NMR-pohjainen metabolinen analyysi ketoglutaraattilisän vaikutuksista C2C12-myoblasteihin eri energiatiloissa

Napsauta tästä saadaksesi Cistanche-ikääntymistä ja väsymystä lievittävät lisäravinteet

1. Esittely

Luurankolihas on ihmiskehon suurin elin ja ylläpitää normaalia elämää.Pitkäaikainen harjoittelutai patologinenl sairauksien prosessit aiheuttavat lihasvaurioitatailihasten riittämätön energian saanti, tällä hetkellä lihasvoiman ja toiminnan palauttaminen on erityisen tärkeää. Erilaisia ​​ravintolisiä on käytetty edistämään luustolihasten liikakasvua ja parantamaan urheilusuoritusta [1]. Orgaanisen hiilen ja typen aineenvaihdunnan leikkauspisteenä ja samanaikaisesti TCA-syklin kriittisenä välituotteena -Ketoglutaraatti (AKG) on osoittanut pleiotrooppisia vaikutuksia lihasten suorituskyvyn parantamiseen kliinisissä ja eläinkokeissa [2–9]. AKG voi esimerkiksi vähentää suolen limakalvovaurioita [8] ja tulehdusta [9], heikentääpaksusuolen syövän kehittyminen[4] ja maksafibroosi [5], edistävät kasvua [6] ja vähentävät sairastuvuutta javiivyttää ikääntymistä[7]. Aiemmat työt ovat osoittaneet, että AKG-lisähoito voi lievittää lihasten menetystä antamalla parenteraalisesti traumamallissa potilaita, joille tehdään täydellinen lonkkaproteesi [2], ja edistää lihasten hypertrofiaa ja proteiinisynteesiä Akt/mTOR-signalointireittien kautta [10,11]. Duchennen lihasdystrofian tapauksessa AKG-lisä voi estää lihasten surkastumista ja toimintahäiriöitä PHD3/ADRB{5}}välitteisen reitin kautta [12]. Aikaisempi työmme osoitti myös, että AKG-lisäys voi merkittävästi helpottaa C2C12-myoblastien proliferaatiota ja lievittää glukoosittomassa alustassa viljeltyjen C2C12-lihasputkien surkastumista [13]. Koska glukoosi on pääasiallinen energianlähde luurankolihasten normaalien fysiologisten toimintojen ylläpitämiseksi, AKG-lisän vaikutukset lihasten suorituskyvyn parantamiseen riippuvat suuresti luustolihaksen glukoositasosta. AKG:n aiheuttamien vaikutusten erot luurankolihaksissa eri energiatilojen välillä ovat epäselviä.

AKG osallistuu aminohappojen, vitamiinien ja vitamiinien synteesiinorgaaniset hapotjaenergian aineenvaihduntaaelimistössä, johon kuuluu AKG:n muuntaminen glutamaatiksi glutamaattidehydrogenaasin vaikutuksesta ja sitä seuraava glutamaatin amidointi ammoniakilla glutamiinisyntetaasin toimesta. AKG tarjoaa energiaa solujen kasvuun TCA-syklin ja oksidatiivisen fosforylaation kautta ja edistää solujen aineenvaihduntaa ja signalointia olemalla vuorovaikutuksessa sen reseptorin OXGR (G-proteiiniin kytketty reseptori) kanssa solukalvolla [14,15]. Lisäksi AKG voi säädellä mitokondrioiden oksidatiivista aineenvaihduntaa ja edistää sallivaa epigeneettistä tilaa välittämällä varhaista alkion solutilan muutosta ja sukusolujen kehitystä [16]. Lisäksi harjoituksen aiheuttama AKG voi stimuloida lisämunuaisten reseptoriaan OXGR1 kontrolloimaan lämpösyntymistä ja triglyseridien hajoamista rasvakudoksessa ja tuottaa hyödyllisiä vaikutuksia aineenvaihduntaan [17].

Kuitenkin vain vähän tutkimuksia on tehty paljastamaan AKG:n aiheuttamia metabolisia muutoksia luustolihaksessa eri energiatiloissa ja taustalla olevia metabolisia mekanismeja. Viime aikoina metabolomista analyysiä on käytetty systemaattisesti selventämään ravintolisän hyödyllisten vaikutusten taustalla olevia molekyylimekanismeja. Geenin transkription alavirran tuotteina toimivien metaboliittien vuorottelut voivat heijastaa yleisiä metabolisia muutoksia intuitiivisesti. Erityisen sopivina tekniikoina metaboliittitasojen muutosten kvantitatiiviseen havaitsemiseen bionesteissä, kudoksissa ja soluissa korkearesoluutioista 1H-ydinmagneettiresonanssispektroskopiaa (NMR) on käytetty laajasti metabolomissa analyyseissä. Merkittävää on, että NMR-pohjaisella metabolomisella profiloinnilla on useita etuja, kuten korkea toistettavuus, kvantitatiivinen mittaus ilman ennakkoluuloja ja kätevä näytteen valmistelu [18,19]. Aiemmin suoritimme NMR-pohjaisia ​​metabolomia analyyseja selvittääksemme sekä kreatiinilisän vaikutuksia C2C12-myoblasteihin [20] että alanyyliglutamiinilisän vaikutuksia energianpuutteen vahingoittamiin myoblasteihin [21].

2. Tulokset

2.1. C2C12-myoblastien lisääntyminen ja erilaistuminen AKG-täydennyksellä

C2C12-myoblastisolut, joita viljeltiin normaalissa kasvualustassa AKG-lisäyksen kanssa ja ilman, ryhmiteltiin Nor-A- ja Nor-ryhmiin, kun taas matalaglukoosipitoisessa kasvualustassa AKG-lisäyksen kanssa tai ilman sitä ryhmiteltiin Low-A- ja Low-ryhmiin. Edellisen tutkimuksen [10] mukaisesti Nor-A-solut, joissa oli AKG-lisää 2 mm:n pitoisuudella, osoittivat merkittävästi parantunutta solujen elinkelpoisuutta verrattuna Nor-soluihin (kuva S1).

Siksi AKG-konsentraatiota 2 mm käytettiin kokeissa arvioitaessa AKG:n aiheuttamia muutoksia myoblastien proliferaatiossa ja erilaistumisessa. Verrattuna Nor-soluihin Low-soluilla oli syvästi hidastunut lisääntymisnopeus energian puutteen vuoksi (kuvio 1A). Vaikka AKG-lisäys ei aiheuttanut merkittävästi erilaista myoblastien morfologiaa kahdessa energiatilassa, se ei ainoastaan ​​lisännyt matalaglukoosisessa elatusaineessa viljeltyjen Low-solujen proliferaationopeutta, vaan myös lisäsi normaalissa elatusaineessa viljeltyjen Nor-solujen proliferaationopeutta. aikaisemmat tutkimukset [10,12]. Solumäärät tiettyä aluetta kohti laskettiin neljälle myoblastiryhmälle (n=4 ryhmälle): Nor, 563,8 ± 10,4; Nor-A, 624,0 ± 10,8; alhainen, 493,8 ± 14,5; Alhainen A, 547,0 ± 11,7 (kuvio 1B). On syytä huomata, että Low-A-solut eivät näyttäneet tilastollisesti erilaisia ​​solumääriä Nor-soluista, mikä osoittaa, että AKG-lisäys saattoi palauttaa myoblastien solumäärät alhaisen glukoosin viljelyolosuhteissa (kuvio 1B).

Kuva 1, C2C12-myoblastien lisääntymis- ja erilaistumiskyky normaalin viljelyn olosuhteissa ja alhaisissa olosuhteissa. glukoosiviljelmä. (A) Myoblastien morfologiat. (B) Paneelia A vastaavat solujen numerot (n=4). (C) Solujen elinkelpoisuudet suhteessa Nor-soluihin, jotka on analysoitu MTS-soluproliferaatiomäärityksellä (n=5). (D) MyoD1-ilmentymät myoblasteissa analysoitu Western blot -menetelmällä. Anti-GAPDH-vasta-ainetta käytettiin standardoimaan proteiinin määrä kussakin kaistassa. (E) Paneeleja (D) vastaava tilastollinen analyysi (n=4). * p < 0.{{10}}5,** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.

Lisäksi suoritettiin MTS-määritys neljän soluryhmän proliferaationopeuksien vertaamiseksi kvantitatiivisesti (kuvio 1C). Matalailla soluilla oli selvästi alentunut proliferaationopeus verrattuna Nor-soluihin, mikä osoitti, että matalaglukoosipitoinen elatusaine haittasi solujen lisääntymistä. Merkittävää on, että AKG-lisäys paransi Nor-A- ja Low-A-solujen lisääntymisnopeuksia verrattuna Nor- ja Low-A-soluihin, vastaavasti. Huomaa, että Low-A-solujen lisääntymiskyky oli pienempi kuin Nor-soluilla, mikä tarkoittaa, että AKG-lisäys palautti vain osittain vähäglukoosisessa elatusaineessa viljeltyjen solujen lisääntymisen.

.Myogenic differentiation 1 (MyoD1) -proteiinin ilmentymistä käytetään yleensä karakterisoimaan solujen erilaistumiskykyä. Näin ollen vertailimme kvantitatiivisesti MyoD1:n ilmentymiä neljän soluryhmän välillä (kuva 1D). Matalat solut osoittivat syvästi heikentynyttä erilaistumiskykyä verrattuna Nor-soluihin. Merkittävää on, että AKG-suplementaatio lisäsi sekä normaalissa elatusaineessa että matalaglukoosisessa elatusaineessa viljeltyjen solujen erilaistumiskykyä, minkä osoittaa noin 30 prosentin lisäys MyoD1-ekspressiossa Nor-A- ja Low-A-soluissa. Erityisesti Low-A-solut eivät osoittaneet tilastollisesti merkitsevästi erilaista MyoD1-ilmentymistä Nor-soluista, mikä viittaa AKG-lisäyksen korkeaan tehokkuuteen vähäglukoosisessa väliaineessa viljeltyjen solujen erilaistumiskyvyn palauttamisessa.

Lisäksi analysoimme myotubien erilaistumiskykyjä neljälle C2C12-myoblastiryhmälle. Myotubes muodostettiin fuusioimalla myoblasteja, joita viljeltiin normaaleissa ja vähäglukoosisissa erilaistumisväliaineissa AKG-lisäyksen kanssa tai ilman sitä. Kuva S3). C2C12-lihasputkien morfologiat osoittivat, että vähäglukoosinen viljelmä heikensi solujen myotuben erilaistumiskykyä, ja AKG-lisäys voi edistää sekä normaalissa väliaineessa että glukoosipitoisessa elatusaineessa viljeltyjen myoblastien erilaistumista myotubissa.

2.2. C2C12-myoblastien vesipitoisten uutteiden NMR-spektrit

Tyypilliset 850 MHz:n 1H NMR-spektrit rekisteröitiin vesiuutteilla, jotka olivat peräisin C2C12-myoblastien Nor-, Nor-A-, Low- ja Low-A-ryhmistä (kuvio 2A). Yhteensä 34 metaboliittia osoitettiin ja niistä tehtiin yhteenveto taulukkoon S1. Metaboliittien resonanssimääritykset varmistettiin käyttämällä 2D 1H-13C HSOC- ja 1H-H TOCSY -spektrejä (kuvat S4 ja S5). NMR-spektrien visuaalinen tarkastus osoitti, että myoblastien viljeleminen AKG-lisäyksellä johti merkittäviin solunsisäisten AKG-solujen kerääntymiseen Nor-A- ja Low-A-soluihin (kuvio 2B).

Kuvio 2, Keskimääräiset 850 MHz:n lH-ydinmagneettiresonanssin (NMR) spektrit, jotka on tallennettu C2C12-myoblastien Nor-, Nor-A-, Low- ja Low-A-ryhmistä peräisin oleville vesiuutteille. (A) Neljän ryhmän keskimääräisten NMR-spektrien vertailu. Pystyasteikot pidettiin vakiona kaikissa 1H NMR-spektreissä. Vesialue (4.{7}}.2 ppm) poistettiin (B) Paikalliset monistetut a-ketoglutaraatti (AKG) -piikit alueet. Sininen/vihreä/keltainen/punainen viiva: spektrialueet Nor/Nor-A/Low/Low-A-ryhmistä. AKG, a-ketoglutaraatti; PC, O-fosfokoliini; GPC, sn-glysero-3-fosfokoliiniUDP-glukoosi, uridiinidifosfaattiglukoosi: CTP, sn-glysero-3-fosfokoliini; NAD plus, nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi AXP adeniinimono/di/trifosfaatti.

2.3. Monimuuttujatietojen analyysi solujen aineenvaihduntaprofiilien tutkimiseen

Lisäksi suoritimme monimuuttujadata-analyysin NMR-spektritiedoille C2C12-myoblastien neljän ryhmän metabolista profilointia varten. Perustimme ensin kolme valvomatonta PCA-mallia kahdella ensimmäisellä komponentilla (PC1, PC2) tarkastellaksemme ryhmittelytrendejä ja paljastaaksemme metaboliset erot myoblastiryhmien välillä. ThePCA-pisteytyskäyrät osoittavat, että matalaglukoosisessa elatusaineessa viljeltyjen solujen metabolinen profiili erottui selvästi normaalissa elatusaineessa viljellyistä soluista (kuva 3A), ja AKC-lisäys muutti merkittävästi sekä normaalissa väliaineessa viljeltyjen solujen aineenvaihduntakuvioita että matalaglukoosisessa elatusaineessa (kuvio 3B, C). Kuitenkin metabolinen ero Nor-A- ja Nor-ryhmien välillä oli suurempi kuin Low-A- ja Low-ryhmien välillä, mikä viittaa siihen, että AKG-lisän vaikutukset myoblastien metaboliseen profiiliin ovat suuresti riippuvaisia ​​solujen energiatilasta.

Kuva 3. Monimuuttujaanalyysit 'HNMR-spektreille rekisteröitiin vesiuutteilla, jotka oli johdettu Nor-, Nor-A-, Low- ja Low-A-ryhmien C2C12-myoblasteista. (AC) PCA:n pisteytyskaaviot Low- ja Nor-ryhmistä, Low-A- ja Low-ryhmät Nor-A- ja Nor-ryhmistä; (DF) OPIS-DA laskee pisteet Low- ja Nor-ryhmistä (R2: 0.999, 02: 0.996), Low-A- ja Low-ryhmistä (R2: 0.918: 02: 0.761), Nor-A- ja Nor-ryhmät (R2: 0,927: 02: 0,838). Ellipsit osoittavat 95 prosentin luottamusrajan.

Lisäksi perustimme kolme valvottua OPLS-DA-mallia havainnollistamaan metabolisia eroja neljän myoblastiryhmän välillä (kuva 3D-F). Kuten odotettiin, OPLSDA-mallit maksimoivat metaboliset erot neljän ryhmän välillä varaamalla korreloituneen ortogonaalisen muuttujan tiedot ja suodattamalla pois korreloimattoman ortogonaalisen muuttujan tiedot. Lisäksi suoritimme satunnaisia ​​permutaatiotestejä (n=200) arvioidaksemme OPLS-DA-mallien luotettavuutta (kuva S6), jotka osoittavat vakiintuneiden OPLS-DA-mallien validiteetin.

2.4. Erilaisten ja tärkeiden aineenvaihduntatuotteiden tunnisteet

Vertaaksemme kvantitatiivisesti metaboliittitasoja C2C12-myoblastien neljän ryhmän välillä, laskemme tunnistettujen metaboliittien suhteelliset tasot niiden suhteellisten integraalien perusteella (taulukko S2). AKG-lisä lisäsi dramaattisesti solunsisäisiä AKG-tasoja Nor-A- ja Low-A-ryhmissä, mutta ei merkittävästi muuttanut Nor- ja Low-ryhmän tasoja. Teimme Studentin t-testin tunnistaaksemme erilaiset metaboliitit kriteerillä p < 0,05 (kuva 4). Nor vs. Lowin vertailussa tunnistettiin 29 erilaista metaboliittia (kuva 4A), mukaan lukien 18 tehostettua metaboliittia (leusiini, isoleusiini, valiini, asetaatti, glutamaatti, glutamiini, metioniini, aspartaatti, lysiini, kreatiini, PC (O-fosfokoliini)tauriini, tyrosiini , fenyylialaniini, histidiini, NAD plus, formiaatti, AXP) ja 11 kieltäytyivät Metabosta. liteet (glutationi, pyroglutamaatti, fosfokreatiini, beeta-alaniini, GPC, glukoosi, glysiini, asetaatti, treoniini, GTP, UDP-glukoosi). Matala-A vs. vähän tunnistettujen erilaisten metaboliittien vertailu (kuva 4B), mukaan lukien 7 lisääntynyttä metaboliittia (etanoli, AKG-beeta-alaniini, PC, tauriini, glysiini ja GTP) ja 3 vähentynyttä metaboliittia (glutamiini, lysiini ja myoinositoli). Nor-A:n ja Norin vertailussa löydettiin 18 erilaista metaboliittia (kuvio 4C), mukaan lukien 6 ylössäädeltyä metaboliittia (AKG, pyroglutamaatti, glutamiini, lysiini, glukoosi, laktaatti) ja 12 alasäädeltyä metaboliittia (alaniini, asetaatti, glutationi) metioniini, fosfokreatiini, PC, myoinositoli, glysiini, treoniini, GTP, UDP-glukoosi ja AXP).

Kuva 4. Erilaisten metaboliittien suhteelliset intensiteetit tunnistettiin neljän C2C12-myoblastiryhmän parivertailuista. (A) Matala vs. ei; (B) Low-A vs. Low; (C) Nor-A vs. Nor. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.n { {13}} jokaiselle ryhmälle.

Lisäksi käytimme OPLS-DA-malleja tunnistaaksemme tärkeitä metaboliitteja, joiden kriteeri oli VIP > 1 (kuva 5). Yhteensä 12, 10 ja 10 tärkeää metaboliittia tunnistettiin OPLS-DA-malleista Nor-A vs. Nor, Nor vs. Low, Low-A vs. Low.

Kuvio 5. Tärkeiden metaboliittien VIP-pisteet tunnistettiin neljän C2C12-myoblastiryhmän parivertailuista. (A) Matala vs. ei; (B) Low-A vs. Low; (C) Nor-A vs. Nor. Punainen/sininen kirjasin tarkoittaa lisääntynyttä/laskua metaboliitin tasoa.

Tunnistettujen tärkeiden metaboliittien ja erilaisten metaboliittien yhdistelmä antoi tunnusomaisia ​​metaboliitteja (taulukko 1). Parittaiset vertailut Low vs. Nor, Low-A vs. Low ja Nor-A vs. Nor tunnistivat vastaavasti 10, 6 ja 10 ominaista metaboliittia, mikä osoittaa, että AKG-lisän vaikutukset myoblasteihin liittyivät läheisesti energiaan. solujen tila.

2.5. Merkittävästi muuttuneen aineenvaihdunnan tunnistaminen

Polut Suoritimme aineenvaihduntareittien analyysin tunnistaaksemme merkittävästi muuttuneet aineenvaihduntareitit (merkittävät reitit) perustuen metaboliittien tasoihin, jotka tunnistettiin neljän C1C12-myoblastiryhmän parivertailuista (kuva S7; taulukko 2 ja taulukko S3). Nor vs. Low -analyysi tunnisti 11 merkittävää reittiä: (1) alaniini-, aspartaatti- ja glutamaattiaineenvaihdunta; (2) glysiinin, seriinin ja treoniinin metabolia; (3) glutationin aineenvaihdunta; (4) D-glutamiini- ja D-glutamaatti-aineenvaihdunta; (5) Tärkkelyksen ja sakkaroosin aineenvaihdunta; (6) beeta-alaniinin metabolia; (7) tauriinin ja hypotauriinin aineenvaihdunta; (8) fenyylialaniinin metabolia; (9) Fenyylialaniinin, tyrosiinin ja tryptofaanin biosynteesi; (10) Nikotinaatti- ja nikotiiniamidiaineenvaihdunta; (11) Histidiinin metabolia. Tämä merkittävä reitti liittyi energia-aineenvaihduntaan, oksidatiiviseen stressiin ja TCA-syklin anapleroottiseen virtaukseen.

Nor-A vs. Nor -analyysissä tunnistettiin vain viisi ensimmäistä merkitsevää reittiä 1–5, lukuun ottamatta kuusi muuta reittiä 6–11. Alhaisen A vs. Low -analyysissä havaittiin eri tavalla vain kuusi merkittävää reittiä: neljä ensimmäistä reittiä 1–4, jotka jakavat vertailut Low vs. Nor, Nor-A vs. Nor; kaksi reittiä 6–7, jotka jaetaan Matala vs. Nor -vertailussa. Huomaa, että AKG-lisä ei merkittävästi muuttanut reittiä 5 (tärkkelyksen ja sakkaroosin aineenvaihdunta) soluissa, joita viljeltiin matalaglukoosisessa väliaineessa, mutta se häiritsi kahta muuta reittiä (beeta-alaniinin aineenvaihdunta sekä tauriini- ja hypotauriiniaineenvaihdunta). AKG:n aiheuttamien muutosten visualisoimiseksi tunnusomaisissa metaboliiteissa projisoimme nämä metaboliitit aineenvaihduntakartalle, joka perustuu Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) -tietokantaan (kuva 6). KEGG:tä on käytetty laajasti yhtenä tärkeimmistä tietolähteistä aineenvaihduntaverkostojen rekonstruoinnissa ja se korostaa merkittäviä aineenvaihduntareittejä. Sekä muuttuneet luonteenomaiset metaboliitit että merkittävästi muuttuneet aineenvaihduntareitit tarjoavat uusia näkemyksiä molekyylimekanismeista, jotka ovat taustalla AKG-lisän vaikutuksen C2C12-myoblasteihin.