Norwogonin vaimentaa hypoksian aiheuttamaa oksidatiivista stressiä ja apoptoosia PC12-soluissa

Lisätietoja:ali.ma@wecistanche.com

Abstrakti

Tausta: Norwogonin on luonnollinen flavoni, jossa on kolme fenolista hydroksyyliryhmää luuston rakenteessa ja jolla on erinomainenantioksidanttiaktiivisuus. Norwogoniinin hermoja suojaava vaikutus on kuitenkin edelleen epäselvä. Täällä tutkimme norwogoniinin suojaavaa kykyä hapettumisvaurioita vastaan ​​PC12-soluissa. Menetelmät: Solujen elinkelpoisuus ja apoptoosi tutkittiin MTT-määrityksellä ja anneksiini V-FITC/PI-värjäyksellä, vastaavasti. Reaktiivisten happilajien (ROS) pitoisuus mitattiin käyttämällä DCFH-DA-määritystä. Laktaattidehydrogenaasi (LDH), malondialdehydi (MDA) jaantioksidanttientsyymitasot määritettiin käyttämällä kaupallisia sarjoja. Sukulaisten geenien ja proteiinien ilmentyminen mitattiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR:llä ja vastaavasti Western blot -menetelmällä. Tulokset: Havaitsimme, että norwogoniini lievitti hypoksian aiheuttamaa vauriota PC12-soluissa lisäämällä solujen elinkelpoisuutta, vähentämällä LDH:n vapautumista ja parantamalla muutoksia solun morfologiassa. Norwogonin toimi myösantioksidanttintpoistamalla ROS:n, vähentämällä MDA:n tuotantoa, ylläpitämällä superoksididismutaasin (SOD), katalaasin (CAT) ja glutationiperoksidaasin (GPx) aktiivisuutta ja alentamalla HIF-1- ja VEGF-ilmentymistasoja. Lisäksi wogoniini esti solujen apoptoosia estämällä kaspaasin -3, sytokromi c:n ja Bax:n ilmentymistasoja samalla kun nosti Bcl-2:n ilmentymistasoja ja Bcl-2/Bax-suhdetta. Johtopäätökset: Norwogonin vaimentaa hypoksian aiheuttamaa vauriota PC12-soluissa sammuttamalla ROS:n, ylläpitämällä antioksidanttientsyymien aktiivisuutta ja estämällä mitokondrioiden apoptoosin reittiä.

Avainsanat: Norwogonin,Antioksidanttiaktiivisuus, Hypoksia, Oksidatiivinen stressi,Apoptoosi

Tausta

Aerobiset organismit tarvitsevat happea (O2) energian tuottamiseksi. Hypoksia määritellään riittämättömäksi happipitoisuudeksi kudoksen solutoiminnan ylläpitämiseksi, ja sitä esiintyy usein joissakin fysiologisissa tilanteissa, kuten korkealla merenpinnasta [1], ja monissa patologisissa tilanteissa, kuten aivohalvauksessa [2]. Aivot ovat erityisen herkkiä hypoksian aiheuttamille vaurioille, koska ne kuluttavat runsaasti happea, sisältävät runsaasti tyydyttymättömiä rasvahappoja ja vähänantioksidanttikapasiteetti[3]. Yhä useammat todisteet ovat osoittaneet, että hypoksia voi aiheuttaa haitallisia vaikutuksia aivoihin [4–6].

Linlin Jing, Rongmin Gao, Jie Zhang, Dongmei Zhang, Jin Shao, Zhengping Jia ja Huiping Ma

Department of Pharmacy, 940th Hospital of Joint Logistics Support Force of PLA, Lanzhou 730050, Gansu, Kiina

Oksidatiivisen stressin ja apoptoosin katsotaan olevan kaksi vaikuttavaa tekijää hypoksian aiheuttamaan vammaan [7, 8]. Hypoksialle altistumisen on raportoitu lisäävän solunsisäisten reaktiivisten happilajien (ROS) tuotantoa, mikä helpottaa oksidatiivista stressiä. Liiallinen ROS, kuten superoksidianioni (O2−˙ ), vetyperoksidi (H2O2) ja hydroksyyliradikaali (HO•), johtaa rakenteellisiin ja toiminnallisiin solumuutoksiin hyökkäämällä lipidejä, kalvoja, proteiineja ja DNA:ta vastaan ​​ja aiheuttaa myöhemmin soluvaurioita. 9].

Klikkaa nähdäksesi NZ:n antioksidantteja varten

Samanaikaisesti ylituotettu ROS helpottaa myös mitokondrioiden läpäisevyyden siirtymähuokosten (mPTP) avaamista [10] ja pro-apoptoosin proteiinien siirtämistä mitokondrioiden ulkokalvolle, mikä indusoi mitokondrioiden kalvojen depolarisaatiota ja sytokromi c:n vapautumista [11]. Nämä muutokset aiheuttavat lopulta mitokondrioista riippuvaisen apoptoosin [12]. Joten uskotaan, että antioksidantit, joilla on kyky estää tai eliminoida liiallista ROS:ää, voivat vaikuttaa suojaavaan vaikutukseensa heikentämällä hapettumisstressiä ja hypoksian aiheuttamaa apoptoosia. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että antioksidanttiset lisäravinteet, kuten C-vitamiini [13], isoflavoni [8] ja nitroksidiradikaalit [14], voivat rajoittaa hypoksian aiheuttamia vaurioita in vitro ja in vivo. Flavonoidit ovat suuri ja monipuolinen luokka kaikkialla esiintyviä kasvien sekundaarisia metaboliitteja. Niitä pidetään aina erinomaisena luonnollisena antioksidanttina, jolla on kyky poistaa vapaita radikaaleja ja estää lipidien peroksidaatiota.

Tällä hetkellä tähän yhdisteluokkaan on kiinnitetty enemmän huomiota ihmisten terveyteen kohdistuvien hyödyllisten vaikutusten vuoksi. Flavonoideilla on osoitettu olevan laaja valikoima farmakologisia vaikutuksia, kuten anti-inflammatorisia, antinosiseptiivisiä ja hermostoa suojaavia vaikutuksia jne., jotka kaikki voidaan johtua niiden antioksidanttivaikutuksista [15]. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että flavonoideilla on erinomainen suojaava vaikutus hypoksian aiheuttamaan epäonnistumiseen. Rutiinilla on esimerkiksi voimakas hermosoluja suojaava vaikutus hypoksian aiheuttamaa verkkokalvon gangliosolukuolemaa vastaan ​​[16]. Tuore tutkimus osoittaa myös, että rutiini voi lievittää kobolttikloridin aiheuttamaa hypoksiavauriota estämällä oksidatiivista stressiä ja apoptoosia H9c2-soluissa [17]. Lisäksi Liu ym. ehdottavat, että nobiletiini (3',4',5,6, 7,8-heksametoksiflavoni) heikentää sydänlihaksen I/R-vaurioita aktivoimalla Akt/GSK-3-reitin H9c2-solussa [18]. Lisäksi asetiini voi suojata rotan sydänlihassoluja ja H9C2-kardiomyoblasteja hypoksian/uudelleenhapetuksen aiheuttamalta vauriolta Nrf2-signalointireitin AMPK-välitteisen aktivaation kautta [19].

Norwogonin (5,7,8-trihydroksiflavoni, kuva 1) on farmakologisesti aktiivinen flavoni, joka on erotettu Scutellaria baicalensis Georgin (kiinaksi "Huang Qin") juuresta. Se on perinteinen kiinalainen yrtti, jota käytetään influenssan ja syövän hoitoon. [20, 21]. Norwogoniinin biologisista vaikutuksista on kuitenkin raportoitu rajoitettuja tutkimuksia sen alhaisten pitoisuuksien vuoksi luonnollisissa kasveissa. Tämän ongelman ratkaisemiseksi on raportoitu useita norwogoniinin synteesimenetelmiä [22, 23].

Edellinen tutkimuksemme loi myös yksinkertaisen menetelmän norwogoniinin saamiseksi krysiinistä neljässä vaiheessa [24]. Nämä tutkimukset ovat vaikuttaneet myönteisesti norwogoninin biologisten toimintojen jatkoarviointiin. Tutkimukset ovat paljastaneet, että norwogoniinilla on antioksidantteja [25], syöpää [26, 27], antiviraalisia [28] ja antimikrobisia vaikutuksia [29] sekä se estää syanidistimuloitua ROS:n tuotantoa [30]. Ei kuitenkaan tiedetä, onko norwogoniinilla suojaava kyky hypoksian aiheuttamaa vauriota vastaan. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää norwogoniinin suojaavia vaikutuksia hypoksian aiheuttamaa oksidatiivista stressiä ja apoptoosia vastaan ​​PC12-soluissa.

menetelmät

Materiaalit ja reagenssit

Norwogoniini (puhtaus suurempi tai yhtä suuri kuin 98 prosenttia) syntetisoitiin aiemmin raportoidulla menetelmällämme [24]. Rutiini (puhtaus suurempi tai yhtä suuri kuin 96 prosenttia) ostettiin Ci Yuan Biotechnology Co., Ltd.:ltä (Xian, Shannxi, Kiina). Norwogoniini ja rutiini liuotettiin steriiliin dimetyylisulfoksidiin (DMSO), säilytettiin -20 asteessa ja laimennettiin soluviljelyalustaan ​​välittömästi ennen käyttöä. Dulbeccon modifioitu Eagle-elatusaine (DMEM), sikiön naudan seerumi (FBS), streptomysiini ja penisilliini ostettiin Solarbio co., Ltd:ltä (Peking, Kiina).

Malondialdehydin (MDA), laktaattidehydrogenaasin (LDH), superoksididismutaasin (SOD), katalaasi (CAT) ja glutationiperoksidaasin (GPx) sarjat hankittiin Nanjing Jiancheng Bioengineering Institutesta (Jiangsu, Kiina). 2',7'-dikloridihydrofluoreseiinidiasetaatti (DCFH-DA) ja (3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5- difenyylitetratsolium bromidi) tetratsolium (MTT) saatiin Sigma-Aldrich Co:lta (St. Louis, MO, USA). Primaariset vasta-aineet hypoksiaa aiheuttavalle tekijälle-1 (HIF-1 ), verisuonten endoteelikasvutekijälle (VEGF), B-solulymfoomalle-2 (Bcl-2), Bcl{{17 }} liittyvä X-proteiini (Bax), kaspaasi-3, sytokromi C ja -aktiini ostettiin kaikki Abcamilta (Cambridge, UK). Toissijaiset vasta-aineet saatiin ZsBio Companylta (Peking, Kiina).

Apoptoosianalyysipakkaus hankittiin Beyotime Institute of Biotechnologysta (Jiangsu, Kiina). Kaikki kemikaalit ja liuottimet olivat analyyttistä laatua, ja ne hankittiin kaupalliselta toimittajalta Kiinasta. Soluviljely PC12-solut ostettiin Kiinan tiedeakatemian Cell Bankista (TCR 9, Shanghai, Kiina) ja niitä ylläpidettiin DMEM:ssä, jossa oli 10 % (v/v) FBS, 100 U/ml penisilliiniä ja 100 U/ml streptomysiiniä. 37 asteessa kostutetussa inkubaattorissa, joka sisältää 5 prosenttia CO2:ta. Norwogoniinin sytotoksisuuden arvioimiseksi PC12-soluja (jaksotus 4 - 6) esi-inkuboitiin eri konsentraatioilla (10-8, 10-7, 10-6, 10-5, 10-4 mol/l) norwogoniinia. 1 h ja viljeltiin sitten 24 tuntia. Hypoksiaaltistus Solujen hypoksiavauriomallin indusoimiseksi PC12-solut altistettiin hypoksiaympäristölle (1 prosentti O2:ta, 5 prosenttia CO2:ta ja 94 prosenttia N2:ta) 37 asteessa 24 tunnin ajan kostutetussa kammiossa. Normoksisia kontrollisoluja viljeltiin 37 asteessa 5 % C02-inkubaattorissa 24 tuntia.

Norwogoniinin hypoksian aiheuttamaa vauriota vastaan ​​suojaavan vaikutuksen arvioimiseksi PC12-soluja esi-inkuboitiin eri pitoisuuksilla (10− 8, 10− 7, 10−6, 10−5 mol/ L) norwogoniinia 1 tunnin ajan ennen hypoksiahoitoa. Solujen elinkelpoisuus Solujen elinkelpoisuus mitattiin MTT-määrityksellä, kuten aiemmin on kuvattu [31]. Lyhyesti sanottuna PC12-solut (1 x 105 solua/ml) kylvettiin 96-kuoppaisille viljelylevyille. Sitten kuoppiin lisättiin erilaisia ​​pitoisuuksia norwogoniinia. Sama tilavuus DMSO:ta lisättiin kontrollikuoppiin. DMSO:n lopullinen pitoisuus soluviljelyväliaineessa on 0,1 prosenttia. Normoksisissa tai hypoksia-olosuhteissa inkuboinnin jälkeen kuhunkin kuoppaan lisättiin 10 µl MTT:tä (5,0 mg/ml), minkä jälkeen inkuboitiin 37 asteessa 4 tuntia. Sitten supernatantti MTT:llä poistettiin ja formatsaanituote liuotettiin 100 µl:aan DMSO:ta. Absorbanssi mitattiin SpectraMax i3 -mikrolevylukijalla (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 570 nm:ssä. Tulokset ilmaistiin vertailuryhmän suhteellisena prosenttiosuutena. Hematoksyliinia ja eosiinia (HE) värjääviä PC12-soluja, jotka oli kylvetty lasisille peitelevyille, inkuboitiin 24 tuntia ennen kuin niitä käsiteltiin norwogoniinilla samalla tavalla kuin edellä on kuvattu.

Väliaine poistettiin ja lasipeitelasit pestiin kylmällä PBS:llä, mitä seurasi fiksaatio metanolilla 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja pestiin sitten kylmällä PBS:llä kolme kertaa 5 minuutin ajan. Lopuksi solut värjättiin HE-värjäysprotokollan mukaisesti [32]. Solun analyysit suoritettiin käyttämällä OLYMPUS IX73 -mikroskooppia (100×) solun morfologisten muutosten todentamiseksi. Digitaaliset kuvat saatiin käyttämällä DXM 1200 C -digitaalikameraa (Nikon), joka on yhdistetty mikroskooppiin. ROS-pitoisuus Solunsisäinen ROS-taso PC12-soluissa määritettiin käyttämällä DCFH-DA-määritystä [33]. Lyhyesti sanottuna PC12-solut (1 × 105 solua/ml) kylvettiin 6-kuoppalevyille. Hypoksiakäsittelyn jälkeen PC12-solut pestiin PBS:llä ja inkuboitiin sitten viljelyväliaineessa, joka sisälsi 10 µM DCFH-DA:ta, 30 minuuttia pimeässä 37 asteessa. Soluja tarkkailtiin Olympuksen käänteisellä fluoresenssimikroskoopilla (Tokio, Japani) ja analysoitiin Bec ton Dickinson FACScan -virtaussytometrillä (BD Biosciences, CA, USA), jonka viritysaallonpituus oli 488 nm ja emissioaallonpituus 525 nm. ROS-taso ilmaistiin suhteellisena prosenttiosuutena kontrollista. LDH-vuoto, MDA-pitoisuus ja antioksidanttientsyymiaktiivisuus PC12-solut (1 x 105 solua/ml) kylvettiin 90 mm:n maljaan. Yllä kuvatun hypoksiakäsittelyn jälkeen kustakin maljasta kerättiin 50 µl viljelmän supernatanttia ja LDH-aktiivisuus väliaineessa havaittiin käyttämällä kaupallisia määrityssarjoja (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, Kiina) ja ilmaistiin U/ml. PC12-solut kerättiin ja homogenisoitiin sen jälkeen, kun ne oli pesty kaksi kertaa kylmällä PBS:llä. Kokonaisproteiinin konsentraatio mitattiin BCA-proteiinimäärityspakkauksella. MDA-pitoisuus ja antioksidanttientsyymiaktiivisuus määritettiin käyttämällä kaupallisia määrityspakkauksia (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, Kiina).

MDA-pitoisuus esitettiin yksikkönä nmol/mg proteiinia. SOD:n, CAT:n ja GPx:n aktiivisuudet esitettiin U/mg proteiinia. Soluapoptoosi (Aneksiini-V/PI-värjäys) Hypoksiakäsittelyn jälkeen PC12-solut kerättiin, pestiin kaksi kertaa kylmällä PBS:llä ja suspendoitiin sitten sitoutumispuskurilla. Solut käsiteltiin Annexin V-FITC- ja PI-liuoksella valmistajan protokollan mukaisesti (Beyotime, Shanghai, Kiina). Tietojen kerääminen suoritettiin käyttämällä Becton Dickinson FACScan -virtaussytometriä (BD Biosciences, CA, USA). Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi PC12-solujen kokonais-RNA uutettiin käyttämällä Trizol-reagenssia (Takara, Dalian, Kiina) ja muutettiin cDNA:ksi käyttäen PrimeScript TM RT -reagenssisarjaa (AK4301,

Takara, Dalian, Kiina). HIF-1, VEGF, Bcl-2, Bax, kaspaasi-3, sytokromi C ja glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) -geeniä koodaava cDNA monistettiin kvantitatiivisella reaali- aika-PCR käyttäen 7300 reaaliaikaista detektiojärjestelmää (Applied Biosystems, CA, USA). Käytetyt alukkeet on esitetty taulukossa 1. PCR-sykliolosuhteet olivat 95 astetta 30 s, mitä seurasi 40 sykliä 95 astetta 5 s ja 60 astetta 31 s. mRNA-tasot laskettiin käyttämällä 2-ΔΔCt-menetelmää ja normalisoitiin GAPDH:ksi, joka on vertailugeeni. Western blot -PC12-solut kerättiin ja homogenisoitiin RIPA-aineissa. Kokonaisproteiinien konsentraatio määritettiin käyttämällä BCA-proteiinimäärityspakkausta. 30 ug näytteitä erotettiin 12-prosenttisella SDS-PAGE-elektroforeesilla ja siirrettiin sitten polyvinylideenifluoridi (PVDF) -kalvoille (Millipore, Billerica, MA, USA).

Kalvot estettiin 5-prosenttisella rasvattomalla maidolla TBST-puskurissa 1 tunnin ajan huoneenlämmössä ja niitä inkuboitiin primääristen vasta-aineiden kanssa: anti-HIF-1 (1:300, ab179483, Abcam, UK), anti-VEGF (1:1000, ab46154, Abcam, UK), anti-Bcl-2 (1:1000, ab59348, Abcam, UK), anti-Bax (1:500, ab32503, Abcam, Iso-Britannia), antikaspaasi-3 (1:300, ab44976, Abcam, UK), antisytokromi C (1:1000, ab13575, Abcam, UK) ja anti- -aktiini (1:2000, ab8227) , Abcam, UK) 4 asteessa yön yli. Sitten kalvot pestiin ja inkuboitiin sekundaaristen vasta-aineiden kanssa (1:2000, ZsBio, Peking, Kiina;) 1 tunti huoneenlämpötilassa. Immunoreaktiiviset vyöhykkeet visualisoitiin käyttämällä tehostetun kemiluminesenssin (ECL) reagensseja. Vyöhykkeiden suhteelliset intensiteetit normalisoitiin -aktiinin sisäiseen kontrolliin ja analysoitiin käyttämällä Image-Pro Plus 6.0:aa (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA).

Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmaistiin keskiarvona ± SD, joka oli johdettu vähintään kolmesta riippumattomasta kokeesta. Ryhmien välinen ero analysoitiin käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA), jota seurasi Student–Newman–Keuls post hoc -testi. P-arvoa < 0,05="" pidettiin="" tilastollisesti="">

Tulokset

Norwogonin suojaa PC12-soluja hypoksian aiheuttamilta vaurioilta

Ensinnäkin norwogoniinin proliferatiivisen aktiivisuuden estämiseksi sen sytotoksisuus normaaleihin PC12-soluihin määritettiin käyttämällä MTT-määritystä. Kuten kuvasta 2a nähdään, solujen lisääntyminen ei muuttunut merkittävästi norwogoniinikäsittelyn jälkeen pitoisuuksilla 1 × 10- 8 -1 × 10- 5 mol/L (P > 0,05). ). Solujen elinkelpoisuus kuitenkin väheni merkittävästi, kun norwogoniinin pitoisuus nostettiin arvoon 1 × 10-4 mol/L (P < 0,05).="" tulokset="" osoittivat,="" että="" norwogoniinilla="" ei="" ollut="" toksisuutta="" tai="" proliferatiivista="" aktiivisuutta="" pc12-soluissa="" pitoisuuksilla="" 1="" ×="" 10="" -="" 8="" -1="" ×="" 10="" -="" 5="">

Sitten tutkimme norwogoniinin suojaavaa vaikutusta hypoksian aiheuttamaa PC12-soluvauriota vastaan. Kuten kuvasta 2b näkyy, verrokkiryhmään verrattuna solujen elinkelpoisuus hypoksiaryhmässä laski 58,71 prosenttiin (P < 0.01).="" verrattuna="" hypoksiahoitoon,="" esikäsitelty="" 1="" ×="" 10−="" 8,="" 1="" ×="" 10−="" 7="" ja="" 1="" ×="" 10−="" 6="" mol/l="" norwogoniinilla,="" annoksesta="" riippuvaisella="" suojatulla="" pc12:lla="" soluja="" hypoksian="" aiheuttamaa="" vauriota="" vastaan,="" palauttaen="" solujen="" elinkelpoisuuden="" 58,71="" prosentista="" 62,79="" prosenttiin="" (p="">< 0,05),="" 66,68="" prosenttiin="" (p="">< 0,01)="" ja="" 69,88="" prosenttiin="" (p="">< 0,01).="" esikäsittely="" 1="" ×="" 10-6="" mol/l="" rutiinilla="" osoitti="" myös="" suojaavaa="" vaikutusta,="" mikä="" nosti="" merkittävästi="" solujen="" elinkelpoisuutta="" 63,78="" prosenttiin="" hypoksiahoitoon="" verrattuna.="" 1="" ×="" 10-5="" mol/l="" norwogoniinilla="" esikäsitelty="" elinkyky="" laski="" 63,43="" prosenttiin,="" mikä="" on="" edelleen="" merkittävästi="" korkeampi="" kuin="" hypoksiaryhmässä="" (p="">< 0,05).="" nämä="" tulokset="" osoittivat,="" että="" norwogoniini="" osoitti="" merkittävää="" sytosuojaa="" pitoisuuksilla="" 1="" ×="" 10="" -="" 8="" -1="" ×="" 10="" -="" 5="" mol/l="" ja="" tehokkain="" pitoisuus="" on="" 1="" ×="" 10="" -="" 6="" mol/l.="" sitten="" tätä="" annosta="" käytettiin="" optimaalisena="" annoksena="" seuraavissa="">

Norwogoniinin suojaava kyky varmistettiin myös morfologisilla muutoksilla. Kuten kuviossa 2c esitetään, PC12-solut ilman hypoksiahoitoa kasvoivat hyvin säännöllisillä muodoilla (fusiform), tasakokoisina. Hypoksialle altistumisen jälkeen PC12-solut kutistivat, pyöreivät muotoa, hilseilivät ja vähensivät solutiheyttä. Ennen hypoksiaaltistusta norwogoniinilla tai rutiinilla esikäsitellyt solut kasvoivat paremmin, hilseilysolujen määrä väheni ja solujen muoto palautui normaalisti. Lisäksi norwogoniinin suojaava kyky vahvistettiin LDH-vuotolla, joka liittyy solukalvon eheyden menettämiseen. Kuten kuvassa 2d esitetään, LDH-aktiivisuus viljelyväliaineessa lisääntyi huomattavasti hypoksiaaltistuksen jälkeen (P <>

Esikäsittely norwogoniinilla tai rutiinilla vähensi dramaattisesti LDH-vuotoa, mikä viittaa siihen, että norwogoniini ja rutiini palauttivat solukalvon eheyden. Norwogonin estää hypoksian aiheuttamaa hapetusstressiä PC12-soluissa. ROS ja MDA ovat kaksi tärkeää osoittimia hypoksian aiheuttamasta soluhapetusstressistä. Kuten kuvioissa 3a ja b esitetään, PC12-soluissa havaittiin merkittävästi lisääntynyt ROS- ja MDA-pitoisuus hypoksiaaltistuksen jälkeen. Norwogoniinin tai rutiinin esikäsittely esti merkittävästi ROS:n ja MDA:n tuotantoa.

Antioksidanttisia entsyymejä, kuten SOD, CAT ja GPx, pidetään tärkeimpänä puolustusjärjestelmänä solujen oksidatiivista stressiä vastaan. Kuten kuvioissa 3c-e esitetään, hypoksialtistus esti merkittävästi SOD:n, CAT:n ja GPx:n aktiivisuuksia PC12-soluissa. Hoito norwogoniinilla tai rutiinilla kumosi nämä muutokset ja palautti antioksidanttientsyymien toiminnan. Kaikki nämä tulokset osoittivat, että norwogoniini suojasi PC12-soluja hypoksian aiheuttamalta oksidatiiviselta stressiltä.