Parikalsitoli parantaa hypoksian ja TGF{1}}-indusoituja vaurioita munuaisten perisyyteissä

Ottaa yhteyttä:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Jeong-Hoon Lim, Ju-min York, Se-Hyun Oh, Soo-Jee Jeon, Hee-Won Noh, Hee-Yeon Jung, Ji-Young Choi, Jang-Hee Cho, Chan-Duck Kim, Yong-Lim Kim, ja Sun-Hee Park *

Sisätautien osasto, lääketieteellinen tiedekunta, Kyungpook National University, Kyungpook National University Hospital, Daegu 41944, Korea; jh-lim@knu.ac.kr (J.-HL); jumin18@naver.com (J.-MY);

ttily@nate.com (S.-HO); hot716@naver.com (S.-JJ); hwn1104@gmail.com (HWN); hy-jung@knu.ac.kr (H.-YJ); jyss1002@hanmail.net (J.-YC); jh-cho@knu.ac.kr (J.-HC); drcdkim@mail.knu.ac.kr (C.-DK); ylkim@knu.ac.kr (Y.-LK)

* Kirjeenvaihto: sh-park@knu.ac.kr; Puh.: plus 82-53-200-5547; Faksi: plus 82-53-426-9464

Tiivistelmä: Viime aikoina on tutkittu munuaisperisyyttien roolia munuaisfibroosissa. Tämän tutkimuksen tarkoituksena on arvioida parikalsitolin vaikutusta hypoksian ja TGF- 1--indusoituun vaurioon munuaisperisyyteissä. Primaariviljeltyjä perisyyttejä esikäsiteltiin parikalsitolilla (20 ng/ml) 90 minuuttia ennen vaurion aiheuttamista, ja sitten ne altistettiin TGF- 1(5 ng/ml) tai hypoksialle (1 prosentti O2 ja 5 % CO2). .TGF- 1 lisäsi -SMA:ta ja muita fibroosimarkkereita, mutta vähensi PDGFR:n ilmentymistä perisyyteissä, kun taas parikalsitoli kumosi muutokset. Parikalsitoli esti TGF{12}}-indusoitua perisyyttien solumigraatiota. Hypoksia lisäsi TGF- 1-, -SMA- ja muita fibroosimarkkereita, mutta vähensi PDGFR:n ilmentymistä perisyytissä, kun taas parikalsitoli käänsi ne. Hypoksia aktivoi HF-1o- ja alavirran molekyylejä, mukaan lukien prolyylihydroksylaasi 3:n ja glukoosinkuljettajan-1, kun taas parikalsitoli heikensi HIF-1 -riippuvaisten molekyylien ja TGF- 1/Smadin aktivaatiota. signalointireitit hypoksisissa perisyyteissä. HIF-1a:n geenin vaimentaminen hävisi hypoksian aiheuttaman TGF- 1-, -SMA-ylössäätelyn ja PDGFR:n alasäätelyn. Parikalsitolin vaikutus HIF-1 -riippuvaisiin fibroosimarkkereiden muutoksiin ei ollut merkittävä HIF-1-geenin vaimentamisen jälkeen. Lisäksi hypoksia pahensi perisyyttien oksidatiivista stressiä, kun taas parikalsitoli käänsi oksidatiivisen stressin lisäämällä antioksidanttientsyymejä HIF-1 -riippumattomalla tavalla. Yhteenvetona voidaan todeta, että parikalsitoli paransi perisyytin fenotyyppimuutoksia myofibroblastiksi TGF- 1--stimuloiduissa perisyyteissä. Lisäksi parikalsitoli paransi fibroosimarkkerien ilmentymistä hypoksialle altistuneissa perisyyteissä sekä HIF-1 -riippuvaisella että riippumattomalla tavalla.

Avainsanat: hypoksia; parikalsitoli; perisyytti; perisyytti-myofibroblast-siirtymä; TGF- 1; D-vitamiiniagonisti

cistanche-kokemus on erittäin hyvä munuaisten toiminnalle

1. Esittely

Munuaisten interstitiaalinen fibroosion yleinen patologinen seuraus erilaisista munuaisvaurioista, ja transformoiva kasvutekijä (TGF)- 1 on tärkein munuaisfibroosin aiheuttaja. Hypoksian tiedetään liittyvän myös munuaisten toiminnan asteittaiseen menettämiseen samalla kun se vaikuttaa eri solupopulaatioihin munuaisissa. Erilaiset humoraaliset tekijät vaurioituneista tubulaarisista epiteelisoluista ja tunkeutuvista tulehdussoluista laukaisevat interstitiaalisten solujen, kuten perisyyttien, transformaation myofibroblasteiksi. Geneettinen sukulinjan jäljitystekniikka on osoittanut, että perisyytit ovat myofibroblastien alkuperä munuaisfibroosissa [1]. Progressiivinen tubulointerstitiaalinen fibroosi aiheuttaa munuaisten hypoksiaa, mikä pahentaa fibroosia muodostaen siten noidankehän [2]. Hypoksialle altistuneet solut säätelevät hypoksian aiheuttamaa tekijää (HIF)-1a, joka on tärkein transkriptiotekijä, jota tarvitaan sopeutumaan hypoksisiin olosuhteisiin säätelemällä hapen homeostaasia ja solujen aineenvaihduntaa. HIF-1:lla tiedetään olevan erilaisia ​​rooleja eri munuaissoluissa [3]. HIF-1 liittyy kroonisen munuaissairauden (CKD) etenemiseen ja munuaisfibroosiin aktivoimalla TGF- 1--riippuvaista reittiä ja välittämällä epiteelistä mesenkymaaliseen siirtymistä [4].

Perisyyteillä, jotka ovat haarautuneita mesenkymaalisia soluja, jotka ympäröivät endoteelisoluja kapillaarikerroksessa ja postkapillaarisissa laskimoissa, ovat hemostaattisia toimintoja angiogeneesiprosessin aikana ja ne osallistuvat vasomotorisen sävyn säätelyyn. Lisäksi perisyyteillä on keskeinen rooli verisuonitautien tai fibrogeenisten sairauksien alkamis- ja etenemisprosessissa. Kertyvä näyttö on paljastanut munuaisten perisyyttien toiminnan, kuten munuaisten verenkierron säätelyn, mikroverisuonien stabiilisuuden ja endoteelin eloonjäämisen, ja niillä on olennainen rooli munuaisvaurioissa (esim. akuutti munuaisvaurio [AKI] ja CKD) [2,5, 6].

Aiempi tutkimus, joka osoitti, että tulehdusärsyke indusoi CYP2R1:n (D-vitamiini 25-hydroksylaasi) ja D-vitamiinireseptorien (VDR) ilmentymistä aivojen perisyyteissä [7], johti meidät hypoteesiin, että VDR-aktivaattorit voivat liittyä perisyyttivaurio munuaisissa.

Siksi tämän tutkimuksen tavoitteena on arvioida parikalsitolin vaikutuksia hypoksian ja TGF{1}}indusoituihin vaurioihinmunuaisten perisyytit.

2. Tulokset

2.1. Parikalsitolin suojaavat vaikutukset TGF- 1--indusoituun perisyyttien ja myofibroblastien väliseen siirtymiseen

TGF{0}}-stimulaatio lisäsi profibroottisten markkerien, kuten alfa-sileän lihasaktiinin (-SMA), fibronektiinin, vimentiinin ja matriisin metalloproteinaasin-9 (MMP{4}}) mRNA-ilmentymistä annoksesta riippuvaisella tavalla (lisäkuva S1). Parikalsitolin vaikutuksen arvioimiseksi TGF- 1--indusoituun perisyyttien fibroosiin suoritettiin TGF- 1-altistus parikalsitoliesikäsittelyn jälkeen. Mesenkymaaliset markkerit mitattiin käyttämällä reaaliaikaista PCR:ää; -SMA:n, fibronektiinin ja vimentiinin mRNA:n ilmentymät lisääntyivät merkittävästi TGF- 1-stimulaation jälkeen (kaikki p < 0.{{20}}5)="" (kuvio="" 1a–c).="" parikalsitolihoito="" heikensi="" mesenkymaalisten="" markkerien,="" kuten="" -sma-,="" fibronektiinin="" ja="" vimentiinin="" ilmentymien,="" lisääntymistä="" (kaikki="" p="">< 0.05).="" myös="" ekstrasellulaarisen="" matriisin="" (ecm)="" hajoamiseen="" osallistuvan="" mmp-9:n="" mrna-ilmentyminen="" lisääntyi,="" kun="" taas="" parikalsitolihoito="" vähensi="" mmp-9-ilmentymistä="" (p="">< 0,05)="" (kuva="" 1d).="" ).="" perisyyttimarkkerina="" verihiutaleperäisen="" kasvutekijäreseptorin="" beetan="" (pdgfr)="" mrna:n="" taso="" laski="" tgf-="" 1-stimulaation="" jälkeen,="" ja="" parikalsitoli="" lisäsi="" pdgfr-ilmentymistä="" sekä="" kontrolli-="" että="" tgf{25}}-altistuneisiin="" ryhmiin="" (molemmat).="" p="">< 0,05)="" (kuvio="" 1e).="" -sma:n="" proteiiniekspressio="" lisääntyi="" ja="" pdgfr="" väheni="" tgf-="" 1-stimulaation="" jälkeen="" (molemmat="" p="">< 0,05)="" (kuvio="" 1f,="" 1g),="" kun="" taas="" parikalsitolihoito="" kumosi="" sekä="" -sma-="" että="" pdgfr-proteiinitasojen="" muutokset="" (molemmat="" p="">< 0,05).="" nämä="" tulokset="" viittaavat="" siihen,="" että="" tgf-="" 1-altistus="" aiheuttaa="" perisyytti-myofibroblasti-siirtymän="" (pmt)="" ja="" että="">

parantaa PMT:tä.

2.2. Parikalsitoli heikensi Smad2-fosforylaatiota TGF- 1--indusoidussa fibroosissa perisyyteissä

Tutkimme parikalsitolihoidon vaikutusmekanismia Smad-riippuvaiseen reittiin TGF- 1--indusoidussa PMT:ssä. Smad2- ja Smad3-reittien proteiiniekspressiot mitattiin Western blot -analyysillä (kuvio 2). p-Smad2:n taso ja p-Smad2:n suhde Smad2:een nousivat merkittävästi TGF{{10}}-altistuksen jälkeen, ja tämä nousu helpotti parikalsitolihoidon jälkeen (kuvio 2B). Myös p-Smad3:n taso ja p-Smad3:n suhde Smad3:een nousivat TGF- 1-altistuksen jälkeen (molemmat p < 0.05),="" mutta="" parikalsitolihoito="" ei="" muuttanut="" p-tasoja="" -smad3="" ja="" p-smad3:n="" suhde="" smad3:een="" (molemmat="" p=""> 0,05) (kuvio 2C).

2.3. Parikalsitoli alensi TGF- 1--indusoitua perisyyttien migraatiota

Selvittääksemme, indusoiko TGF- 1 perisyyttien migraatiota ja arvioidaksemme parikalsitolin roolia migraatiossa, tutkimme perisyyttien migraatiota TGF- 1-stimulaation jälkeen parikalsitolihoidon kanssa tai ilman sitä. TGF- 1 kiihdytti merkittävästi haavan sulkeutumista verrattuna kontrolliperisyytteihin raaputussolumigraatiomäärityksessä, kun taas TGF- 1:n ja parikalsitolin yhteiskäsittely viivästytti perisyyttien naarmuhaavan sulkeutumista (kuvat 3A–C).

Kuva 1. Parikalsitolin vaikutus TGF- 1--indusoituun fibroosiin. (A–C) TGF- 1 lisäsi profibroottisten mesenkymaalisten markkerien, -SMA:n, fibronektiinin ja vimentiinin, mRNA:n ilmentymistä ja parikalsitoli vähensi fibroottisia markkereita perisyyteissä. (D) MMP-9-mRNA:n ilmentyminen lisääntyi TGF- 1-stimulaation jälkeen, ja parikalsitoli heikensi MMP-9-ilmentymistä. (E) PDGFR-mRNA:n (perisyyttimarkkerin) ilmentyminen väheni TGF- 1-hoidon jälkeen, ja parikalsitoli lisäsi PDGFR-ilmentymistä. (F,G) -SMA:n proteiiniekspressio väheni ja PDGFR lisääntyi TGF- 1-stimulaation jälkeen. Parikalsitolihoito kumosi -SMA- ja PDGFR-proteiinitasojen muutokset. Tiedot esitetään keskivirheinä. n=4 jokaista ryhmää kohti. * p < 0.05="" vs.="" kontrolli;="" **="" p="">< 0.01="" vs.="" kontrolli;="" ***="" p="">< 0.001="" vs.="" kontrolli;="" #="" p="">< 0,05="" vs.="" tgf-="" 1="" -hoitoryhmä;="" ##="" p="">< 0,01="" vs.="" tgf-="" 1="" -hoitoryhmä.="" lyhenteet:="" -sma,="" alfa-sileälihasaktiini;="" mmp-9,="" matriisin="" metalloproteinaasi-9;="" pdgfr,="" verihiutaleperäinen="" kasvutekijäreseptori="">

Kuva 2. Smad2:n ja Smad3:n ilmentyminen TGF- 1--altistuissa perisyyteissä. (A,B) TGF- 1 nosti merkittävästi sekä p-Smad2-tasoa että p-Smad2:n suhdetta Smad2:een perisyyteissä, ja ne vähenivät parikalsitolihoidon jälkeen. (A,C) Lisäksi TGF{{10}} nosti merkittävästi sekä p-Smad3-tasoa että p-Smad3:n suhdetta Smad3:een, eivätkä ne muuttuneet parikalsitolihoidon jälkeen. Tiedot esitetään keskivirheinä. n=4 jokaista ryhmää kohti. * p < 0.05="" vs.="" kontrolli;="" **="" p="">< 0.01="" vs.="" kontrolli;="" ***="" p="">< 0,001="" vs.="" kontrolli;="" #="" p="">< 0,05="" vs.="" tgf-="" 1="" hoitoryhmä.="">

C, kontrolliryhmä; P, parikalsitolikäsittelyryhmä; T, TGF- 1 -hoitoryhmä; T plus P, TGF- 1 ja parikalsitolihoitoryhmä.

Kuva 3. Parikalsitolin vaikutus TGF- 1--indusoituun migraatioon perisyyteissä scratch- ja transwell-solumigraatiomäärityksissä. (A) Kevyet mikrokuvat naarmuuntuneiden solujen yksikerroksisista kerroksista otettiin 0, 24 ja 48 tunnin kohdalla TGF- 1:lla ja/tai parikalsitolilla. (B) Suhteellinen raaputussolujen migraatio mitattiin ajan myötä käyttämällä Incucyte live -kuvausalustaa 4 tunnin välein aina 48 tuntiin asti raaputussolujen migraation jälkeen. (C) Suhteellinen raaputussolujen migraatio 48 tunnin kohdalla. n=4 jokaista ryhmää kohti. (D) Edustavat mikroskooppiset kuvat perisyyteistä, jotka olivat vaeltaneet (värjätty {{10}},1 prosentin kristallivioletilla; alkuperäinen suurennus, ×100). (E) Suhteellinen migraatio määritettiin vertaamalla siirtyneiden perisyyttien määrää, ja ne laskettiin 10 satunnaisesti valitussa kentässä kussakin ryhmässä. n=4 ryhmää kohden. Tiedot esitetään keskivirheinä. ** p < 0,01="" vs.="" kontrolli;="" ***="" p="">< 0,001="" vs.="" kontrolli;="" ##="" p="">< 0,01="" vs.="" tgf-="" 1="" -hoitoryhmä;="" ###="" p="">< 0,001="" vs.="" tgf-="" 1="">

Lisäksi suoritettiin transwell-migraatiomääritys parikalsitolin vaikutuksen perisyyttien kulkeutumiseen kalvon läpi vahvistamiseksi. TGF- 1 lisäsi merkittävästi perisyyttien liikkuvuutta, kun taas parikalsitolihoito vähensi TGF- 1--indusoitua migraation lisääntymistä (kuva 3D, E). Kaiken kaikkiaan parikalsitolihoito paransi perisyyttien migraatiomuutoksia TGF- 1-altistuksen jälkeen.

2.4. Parikalsitolin suojaava vaikutus hypoksian aiheuttamaan fibroosiin perisyyteissä

Seuraavaksi tutkimme perisyytti- ja fibroosiin liittyvien merkkiaineiden muutoksia hypoksialle altistuneissa perisyyteissä. Sekä TGF- 1-geenin ilmentyminen että proteiinitasot lisääntyivät merkittävästi hypoksisissa olosuhteissa verrattuna normaaleihin olosuhteisiin (molemmat p < 0.05)="" (kuvio="" 4a,g).="" parikalsitolihoito="" hypoksialle="" altistuneissa="" perisyyteissä="" käänsi="" sekä="" lisääntynyt="" tgf-="" 1-geeni-="" että="" proteiinitasot="" verrattuna="" parikalsitolihoitoon="" (molemmat="" p="">< 0.05).="" mesenkymaaliset="" markkerit,="" kuten="" -sma,="" fibronektiini="" ja="" vimentiini="" sekä="" mmp-9="" osoittivat="" lisääntynyttä="" mrna:n="" ilmentymistä="" hypoksisissa="" perisyyteissä="" (kaikki="" p="">< 0.05),="" kun="" taas="" parikalsitolihoito="" kääntyi="" päinvastaiseksi.="" lisääntynyt="" -sma:n,="" fibronektiinin,="" vimentiinin="" ja="" mmp{16}}="" mrna:n="" ilmentyminen="" (kaikki="" p="">< 0,05)="" (kuvio="" 4b–e).="" parikalsitolikäsittely="" käänsi="" myös="" -sma:n="" proteiiniekspression="" hypoksisissa="" perisyyteissä="" (p="">< 0,05)="" (kuvio="" 4h).="" pdgfr:n="" mrna-="" ja="" proteiiniekspressiot="" vähenivät="" hypoksialle="" altistetuissa="" perisyyteissä,="" ja="" parikalsitoli="" käänsi="" pdgfr:n="" mrna-="" ja="" proteiiniekspressiot="" sekä="" kontrolli-="" että="" hypoksisiin="" perisyytteihin="" verrattuna="" (kaikki="" p="">< 0,05)="" (kuvio="" 4f,="" i).="" nämä="" tulokset="" osoittivat,="" että="" hypoksia="" indusoi="" pmt:tä,="" joka="" liittyy="" tgf-="" 1:n="" nousuun,="" kun="" taas="" parikalsitoli="" heikentää="" hypoksian="" aiheuttamaa="">

Kuva 4. Parikalsitolin vaikutus TGF- 1- ja fibroosimarkkereihin hypoksisissa perisyyteissä. (A) Hypoksia lisäsi TGF- 1 mRNA:n ilmentymistä, kun taas parikalsitolihoito alensi TGF- 1 mRNA-tasoa. (B–D) Hypoksia lisäsi profibroottisten mesenkymaalisten markkerien, -SMA:n, fibronektiinin ja vimentiinin, mRNA-ilmentymiä, kun taas parikalsitoli vähensi fibroottisia markkereita perisyyteissä. (E) MMP-9-mRNA:n ilmentyminen lisääntyi hypoksisessa tilassa, ja parikalsitoli heikensi MMP-9-ilmentymistä. (F) Hypoksia vähensi PDGFR:n mRNA-ilmentymistä normoksiseen kontrolliin verrattuna, kun taas parikalsitoli lisäsi PDGFR:n ilmentymistä verrattuna hypoksiseen perisyyttiin. (G) Hypoksia lisäsi TGF- 1-proteiinitasoa, kun taas parikalsitolihoito laski TGF- 1-proteiinitasoa. (H, I) Parikalsitolikäsittely käänsi -SMA:n proteiiniekspression hypoksisissa perisyyteissä. PDGFR-proteiinitaso laski hypoksialle altistuneissa perisyyteissä, ja parikalsitoli myös käänsi PDGFR-proteiinin ilmentymisen. Tiedot esitetään keskivirheinä. n=4 ryhmää kohden. * p < 0.05="" vs.="" normoksiakontrolli;="" ***="" p="">< 0.001="" vs.="" normoksiakontrolli;="" #="" p="">< 0,05="" vs.="" hypoksiaryhmä;="" ##="" p="">< 0,01="" vs.="" hypoksiaryhmä.="" lyhenteet:="" -sma,="" alfa-sileälihasaktiini;="" mmp-9,="" matriisin="" metalloproteinaasi-9;="" pdgfr,="" verihiutaleperäinen="" kasvutekijäreseptori="">

2.5. Parikalsitoli heikensi Smad2-fosforylaatiota hypoksialle altistuneissa perisyyteissä

Tutkimme Smad-signalointireitin säätelyä perisyyteissä hypoksian aikana Western blot -analyysin avulla. p-Smad2:n ilmentyminen ja p-Smad2:n ja Smad2:n suhde lisääntyivät merkittävästi hypoksialle altistuneissa perisyyteissä, kun taas parikalsitoli käänsi Smad2-reitin ylössäätelyn hypoksialle altistuneissa perisyyteissä (molemmat p < 0).="" 11}}5)="" (kuva="" 5a,="" b).="" parikalsitoli="" ei="" kuitenkaan="" muuttanut="" ylössäädeltyä="" smad3-signalointireittiä="" hypoksisissa="" olosuhteissa="" (p=""> 0,05) (kuvio 5A, C).

Kuva 5. Smad2:n ja Smad3:n ilmentyminen hypoksisissa perisyyteissä. (A,B) Altistuminen hypoksialle nosti merkittävästi sekä p-Smad2-tasoa että p-Smad2:n suhdetta Smad2:een perisyyteissä, ja ne vähenivät parikalsitolihoidon jälkeen. (A, C) Hypoksia ei muuttanut sekä p-Smad3-tasoa että p-Smad3:n suhdetta Smad3:een, eivätkä ne vähentyneet parikalsitolihoidon jälkeen. Tiedot esitetään keskivirheinä. n=4 ryhmää kohden. * p < 0.05="" vs.="" kontrolli;="" #="" p="">< 0,05="" vs.="" hypoksiaryhmä.="" lyhenteet:="" nc,="" normoksiakontrolliryhmä;="" n="" plus="" p,="" normoksia="" ja="" parikalsitolihoitoryhmä;="" h,="" hypoksiaryhmä;="" h="" plus="" p,="" hypoksia="" ja="">

2.6. Parikalsitolin heikentämä hypoksian aiheuttama perisyyttivamma HIF-1a-riippuvaisella tavalla

Hypoksia aiheutti HIF-1-geenin ilmentymisen voimistumisen normoksisiin perisyytteihin verrattuna, ja parikalsitolihoito heikensi HIF-1-ilmentymistä (p < 0.05)="" (kuva)="" 6a).="" hif-1="" -riippuvaiset="" geeniekspressiot,="" kuten="" prolyylihydroksylaasi="" 3="" (phd3)="" ja="" glukoosin="" kuljettaja-1="" (glut-1),="" lisääntyivät="" myös="" hypoksisissa="" olosuhteissa,="" mutta="" vähenivät="" parikalsitolihoidon="" jälkeen="" (molemmat="" p="">< 0,05)="" (kuvio="" 6b,="" c).="" nämä="" tulokset="" osoittivat,="" että="" parikalsitoli="" heikentää="" hif-1="" -riippuvaisen="" reitin="" aktivaatiota="" hypoksian="">

Kuva 6. Parikalsitolin vaikutus hypoksian aiheuttamaan HIF-1-aktivaatioon ja HIF-1-geenin hiljentämisen jälkeen. (A–C) Parikalsitoli heikensi hypoksian aiheuttamaa HIF-1- ja HIF-1 --riippuvaista geeniä (PHD3 ja GLUT-1). (D) Perisyyttien transfektio HIF-1 siRNA:lla (5{{20}} uM, 6 h) esti merkittävästi HIF-1-ilmentymistä verrattuna kontrolli- ja ei-kohde-siRNA-ryhmiin. . (E–G) Parikalsitolin vaikutukset TGF- 1-, PHD3- ja GLUT--1-arvoihin vähenivät HIF-1-geenin hiljentämisen jälkeen. (H, I) Parikalsitolin vaikutukset -SMA:han ja PDGFR:ään vähenivät HIF-1 -geenin vaimentamisen jälkeen. Tiedot esitetään keskivirheinä. n=4 ryhmää kohden. ** p < 0.01="" vs.="" normoksiakontrolli;="" ***="" p="">< 0.{{30}}01="" vs.="" normoksiakontrolli;="" #="" p="">< 0,05="" vs.="" hypoksiaryhmä;="" ##="" p="">< 0,01="" vs.="" hypoksiaryhmä;="" ###="" p="">< 0,001="" vs.="" hypoksiaryhmä;="" ja="" &="" p="">< 0,001="" vs.="" ei-kohde-sirna-normoksiaryhmä;="" §="" p="">< 0,05="" vs.="" non-target="" sirna="" hypoksiakontrolli;="" †="" p="">< 0,05="" vs.="" sihif-1="" hypoksiaryhmä.="" lyhenteet:="" hif,="" hypoksian="" aiheuttava="" tekijä;="" phd3,="" prolyylihydroksylaasi="" 3;="" glut-1,="" glukoosin="" kuljettaja-1;="" sirna,="" pieni="" häiritsevä="" rna;="" h,="" hypoksia;="" -sma,="" alfa-sileän="" lihaksen="" aktiini;="" pdgfr,="" verihiutaleperäinen="" kasvutekijäreseptori="">

Tutkiaksemme HIF-1:n roolia perisyyttien hypoksisessa vauriossa ja parikalsitolin aktiivisessa kohdassa arvioimme HIF-1:n geenin vaimentamisen vaikutusta käyttämällä pieniä häiritseviä (si)RNA:ita. Kuvio 6D esittää HIF-1:n tehokkaan eston HIF-1 siRNA:lla. TGF- 1 ei noussut HIF-1:n geenin hiljentämisellä hypoksialle altistuneissa perisyyteissä, eikä parikalsitolihoito merkittävästi laskenut TGF- 1-tasoja HIF{{:n geenin vaimentamisen jälkeen. 9}} (kuva 6G). Hypoksisissa olosuhteissa HIF-1 -riippuvaiset geeniekspressiot, kuten PHD3 ja GLUT-1, eivät myöskään lisääntyneet HIF-1 geenin vaimentamisen jälkeen. Parikalsitolikäsittely vähensi edelleen PHD3:n mRNA-ilmentymistä (kuvio 6E), mutta ei muuttanut GLUT-1:n mRNA-ilmentymistä (kuvio 6F). -SMA:n ja PDGFR:n mRNA:n ilmentyminen ei myöskään muuttunut merkittävästi parikalsitolikäsittelyllä HIF-1 siRNA:lla käsittelyn jälkeen hypoksisissa perisyyteissä (kuvio 6H, I).

2.7. Parikalsitoli heikensi hypoksian aiheuttamaa oksidatiivista stressiä HIF-1a-riippumattomalla tavalla

Kuvio 7 esittää parikalsitolin vaikutuksen oksidatiiviseen stressivaurioon hypoksialle alttiina olevissa perisyyteissä. Mittasimme antioksidanttientsyymien, mukaan lukien superoksididismutaasit (SOD:t), katalaasin ja glutationiperoksidaasin, muutoksia hypoksisissa perisyyteissä HIF-1-geenin vaimentamisen kanssa ja ilman. Hypoksialle altistuneissa perisyyteissä antioksidanttientsyymitasot (SOD1, SOD2, katalaasi ja glutationiperoksidaasi) laskivat, mutta ne nousivat parikalsitolihoidon jälkeen (kuva 7A–D). Perisyyttien HIF- 1:n geenin hiljentämisen jälkeen parikalsitolihoito lisäsi antioksidanttientsyymien (SOD1, SOD2, katalaasi ja glutationiperoksidaasi) ilmentymistä hypoksisissa olosuhteissa (kaikki p < 0.05)="" (kuva="" 7e–h).="" lisäksi="" tulokset="" osoittivat,="" että="" parikalsitolilla="" voi="" olla="" myös="" antioksidanttisia="" vaikutuksia="" hypoksisissa="" perisyyteissä,="" ja="" nämä="" vaikutukset="" ovat="" riippumattomia="" hif-1:n="">

Kuva 7. Parikalsitolin vaikutus antioksidanttisiin entsyymeihin hypoksisissa perisyyteissä joko HIF-1-geenin vaimentamisen kanssa tai ilman sitä. (A–D) Oksidatiiviseen stressiin liittyvät antioksidanttientsyymit (SOD1, SOD2, katalaasi ja glutationiperoksidaasi) vähenivät merkittävästi hypoksisissa perisyyteissä, kun taas antioksidanttientsyymit lisääntyivät parikalsitolihoidon jälkeen. (E-H) Antioksidanttientsyymit lisääntyivät merkittävästi parikalsitolihoidon jälkeen hypoksisissa perisyyteissä HIF-1:n geenin vaimentamalla. Tiedot esitetään keskivirheinä. n=4 jokaista ryhmää kohti. *** p < 0.{{10}}01="" vs.="" normoksiakontrolli;="" #="" p="">< 0.05="" vs.="" hypoksiaryhmä;="" ##="" p="">< 0,01="" vs.="" hypoksiaryhmä;="" ###="" p="">< 0,001="" vs.="" hypoksiaryhmä;="" †="" p="">< 0,05="" vs.="" sihif-1="" hypoksiaryhmä;="" ††="" p="">< 0,01="" vs.="" sihif-1="" hypoksiaryhmä.="" lyhenteet:="" hif,="" hypoksian="" aiheuttava="" tekijä;="" sod,="" superoksididismutaasi;="" sirna,="" pieni="" häiritsevä="" rna;="" h,="">

3. Keskustelu

Tämä tutkimus osoitti parikalsitolin suojaavan vaikutuksen hypoksian aiheuttamaa ja TGF- 1--indusoitua vauriota vastaan ​​perisyytissä. Munuaisfibroosin ja kudosten hypoksian välillä voidaan havaita ylikuuluminen, ja ne edistävät synergistisesti CKD:n etenemistä [2]. Sekä TGF- 1-stimulaatio että hypoksialle altistuminen indusoivat PMT:tä, ja parikalsitolihoito parantaa vaurioituneiden perisyyttien fibroottisia muutoksia. Parikalsitolin antifibroottinen vaikutus yhdistettiin HIF-1 -riippuvaiseen Smad2-signalointireittiin ja sen vaimenemiseen. Lisäksi parikalsitolilla oli antioksidanttisia vaikutuksia hypoksialle altistuneissa perisyyteissä HIF-1 --riippumattomalla tavalla, mikä saattaa myös estää PMT:tä.

Parikalsitoli, 19-nor-1,25-(OH)2-D2-vitamiini, on aktiivinen D-vitamiinianalogi ja aktivoi selektiivisesti VDR:n. Sitä käytetään pääasiassa sekundaarisen hyperparatyreoosin hoitoon, ja sen lisäantifibroottiset ja antioksidanttiset vaikutukset on todistettu aikaisemmissa tutkimuksissa [8–10]. Vaikka ei-selektiivisillä D-vitamiiniaktivaattoreilla oli myös samanlaisia ​​hyödyllisiä vaikutuksia, kuten anti-inflammatorisia ja immunomodulaatioita [11,12], niillä on taipumus nostaa seerumin kalsium- ja fosfaattitasoja. Parikalsitoli on selektiivinen VDR-agonisti ja sillä on suotuisia vaikutuksia kalsiumin homeostaasiin nostamatta elektrolyyttitasoja. Se on osoittanut monia hyödyllisiä vaikutuksia munuaissairauksiin kokeellisissa tutkimuksissa, kuten diabeettiseen nefropatiaan, obstruktiiviseen nefropatiaan ja iskeemiseen munuaisvaurioon [13–15]. Perisyyttejä on kaikkialla kaikissa vaskularisoituneissa kudoksissa, mukaan lukien munuaiset, ja niillä on välittämiä perustoimintoja, jotka liittyvät mikroverisuonten rakenteelliseen stabilointiin, verenvirtauksen säätelyyn, angiogeneesiin ja haavan paranemiseen [5, 6, 16–18]. Lepotilassa olevia perisyyttejä aktivoivat ja muuttavat useat tekijät, kuten TGF- 1 ja oksidatiivinen stressi, jotka lisääntyvät munuaisvammojen tai hypoksisten tilojen yhteydessä [2,6,19]. Aktivoidut perisyytit irtoavat peritubulaarisista kapillaareista ja muuttuvat myofibroblasteiksi ja aiheuttavat siten munuaisfibroosin [2]. Lisäksi olemme osoittaneet parikalsitolin suojaavat vaikutukset hypoksian ja TGF{22}}-indusoidulle fibroosille perisyyteissä, mikä saattaa osaltaan estää CKD:n etenemistä.

Munuaisfibroosi on kroonisen munuaistaudin yleinen patologinen ominaisuus sen syystä riippumatta, ja se on kroonisen munuaistaudin tunnusmerkki, joka ennustaa pitkäaikaista munuaisten toimintaa ja etenemistä loppuvaiheen munuaissairaudeksi (ESKD) [2,20,21]. Tässä tutkimuksessa TGF- 1-stimulaatio, hypoksian aiheuttama PMT ja parikalsitolihoito vaimensivat profibroottista prosessia estämällä TGF- 1/Smad-signalointireittiä. Munuaisen myofibroblastit, jotka ovat aktivoituneita mesenkymaalisia soluja, jotka ilmentävät -SMA:ta, ovat tärkeässä roolissa munuaisfibroosissa ECM:n muodostumisen ja kertymisen kautta munuaisarven muodostavaan tubulointerstitiumiin [6]. Mitä tulee antifibroottiseen hoitoon CKD:n etenemisen estämiseksi, tutkijat ovat tutkineet tärkeimpiä kohdesoluja ja välittäjiä, jotka liittyvät myofibroblastien lisääntymiseen [22–24]. Lisäksi myofibroblastien tarkka alkuperä on vielä selvittämättä. Niiden tiedetään olevan peräisin erilaisista soluista, kuten perisyyteistä, paikallisista fibroblasteista, epiteelisoluista, endoteelisoluista ja stroman mesenkymaalisista soluista [25]. Kuitenkin erityisesti munuaisissa Humphreys et ai. raportoivat, että useimmat näistä aktivoiduista mesenkymaalisista fibroblasteista ovat kiinnittyneet mikroverisuonistoon ja ovat peräisin perisyyteistä [19]. Mielenkiintoista on, että parikalsitoli alensi vain Smad2-signalointireittiä, mutta ei Smad3-reittiä, sekä hypoksian että TGF{17}}-indusoidun perisyyttien vaurion tässä tutkimuksessa. Smad2:lla ja Smad3:lla on 90 prosentin samankaltaisuus aminohapposekvensseissään, mutta niillä on erilainen herkkyys TGF- 1-signaloinnin välittämisessä [26]. Vaikka tarkkaa mekanismia, kuinka parikalsitoli estää Smad2-reittiä, ei voida selittää tässä tutkimuksessa, Smad2:n fosforylaation estäminen voi olla päämekanismi parikalsitolin antifibroottiselle vaikutukselle munuaisperisyyteissä.

Munuaiset ovat fysiologisesti hypoksisia elimiä, vaikka niillä on runsaasti verenkiertoa (20 prosenttia sydämen minuuttitilavuudesta ihmisillä) valtimo-laskimohappishuntin vuoksi [27–29]. Lisäksi hapen saanti munuaiskuoreen voi muuttua dramaattisesti riippuen munuaisperfuusion tilasta [30]. Koska nämä aiheuttavat hapen tehotonta hyödyntämistä ja vaihtelua munuaisten happitasoissa, munuaiset ovat yleensä alttiita hypoksisille vaurioille [30]. AKI:n akuutissa vaiheessa munuaisten tubulusepiteelisolut ja verisuonten endoteelisolut vaurioituvat ja aktivoituvat. Tämä johtaa useiden sytokiinien ja kemokiinien lisääntymiseen, minkä seurauksena tulehdukselliset kaskadit alkavat ja vauriot pahenevat [31–33]. AKI:n kroonisessa vaiheessa AKI pahentaa munuaisten hypoksiaa indusoimalla tubulointerstitiaalista fibroosia, koska ECM:n liiallinen kerrostuminen lisää etäisyyttä peritubulaaristen kapillaarien ja tubulaaristen epiteelisolujen välillä, mikä johtaa hapen diffuusiotehokkuuden heikkenemiseen [27]. Perisyyttien irtoamisen aiheuttama kapillaariharvinaisuus ja verisuonitekijöiden vähentynyt ilmentyminen on myös tärkeä syy munuaisten hypoksiaan. Hypoksia aktivoi HIF-1-signalointireitin, mikä johtaa useiden signalointiverkkojen, kuten TGF-/Smad-, Notch- ja NF-kB-reittien, integroitumiseen munuaisfibroosin indusoimiseksi [3]. Tämä munuaisfibroosin ja hypoksian välinen noidankehä edistää kroonisen munuaistaudin etenemistä. Näin ollen nämä ovat tärkeimmät terapeuttiset kohteet munuaisvauriossa.

Perisyyttien hypoksisten muutosten ja parikalsitolin suojaavan vaikutuksen arvioimiseksi selkeästi munuaisvaurion kaltaisessa ympäristössä perisyytit altistettiin hypoksisille olosuhteille. Altistuminen hypoksialle lisäsi HIF{0}}- ja HIF-1 --riippuvaisia ​​geenien ilmentymiä. HIF-1 aiheuttaa munuaisfibroosia ja vähentää hapen käyttöä estämällä happea kuluttavia aineenvaihduntareittejä ja solunsisäisiä organelleja [34–36]. Parikalsitoli osoitti antifibroottista vaikutusta alentamalla HIF-1:a, myöhempiä HIF-1 --riippuvaisia ​​geenejä ja TGF- 1-ilmentymiä hypoksialle altistuneissa perisyyteissä. HIF-1:n geenin vaimentamisen tulokset tukevat myös sitä, että HIF-1 olisi parikalsitolin tärkein terapeuttinen kohde hypoksisessa perisyyttivauriossa. Samaan aikaan PHD3:n ilmentyminen laski parikalsitolihoidon jälkeen jopa HIF-1 hiljentämisen jälkeen, vaikka laskun aste heikkeni. Tämä saattaa liittyä siihen tosiasiaan, että PHD3 ei ole vain happianturi, vaan se myös indusoi apoptoosia HIF{14}}riippumattoman mekanismin kautta [37]. Tarvitaan kuitenkin lisätutkimuksia parikalsitolin antiapoptoottisesta vaikutuksesta perisyyteissä. Lisäksi parikalsitolin on osoitettu vähentävän oksidatiivista stressivauriota hypoksialle altistuneissa perisyyteissä HIF{17}}riippumattomalla tavalla. Oksidatiivinen stressi on hyvin tunnettu tekijä, joka edistää munuaisfibroosia ja -tulehdusta [38]. Kaiken kaikkiaan munuaisten hypoksia aktivoi PMT:n kehittämään CKD:tä, kun taas parikalsitoli voi inaktivoida fibroosin HIF-1 -riippuvaisella ja HIF{21}}-riippumattomalla tavalla.

Viime aikoina monet tutkimukset ovat raportoineet hypoksian merkityksestä AKI:sta CKD:hen siirtymisessä [39,40]. Fibroosi on olennainen suojareaktio itse kudosvauriolle, mutta krooninen liiallinen munuaisten fibroosi aiheuttaa hypoksiaa ja estää korjausprosessin [41]. Tietojemme mukaan tämä on ensimmäinen tutkimus, jossa tutkittiin hypoksiaa ja TGF{5}}-indusoitua PMT:tä sekä parikalsitolin antifibroottisia ja antioksidanttisia vaikutuksia perisyyteissä. Tämän tutkimuksen odotetaan muodostavan pohjan tulevalle tutkimukselle, joka todistaa parikalsitolin terapeuttisen vaikutuksen munuaisvaurioiden hoidossa estämään AKI:sta CKD:hen siirtymistä. Tällä tutkimuksella on kuitenkin useita rajoituksia. Ensinnäkin emme arvioineet parikalsitolin antifibroottisia ja antioksidanttisia vaikutuksia yhteisviljelykokeessa. Koska perisyytit sijaitsevat lähellä kapillaarin endoteelisoluja, vaurioituneiden endoteelisolujen tuottamat tekijät voivat vaikuttaa parikalsitolin vaikutuksiin [2]. Toiseksi parikalsitolin suojaavan vaikutuksen yksityiskohtaista mekanismia ja sitä, kuinka se estää Smad2:n fosforylaatiota, ei arvioitu. Lisätutkimuksia tarvitaan tarkan vaikutusmekanismin vahvistamiseksi.

Yhteenvetona voidaan todeta, että hypoksia tai TGF{0}} aiheutti PMT:n HIF-1 -riippuvaisella tavalla Smad2-signalointireitin kautta. Parikalsitoli paransi ylössäädeltyä PMT:tä vähentämällä HIF-1 -riippuvaista reittiä ja estämällä TGF- 1/Smad2-signalointireittiä. Hypoksialle altistuneet perisyytit aiheuttivat myös oksidatiivisia stressivaurioita, joita parikalsitolihoito paransi lisäämällä antioksidanttientsyymejä HIF{6}}riippumattomalla tavalla. Lisäksi tuloksemme viittaavat siihen, että parikalsitoli voisi olla mahdollinen terapeuttinen vaihtoehto munuaisfibroosin hoidossa kohdentamalla perisyyttibiologiaa hypoksian ja TGF{8}}:n aiheuttamissa vaurioissa.

4. Materiaalit ja menetelmät

4.1. Hiiren munuaisten perisyyttien eristäminen ja viljely

C57BL/6 hiirimunuaisetkapselit poistettiin, paloiteltiin ja inkuboitiin sitten 37 asteessa 45 minuuttia Liberasen (0,5 mg/ml, Roche, Mannheim, Saksa) ja DNaasin (100 U/ml, New England) kanssa. Biolabs, Hitchin, UK) DMEM/F12:ssa 37 °C:ssa ravistellen vesihauteessa. Sentrifugoinnin jälkeen solut suspendoitiin uudelleen RBC-lyysipuskuriin 4 °C:ssa 5 minuutin ajan, pestiin, suspendoitiin uudelleen 0,5-prosenttiseen BSA-puskuriin, joka sisälsi EDTA:ta, ja suodatettiin 70- ja 40- mm solusiivilä. Sentrifugoinnin jälkeen pelletti suspendoitiin uudelleen 45 % (v/v) Percoll-liuokseen ja sentrifugoitiin 5525 x g 30 minuuttia 4 °C:ssa (ilman jarrutusta). Sitten solukerros kerättiin Percoll-liuoksen yläkerroksesta. Sentrifugoinnin jälkeen solupelletit leimattiin magneettisesti CD146 (LSEC) MicroBeadsillä ja erotettiin

valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kerättyjä soluja viljeltiin sitten

perisyyttiväliaine, jota on täydennetty 2 prosentilla FBS:llä, 1 prosentilla PGS:llä ja 1 prosentilla P/S:llä (ScienCell, Carlsbad, CA, USA) 37 °C:ssa 5 prosentin CO2:ssa ja 95 prosentin ilmatilassa. Tässä tutkimuksessa käytetyt primääriviljellyt solut olivat passioiden 2 ja 6 välillä. Kasvualustaa vaihdettiin 3-4 päivän välein.

Vahvistimme viljellyt perisyytit virtaussytometrialla ja perisyyttispesifisellä markkerivärjäyksellä, kuten PDGFR, CD146 ja neuroni-gliaantigeeni 2 (NG2) (täydentävä kuva S2). Fluoresenssiaktivoidussa solulajitteluanalyysissä viljellyt perisyytit osoittivat lisääntyneen PDGFR-, CD146- ja NG2-positiivisten solujen populaation, ja CD31-positiivinen solupopulaatio ei muuttunut. Immunofluoresenssivärjäysanalyysissä viljellyt perisyytit ilmensivät yhdessä myös CD146/PDGFR:ää, CD146/NG2:ta ja PDGFR/NG2:ta. Perisyyttien elinkelpoisuus arvioitiin käyttämällä Cell Counting Kit-8 (CCK-8) -määritystä; perisyyttien elinkelpoisuus ei muuttunut parikalsitolilla (20 ng/ml) ja/tai TGF- 1:lla (5 ng/ml) 24 tunnin ajan käsittelyn jälkeen.

4.2. Soluhoidot

Kasvutekijän nälänhädän jälkeen 24 tuntia perisyyttejä esikäsiteltiin parikalsitolilla (20 ng/ml) tai ilman sitä 90 minuutin ajan, minkä jälkeen niitä stimuloitiin TGF- 1:lla (5 ng/ml; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) 48 tunnin ajan. Hypoksiaa varten perisyyttejä viljeltiin 1 prosentissa happea ja 5 prosentissa CO2:ta hypoksiatyöasemassa (Invivo2 400, Baker Ruskin, Sanford, ME, USA).

4.3. Perisyyttien immunofluoresenssivärjäys

Perisyyttejä viljeltiin kammiolevyillä ja kiinnitettiin 3,7-prosenttisella paraformaldehydillä PBS:ssä 3 0 minuutin ajan. Lisäksi perisyytit pestiin PBS:llä ja permeabilisoitiin 0,3-prosenttisella Tritonilla 15 minuutin ajan. Kiinnittyneitä soluja inkuboitiin primääristen vasta-aineiden kanssa PDGFR:lle (1:50), CD146:lle (1:50) ja NG2:lle (1:50) yön yli 4 °C:ssa. Perisyyttien uudelleenpesun jälkeen niitä inkuboitiin sekundaaristen vasta-aineiden kanssa (Alexa Fluor 488 ja Alexa Fluor 594, Life Technologies, Eugene, OR, USA) 2 tuntia huoneenlämpötilassa. Ydin vastavärjättiin 4/,6-diamidino-2-fenyyli-indolilla (DAPI) ja objektilasit kiinnitettiin haalistumista estävällä asennusreagenssilla (Molecular Probes). Leikkeitä tutkittiin Zeiss-konfokaalipyyhkäisylasermikroskoopilla käyttäen LSM 5 Exciteriä (Carl Zeiss, Oberkochen, Saksa).

4.4. Solujen elinkelpoisuusmääritys

Perisyytit kylvettiin 96-kuoppalevyille ja niitä inkuboitiin 24 tunnin ajan seerumivapaalla alustalla. Nälkään näkemisen jälkeen perisyyttejä käsiteltiin parikalsitolilla (20 ng/ml) ja/tai TGF- 1:lla (5 ng/ml). Solujen elinkelpoisuus analysoitiin käyttämällä CCK-8-määritystä (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japani) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 450 nm käyttämällä mikrolevyä (SPARK 10M, Tecan, Durham, NC, USA). Arvo ilmaistiin prosentteina kontrollista.

4.5. Scratch Cell Migration Assay

Perisyytit maljattiin 96-kuoppa IncuCyte ImageLock -levyille (Essen BioScience, AnnArbor, MI, USA) ja inkuboitiin yön yli. Elatusaine vaihdettiin täydelliseen elatusaineeseen, jossa oli mitomysiini-C (10 ug/ml, M4287; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) 2 tunniksi solujen lisääntymisen estämiseksi. Jokainen solun yksikerros raaputettiin käyttämällä 96-pin WoundMakeria (IncuCyte Zoom Live-Cell Imaging System; Essen BioScience) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Naarmuuntumisen jälkeen parikalsitolin vaikutuksen solumigraatioon tutkimiseksi perisyyttejä esikäsiteltiin parikalsitolilla (20 ng/ml) 90 minuuttia ja inkuboitiin sitten TGF- 1:n (5 ng/ml) kanssa 48 tuntia. Käsittelyn jälkeen kuvat hankittiin, tallennettiin ja rekisteröitiin IncuCyte-ohjelmistojärjestelmään 4 tunnin välein. Tiedot analysoitiin käyttämällä integroitua metriikkaa, ja arvot ilmaistiin suhteellisena haavatiheydenä.

4.6. Transwell Cell Migration Assay

Perisyyttejä käsiteltiin TGF- 1:lla (5 ng/ml) 24 tunnin ajan parikalsitolin (20 ng/ml) kanssa 90 minuutin esi-inkuboinnin jälkeen. Lisäksi solut irrotettiin trypsiini-EDTA:lla ja maljattiin 24-kuoppa Transwell-inserteille (1 × 104 solua/kuoppa, 8 mm huokoskoko; 6,5 mm

Transwell [#3422], Corning, NY, USA). 24 tunnin kuluttua solut, jotka olivat siirtyneet inserttien alapintaan, kiinnitettiin 3,7-prosenttisella paraformaldehydillä 1 0 minuutin ajaksi. Toisaalta alapinnalla kulkeneet solut värjättiin 0,1 prosentin kristallivioletilla (V5265; Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, USA) 5 minuutin ajan, ja solut 10 satunnaisesti valitussa kentässä laskettiin valomikroskooppi × 100 suurennuksella.

4.7. Perisyyttien transfektio HIF-1siRNA:lla

Hiiren HIF{{0}} siRNA ja ei-kohdistava (negatiivinen kontrolli) siRNA ostettiin Dharmaconilta (Chicago, IL, USA). Transfektio suoritettiin käyttämällä Lipofectamine RNAiMaxia (Invitrogen, Paisley, UK) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Perisyyttisolut (5,0 × 104) kylvettiin 1 päivä ennen transfektiota ja viljeltiin 40–50 prosentin konfienssin saavuttamiseksi seuraavana päivänä. HIF-1:n RNAi-dupleksit sekoitettiin lipofektamiinin kanssa transfektiokompleksin muodostamiseksi, joka lisättiin maljattuihin soluihin. 6 tunnin inkubaation jälkeen soluja esikäsiteltiin parikalsitolilla (20 ng/ml) 90 minuutin ajan, siirrettiin sitten hypoksiakammioon ja altistettiin hypoksialle 24 tunnin ajan. Transfektoituja soluja käytettiin kvantitatiiviseen reaaliaikaiseen käänteistranskriptiopolymeraasiketjureaktioon (qRT-PCR).

4.8. RNA:n uuttaminen ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi

Kokonais-RNA uutettiin Trizolilla (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) käsitellyistä perisyyteistä valmistajan ohjeiden mukaisesti. Yksi mikrogramma kokonais-RNA:ta transkriptoitiin käänteisesti käyttämällä PrimeScript cDNA Synthesis -pakkausta (Takara Shuzo Co., Otsu, Japani). Kaikki reaaliaikaisen PCR:n alukkeet (lisätaulukko S1) suunniteltiin käyttämällä Primer Express V1.5 -ohjelmistoa (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR suoritettiin ABI PRISM 7500 Sequence Detection System -järjestelmällä (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) käyttämällä SYBR Green PCR Master Mixiä (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Kaikki näytteet laskettiin käyttämällä vertailevaa Ct-menetelmää geeniekspression suhteelliseen kvantifiointiin ja normalisointiin suhteessa GAPDH-ilmentymiseen.

4.9. Western Blot -analyysi

Käsittelyn jälkeen kokonaisproteiinit (25 ug) erotettiin 10-prosenttisella natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Kalvo suljettiin 10-prosenttisella rasvattomalla maidolla 1 tunnin ajan huoneenlämmössä ja inkuboitiin yön yli 4 asteessa primääristen vasta-aineiden kanssa fosfo-Smad2:ta (1:1000, Millipore), Smad2:ta (1:200, Invitrogen), fosfo-Smad3:a (1:1) vastaan. 1000, Cell Signaling, Danvers, MA, USA), Smad3 (1:1000, Cell Signaling), TGF- 1 (1:1000, Santa Cruz, Dallas, TX, USA) ja GAPDH (1:2000, Solun signalointi). Pesun jälkeen kalvoa inkuboitiin piparjuuriperoksidaasiin konjugoitujen sekundaaristen vasta-aineiden kanssa (P0448, Dako, Glostrup, Tanska) 1 tunti. Kalvo havaittiin käyttämällä ECL-reagensseja (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, USA) ja visualisoitiin ImageQuant™ LAS 4000 -järjestelmällä (GE Healthcare Life Sciences, Tokio, Japani). Proteiinivyöhykkeiden tiheydet määritettiin käyttämällä Scion Image -ohjelmistoa (Scion, Frederick, MD, USA).

4.10. Tilastollinen analyysi

Tiedot esitetään keskivirheinä ja ne on johdettu vähintään kolmesta riippumattomasta kokeesta. Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttämällä ei-parametrista Kruskal-Wallis-testiä, jota seurasi posthoc-analyysi Mann-Whitney U -testillä Bonferroni-korjauksella. Analyysi suoritettiin käyttämällä SPSS:ää (versio 20.0, IBM Corp., Armonk, NY, USA). Alle 0,05 p-arvoa pidettiin tilastollisesti merkitsevänä.

Täydentävät materiaalit: Seuraavat ovat saatavilla verkossa osoitteessa https://www.mdpi.com/article/10 .3390/ijms22189751/s1.

Tekijän panokset: Conceptualization, J.-HL ja S.-HP; metodologia, J.-HL, J.-MY ja S.-HP; validointi, J.-HL, J.-MY ja S.-HP; formal Analysis, J.-HL ja J.-MY; tutkimus, J.-HL, J.-MY, S.-HO ja S.-HP; resurssit, J.-MY ja S.-HP; tietojen kuratointi, J.-HL, J.-MY ja S.-HP; kirjoitus – alkuperäisen luonnoksen valmistelu, J.-HL, J.-MY ja S.-HP; kirjoittaminen – arvostelu ja editointi, J.-HL, S.-JJ, HWN, H.-YJ, J.-YC, J.-HC, C.-DK, Y.-LK ja S.-HP; valvonta, S.-HP; projektihallinto, S.-HP Kaikki kirjoittajat ovat lukeneet käsikirjoituksen julkaistun version ja hyväksyneet sen.

Rahoitus: Tätä työtä tuki Biomedical Research Institute -apuraha, Kyungpook National University Hospital (2019).

Tietojen saatavuusilmoitus: Tässä tutkimuksessa esitetyt tiedot ovat saatavilla pyynnöstä vastaavalta kirjoittajalta.

Eturistiriidat: Kirjoittajat ilmoittavat, että ne eivät ole eturistiriitoja.