Osa 1 Fenyylietanoliglykosidien neurosuojaavat vaikutukset Alzheimerin taudin in vitro -mallissa

Onko Cistanchen hermoja suojaava vaikutus todellinen?

JIANHUA YANG1*, BOWIE JU1,2*, YAO YAN1, HUAN HUAN XU1,

SHANSHAN WU1, DANDAN ZHU1, DANDAN CAO1 ja JUMPING HU2

1 Farmasian osasto, The First Affiliated Hospital; 2 Luonnonlääkkeiden osasto,

College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi, Xinjiang 830011, PR Kiina

Vastaanotettu 8. tammikuuta 2016; Hyväksytty 6.1.2017

Abstrakti.

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia hermostoa suojaavia vaikutuksiafenyylietanoidiglykosidit(PhG:t) H2O2-- ja -amyloidipeptidillä (A )1-42- indusoivat PC12-solujen vaurioita Alzheimerin taudin (AD) in vitro -mallina. Optimaaliset induktioolosuhteet määritettiin seulomalla eri inkubaatioaikoja ja pitoisuuksia. PC12-soluja käsiteltiin 0,5 µM A 1-42:lla ja H202:lla PhG:iden läsnä ollessa 24 tunnin ajan ja solujen elinkelpoisuus arvioitiin sitten MTT-määrityksellä; Myös laktaattidehydrogenaasin (LDH) vapautuminen ja malondialdehydi (MDA) pitoisuus mitattiin. Optimaaliset olosuhteet AD-mallin luomiselle olivat PC12-solujen käsittely 0,5 µM A 1-42:lla 48 tunnin ajan tai 25 µM H2O2:lla liuotettuna DMEM:ään PBS:n kanssa. PhG:t pitoisuuksina 5, 25 ja 50 µg/ml lisäsivät A 1-42:lla tai H2O2:lla vaurioituneiden PC12-solujen LDH:n ja MDA:n vapautumista. Yhteenvetona voidaan todeta, että A-1-42-- ja H2O2--indusoitujen PC12-soluvaurioiden malli luotiin onnistuneesti. PhG:illä osoitettiin olevan merkittävä neuroprotektiivinen vaikutus A-1-42-- tai H2O2--indusoitua soluvauriota vastaan.

Lisätietoja saat ottamalla yhteyttä:joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticolalla on monia vaikutuksia, napsauta tästä saadaksesi lisätietoja

Johdanto

Alzheimerin tauti (AD), neurodegeneratiivinen sairaus, jonka kliiniset ominaisuudet ovat etenevä muistin menetys ja kognitiivisten toimintojen heikkeneminen (1), on yleisin dementian syy maailmanlaajuisesti (2). Taloudelliset kustannukset ovat valtavat AD:n esiintyvyyden vuoksi (3). Siksi on kiireellisesti kehitettävä asianmukaiset keinot AD:n hallintaan ja ehkäisyyn.

AD:n patogeneesi liittyy läheisesti neurofibrillaaristen kimppujen ja seniiliplakkien (SP) kerääntymiseen sairastuneille aivoalueille (4, 5). -amyloidipeptidillä (A), SP:iden pääkomponentilla, on raportoitu olevan aiheuttava rooli AD:n etenemisessä, koska sillä on toksinen vaikutus hermosoluihin (6). A-fragmentit, mukaan lukien A 1-40, A 25-35 ja A 1-42, on syntynyt amyloidiprekursoriproteiinin (7) halkeamisen kautta. A:n 1-42 neurotoksisuuden havaittiin olevan merkittävästi korkeampi kuin A:n 25-35 ja A 1-40, ja A 1-42 pystyy indusoimaan AD-mallin (1,{ {13}}). Oksidatiivinen stressi voi olla osallisena AD:n patogeneesissä, ja se on tärkein mekanismi A:n aiheuttaman neurotoksisuuden taustalla (11-13). Useat tutkimukset viittaavat siihen, että A 1-42 aiheutti reaktiivisten happilajien (ROS) kertymistä solunsisäiseen, mikä johti lipidien ja proteiinien hapettumiseen, DNA-vaurioihin ja solusyklin tarkistuspisteiden signaalin aktivoitumiseen (1,14,15). Liialliset H2O2-määrät voivat johtaa oksidatiivisiin vaurioihin ja indusoida PC12-solujen apoptoosia (16). Siksi oksidatiivisen stressin kohdistaminen voi olla lupaava lähestymistapa terapeuttisten strategioiden kehittämisessä A-indusoidun neurotoksisuuden estämiseksi AD:ssa. Herba (H.)Cistanche, kiinalaista kasviperäistä lääkettä, jota käytetään yleisesti Manner-Kiinassa munuaisten ravitsemiseen ja esanssin ja veren täydentämiseen, on käytetty muistin menetyksen ja seniilin ummetuksen hoitoon (17).Fenyylietanoidiglykosidi(PhG), yksi H:n tärkeimmistä aineosista.Cistanche, parantaa A 25-35:n aiheuttamaa hermosolujen apoptoosin heikkenemistä antioksidanttisten vaikutustensa kautta (18,19). Edellisessä tutkimuksessa tunnistettiin viisi pääkomponenttia kaikista PhG:istä, nimittäinakteosidi, 2'-asetyylilakteosidi, ekinakosidi, cistanosidit jaisoakteosidi(20). Näiden komponenttien joukossaakteosidijaekinakosidiniillä on raportoitu olevan hermostoa suojaavia vaikutuksia A-25-35-- tai H2O2--indusoituun neurotoksisuuteen (21-23). Esimerkiksi Wu et al (24) ehdottivat sitäakteosidijaekinakosidiparantunut kognitiivinen toimintahäiriö, jonka aiheutti A 1-42. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia PhG:iden suojaavia vaikutuksia AD:n in vitro rottasolumallissa.

Materiaalit ja menetelmät

Valmistautuminen/PhGs. Yhteensä PhG:t uutettiinH. Cistanchekuten aiemmin on kuvattu (25). Ilmakuivattu varsiH. Cistanche jauhettiin ja uutettiin perkolaatiolla 80-prosenttisella EtOH:lla. Perkolaatti haihdutettiin pelkistettynä

paine, jonka jälkeen suspendoidaan uudelleen sopivaan määrään H:ta₂O₂(100 µmol/l). Seos eristettiin makrohuokoisessa SP-825-hartsikolonnissa (Mitsubishi Chemical, Tokio, Japani) ja eluoitiin 0, 30, 50, 70 ja 90 % EtOH:lla vedessä. PhG-rikkaan fraktion saamiseksi 30-50 % EtOH-eluentit konsentroitiin ja kuivattiin alennetussa paineessa. Ultravioletti (UV) spektrofotometria suoritettiin PhG:iden kokonaismäärän määrittämiseksi. Sisältöekinakosidijaakteosidimääritettiin korkeapainenestekromatografialla aikaisemman protokollan mukaisesti (26). Hypersil ODS-2 -kolonnia (4,6 x 250 mm, 5 µm; Dalian Elite Analytical Instruments, Co., Ltd., Dalian, Kiina) käytettiin ja pidettiin huoneenlämpötilassa. Liikkuvat faasit olivat metyylisyanideja ja vettä, joka sisälsi 0,4 % fosforihappoa (tilavuus/tilavuus; Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Saksa). Virtausnopeus oli 0,75 ml/min ja aallonpituus asetettiin 333 nm:iin.

Soluviljelyjalääkehoito.PC12-rotan feokromosytoomasolulinjan toimitti tri He Chunhui, lääketieteellinen tiedekunta, Xinjiang Medical University (Urumqi, Kiina). Soluja viljeltiin runsaasti glukoosia sisältävässä Dulbeccon modifioidussa Eagle's-elatusaineessa (DMEM; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA), joka sisälsi 10 prosenttia naudan sikiön seerumia (Sangon Biotech Co. Ltd., Shanghai, Kiina), 100 U/ml penisilliiniä ja 100 U/ml streptomysiiniä inkubaattorissa 37 ˚C:ssa, joka sisältää 5 prosenttia CO₂ja 95 prosenttia ilmaa. Saavuttuaan 80 prosentin konfluenssin soluja käsiteltiin 0,25 prosentilla trypsiinillä ja siirrostettiin.

Myrkyllisyyskoe suoritettiin, jotta eliminoitiin itse lääkkeen häiriö PC12-solujen kasvuun. Lyhyesti sanottuna PC12-solut (3x10⁴soluja/ml) ympättiin 96-kuoppalevyille 100 µl/kuoppa ja inkuboitiin 37 ˚C:ssa yön yli. Supernatantin hävittämisen jälkeen 200 µl täydellistä DMEM:ää lisättiin nollaryhmään, kun taas interventioryhmien soluja käsiteltiin PhG:illä eri annoksilla (5, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 ja 200 µg/ ml). Kun soluja oli inkuboitu 37 °C:ssa 48 tuntia, kuhunkin kuoppaan lisättiin 20 µl MTT-liuosta (Sigma-Aldrich; Merck KGaA). 4 tunnin inkubaation jälkeen supernatantti heitettiin pois ja 150 ui dimetyylisulfoksidia lisättiin kuoppaa kohti, minkä jälkeen sekoitettiin 10 minuuttia. Optisen tiheyden (OD) arvot 490 nm:ssä havaittiin käyttämällä ELISA-levylukijaa.

A 1‑ 42- aiheutettuPC12soluvaurio.Bioss Biotechilta (Peking, Kiina) ostettu 1-42-peptidi liuotettiin veteen (100 µg/ml). Sen jälkeen seosta inkuboitiin 37 °C:ssa 4 päivää ja säilytettiin 4 °C:ssa ennen käyttöä.

PC12-solut kylvettiin 96-kuoppalevyille (3xl0⁴soluja 100 µl per kuoppa). 24 tunnin viljelyn jälkeen kiinnittymistä varten liukeni 50 µl A 1-42 eri loppupitoisuuksilla (0, 0,25, 0,5, 1, 1,5 tai 2 µM) seerumivapaassa DMEM:ssä lisättiin, minkä jälkeen inkuboitiin 24, 48, 72 tai 96 tuntia. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT-määrityksellä. Optimaalinen A 1-42 -pitoisuus oli 0,5, joka määritettiin olevan µM. PC12 solut (3xl0⁴soluja per kuoppa) käsiteltiin erilaisilla PhG-annoksilla ({{0}}, 0,5, 5, 25 tai 50 µg/ml) 0,5 µM A {{8 }} 24 tunnin ajan. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT-määrityksellä.

H₂O₂- aiheutettuPC12soluvaurio. PC12-solut maljattiin kylvettyinä 96-kuoppalevyille (3xl0)⁴soluja 100 µl:ssa per kuoppa). Viljelyn jälkeen

24 tunnin ajan kiinnittymistä varten, 100 µl H₂O₂eri loppupitoisuuksilla ({{0}}, 25, 50, 100, 200, 300, 400 ja 500 µM) liuotettuna DMEM:ään PBS:n (0,01 mol/l) kanssa tai ilman sitä, minkä jälkeen inkuboitiin 24 h. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT-määrityksellä. Optimaalinen H₂O₂pitoisuus ja liuotin määritettiin määrittämäänin vitroAD malli.

PC12-kennot (3xl0⁴soluja per kuoppa) käsiteltiin erilaisilla PhG-annoksilla ({{0}}, 0,5, 5, 25 ja 50 µM). 24 tunnin viljelyn jälkeen kiinnittymistä varten PC12-soluja käsiteltiin 100 ul:lla H₂O₂liuotettiin DMEM:ään PBS:n kanssa PhG:iden läsnä ollessa 24 tunnin ajan. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT-määrityksellä.

Laktaattidehydrogenaasi (LDH)vapautumismääritys. Soluvaurio arvioitiin mittaamalla LDH-aktiivisuus PC12-solujen supernatantista käyttämällä LDH-sarjaa valmistajan protokollan mukaisesti (luettelonumero 20150604; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kiina). Lyhyesti sanottuna kaksoistislattu H₂O, {{0}},2 µmol/ml palorypälehappoa, matriisipuskuria ja koentsyymi I -puskuria lisättiin peräkkäin 48 tunnin kuluttua lääkekäsittelystä. 37 °C:ssa 15 minuutin inkuboinnin jälkeen lisättiin 2,4-dinitrofenyylihydratsiinia. Sen jälkeen kuhunkin kuoppaan lisättiin 250 ui 0,4 M NaOH-liuosta. Supernatantti kerättiin 30 minuutin huoneenlämpötilassa inkuboinnin jälkeen. Absorbanssi aallonpituudella 450 nm mitattiin sitten mikrolevylukijalla.

Mittaus/malondialdehydi(MDA). MDA mitattiin PC12-solujen supernatantista käyttämällä kaupallista pakkausta (luettelonro 20150604; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) valmistajan protokollan mukaisesti. Lyhyesti sanottuna dehydratoitu alkoholi ja muut reagenssit lisättiin järjestyksessä, minkä jälkeen inkuboitiin vesihauteessa 95°C:ssa 40 minuuttia. Seos sentrifugoitiin 1006 xg ja 25˚C 10 min jäähdytyksen jälkeen. Supernatanttia käytettiin sitten MDA-pitoisuuden määrittämiseen. Absorbanssi mitattiin tämän jälkeen mikrolevylukijalla aallonpituudella 532 nm.

Arviointi / suojaava tehosteita / ekinakosidi ja akteosidi vastaan ILMOITUS sisään vitro. PC12-solut kylvettiin tiheydellä 3xl0⁴soluja/kuoppa {{0}}kuoppalevyillä (100 µl/kuoppa). Soluja inkuboitiin lääkkeiden kanssa, mukaan lukien ekinakosidi (luettelonro 111670-200503; National Institutes for Food and Drug Control, Peking, Kiina) ja akteosidi (luettelonro 111530-200505; National Institutes for Food and Drug Control ) eri pitoisuuksina (0,5, 25 ja 50 ug/ml). Sen jälkeen solut käsiteltiin A:lla 1-42 tai H₂O₂24 tunnin ajan ja solujen elinkelpoisuus mitattiin MTT-määrityksellä.

Tilastollinen analyysi. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± standardipoikkeama. Ryhmien välisissä vertailuissa käytettiin opiskelijan t-testiä. Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttämällä SPSS 18:a.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Tulokset

PhG:iden kvantifiointi H. Cistanchesista.Uutettujen PhG-yhdisteiden UV-spektrit sekä standardiliuostenekinakosidija akteosidi rekisteröitiin, ja tulokset osoittivat, että UV-spektrit olivat yhdenmukaiset (kuvio 1). UV-spektrofotometria

osoitti, että PhG-pitoisuus oli 87,6 prosenttia. HPLC-tulokset osoittivat, että ekinakosidin ja akteosidin pitoisuudet olivat

37,7 ja 17,8 prosenttia (kuvio 2).

Päättäväisyys/theihanteellinenPhGkeskittyminen. Nollaryhmään verrattuna PhG:llä pitoisuuksilla 75, 100, 125, 150, 175 ja 200 µg/ml oli merkittävä estävä vaikutus PC12-soluihin (P<0.05), while="" phg="" at="" 5,="" 25="" and="" 50="" µg/ml="" showed="" low="" toxicity="" on="" pc12="" cells,="" and="" the="" cell="" viability="" was="">80 prosenttia (kuvio 3). Siten PhG:itä pitoisuuksina 5, 25 ja 50 ug/ml käytettiin PC12-solujen hoitamiseen myöhemmissä kokeissa, koska ne eivät vaikuttaneet solujen elinkelpoisuuteen.

A 1‑42- aiheutettuPC12soluvaurio.Verrattuna kontrolliryhmään solujen elinkelpoisuus 0,5 µM A 1-42 -vammaryhmässä oli 63 prosenttia (P<0.05). the="" cell="" viability="" was="" decreased="" by="" aβ1-42="" in="" a="" concentration-dependent="" manner,="" and="" the="" viability="" was=""><50% in="" the="" 1,="" 1.5,="" and="" 2="" µm="" aβ1-42="" injury="" groups="" (fig.="" 4).="" thus,="" treatment="" with="" 0.5="" µm="" aβ1-42="" for="" 48="" h="" was="" determined="" to="" be="" the="" optimal="" condition="" for="" establishing="" the="">in vitroAD malli.

Määritettiin myös sellaisten PC12-solujen aktiivisuus, joita käsiteltiin 0,5 µM A 1-42:lla turvallisten PhG-annosten (5, 25 ja 50 µg/ml) läsnä ollessa 24 tunnin ajan. Verrattuna malliryhmään (P<0.01), phgs="" showed="" a="" significant="" neuroprotective="" effect="" on="" pc12="" cells.="" the="" cell="" viability="" was="" rescued="" by="" phgs="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="">

H₂O₂- aiheutettuPC12soluvaurio. 25 uM H:lla käsiteltyjen PC12-solujen elinkelpoisuus₂O₂liuotettuna DMEM:iin PBS:n kanssa oli 56,43 prosenttia. 200 µM H:lla käsiteltyjen PC12-solujen elinkelpoisuus₂O₂liuotettuna DMEM:iin ilman PBS:ää oli 71,64 prosenttia (taulukko I). Siten PC12-solut käsiteltiin 25 uM H:lla₂O₂DMEM:iin liuotetut PBS:n kanssa valittiin optimaaliseksi olosuhteiksi AD-mallin luomiselle.

Verrattuna kontrolliryhmään solujen elinkelpoisuus malliryhmässä oli 48,8 prosenttia (P<0.05). compared="" with="" the="" model="" group,="" phgs="" had="" a="" significant="" neuroprotective="" effect="" on="" pc12="" cells.="" the="" cell="" viability="" was="" dose-dependently="" increased="">

PhG:t ja PhG:illä pitoisuuksilla 5, 25 ja 50 ug/ml käsiteltyjen PC12-solujen elinkelpoisuus olivat 54, 57 ja 64 prosenttia, vastaavasti (taulukko II).

PhG:t estävät PC12-solujen vamman aiheuttamaa LDH:n vapautumista. Verrokkiryhmään verrattuna vaurioituneiden PC12-solujen supernatantin LDH-pitoisuus nousi, mitä PhG:t estivät pitoisuudesta riippuvaisella tavalla. Tämä tulos osoitti, että PhG:illä on merkittävä neuroprotektiivinen vaikutus PC12-soluihin (kuvio 6).

PhG:t estävät pitoisuudesta riippuvaisella tavalla. Tämä tulos osoitti, että PhG:illä on merkittävä neuroprotektiivinen vaikutus PC12-soluihin (kuvio 7). PhG ja sen komponentit ekinakosidi ja akteosidi pelastavat loukkaantuneiden PC12-solujen elinkyvyn. Malliryhmään verrattuna akteosidihoito lisäsi merkittävästi A 1-42--vaurioituneiden PC12-solujen elinkykyä annoksesta riippuvalla tavalla. PhG:t ja ekinakosidi lisäsivät myös merkittävästi A 1-42--vaurioituneiden PC12-solujen elinkykyä kaikilla testatuilla pitoisuuksilla (kuvio 8A).

Malliryhmään verrattuna akteosidi lisäsi merkittävästi H:lla käsiteltyjen PC12-solujen elinkykyä₂O₂. PhG:t lisäsivät myös H:lla käsiteltyjen PC12-solujen elinkykyä₂O₂, kun taas vaikutus ei ollut merkittävä pitoisuuksilla 5 ja 25 ug/ml (kuvio 8B). Lisäksi ekinakosidi lisäsi solujen elinkelpoisuutta pitoisuudella 25 µg/ml.

Yhteenvetona voidaan todeta, että akteosidilla, PhG:llä ja ekinakosidilla oli merkittäviä hermostoa suojaavia vaikutuksia PC12-soluihin, jotka oli alttiina A-1-42- tai H-vauriolle₂O₂.