lyhyesti sanottuna solut ympättiin 6-kuoppalevylle pitoisuudella 1 x 105 solua/kuoppa 2 ml:ssa elatusainetta. Kun 70 prosentista 80 prosenttiin konfluenssi saavutettiin, soluja käsiteltiin 200, 400 ja 600 ug/ml CTPG:tä tai sisplatiinia 24 tunnin ajan. Solut pestiin PBS:llä ja kiinnitettiin 4 % jääkylmällä paraformaldehydillä 4 asteessa 10 minuutin ajan. PBS:llä pesun jälkeen solut värjättiin Hoechst 33342:lla 4 asteessa 10 minuutin ajan. Näytteet tarkkailtiin käänteisellä fluoresenssimikroskoopilla (Nikon Eclipse Ti-E, Japani).

cistanche-uute

Migration Assay

HCC-solujen migraatio havaittiin haavan paranemismäärityksellä. Lyhyesti sanottuna HepG2-solut (2 x 104/kuoppa) kylvettiin 24-kuoppalevylle. Kun oli saavutettu 80 prosentin yhtymäkohta, kunkin kuopan keskustaa raaputettiin kerran 20 µl:n pipetin kärjellä. PBS:llä pesun jälkeen soluja käsiteltiin sisplatiinilla (35 ug/ml) tai eri pitoisuuksilla (0, 200, 400 ja 600 ug/ml) CTPG:tä 37 asteessa. 24 tunnin kuluttua kustakin näytteestä otettiin kuvat mikroskoopilla (Nikon Eclipse Ti-E). Solujen vaeltamisen keskimääräiset etäisyydet analysoitiin kuvalla J. Haavojen paranemisprosentti laskettiin yhtälöllä: haavan paraneminen ( prosenttia )=(1-naarmuuntumisalue ilmoitetulla aikapisteellä/naarmuuntumisalue 0 tunnin kohdalla) × 100 prosenttia. Solujen migraatioon liittyvien proteiinien MMP-2 ja VEGF ilmentymistasot havaittiin Western blot -menetelmällä.

Splenosyyttien lisääntyminen ja apoptoosi

Proliferaatioanalyysiä varten splenosyytit eristettiin 3 C57BL/6-hiirestä ja värjättiin CFSE:llä (eBioscience). CFSE-leimattuja soluja siirrostettiin 24-kuoppalevyille tiheydellä 2 × 106 solua 1 ml:ssa elatusainetta per kuoppa ja käsiteltiin eri konsentraatioilla CTPG:tä (200, 400 ja 600 ug/ml) tai yhdistettiin 35 ug:n kanssa. /ml sisplatiinia 72 tunnin ajan. Virtaussytometrianalyysi suoritettiin CD3-APC:llä ja CD19-PE:llä (BD Biosciences) värjäyksen jälkeen. Apoptoosianalyysiä varten pernasolut ympättiin 24-kuoppalevyille tiheydellä 2 × 106 solua 1 ml:ssa elatusainetta kuoppaa kohti ja käsiteltiin eri konsentraatioilla CTPG:tä (200, 400 ja 600 ug/ml) tai yhdistettiin sisplatiinia 24 tunnin ajan. Virtaussytometrianalyysi suoritettiin värjäyksen jälkeen 2,5 µl:lla Annexin V-FITC:llä ja 5 µl:lla PI-PE-liuosta.

CTPG:n turvallisuusarviointi ja immunostimuloivat toimet in vivo

CTPG:n in vivo immunostimulatoristen aktiivisuuksien arvioimiseksi 6 - 8 viikon ikäiset Kunming-uroshiiret jaettiin satunnaisesti 7 ryhmään (5 hiirtä/ryhmä). Ihonalainen injektio (sc, 200, 400 mg/kg), intraperitoneaalinen injektio (ip, 200, 400 mg/kg) ja mahalaukunsisäinen anto (ig, 200, 400 mg/kg) annettiin joka toinen päivä, yhteensä 7 kertaa , kun taas kontrolliryhmä ei saanut mitään hoitoa. Hiiret ovat punnittu joka toinen päivä ja hiirten tilaa tarkkailtiin joka päivä. CTPG-käsittelyn jälkeen hiirten elimet erotettiin ja punnittiin. Elinindeksit laskettiin kaavan mukaan: elinindeksi=elimen paino (mg) / ruumiinpaino (g). Splenosyytit kerättiin, laskettiin ja värjättiin anti-CD3-APC:llä, anti-CD19-PE:llä, anti-CD49b FITC:llä tai anti-CD4-APC:llä, anti-CD{{ 22}}PE, anti-CD8-FITC (BD Biosciences). Näytteet havaittiin virtaussytometrialla (BD FACSCalibur).

CTPG:n kasvainten vastainen teho yhdistettynä sisplatiiniin H22-kasvainta kantavissa hiirissä Noin 6-8 viikon ikäisiin urospuolisiin BALB/c-hiiriin injektoitiin ihon alle H22-soluja (10 × 106 per hiiri 100 µl:ssa PBS:ää). Kun kasvaimen tilavuudet saavuttivat noin 60 mm3, kasvaimia kantavat hiiret jaettiin satunnaisesti 4 ryhmään (6 hiirtä/ryhmä) ja niitä hoidettiin sisplatiinilla (4 mg/kg), CTPG:llä (400 mg/kg), sisplatiinilla (4 mg/kg) ja CTPG:llä ( 400 mg/kg) tai ilman käsittelyä (kontrolliryhmä). Kasvainhiiriin injektoitiin intraperitoneaalisesti CTPG:tä 5., 7., 9., 11. ja 13. päivänä, vastaavasti. Sisplatiinia annettiin suonensisäisesti 7. ja 11. päivänä. Kasvaimen tilavuus ja ruumiinpaino mitattiin joka toinen päivä. Kasvaimen tilavuus laskettiin seuraavasti: Kasvaimen tilavuus (V)=a × b2/2, jossa a ja b edustavat kasvaimen pisintä ja lyhintä halkaisijaa mitattuna vernier-satulalla, vastaavasti. 20. päivänä elimet ja kasvaimet eristettiin ja punnittiin. Pernasolut kerättiin, laskettiin ja värjättiin anti-CD3-APC:llä ja anti-CD19-PE:llä tai anti-CD4-FITC:llä ja anti-CD8-APC:llä tai anti-CD11b-PE ja anti-Gr-1-APC tai anti-CD4-FITC, anti-CD25-APC ja anti-Foxp3-PE (BD Biosciences) . Sen jälkeen solujen tiheydet ja lukumäärät analysoitiin virtaussytometrillä (BD FACSCalibur).

Cistanche tehostaa kasvainten vastaista vaikutusta ja parantaa immuniteettia.

Saat lisätietoja napsauttamalla kuvaa.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot ilmaistiin keskiarvona ± keskiarvon standardivirhe (SEM). Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä yksi/kaksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA) käyttäen Prism5.{2}} -ohjelmistoa. P<.05 was="" considered="" statistically="">

KLIKKAA TÄSTÄ OSAAN 2