Munuaiset poistavat lukuisia proteiineihin sitoutuneita aineita tehokkaasti

Munuaiset puhdistavat lukuisia liuenneita aineita plasmasta; näiden liuenneiden aineiden pidättäminen aiheuttaa kuitenkin ureemisen sairauden, kun munuaiset eivät toimi. Tiedämme erittäin vähän siitä, mitkä säilyneet liuenneet aineet ovat myrkyllisiä, mikä rajoittaa kykyämme parantaa dialyysihoitoja.

Tämän tutkimiseksi käytimme kohdentamatonta massaspektrometriaa tunnistaaksemme liuenneet aineet, jotka munuaiset poistavat tehokkaasti. Korkearesoluutioinen massaspektrometria havaitsi 1808 ominaisuutta virtsasta ja plasman ultrasuodosta 5 yksilöllä, joilla oli normaali munuaisten toiminta. Arvioidut 1082 piikin puhdistumanopeudet olivat suurempia kuin kreatiniinipuhdistuma, mikä osoittaa tubuluseritystä.

Lisäanalyysi tunnisti 90 ominaisuutta, jotka edustavat liuenneita aineita, joiden arvioidut puhdistumanopeudet ovat merkittävämpiä kuin munuaisten plasmavirtaus. Kvantitatiivinen massaspektrometria stabiililla isotooppilaimennuksella vahvisti, että näiden liuenneiden aineiden tehokas puhdistuma on mahdollista plasman proteiineihin sitoutumisen ja tubuluserityksen yhdistelmällä. Tandem-massaspektrometria vahvisti 13 liuenneen aineen kemiallisen identiteetin, mukaan lukien hippurihappo, indoksyylisulfaatti ja p-kresolisulfaatti. Näiden 13 tehokkaasti puhdistetun liuenneen aineen havaittiin kerääntyvän hemodialyysipotilaiden plasmaan, ja vapaat pitoisuudet nousivat yli 20--kertaisiksi normaaleihin kaikilla paitsi kahdella. Siten luonnollisessa munuaisessa erityksellä tehokkaasti puhdistuneiden liuenneiden aineiden lisäanalyysi voi tarjota mahdollisen reitin ureemisten toksiinien tunnistamiseen.

Klikkaa nähdäksesi cistanche wirkung

AVAINSANAT

massaspektrometria;munuaisten funktioureeminen;toksiinit

Munuaiset poistavat lukuisia jäteliuoksia veriplasmasta. Kun munuaisten toiminta heikkenee, nämä liuenneet aineet kerääntyvät elimistöön ja aiheuttavat ureemisen sairauden, joka huipentuu kuolemaan, ellei munuaisten toimintaa osittain korvata dialyysillä.

Tällä hetkellä tiedämme erittäin vähän koulutettuja siitä, mikä on myrkyllistä, ja tämä tiedon puute rajoittaa kykyämme parantaa hoitoa. 1,2 Edistyminen on ollut hidasta osittain siksi, että munuaisten vajaatoiminnan yhteydessä jääneiden liuenneiden aineiden määrä on erittäin suuri. 1., 3., 4., 5., 6. Tässä tutkimuksessa käytettiin kohdentamatonta massaspektrometriaa löytääkseen liuenneita aineita, jotka poistuvat tehokkaasti plasmasta munuaisten kautta.

Se paljasti, että on monia jäteliuoksia, joiden munuaispuhdistuma ylittää normaalisti munuaisten plasmavirtauksen. Tällaiset korkean puhdistuman sitoutumiset vaativat plasmaproteiineja ja aktiivista tubuluseritystä. Tällaisten liuenneiden aineiden pitoisuudet voivat nousta korkeille tasoille, kun munuaisten toiminta korvataan hemodialyysillä, joka puhdistaa liuenneet aineet vain diffuusiolla. Lehdistö väittää, että evoluution ansiosta munuaiset voivat poistaa myrkyllisiä aineita tehokkaasti, liuenneiden aineiden tunnistaminen, joiden munuaispuhdistuma on korkea, voisi tarjota reitin ureemisten toksiinien tunnistamiseen.

TULOKSET

Mittaukset tehtiin neljällä miehellä ja yhdellä naisella, joilla oli normaali munuaisten toiminta, mikä näkyy keskimääräisenä kreatiniinipuhdistumana 142±22 ml/min/1,73 m2. Kohduttamattomalla korkean erotuskyvyn massaspektrometrialla havaittiin yhteensä 1808 ominaisuutta sekä virtsan että plasman ultrasuodosta. Näiden ominaisuuksien puhdistumanopeudet arvioitiin virtsan erittymisnopeudella jaettuna plasman ultrasuodoksen pitoisuudella. Puhdistusarvot ilmaistaan ​​siten "vapaana" sitoutumattomana liuenneena aineena plasmassa pikemminkin kuin liuenneen aineen kokonaispitoisuutena.

Arvioitujen puhdistumanopeuksien jakauma suhteessa kreatiniinin puhdistumaan on kuvattu kuvassa 1. 1082:n ominaisuuden arvioidut puhdistumanopeudet olivat suurempia kuin kreatiniinin puhdistuma väärän havaitsemisnopeuden ollessa q<0.05. Because the creatinine clearance is slightly higher than the glomerular filtration rate (GFR), these features were considered likely to represent solutes secreted by the renal tubules. There were, in contrast, only 290 features with estimated clearance rates less than the creatinine clearance with a false discovery rate of q<0.05.

Kuva 1. Sininen viiva edustaa arvioitujen puhdistumanopeuksien jakaumaa suhteessa kreatiniinipuhdistumaan 1808:n piirteille, jotka löytyvät normaalien koehenkilöiden virtsan ja plasman ultrasuodosta. Punaiset kolmiot edustavat 13 ominaisuutta, joiden identiteetti varmistettiin reagenssistandardien analyysillä.

163 ominaisuuden arvioidut puhdistumanopeudet olivat yli seitsemän kertaa kreatiniinin puhdistumaan verrattuna. Tämä viittasi siihen, että niiden puhdistumat ylittivät munuaisten plasmavirtauksen, joka on noin nelinkertainen kreatiniinin puhdistumaan verrattuna.

Näistä 163 ominaisuudesta 90:n katsottiin edustavan ainutlaatuisia kemiallisia yhdisteitä kaksoiskappaleiden poistamisen jälkeen, ja ominaisuuksien katsottiin edustavan dimeerejä, additiotuotteita, isotooppeja tai artefakteja kromatogrammien manuaalisessa tarkistuksessa (lisätaulukko S2 verkossa). Yhdisteitä, joiden massa-arvot vastaavat, etsittiin standarditietokannoista, ja näistä 90 ominaisuudesta 13:n kemiallinen identiteetti määritettiin vertaamalla niiden kromatografisia retentioaikoja ja tandemmassaspektrometria (MS/MS) spektrejä reagenssistandardien vastaaviin (taulukko 1 ja täydennys). Taulukko S2 verkossa). 40:lle 90:stä kiinnostavasta ominaisuudesta ei kuitenkaan löydetty ehdokasyhdisteitä tunnetuista ihmisen metaboliiteista, joiden massa oli 3 miljoonasosaa (ppm) (lisätaulukko S2 verkossa). Tämä on mahdollista, koska näiden liuenneiden aineiden "vapaat" pitoisuudet plasman ultrasuodoksessa olivat alhaisemmat kuin niiden plasman kokonaispitoisuudet, mikä oletettavasti heijastaa sitoutumista plasman proteiineihin.

Vaikka kaikki tehokkaasti puhdistuneet liuenneet aineet sitoutuivat proteiineihin, sitoutumisen määrä vaihteli laajasti vapaan fraktion ollessa 2-52 prosenttia plasman kokonaispitoisuudesta. Plasman kokonaispitoisuuden laskeminen tuotti paljon pienemmät puhdistumaarvot sitoutuneille liuenneille aineille (lisätaulukko S2 verkossa).

Taulukko 1. Alkuperäinen munuainen ja niiden kerääntyminen hemodialyysipotilailla poistavat liuokset tehokkaasti.

Arvot ovat keskiarvo±sd Puhdistus/puhdistumacre on liuenneen aineen puhdistuman keskimääräinen suhde kreatiniinipuhdistumaan. Vapaa fraktio on plasman ultrasuodoksen taso prosentteina plasman kokonaistasosta. Hemodialyysi/normaali on hemodialyysipotilaiden keskimääräisen hoitoa edeltävän pitoisuuden suhde normaaleiden koehenkilöiden keskimääräiseen pitoisuuteen.

a

Osoittaa q<0.05 for the elevation of the solute concentration in hemodialysis patients above the level in normal subjects.

b

Osoittaa, että furoyyliglysiinin vapaa fraktio laskettiin vain yhdelle koehenkilölle, koska muiden koehenkilöiden plasmanäytteiden piikit olivat liian pieniä kvantifioitavissa.

Mittaukset käyttäen nestekromatografiaa/tandemmassaspektrometriaa (LC/MS/MS) isotooppisesti leimatuilla standardeilla vahvistivat havainnot erittäin korkeista puhdistumanopeuksista sitoutuneille liuenneille aineille, hippuraatille, indoksyylisulfaatille ja p-kresolisulfaatille. Näiden liuenneiden aineiden sekä urean ja kreatiniinin puhdistumaarvot on esitetty yhteenvetona taulukossa 2.

Vertailun vuoksi mitattiin myös fenyyliasetyyliglutamiinin puhdistuma-arvot, jonka aiempien tutkimusten oli osoitettu erittävän munuaistiehyet mutta suurelta osin sitoutumattomana.9 Kuten odotettiin, urean puhdistuma oli pienempi kuin kreatiniinin puhdistuma, mikä kuvastaa tubulusreabsorptiota glomerulussuodatuksen jälkeen. Fenyyliasetyyliglutamiinin puhdistuma sen sijaan oli keskimäärin 455 ± 62 ml/min 1,73 m2:tä kohti eli noin kolme neljäsosaa arvioidusta munuaisten plasman virtausnopeudesta. Hippuraatin, indoksyylisulfaatin ja p-kresolisulfaatin puhdistumaarvot olivat paljon korkeammat. Kvantitatiivisella määrityksellä leimatuilla standardeilla saadut arvot olivat hieman pienempiä kuin ne, jotka arvioitiin kohdentamattomalla massaspektrometrialla arvioiduista huippualueista, mutta silti selvästi arvioitua munuaisten plasmavirtausta korkeampia. Näiden liuenneiden aineiden puhdistumaarvot ilmaistuna plasman kokonaispitoisuutena olivat paljon alhaisemmat kuin vapaana pitoisuutena ilmaistut eivätkä ne ylittäneet munuaisten plasmavirtausta.

Taulukko 2. Puhdistusarvot, jotka on saatu käyttämällä LC/MS/MS-määritystä

Lyhenne:

LC/MS/MS, nestekromatografia/tandem-massaspektrometria.

Arvot ovat keskiarvo±sd Puhdistus/puhdistumacre on liuenneen aineen puhdistuman keskimääräinen suhde kreatiniinipuhdistumaan. Vapaa fraktio on plasman ultrasuodoksen taso prosentteina plasman kokonaistasosta. Kokonaispuhdistuma on arvo, joka saataisiin, jos puhdistuma laskettaisiin käyttämällä plasman kokonaispitoisuutta plasmavapaan pitoisuuden sijaan.

Lisätutkimuksissa tutkittiin munuaisten vajaatoimintaa sairastavien potilaiden liuenneiden aineiden kertymistä, joiden havaittiin poistavan tehokkaasti alkuperäisen munuaisen. Kuten taulukossa 1 on esitetty, kaikkien 13 kemiallisesti tunnistetun liuenneen aineen vapaat tasot, joilla oli korkea natiivi munuaispuhdistuma, kohosivat hemodialyysipotilailla. Huomionarvoista on, että kaikkien näiden liuenneiden aineiden, paitsi kahden, keskimääräiset vapaat pitoisuudet hemodialyysipotilaiden esikäsittelynäytteissä olivat yli 20-kertaiset normaalit, ja vapaiden aineiden pitoisuudet nousivat korkeammaksi kuin liuenneiden aineiden kokonaispitoisuudet. Suurin osa liuenneista aineista, joille on tunnusomaista vain tarkat massa-arvot, joilla on korkeat natiivit munuaispuhdistumat, todettiin myös kerääntyvän hemodialyysipotilaille, kuten on yhteenveto lisätaulukossa S2 verkossa.

KESKUSTELU

Aineenvaihduntatutkimukset ovat osoittaneet, että virtsa sisältää satoja liuenneita aineita, joista suurin osa on vielä kemiallisesti identifioimatta.10., 11., 12. Oletettavasti suurin osa näistä liuenneista aineista poistuu munuaisten kautta plasmasta ja niiden kerääntyminen elimistöön koska ureemiset liuenneet aineet voivat edistää sairauksia, kun munuaisten toiminta on heikentynyt. Tällä hetkellä meillä on kuitenkin vain vähän tietoa siitä, mitkä näistä liuenneista aineista ovat kliinisesti tärkeitä.3,13.

Tämä tutkimus oli suunniteltu tunnistamaan liuenneet aineet, joiden munuaispuhdistuma on normaalisti erittäin korkea. Korkea puhdistuma auttaa pitämään liuenneen aineen tason kehossa alhaisena. Voisimme siis odottaa löytävänsä myrkyllisiä jäteyhdisteitä niiden liuenneiden aineiden joukosta, joiden puhdistuma on korkea. Ajastettujen virtsan ja plasman ultrasuodosnäytteiden analyysi kohdentamattomalla massaspektrometrialla paljasti 90 ominaisuuden esiintymisen, joiden katsottiin todennäköisesti vastaavan liuenneita aineita, joiden munuaispuhdistuma on suurempi kuin munuaisplasman virtaus.

On huomattava, että yhdisteitä, joilla on vastaavia massa-arvoja monille näistä ominaisuuksista, ei löytynyt ihmisen aineenvaihduntatuotteiden standardiluetteloista.7,8 Tämä viittaa siihen, että monet aineet, joiden evoluutio on tuottanut korkean puhdistumanopeuden, on vielä tunnistamatta. Yhdisteitä, jotka pystyimme tunnistamaan, olivat indoksyylisulfaatti ja p-kresolisulfaatti. Nämä yhdisteet ovat peräisin suolistobakteerien vaikutuksesta, ja niiden tiedetään erittyvän munuaistiehyissä. Ne kerääntyvät plasmaan, kun munuaiset pettävät, ja niitä on äskettäin pidetty laajalti ureemisina toksiineina.14., 15., 16., 17. Muut tunnistetut yhdisteet käsittivät kolme dikarboksyylihappoa, kuusi asyyliglysiiniä ja kaksi substituoitua puriinimetaboliitia.

Kaikkia näitä aineita on aiemmin löydetty ihmisen virtsasta ja hippuraatista, adipiinihapon ja kanemoyyliglysiinin on myös raportoitu kerääntyvän munuaisten vajaatoimintaa sairastavien potilaiden plasmaan (http://www.hmdb.ca).5., 13. , 18. Indoksyylisulfaatin ja p-kresolisulfaatin tapaan hippuraattia ja 3-hydroksihippuraattia erittyvät munuaistiehyet.9,19 Mutta sikäli kuin voimme havaita, mahdollisuus munuaispuhdistumalle ylittää munuaisten plasmavirtauksen ei ole otettu huomioon minkään näistä liuenneista aineista.

Kuten tässä on kuvattu, munuaiset voivat saavuttaa puhdistumanopeudet yli munuaisplasman virtauksen tubulaarisen erityksen ja nopeasti palautuvan liuenneen aineen sitoutumisen yhdistelmän avulla plasman proteiineihin. Plasmaan rajoittuneiden ja proteiineihin sitoutumattomien liuenneiden aineiden maksimipuhdistuma on yhtä suuri kuin munuaisten plasman virtausnopeus. Mutta sitoutuneiden liuenneiden aineiden kohdalla aktiivinen eritys alentaa vapaan plasman liuenneen aineen pitoisuutta veressä, joka kulkee peritubulaaristen hiussuonten läpi sen jälkeen, kun se on poistunut glomeruluksista, joten liuenneen aineen sitoutuneella osalla on taipumus irtautua sitovista proteiineista ja tulee saataville eritystä varten.

Jos erittyvän kuljetuksen aviditeetti tubulusonteloon on riittävä, erittyvän liuenneen aineen määrä on suurempi kuin munuaisten plasmavirtaus kerrottuna peritubulaarisiin kapillaareihin tulevan plasman vapaalla pitoisuudella, ja puhdistuma nousee plasman virtausnopeuden yläpuolelle. Nettovaikutus on vähentää sitoutumattoman liuenneen aineen pitoisuutta systeemisessä verenkierrossa alemmalle tasolle kuin saavutettaisiin, jos liuennut aine poistettaisiin kokonaan munuaisten läpi kulkevasta plasmasta, mutta se ei olisi sitoutunut proteiineihin.

Koska kyse on liuenneiden aineiden vapaasta, sitoutumattomasta pitoisuudesta, jolle kudokset kaikkialla kehossa ovat alttiina, proteiinisitoutumisen ja tubulaarisen erityksen yhdistelmä voi tarjota mukautuvan edun myrkyllisten jäteyhdisteiden poistamisessa. Pohjimmiltaan palautuvan proteiinisitoutumisen lisääminen eritykseen mahdollistaa liuenneen aineen vapaan tason alenemisen lisäämättä munuaisten verenkiertoa ja kokoa.

Marshall20 tunnisti munuaisten kyvyn alentaa sitoutuneiden liuenneiden aineiden vapaan plasman pitoisuutta erittäin alhaisille tasoille, joka esitti ensimmäisen yksiselitteisen todisteen munuaistiehyissä tapahtuvasta liuenneen aineen erittymisestä. Marshall ei mitannut luonnollisia liuenneita aineita, mutta oletti niiden mahdollisen korkean puhdistuman, joka perustuu havaintoihin fenolipunaisen, proteiiniin sitoutuneen väriaineen, käsittelystä munuaisissa.

Siitä lähtien proteiinisitoutumisen mahdollinen etu on kuitenkin jäänyt suurelta osin huomiotta munuaislääketieteessä, ja sitoutuneiden ja sitoutumattomien jäteliuenneiden aineiden puhdistuma-arvot on ilmaistu kokonaismääränä eikä merkityksellisempänä vapaan plasman pitoisuutena. Vakiokäytäntö on kuitenkin ollut erilainen farmakologisessa kirjallisuudessa.21 Farmaseuttisilla aineilla, kuten muillakin yhdisteillä, vain vapaa osa sitoutuneesta liuenneesta aineesta on biologisesti aktiivinen, ja siksi lääkkeiden puhdistumanopeudet on rutiininomaisesti ilmaistu niiden vapaana plasmana. pitoisuudet. Kokonaispitoisuuden laskeminen tuottaa pienempiä arvoja ja aliarvioi kehon kyvyn rajoittaa tehokasta, vapaata liukenevaa ainetta, kuten taulukosta 2 ja täydentävästä taulukosta S2 ilmenee verkossa.

Munuaislääketieteessä ilmeinen kysymys on, voiko eritys jatkua, kun glomerulussuodatus heikkenee. Varhaisiin morfologisiin havaintoihin perustuva toivo, että merkittävä määrä "glomerulaarisia tubuluksia" jatkaa toimintaansa potilailla, joilla on glomerulaarinen sairaus, oli suurelta osin pettymys myöhemmissä analyyseissä.22,23 Vielä tärkeämpää on, että toiminnalliset tutkimukset ovat osoittaneet toistuvasti, että erityksen puhdistumat vähenevät GFR:n myötä. Laajimmat todisteet ovat paraaminohippuraatin puhdistumasta, jota on pitkään käytetty munuaisten plasmavirtauksen mittana.

Keskimäärin paraaminohippuraatin puhdistuma laskee vain hieman vähemmän kuin GFR, ja yksittäisten potilaiden ja tiettyjen sairauksien välillä on vaihtelua.24,25 GFR:n aiheuttaman sekretorisen puhdistuman heikkeneminen on osoitettu myös endogeenisille orgaanisille anioneille, kuten hippuraatille ja { {3}}hydroksi-indolasetaatti ja monet lääkkeet, mukaan lukien proteiineihin sitoutuneet yhdisteet, kuten furosemidi.26., 27., 28. Tiukasti sitoutuneiden endogeenisten liuenneiden indoksyylisulfaatin ja p-kresolisulfaatin keskimääräisen erittyneen puhdistuman samanlainen lasku rinnakkain arvioidun GFR:n kanssa on myös äskettäin kuvattu abstraktissa muodossa.29 Nousevat plasmapitoisuudet kroonisen munuaissairauden edetessä eivät siis erota erityksellä puhdistuvia yhdisteitä niistä, jotka puhdistuvat suurelta osin suodatuksella. Hienovaraisempia kysymyksiä, kuten sitä, missä määrin erittyneen liuenneen aineen tasoihin vaikuttaa kilpailu kuljetusmolekyyleistä ja muuttuneista ilmentymisen kuljetusmolekyyleistä munuaissairauden etenemisen aikana, on tutkittu vähemmän perusteellisesti.

Kohdistamattoman massaspektrometrian heikkous on, että se ei anna tarkkaa kvantitointia. Matriisivaikutukset muuttavat yksittäisten näytteiden ionisignaalien voimakkuutta, erityisesti eri nesteiden näytteistä. Taulukon 1 puhdistumaarvoja, jotka perustuvat suhteellisiin piikkien pinta-aloihin virtsan ja plasman ultrasuodoksen kromatogrammeissa, on siten pidettävä vain likimääräisinä. Tarkempia kvantitatiivisia LC/MS/MS-määrityksiä kehitettiin mittaamaan valittujen liuenneiden aineiden pitoisuuksia, joille pystyimme saamaan sekä leimaamattomia että isotooppisesti leimattuja standardeja.

Nämä mittaukset vahvistivat, että hippuraatin, p-kresolisulfaatin ja indoksyylisulfaatin puhdistumat olivat paljon korkeammat kuin arvioitu munuaisplasman virtaus. Niiden puhdistumat voidaan verrata fenyyliasetyyliglutamiinin puhdistumaan, liuenneen aineen, joka erittyy aktiivisesti mutta suurelta osin sitoutumaton, joten sen puhdistuma voi vain lähestyä munuaisten plasmavirtausta. Orgaanisen anionin kuljettajan tiedetään käsittelevän indoksyylisulfaattia, p-kresolisulfaattia, 3-hydroksihippuraattia, 1,3,7-trimetyylivirtsahappoa ja 1,7-dimetyylivirtsahappoa 1 ja/tai 3 munuaisten proksimaalisessa tubuluksessa, ja muiden liuenneiden aineiden rakenteet, joiden tunnistamme tehokkaasti puhdistetuiksi, jotta ne olisivat todennäköisiä ehdokkaita kuljetettavaksi samojen mekanismien kautta.30., 31., 32., 33., 34. Sen tunnistaminen, mitkä kuljettajat käsittelevät mitäkin liuenneita aineita, vaatii kuitenkin tutkimuksia viljellyillä soluilla tai eläimillä, joissa kuljettajatoimintaa on manipuloitu geneettisesti.

Vahvistuksen siitä, että yksittäiset liuenneet aineet puhdistuvat munuaisten kautta, saadaan korkeasta munuaisten vajaatoiminnasta kärsivillä potilailla. Niiden yhdisteiden joukossa, joiden natiivi munuaispuhdistumat ovat suurempia kuin munuaisten plasmavirtaus, hippuraatin, p-kresolisulfaatin, indoksyylisulfaatin, adipiinihapon ja kanemoyyliglysiinin kokonaispitoisuuksien plasmassa on aiemmin raportoitu olevan kohonneita potilailla, joilla on munuaisten vajaatoiminta. .5., 13., 18. Tämä tutkimus osoittaa lisäksi, että sitoutuneiden liuenneiden aineiden vapaat tasot, jotka natiivi munuaiset poistavat tehokkaasti, voivat nousta korkeille tasoille potilailla, joita ylläpidetään hemodialyysissä, joka saa aikaan puhdistuman passiivisen diffuusion avulla.

Niiden 13 yhdisteen joukossa, joiden natiivi munuaispuhdistuma oli korkea, vapaat pitoisuudet kaikissa kahta lukuun ottamatta olivat yli 20-kertaiset hemodialyysipotilailla. Poikkeukset, 1,3,7-trimetyylivirtsahappo ja 1,7-dimetyylivirtsahappo ovat kofeiinin metaboliitteja.35 Kaikki normaalihenkilömme olivat kahvin tai teen juojia, kun taas hemodialyysipotilaiden nauttiminen oli rajoitettu yhteen päivittäiseen kuppilliseen teetä yhdellä yksilöllä. Tuotantoerojen lisäksi yksittäisten liuenneiden aineiden ei-renaalinen puhdistuma ja jakautumistilavuus voivat vaikuttaa siihen, missä määrin niiden tasot ovat kohonneet dialyysipotilailla.

On tunnustettava useita rajoituksia. Ensinnäkin, luettelo ominaisuuksista, jotka vastaavat liuenneita aineita, joilla on korkea munuaispuhdistuma, on epäilemättä epätäydellinen. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että massaspektrometrialla tunnistettujen piirteiden määrä kasvaa, kun näytteet analysoidaan käyttämällä useita kromatografisia ja ionisaatiomenetelmiä.11., 12., 36., 37. Toiseksi nykyinen lähestymistapa ei pystyisi tunnistamaan yhdisteitä, jotka poistetaan tehokkaasti. plasmasta, mutta ne joko hajoavat munuaisissa tai muuttuivat ennen erittymistä virtsaan. Lopuksi olemme saaneet laskea virheellisesti korkeita puhdistumaarvoja aineille, jotka erittyvät virtsaan munuaisissa tapahtuneen tuotannon jälkeen.

Yhteenvetona tämä tutkimus osoittaa, että proteiinisitoutumisen ja tubulaarisen erityksen yhdistelmä sallii munuaisen puhdistaa jäteliuenneet aineet nopeuksilla, jotka ylittävät munuaisten plasmavirtauksen. Ja se viittaa siihen, että niin korkeat puhdistumanopeudet saavutetaan suurella määrällä luonnollisia liuenneita aineita, joista monet ovat vielä kemiallisesti tunnistamatta. Munuaisten tehokkaasti poistamien liuenneiden aineiden ryhmän lisäanalyysi voisi tarjota reitin näiden ureemisten toksiinien tunnistamiseen.

MATERIAALIT JA MENETELMÄT

Verinäytteet otettiin ajoitetun virtsankeräyksen puolivälissä yön yli paaston jälkeen viideltä koehenkilöltä, joilla oli normaali munuaisten toiminta ja joiden ominaisuudet on merkitty lisätaulukossa S1 verkossa. Selvitykset suoritettiin Declaration of Helsinki Principles -julistuksella. Plasman proteiini poistettiin metanolilla (1:3 tilavuus:tilavuus), kuivattiin ja rekonstituoitiin 90:10 tilavuus:tilavuus vesi/asetonitriiliin puoleen alkuperäisestä pitoisuudesta. Ultrasuodos saatiin käyttämällä Nanosep 30K Omega -erottimia (Pall, Ann Arbor, MI), kuivattiin ja rekonstituoitiin 90:10 vesi/asetonitriiliin viisinkertaiseksi alkuperäiseen pitoisuuteen verrattuna. Virtsa laimennettiin vedellä, jotta saatiin liuenneen aineen pitoisuudet, jotka löytyisivät virtsan virtauksesta 100 ml/min, kuivattiin ja liuotettiin 90:10 vesi/asetonitriiliin kaksinkertaiseksi laimennetun näytteen pitoisuuteen.

Täydentävä taulukko 1.

Kromatografia suoritettiin ACQUITY UPLC -järjestelmällä (Waters, Milford, MA). Jokaisesta näytteestä 10 ul ladattiin Kinetex XB-C18 150 × 2,1 mm, 1,7 μm hiukkaskoon kolonniin (Phenomenex, Torrance, CA), jota pidettiin 4{{1{{12} }}} tutkinto. Liikkuvan faasin virtaus oli 0,4 ml/min käyttäen 0,1-prosenttista muurahaishappoa vedessä (A) ja 0,1-prosenttista muurahaishappoa asetonitriilissä (B) gradientilla 3 prosentista B 25 prosenttiin B 9 minuutin aikana, 25 prosentista B:stä 100 prosenttiin B - 15 min, pysyy 100 prosentissa B - 19 min ja palaa 3 prosenttiin B - 21 min. MS suoritettiin Exactive orbittrap -massaspektrometrillä (Thermo Fisher, San Jose, CA) datalla, joka kerättiin alueella m/z 70 - 800 50,000 täydellä leveydellä puolella maksimiresoluutiolla käyttäen sähkösumutusionisaatiota (ESI) ) lämmitetyllä anturilla (400 astetta). MS kalibroitiin positiivisessa moodissa käyttämällä standardia LTQ (linear trap kvadrupoli) ESI-positiivinen ionikalibrointiliuos (Pierce, Rockford, IL) m/z 138-1922 massaalueella. Negatiivisen ionin kalibrointia laajennettiin m/z 97:een standardin LTQ ESI-negatiivisten ionien kalibrointiliuoksen massa-alueelta m/z 265–1980 lisäämällä siihen p-kresolisulfaattia ja indoksyylisulfaattia pitoisuudella 3,3 ug/ml, mikä synnytti lisäkalibrointiioneja m/z 96,9601 (sulfaattifragmentti), m/z 187,0070 (p-kresolisulfaatti) ja m/z 212,0023 (indoksyylisulfaatti).

Kalibrointiseoksen modifioinnin oli tarkoitus sallia alle 1 ppm:n tarkkuudet suurimman osan virtsaan erittyneiden liuenneiden aineiden massa-alueelta ja siten vähentää mahdollisten alkuainekoostumusten määrää. Instrumentin ajautumisen vaikutusten minimoimiseksi näytteet kustakin koehenkilöstä ajettiin yhdessä kolmena kappaleena, ja näytteet kaikista koehenkilöistä ajettiin ensin negatiivisessa ja sitten positiivisessa tilassa.

MZmine-ohjelmistoa v2.2 (Okinawa Institute of Science and Technology, Okinawa, Japani) käytettiin tunnistamaan piirteitä, joille on tunnusomaista retentioaika ja m/z jokaisesta LC/MS-ajosta, ja määrittämään näille ominaisuuksille amplitudit ionin integroinnin perusteella. Nykyarvot.38 Koska tavoitteemme oli tunnistaa munuaisten puhdistamat liuenneet aineet, analyysi rajoittui edelleen 754 negatiiviseen ioniin ja 1054 positiiviseen ioniin, joiden keskimääräinen huippupinta-ala oli yli 4000 plasma-ultrasuodoksen kolmen rinnakkaisajon aikana. viidestä koehenkilöstä ja myös virtsassa vähintään kolmelta viidestä koehenkilöstä. Näiden 1808 ominaisuuden puhdistumanopeudet arvioitiin vertaamalla virtsan ja plasman ultrasuodoksen pitoisuuksia kreatiniinin pitoisuuksiin.

1082:lla 1808 ominaisuudesta arvioidut puhdistumanopeudet olivat suuremmat kuin kreatiniinipuhdistuma väärän havaintoasteen ollessa q<0.05. This was considered evidence of tubular secretion. Chromatograms for 163 of the 1082 secreted features with clearance values more than sevenfold the creatinine clearance were examined manually. The cutoff of sevenfold was chosen to be well above the renal plasma flow, which is approximately fourfold the creatinine clearance and to include the feature identified as p-cresol sulfate for which a deuterated standard was available, allowing its high renal clearance to be confirmed by a more quantitative assay (below). Elimination of duplicates when features appeared in both positive and negative mode and of features considered to represent dimers, adducts, isotopes, or artifacts on manual review reduced the total number of features with estimated clearance rates greater than sevenfold the creatinine clearance to 90 as summarized in Supplementary Table S2 online. Compounds with m/z values corresponding to these features were identified using the Human Metabolome and Metlin Databases (http://www.hmdb.ca and http://metlin.scripps.edu/) and chemical standards were obtained as further summarized in Supplementary Table S2 online. 

Kemiallisen identiteetin vahvistamiseksi valitut virtsanäytteet ja kemialliset standardit ajettiin käyttämällä samaa LC-menetelmää yhdistettynä LTQ Orbitrap Velos -laitteeseen (Thermo Fisher) negatiivisella tilassa esiintyvien piirteiden osalta ja LTQ XL -ioniloukun (Thermo Fisher) positiivisten piirteiden osalta. tila. Kemiallinen tunnistus määritettiin retentioajan, pää-ionimassan ja MS/MS-spektrin vastaavuudella (lisätaulukko S3 verkossa). 13 kemiallisesti tunnistetun ominaisuuden joukossa MZminella erotetuille huippuille määritetyn massavirheen keskimääräinen suuruus oli 0,5±0,5 ppm, mikä rohkaisee luottamusta siihen, että tunnistamattomille piirteille määritettiin oikeat massa-arvot lueteltu lisätaulukossa S2 verkossa.

Täydentävä taulukko 3.

Kuuden hemodialyysipotilaan ja kuuden normaalin kohteen esikäsittelyplasma, joiden ominaisuudet on yhteenveto lisätaulukossa S1 verkossa, analysoitiin myös korkearesoluutioisella massaspektrometrialla edellä kuvatulla tavalla. Plasman proteiini poistettiin, kuivattiin ja liuotettiin 90:10 tilavuussuhteeseen vesi/asetonitriili neljäsosaan alkuperäisestä pitoisuudesta dialyysipotilailla ja alkuperäiseen pitoisuuteen normaaleilla koehenkilöillä. Ultrasuodos liuotettiin 90:10 vesi/asetonitriiliin alkuperäiseen pitoisuuteen dialyysipotilailla ja kymmenkertaiseksi alkuperäiseen pitoisuuteen normaaleilla koehenkilöillä. MZmine-ohjelmistolla saadut plasman ja ultrasuodoksen huippualueet laskettiin keskiarvosta pois arvot<4000 in duplicate runs of each sample. Peaks corresponding to solutes previously identified as having very high renal clearance values were identified by matching retention time and mass. Peaks corresponding to the 13 chemically identified features were reintegrated manually using Xcalibur Software (Thermo Fisher).

P-kresolisulfaatin, indoksyylisulfaatin, hippuraatin ja fenyyliasetyyliglutamiinin pitoisuudet normaaleissa näytteissä määritettiin edelleen stabiililla isotooppilaimennuksella LC/MC/MS käyttäen p-kresoli-d8-sulfaattia (syntetisoitu p-kresolista d8; 39 Cambridgen isotooppia), indoksyyli-2,4,5,6,7-d5-sulfaatti (Isosciences) ja N-bentsoyyli-d5-glysiini ja N-( fenyyli-d5-asetyyli)-L-glutamiini (molemmat C/D/N Isotopesilta, Pointe-Claire, Quebec, Kanada) sisäisinä standardeina. Valmistus oli sama paitsi että kuivatut näytteet rekonstituoitiin veteen kaksinkertaiseksi pitoisuuteen, jota käytettiin kohdentamattomaan analyysiin.

Kustakin näytteestä 10 ul ladattiin Kinetex C18 150 × 2,1 mm, 1,7 μm hiukkaskoon kolonniin, jota pidettiin 30 asteessa. Puskurin virtaus asetettiin arvoon 0,35 ml/min käyttämällä 10 mmol/l ammoniumformiaattia vedessä (A) ja 10 mmol/l ammoniumformiaattia metanolissa (B) 5 prosenttia B 1 minuutin ajan, 5 prosentista B 30 prosenttiin B 6 minuuttiin, nopeasti 90 prosenttiin B 8,5 minuuttiin ja sitten 5 prosenttiin B 13,5 minuuttiin. MS suoritettiin Agilent 6430 Triple Quadrupol -massaspektrometrillä ESI:llä negatiivisessa tilassa (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Liuoneiden pitoisuudet laskettiin käyttämällä valmistajan ohjelmistoa (MassHunter Quant, Agilent Technologies). Kvantitoinnissa käytetyt ionisiirtymät olivat m/z 187,0 → 107,0 p-kresolisulfaatilla, m/z 212,0 → 80,0 indoksyylisulfaatilla, m/z 178,1 → 134,2 hippuraatilla ja m/z 263,2 → 145,1 phenyyliasetyyliglutamiinia vastaavalla siirtymäfortamiinilla. deuteroidut sisäiset standardit. P-kresolisulfaatin, indoksyylisulfaatin, hippuraatin ja fenyyliasetyyliglutamiinin saannot olivat 100±4, 114±6, 93±3 ja 105±3 prosenttia plasman ultrasuodokselle lisätyille reagensseille, 93±7, 108±25, 107±6 ja 95 ± 4 prosenttia plasmaan lisätyille reagensseille ja 91 ± 17, 105 ± 12, 95 ± 15 ja 102 ± 14 prosenttia virtsaan lisätyille reagensseille, jotta saavutetaan samanlaiset pitoisuudet kuin koehenkilöillä. Kreatiniini ja urea määritettiin kliinisessä laboratoriossa.

Tilastot

Virtsasta ja plasman ultrasuodosta havaittujen 1808 ominaisuuden puhdistumanopeuksia verrattiin kunkin koehenkilön kreatiniinin puhdistumanopeuksiin Wilcoxonin signed-rank-testillä käyttäen SAS Enterprise Guide 4.3:a, ja parittomat vertailut hemodialyysipotilaiden ja normaaleiden koehenkilöiden arvojen välillä tehtiin Mannilla. – Whitneyn U-testi SPSS V20:lla. Väärien havaintojen määrä laskettiin sitten käyttämällä Q-ARVOA.

KIITOKSET

Kiitämme tohtori Andres Martinezia California Polytechnic State Universitystä, San Luis Obispo, CA, USA, deuteroidun p-kresolisulfaatin synteesistä, Stanfordin yliopiston Vincent Coates Foundationin massaspektrometrialaboratorion henkilökuntaa analyyseissä avustamisesta ja Tohtori Jenny Shen Stanfordin yliopistosta saadakseen apua tilastojen kanssa. TLS:ää tuki Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation NKF Fellowship for the Study of Uremia. Toisen tuen tarjosi NIH (R21DK84439 ja RO1 DK80123 TWM:lle ja RO1 DK80123 THH:lle).

OHEISMATERIAALI

Taulukko S1. Normaalin koehenkilön ja hemodialyysipotilaiden ominaisuudet.

Taulukko S2. Massaspektrometriset ominaisuudet edustavat mahdollisesti munuaisten tehokkaasti poistamia liuenneita aineita ja niiden kertymistä hemodialyysipotilailla.

Taulukko S3. Tandem-massaspektrometria (MS/MS) ominaisuuksista, jotka tunnistetaan kemiallisesti liuenneiksi aineiksi, jotka munuaiset poistavat tehokkaasti.

VIITTEET

1. Vanholder R, Abou-Deif O, Argiles A, et ai. EUToxin rooli uremiassatoksiinien tutkimus. Semin Dial 2009; 22: 323–328.

2. Meyer TW, Sirich TL, Hostetter TH. Dialyysihoitoa ei voida annostella. Semin Dial2011; 24: 471–479.

3. Meyer TW, Hostter TH. Uremia. N Engl J Med 2007; 357: 1316–1325.

4. Niwa T. Ureemisen toksiinitutkimuksen päivitys massaspektrometrialla. Mass Spectrom Rev 2011; 30: 510–521.

5. Rhee EP, Souza A, Farrell L, et ai. Metaboliittien profilointi tunnistaa uremian merkkiaineet. J Am Soc Nephrol 2010; 21: 1041–1051.

6. Sato E, Kohno M, Yamamoto M et ai. Hemodialyysipotilaiden ihmisen plasman metabolinen analyysi. Eur J Clin Invest 2011; 41: 241-255.

7. Wishart DS, Knox C, Guo AC, et ai. HMDB: tietokanta ihmisen metabolomista. Nucleic Acids Res 2009; 37: D603–D610.

8. Smith CA, O'Maille G, Want EJ et ai. METLIN: metaboliittien massaspektritietokanta. Ther Drug Monit 2005; 27: 747–751.

9. Zimmerman L, Jornvall H, Bergstrom J. Fenyyliasetyyliglutamiini ja hippurihappo ureemisilla ja terveillä henkilöillä. Nephron 1990; 55: 265-271.

10. Guo K, Peng J, Zhou R et ai. Ionipariutuva käänteisfaasinestekromatografiafraktiointi yhdessä isotooppileimauksen kanssa Käänteisfaasinestekromatografia-massaspektrometria mahdollistaa kattavan metabolomin profiloinnin. J Chromatogr A 2011; 1218: 3689–3694.

11. Roux A, Xu Y, Heilier JF, et ai. Ihmisen aikuisen virtsan metabolomin ja aineenvaihduntatuotteiden tunnistamisen annotaatio käyttämällä ultra-korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa yhdistettynä lineaariseen kvadrupoli-ioniloukku-Orbitrap-massaspektrometriin. Anal Chem 2012; 84: 6429–6437.

12. Zhang T, Creek DJ, Barrett MP, et ai. Käänteisen faasin, vesipitoisen normaalifaasin ja hydrofiilisen vuorovaikutuksen nestekromatografian kytkemisen arviointi Orbitrap-massaspektrometrialla ihmisen virtsan metabolomisiin tutkimuksiin. Anal Chem 2012; 84: 1994–2001.

13. Duranton F, Cohen G, De Smet R et ai. Ureemisten toksiinien normaalit ja patologiset pitoisuudet. J Am Soc Nephrol 2012; 23: 1258–1270.

14. Wikoff WR, Anfora AT, Liu J et ai. Aineenvaihdunta-analyysi paljastaa suoliston mikroflooran suuret vaikutukset nisäkkään veren metaboliitteihin. Proc Natl Acad Sci USA 2009; 106: 3698–3703.

15. Evenepoel P, Meijers BK, Bammens BR et ai. Paksusuolen mikrobien aineenvaihdunnasta peräisin olevat ureemiset toksiinit. Kidney Int Suppl 2009; 76:S12–S19.

16. Schepers E, Glorieux G, Vanholder R. Suolisto: unohdettu elin uremiassa? Blood Purif 2010; 29: 130–136.

17. Meyer TW, Hostetter TH. Ureemiset liuenneet aineet paksusuolen mikrobeista. Kidney Int 2012; 81: 949-954.

18. Aronov PA, Luo FJ, Plummer NS et ai. Paksusuolen osuus ureemisissa liuenneissa aineissa. J Am Soc Nephrol 2011; 22: 1769–1776.

19. Smith HW, Finkelstein N, Aliminosa L et ai. Substituoitujen hippurihappojohdannaisten ja muiden aromaattisten happojen munuaispuhdistumat koiralla ja ihmisellä. J Clin Invest 1945; 24: 388–404.

20. Marshall EK Jr. Kaksi luentoa munuaisfysiologiasta. Fysiologi 1966; 9:367–384.

21. Benet LZ, Hoener BA. Muutoksilla sitoutumisessa plasman proteiineihin on vähän kliinistä merkitystä. Clin Pharmacol Ther 2002; 71: 115-121.

22. Oliver j. Munuaisen arkkitehtuuri kroonisessa Brithin taudissa. Paul B. Hoeber: New York, 1939.

23. Meyer TW. Tubulusvaurio glomerulaarisessa sairaudessa. Kidney Int 2003; 63:774-787.

24. Bradley SE, Bradley GP, Tyson CJ et ai. Munuaisten toiminta munuaissairauksissa. Am J Med 1950; 9: 766-798.

25. Bricker NS, Klahr S, Lubowitz H et ai. Munuaisten toiminta kroonisessa munuaissairaudessa. lääketiede (Baltimore) 1965; 44: 263-288.

26. Igarashi P, Gulyassy P, Stanfel L, et ai. Plasmahippuraatti munuaisten vajaatoiminnassa: korkean suorituskyvyn nestekromatografiamenetelmä ja kliininen sovellus. Nephron 1987; 47: 290-294.

27. Hannedouche T, Laude D, Dechaux M et ai. Plasman 5-hydroksi-indolietikkahappo munuaisten plasmavirtauksen endogeenisenä indeksinä. Kidney Int 1989; 35: 95-98.

28. Voelker JR, Cartwright-Brown D, Anderson S, et ai. Silmukan vertailu

diureetteja potilaille, joilla on krooninen munuaisten vajaatoiminta. Kidney Int 1987; 32: 572-578.

29. Meijers B, Viaene L, Poesen R. Arvioitu glomerulussuodatusnopeus on hyvä munuaispuhdistuman merkkiaine indoksyylisulfaatille ja p-kresyylisulfaatille PO384 ASN Kidney Week 2012.

30. Enomoto A, Takeda M, Taki K, et ai. Ihmisen orgaanisten anionien sekä kationinkuljettajien vuorovaikutukset indoksyylisulfaatin kanssa. Eur J Pharmacol 2003; 466: 13–20.

31. Sugawara M, Mochizuki T, Takekuma Y et ai. Rakenne-affiniteettisuhde ihmisen orgaanisen anionin kuljettajan 1 vuorovaikutuksessa kofeiinin, teofylliinin, teobromiinin ja niiden metaboliittien kanssa. Biochim Biophys Acta 2005; 1714: 85–92.

32. Anzai N, Kanai Y, Endou H. Orgaanisten anionien kuljettajaperhe: nykyinen tieto. J Pharmacol Sei 2006; 100: 411–426.

33. Miyamoto Y, Watanabe H, Noguchi T et ai. Orgaanisilla anioninkuljettajilla on tärkeä rooli p-kresyylisulfaatin, ureemisen toksiinin, imeytymisessä munuaisiin. Nephrol Dial Transplant 2011; 26(): 2498–2502.

34. Wikoff WR, Nagle MA, Kouznetsova VL et ai. Kohdistamaton metabolomiikka tunnistaa enterobiomimetaboliitit ja oletetut ureemiset toksiinit orgaanisen anionin kuljettajan 1 (Oat1) substraateiksi. J Proteome Res 2011; 10: 2842–2851.

35. Tang-Liu DD, Williams RL, Riegelman S. Kofeiinin ja sen metaboliittien jakautuminen ihmisessä. J Pharmacol Exp Ther 1983; 224: 180–185.

36. Psychogios N, Hau DD, Peng J et ai. Ihmisen seerumin metabolomi. PLoS One 2011; 6: e16957.

37. Nordstrom A, Want E, Northen T et ai. Usein ionisaatiomassaspektrometriastrategia, jota käytetään paljastamaan metabolomiikan monimutkaisuus. Anal Chem 2008; 80: 421-429.

38. Pluskal T, Castillo S, Villar-Briones A et ai. MZmine 2: modulaarinen kehys massaspektrometriaan perustuvan molekyyliprofiilitietojen käsittelyyn, visualisointiin ja analysointiin. BMC Bioinformatics 2010; 11: 395.

39. Feigenbaum J, Neuberg C. Yksinkertaistettu menetelmä aromaattisten rikkihappoestereiden valmistamiseksi. J Am Chem Soc 1941; 63: 3529–3530. 590 Kidney International (2013) 84, 585–590 cl I n I cal I nvest I gat I on TL Sirich et ai.: Liuenneet aineet puhdistettu tehokkaasti

For more information:1950477648@gmail.com