Uudet kuvantamistyökalut nefronien määrän mittaamiseen in vivo: Kehitysnefrologian mahdollisuudet

Lisätietoja: ottaa yhteyttätina.xiang@wecistanche.com

Abstrakti

Nisäkäsmunuainenon monimutkainen elin, joka vaatii jopa miljoonien nefronien yhteistä toimintaa. Nefronien määrä on vakio nefrogeneesin jälkeen kehityksen aikana ja nefronien menetys eliniän aikana voi johtaa alttiuteen akuutille taikrooninen munuaissairaus. Uusia teknologioita on kehitteillä yksittäisten munuaisten nefronien laskemiseksi in vivo. Tässä katsauksessa hahmotellaan näitä tekniikoita ja korostetaan niiden merkitystä ihmisen munuaisten kehityksen ja sairauksien tutkimuksissa.

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja yrttisäiliöiden käytöstä

Johdanto

Nisäkkään munuainen on monimutkainen elin, joka on kehittynyt hallitsemaan monenlaisia ​​fysiologisia prosesseja. Näitä prosesseja ovat veren tilavuus, verenpaine, osmoottinen paine, jätteiden poisto ja metaboliittien homeostaasi. Normaali munuaisten kehitys edellyttää virtsanjohtimen ja metanefrisen mesenkyymin vastavuoroista muodostumista. Tätä seuraa iteratiivinen haarautumisprosessi ja signalointikaskadi ylläpitämään uusiutuvaa esisolujen poolia, jotka tuottavat erilaistuneita soluja, jotka suorittavat munuaisten erilaisia ​​toimintoja.

Nefrogeneesin kesto ja loppu vaihtelevat lajeittain. Ihmisillä ja kädellisillä syntymä ja ihmisen nefrogeneesin loppu tapahtuvat samanlaisina ajankohtina; nefrogeneesi päättyy ihmisillä noin 35 raskausviikolla. Lajeilla, jotka synnyttävät jälkeläisiä, on usein vaihteleva luonnollinen postnataalinen nefrogeneesi. Vaihteleeko nefronien lukumäärä lajin, kannan,seksiäsekä ympäristö- ja geneettiset tekijät? Ihmisen nefronien määrä vaihtelee suuresti (200,000 - 2,7 miljoonaa) ruumiinavaustutkimusten perusteella. Laaja valikoima nefronilukuja on havaittu myös ihmisen vastasyntyneen ruumiinavauksessa, mikä viittaa siihen, että tämä vaihteluväli muodostuu nefrogeneesin aikana.

Nefronien lukumäärä voi määrittää alttiuden lukuisille munuaissairauksille, ja nefronien menetys voi nopeuttaa kroonisen munuaissairauden (CKD) kehittymistä. Siksi on tärkeää pohtia alhaisen nefronien määrän ja häviämisen syitä ja ymmärtää, miksi niin laaja nefronien lukumäärä säilyy ihmisissä. On yhä enemmän todisteita siitä, että äidin terveyden ja ravinnon määräämät genetiikka ja epigeneettiset tekijät ovat kriittisiä nefrogeneesin määrääviä tekijöitä. Sikiön kehitystä rajoittaa äidiltä saatava energia, jota säätelee istukan toiminta. Lisääntymiskunnon ohjaama evoluutiovalintapaine on asettanut aivojen kasvun etusijalle sikiön ja varhaisen postnataalisen munuaisten kehityksen sijaan, ja yli 50 prosenttia lepotilassa olevasta aineenvaihduntanopeudesta kohdistuu aivoihin ensimmäisen elinvuoden aikana. Siten äidin aliravitsemus, ympäristöstressi tai infektio johtavat kohdunsisäiseen kasvun rajoittumiseen tai ennenaikaiseen synnytykseen ja DNA-metylaation vähenemiseen nefronien esisoluissa. Terveen munuaisen kehittämiseen tarvittavia molekyylimekanismeja on tutkittu pääasiassa jyrsijämalleilla. Viime aikoihin asti oli kuitenkin vain vähän suoria vertailuja munuaisten kehityksen välillä jyrsijöillä ja ihmisillä.

Nefronien katoaminen selviää tyypillisesti jäljelle jääneiden nefronien hypertrofiasta ja hyperfiltraatiosta, mikä on osoituksena koko munuaisen GFR:n ylläpitämisestä. Hypertrofia on lyhytaikainen sopeutuminen metabolisen homeostaasin ylläpitämiseen lisääntymisvuosien ajan. Adaptiiviseen hypertrofiaan liittyy kuitenkin fyysisiä rajoituksia, joita rajoittaa kuljetukseen tarvittava putkimainen pinta-ala ja virtausvastus, joka johtuu putken pituuden kasvamisesta. Tämä rajoitus voitetaan suurimmissa nisäkkäissä (valaat) pakkaamalla 100 miljoonaa nefronia pieniin unipapillaarisiin yksiköihin, jotka sisältävät lyhyitä tubuluksia. Lisääntymisvuosien jälkeen lisääntyvät solujen oksidatiiviset vauriot, jotka johtuvat kasautuvista stressitekijöistä (iskemia, hypoksia, infektio), edistää jatkuvaa nefronien menetystä, joka on päällekkäin vanhenemisen kanssa, mikä näkyy 50 prosentin vähenemisenä nefronien määrässä normaalissa ikääntyvässä väestössä.

Huolimatta kasvavasta ymmärryksestämme munuaisten kehityksestä ja raskausympäristön roolista munuaisten terveyden määrittämisessä, meiltä puuttuu edelleen integroitu näkemys yksittäisistä nefroneista ehjän, toimivan elimen kontekstissa. Nykyiset puolueettomat menetelmät glomerulusten lukumäärän arvioimiseksi edellyttävät munuaisten tuhoamista, mikä rajoittaa niiden potentiaalia pitkittäisanalyysissä ja in vivo -käytössä. Ei-invasiivisten kuvantamistekniikoiden kehittäminen toimivien nefronien määrän seuraamiseksi koko elinkaaren ajan antaisi keskeistä tietoa kroonisen munuaissairauden etenemisen ennustamiseen ja uusien interventioiden tehokkuuden mittaamiseen.

Uusia radiologisia työkaluja kehitetään vastaamaan näihin haasteisiin ja tarjoamaan ei-invasiivisia keinoja nefronimassan seuraamiseen ja mittaamiseen in vivo. Tällä tekniikalla on potentiaalia tarjota uusia näkemyksiä munuaisten kehityksestä ja sen roolista taudin etenemisessä myöhemmällä iällä. Tämän tekniikan avulla saatavilla olevia havaintoja ovat nefronien lukumäärä, glomerulusten tilavuus ja hypertrofia sekä mahdollisesti yhden nefronin toiminta. Tässä katsauksessa hahmotellaan tämän uuden teknologian nykytilaa ja annetaan näkemys sen mahdollisista sovelluksista prekliinisissä tieteissä ja kliinisissä tutkimuksissa.

Ex vivo -lähestymistapoja nefronien lukumäärän ja glomerulaarisen koon mittaamiseen

Laajimmin kehitetyt lähestymistavat nefronien lukumäärän ja glomerulusten koon mittaamiseen perustuvat suunnittelupohjaiseen stereologiaan. Kudos valmistetaan ja leikataan mikroskopiaa varten, ja objektilaseilla havaittujen rakenteiden, kuten glomerulusten, koot analysoidaan, jotta voidaan päätellä rakenteiden keskimääräiset tilavuudet alkuperäisessä kudoksessa. Tämä voidaan tehdä leikatuista elimistä tai koepalakudoksista ottamalla järjestelmällisesti ja satunnaisesti näytteitä kudoksesta. Dissektori-fraktiointitekniikka on paljastanut populaatioon perustuvia eroja nefronien lukumäärässä ja hyperfiltraatiossa ihmisillä25, ja sitä on käytetty laajasti ihmisten sairauksien eläinmallien tutkimiseen.

Stereologian edellyttämän leikkaamisen välttämiseksi kehitettiin äskettäin uusia kuvantamismenetelmiä täydentämään biopsiatietoja ja mittaamaan nefronilukuja. Magneettiresonanssikuvaus (MRI) perustuu useimmiten vesiprotonien havaitsemiseen kudoksesta, pääasiassa vedestä, magneettikenttien avulla. Kohde tai näyte sijoitetaan suuren magneettikentän sisään. Tyypilliset kliinisen MRI:n magneettikentän voimakkuudet vaihtelevat välillä 1,5 - 7 T. Prekliiniset MRI-järjestelmät käyttävät usein paljon suurempia kenttävoimakkuuksia korkean signaali-kohinasuhteen ja paremman kuvan kontrastin ja resoluution saavuttamiseksi. MRI tarjoaa laajan valikoiman kuvan kontrastitekniikoita pehmytkudosten kuvaamiseen, eikä se vaadi ionisoivaa säteilyä. MRI tarjoaa myös korkean resoluution sekä prekliinisissä että kliinisissä järjestelmissä.

Kationinen ferritiini (CF) otettiin käyttöön suonensisäisesti injektoituna varjoaineena, jotta voidaan havaita ja kuvata glomerulukset koko munuaisessa MRI:llä. Varautuneita nanohiukkasia, mukaan lukien ferritiini, oli käytetty vuosikymmeniä tyvikalvon rakenteen ja toiminnan tutkimiseen elektronimikroskopian (EM) avulla. Danon loi alun perin elektronimikroskopian merkkiaineena, joka osoitti, että se voi sitoutua anionisiin kohtiin. . Ferritiinimolekyyli havaitaan EM:ssä sen elektronitiheän rautaoksidiytimen vuoksi. Tämä sama rautaoksidiydin on usein magneettinen, joten se on havaittavissa MR:llä. Tätä tekniikkaa, kationisella ferritiinillä tehostettua MRI:tä (CFE-MRI), on käytetty jokaisen glomeruluksen laskemiseen terveissä rotan munuaisissa30, ex vivo, ja sitä käytettiin glomerulusten tilavuuden munuaisten sisäisen jakautumisen mittaamiseen. CFE-MRI:tä käytettiin myös jokaisen hiiren munuaisen glomeruluksen laskemiseen ja mittaamiseen3], ja glomerulusten tilavuudet kartoitettiin glomerulusten koon spatiaalisen vaihtelun paljastamiseksi. Useat ryhmät ovat vahvistaneet nämä havainnot. Sekä rotan että hiiren mittaukset CFE-MRI:tä käyttäen validoitiin dissektori-fraktioija-stereologialla.

CFE-MRI on tehty myös ehjillä ihmisen luovuttajan munuaisilla, joissa CF injektoitiin suoraan munuaisvaltimoon ja munuainen huuhdeltiin suolaliuoksella ennen kiinnitystä ja kuvantamista. CFE-MRI ihmisen munuaisissa tarjosi kolmiulotteisen kuvanmunuaisten glomerulaarinenmorfologia, joka osoittaa heterogeenista glomerulusten hypertrofiaa ja nefronien menetyksen alueita, jotka todennäköisesti liittyvät potilaan hoitamattomaan verenpaineeseen. Nefronien katoamisen alueet korreloivat samojen alueiden histologian kanssa, mikä osoitti sekä verisuoni- että glomeruluskleroosia.

Nämä alkuperäiset tutkimukset keskittyivät muutoksiin nefronien lukumäärässä ja glomerulusten morfologiassa sekä kroonisessa että akuutissa munuaissairaudessa. Julkaisussa Bennett et al Hiirillä CFE-MRI:tä on sovellettu glomerulaarisen hypertrofian havaitsemiseen ja kartoittamiseen nefronien pelkistyksen oligosyndaktylismi (Os/ plus) -mallissa31. Äskettäin osoitimme senakuutti munuaisvauriovastasyntyneen kanimallissa aiheutti havaittavissa olevan glomerulusten häviämisen verisuonten uudelleenorganisoinnilla35 Täten CF-leimauksen muutosten seuraaminen MRI:llä voi olla tärkeä työkalu, jotta voidaan ymmärtää vaurion vaikutus kehityksen aikana ja sen vaikutus munuaisten terveyteen myöhemmällä iällä.

On olemassa joitakin tärkeitä näkökohtia CFE-MRI:n validoinnissa käyttämällä muita tekniikoita, kuten näissä varhaisissa tutkimuksissa käytettyä ohjaaja-fraktioija-stereologiaa. CFE-MRI voi mitata vain glomeruluksia, jotka ovat perfusoituja, kun taas histologiset lähestymistavat havaitsevat myös glomerulukset, joita ei ole. Jos näitä kahta verrataan suoraan, kun on ali- tai perfusoimattomia glomeruluksia, MRI-mittaukset ovat alhaisemmat. Rakenteelliset ja toiminnalliset tekijät, kuten onkoottinen paine, kapillaariperfuusionopeudet ja GBM-rakenne, jotka vaikuttavat CF:n kertymiseen GBM:ssä, ovat huonosti ymmärrettyjä, joten on mahdollista, että glomerulusten ottoa moduloivat sairausprosessit, jotka moduloivat CFE-MRI:tä tavalla. joita ei ole kuvattu. Lopuksi GBM-vaurio tai proteinuria voi aiheuttaa CF:n vuotamisen tubuluksiin, mikä johtaa magneettikuvauksessa havaittuun glomerulusten diffuusiin eikä pistemäiseen leimaamiseen. Kehitystutkimuksissa GBM-varausrakenne ja glomerulussuodatus vaihtelevat raskauden iän mukaan. Kaikissa näissä tapauksissa on tärkeää ymmärtää CF-leimaukseen liittyvät parametrit jatkuvien tutkimusten kautta. On myös tärkeää määrittää CF:n toksikologia, joka näyttää olevan minimaalista terveillä eläimillä, mutta joka on tutkittava jokaisen uuden mallin yhteydessä.

Röntgen-CT on äskettäin osoitettu munuaisten mikrorakenteen mittaamiseen ja nefronilukujen kartoittamiseen ehjässä munuaisessa ex vivo. TT:n ensisijainen etu on sen yksinkertaisuus ja nopeus sekä alhaiset kustannukset verrattuna magneettikuvaukseen. Haittapuolena on ionisoivan säteilyn käyttö, joka voi rajoittaa sen käyttöä in vivo tai kliinisissä sovelluksissa. Siitä huolimatta C tarjoaa leimattujen rakenteiden korkearesoluutioisen kuvantamisen ex vivo, joka voidaan sitten rekisteröidä yhdessä pehmytkudosten anatomian kanssa käyttämällä muita kuvantamismenetelmiä.

Valolevymikroskopiaa koko elimen optisen puhdistamisen jälkeen on käytetty glomerulusten lukumäärän ja kapillaaritupin koon mittaamiseen koskemattomissa hiiren munuaisissa. Tämän houkuttelevan lähestymistavan etuna on koko glomeruluksen automatisointi ja visualisointi mikroskooppisella resoluutiolla koko elimessä tai näytteissä suurista elimistä.

In vivo -lähestymistapoja nefronien lukumäärän ja glomerulaarisen koon mittaamiseen

Vakiintuneet ja kehittyvät työkalut nefronien määrän mittaamiseen ex vivo ovat tehneet mahdolliseksi päätellä nefronien lukumäärän ja glomerulusten tilavuuden yksilöiden välisestä ja sisäisestä heterogeenisuudesta. Nämä työkalut alkavat korjata kriittisiä aukkoja tietämyksessämme munuaisten rakenteesta ja siitä, miten se liittyy munuaisten toimintaan in vivo. Näitä kysymyksiä ovat muun muassa: 1) Mikä on munuaiskerästen lukumäärän ja koon välinen suhde yksittäisen nefronisuodatuksen kanssa?, 2) Mikä on nefronien lukumäärän ja glomerulusten koon spatiaalinen jakauma ja sen suhde patologiaan? ja 3) Onko glomerulusten vanhenemisnopeus muutoksia terveydessä ja munuaissairaudessa? Kliinisesti on mahdollista arvioida nefronien lukumäärä in vivo käyttämällä röntgen-/CT- ja biopsian yhdistelmää. Tämäntyyppinen työ alkaa tarjota kriittistä yhteyttä nefronien määrän ja munuaisten toiminnan välille. Useat julkaisut ovat osoittaneet, että MRI:tä voidaan käyttää yksittäisten glomerulusten havaitsemiseen elävässä eläimessä. Varhainen työ tällä alueella käyttämällä CFE-MRI:tä rajoittui tiettyihin munuaisen alueisiin. Eräässä raportissa kehitettiin langaton vahvistin lisäämään paikallisesti signaalia munuaisissa mahdollistamaan yksittäisten nefronien yhteisrekisteröinnin suodatuksen ja toiminnan aikana4. Äskettäin kahdessa julkaisussa on raportoitu yksittäisten glomerulusten mittauksista in vivo koko munuaisessa CFE-MRI:llä sekä rotilla että hiirillä. Tätä lähestymistapaa käytettiin myös pitkittäistutkimuksessa, joka osoitti, että CFE-MRI:tä voidaan mahdollisesti käyttää seuraamaan nefronien lukumäärän muutoksia ajan kuluessa vasteena terapiaan tai seuraamaan munuaisten kehitystä.

Ensisijainen haaste CFE-MRI:lle in vivo on herkkyys. Deoksihemoglobiini veressä on paramagneettista ja voi aiheuttaa magneettisen herkkyyden artefaktin kapillaareissa, mikä vähentää dynaamista aluetta CF-leimattujen glomerulusten havaitsemisessa. Tämän ratkaisemiseksi ferritiiniä voidaan modifioida sisältämään enemmän rautaa ja CF:n metallioksidiydintä voidaan muokata, jotta se olisi helpompi havaita ilman herkkyysartefaktia. Muissa havaitsemisstrategioissa on kuitenkin kompromisseja tuotteen tuoton tai kuvantamisnopeuden suhteen, joten ensimmäinen CFE-MRI:n esittely ei käyttänyt näitä lähestymistapoja. CFE-MRI:n avain on hallita liikettä ja varmistaa, että radiotaajuinen (RF) kela on riittävän herkkä koko munuaisessa.

Nefrologian kehitysnäkymät: Rakenne ja toiminta Tässä olemme kuvanneet uusia työkaluja, joilla mitataan suoraan nefronien varallisuutta sekä ex vivo että in vivo. Röntgen-CT tarjoaa nopean kuvanoton ja fenotyypin määrittämisen ex vivo. Työkaluilla, kuten röntgen-CT:llä yhdistettynä biopsiaan, on se etu, että ne otetaan nopeasti käyttöön klinikalla, ja haittapuolena on invasiivisuus, ionisoivan säteilyn käyttö ja mahdollisuus näytteen harhaan. MRI-pohjaiset lähestymistavat poistavat ionisoivan säteilyn tarpeen ja tarjoavat yhdistetyn pehmytkudoskontrastin, ja niitä voidaan käyttää sekä ex vivo että in vivo. CFE-MRI vaatii varjoaineen injektion, jonka on katsottava olevan turvallinen, ennen kuin sitä voidaan käyttää klinikalla. Vaikka nefronien määrän in vivo -mittaus on lapsenkengissään, uudet kuvanottosekvenssit nopeaa kuvantamista varten, parannetun laitteiston ja kuvankäsittelyn lisäksi voivat tehdä näistä MRI-työkaluista käytännöllisiä rutiinikäyttöön. Kun tekniikka kehittyy, muita pulssisekvenssejä käytetään vähentämään herkkyyttä CF-indusoidulle herkkyysartefaktille, ja paikallisen magneettisen ympäristön fysiikka ymmärretään paremmin, jotta se mahdollisesti paljastaa vielä enemmän tietoa. On myös ainutlaatuisia mahdollisuuksia yhdistää glomerulaarinen ja tubulaarinen morfologia muihin kuvanottostrategioihin, jotta saadaan täydellinen kuva munuaisten mikrorakenteesta, karkeasta anatomiasta ja fysiologiasta in vivo. Tätä yhdistettyä tietoa voidaan käyttää tutkimaan nefronihäviön kehittymistä ajan mittaan, mikä on sekä akuutin että kroonisen munuaissairauden ensisijainen piirre ja etenevien munuaissairauksien kehittymisen aikana.

Kuvien visualisoinnin ja segmentoinnin viimeaikainen jalostus analyyttisten työkalujen tai tekoälyn avulla mahdollistaa suurten tietomäärien poimia kolmiulotteisista kudoskuvista. Jotkut nousevat tekniikat, kuten herkkyystensorikuvaus, lupaavat tarjota uutta tietoa, jota voidaan käyttää kudoksen mikrorakenteen korvikkeena. Munuaisissa tämä voi helpottaa glomerulusten, tubulusten, verisuoniston ja interstitiumin yhdistettyjä karttoja yhteisrekisteröityjen kuvien yhdistelmästä. Voi myös olla mahdollista rekisteröidä nämä kuvat suoraan optiseen kuvantamiseen tai muilla radiologisilla kuvantamismenetelmillä saatuun tietoon. Kussakin tapauksessa on tärkeää validoida nämä uudet työkalut kattavasti ja lopulta standardoida joitakin hankintaprotokollia eri instituutioissa korkean toistettavuuden varmistamiseksi. Uusien työkalujen saatavuus ja helppokäyttöisyys ohjaavat todennäköisesti uusia lähestymistapoja tietotieteeseen, jotta voidaan integroida tiedot kaikista näistä kontrastimekanismeista ja -modaliteeteista, jotta saadaan uusi, kvantitatiivinen näkemys munuaisista monissa koehenkilöissä. Kehityksessä näitä työkaluja voidaan lopulta yhdistää pitkittäistutkimuksiin. Uuden koneoppimisen käyttöönotto ja luominen on ratkaisevan tärkeää tässä pyrkimyksessä.

Jäljellä oleva haaste on kääntää nefronimäärän mittaukset ihmisten in vivo -kuvausta varten49. Nefronien lukumäärän tai munuaiskerästen tilavuuden kliininen mittaus voisi mahdollistaa yksilöllisiä hoitoja, jotka on räätälöity tiettyjen potilaiden havaintojen mukaan, ja se voisi tarjota täysin uudenlaisen kuvan ihmisen munuaisista. kehitystä.