Kasvipohjainen ruokavalio on yhdistetty pienempään riskiin sairastua kroonisiin sairauksiin, kuten liikalihavuuteen

Ota yhteyttäoscar.xiao@wecistanche.comLisätietoja

Abstrakti:On ehdotettu, että pinaatin metanoliuute (SME) estää kehittyneiden glykaation lopputuotteiden (AGE) muodostumista, jotka lisääntyvät diabeteksen etenemisen aikana, joten on tärkeää tietää, onko pk-yrityksillä hyödyllisiä vaikutuksia diabeettiseen verkkokalvoon. Tässä tutkimuksessa in vitro -määritykset osoittivat, että pk-yritys estää glykaatiota, karbonyyliryhmien muodostumista ja pelkistettyjen tioliryhmien ehtymistä naudan seerumin albumiinissa, jota inkuboitiin joko pelkistäviä sokereita tai metyyliglyoksaalia. SME-vaikutusta streptotsotosiinin indusoimien diabeettisten rottien (STZ2) verkkokalvoon tutkittiin myös (n=10) normoglykeemisessä ryhmässä, STZ-, STZ-rotissa, joita hoidettiin SME:llä ja STZ-rotilla, joita hoidettiin aminoguanidiinilla (anti-AGEs-viite). ryhmä) 12 viikon ajan. Verkkokalvo leikattiin ja immunovärjättiin ne-karboksimetyylilysiinin (CML), RAGE-reseptorin, NADPH-Nox4:n, indusoituvan typpioksidisyntaasin (iNOS), 3-nitrotyrosiinin (NT), tuman NF-kB:n, verisuonten endoteelin kasvutekijän ( VEGF), gliafibrillaarihappoproteiini (GFAP), S100B-proteiini ja TUNEL-määritys. Lipidiperoksidaatio määritettiin koko verkkokalvossa malondialdehydi (MDA) tasoilla. Tulokset osoittivat, että diabeettisessa verkkokalvossa pk-yritys vähensi CML-RAGE:n yhteislokalisaatiota, oksidatiivista stressiä (NOX4, iNOS, NT, MDA), tulehdusta (NF-B, VEGF, S10B, GFAP) ja apoptoosia (p<0.05).therefore, smes="" could="" attenuate="" retinal="" degeneration="" by="" inhibiting="" cml-rage="">

Avainsanat:pinaatti; diabeettinen retinopatia; kehittyneet glykaatio lopputuotteet; oksidatiivista stressiä; tulehdus; RAGE; karboksimetyyli-L-lysiini

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja

1. Esittely

Kasvipohjainen ruokavalio on yhdistetty pienempään riskiin sairastua kroonisiin sairauksiin, kuten liikalihavuuteen, tyypin 2 diabetekseen ja sepelvaltimotautiin. Pinaatti (Spinacia oleracea L.) on syötävä lehtivihannes, jota kulutetaan kaikkialla maailmassa, koska se sisältää huomattavan määrän kuituja, vitamiineja ja kivennäisaineita [1,2]. Useita sen fytokemikaaleja on tunnistettu, mukaan lukien klorofyllit, karotenoidit (luteiini ja zeaksantiini) [3] ja fenoliyhdisteet (flavonit, flavonoidit, kumariinit) [4-8] (katso liite 1). On raportoitu, että pinaatilla, joka nautitaan ruoana, vesiliukoisena uutteena tai pakastekuivatussa muodossa, ja sen tylakoideilla on syöpää, liikalihavuutta ja hypoglykeemisiä ominaisuuksia [9]. Pinaatin anti-inflammatorinen vaikutus on osoitettu eläinten endotoksemiamalleilla, lihavilla eläimillä ja terveillä ihmisillä [9]. Sen antioksidanttista vaikutusta tutkittiin ihmisen eturauhaskarsinoomasoluilla, lihavilla eläinmalleilla, UV-säteilytetyillä hiirillä ja siirtogeenisen hiiren eturauhasen adenokarsinoomalla [9,10]. Pinaattimetanoliuutteen (SME) glykaatiota estäviä ja anti-inflammatorisia vaikutuksia on tutkittu glukoosin aiheuttaman diabeteksen mallissa seeprakalalla ja isoproterenolin aiheuttaman sydänlihasnekroosin mallissa rotilla [11,12]. SME alensi glykosyloituneen hemoglobiinin ja fruktosamiinin tasoja, mukaan lukien glykoituneiden proteiinien tasot, vähentämällä aldoosireduktaasin aktiivisuutta linssin silmässä [11]. Yllä olevat havainnot viittaavat siihen, että pk-yrityksillä voi olla ehkäisevä vaikutus diabeteksen komplikaatioiden, kuten diabeettisen retinopatian (DR) etenemiseen.

DR johtaa asteittain näöntarkkuuden menettämiseen tai sokeuteen, joka on liittynyt tulehdukseen, oksidatiiviseen stressiin ja edistyneiden glykaation lopputuotteiden (AGE) kertymiseen [13,14]. AGE:t indusoivat proteiinien silloittumista, muuttaen rakennetta/toimintoa ja sen vaihtuvuutta/puhdistumaa. AGE:ita voidaan tuottaa ei-entsyymireaktiolla glukoosin ja proteiinien vapaan aminoryhmän välillä, jolloin muodostuu palautuvia välituotteita, kuten Schiffin emäksiä ja Amadori-tuotteita (fruktosamiini)[15]. Muita AGE:iden muodostumismekanismeja ovat "karbonyylistressi"-reitti, jossa sokereiden ja lipidien hapettuminen luo dikarbonyylivälituoteyhdisteitä, kuten glyoksaalia ja metyyliglyoksaalia (MGO), jotka johtavat AGE:iden muodostumiseen N:-karboksimetyylilysiininä (CML)[ 16]. Seerumin ja lasiaisen kohonneet CML-tasot voivat olla biokemiallinen merkki sekä DR:n ilmaantumisesta että etenemisestä [17,18]. Verkkokalvossa AGE:t (AGEs-RAGE) aiheuttavat RAGE-reseptorin aktivoinnin indusoi gliafibrillaarisen happaman proteiinin (GFAP) ja tulehdusta edistävien tekijöiden yli-ilmentymistä, jota säätelee aktivoidun B:n ydintekijä kappa-kevytketjun tehostaja. solut (NF-kB)[19]. NF-kB säätelee positiivisesti RAGE-ilmentymistä toimimalla positiivisena palautemekanismina [20].mikä on cistancheToisaalta korkeat pitoisuudet S100B:tä, kalsiumia sitovaa proteiinia, voivat myös aktivoida NF-kB:tä, mikä indusoi hermotulehdusta ja gliasolujen aktivaatiota [21]. S100B:n yli-ilmentyminen astrosyyteissä aiheuttaa neurotoksisia vaikutuksia, jotka ilmenevät verkkokalvon astroglioosina [22].

Cistanche voi estää ikääntymistä

Strategioita on kehitetty kokeellisesti verkkokalvovaurioiden estämiseksi. Jotkut muista kasveista eristettyjen pinaatin fytokemikaalit on yhdistetty AGE:iden ja oksidatiivisen stressin estoon [8,23-26]. Luteiini, astaksantiini ja kaempferoli ovat suojelleet ihmisperäisiä verkkokalvon pigmenttiepiteelisoluja (ARPE-19) vaurioilta niiden anti-AGE-, antioksidantti- ja apoptoosin ominaisuuksien ansiosta [26-28]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että pinaatin fytokemikaaleilla on olennainen rooli verkkokalvon rappeutumisen, kuten DR:n, ehkäisyssä. Toinen strategia on ollut aminoguanidiinin (AG) käyttäminen glykaation ja iNOS-aktiivisuuden voimakkaana estäjänä, mikä vähentää CML:n kertymistä ja reaktiivisten dikarbonyyliprekursorien muodostumista rotissa [29]. Monikeskisessä ja satunnaistetussa kliinisessä tutkimuksessa, johon osallistui 690 diabeetikkoa, hyödyllistä vaikutusta ei kuitenkaan osoitettu selvästi [30].

Verkkokalvon rappeutumisen muutoksia hyperglykeemisissä olosuhteissa on tuskin tutkittu. Siksi on mielenkiintoista tietää, suojaako SME verkkokalvon kerroksia vaurioilta, jotka liittyvät sen anti-AGE:ihin, antioksidanttisiin ja anti-inflammatorisiin ominaisuuksiin streptotsotosiinin aiheuttamien diabeettisten rottien verkkokalvossa.

2. Materiaalit ja metodit

2.1. Pinaattimetanoliuutteen valmistus (SME)

Pinaatin (S.oleracea L.) tuoreet lehdet poimittiin syys-talvikaudella Puebla Provincessa Meksikossa maatalouspellolta, ja kasvitieteilijä tunnisti ne National Polytechnic Instituten (IPN, Mexico City) herbaariosta. Meksiko). Lahjakorttinäyte numero 4532 talletettiin IPN:n National School of Biological Sciences -laitoksen herbaarioon.

Lehdet kuivattiin ja jauhettiin hienoksi. Kuivatut lehdet maseroitiin metanolilla huoneenlämmössä, suodatettiin selluloosasuodattimien läpi (Whatman, Maidstone, UK) ja kuivattiin pyörivällä tyhjiöhaihduttimella (BUCHI Rotavapor R{{0}}, Sveitsi) 45 asteessa. tuottaa vihreää purukumia (95,0 g/kg kuivia lehtiä).Anti-aging -vesisäiliöSME säilytettiin pimeässä 4 asteessa käyttöön asti. Kaikissa määrityksissä uute liuotettiin tislattuun veteen[11].

2.2.Pk-yritysten glykaatiota estävän toiminnan in vitro -määritykset

2.2.1. Naudan seerumialbumiinista (BSA-AGE) johdettujen edistyneiden glykaatiolopputuotteiden muodostuminen

BSA-AGEs-määritys suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [31]. Lyhyesti sanottuna 10 mg/ml BSA:ta (fraktio V; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) lisättiin joko D-glukoosissa 0,5 M, D-fruktoosissa {{12 }},5 M tai metyyliglyoksaali 2,5 mM ja valmistettu liuokseen 0,1 M PBS (pH 7,4) ja 0,02 % natriumatsidia. SME-pitoisuudet (5, 10, 25, 50, 100 ja 200 mg/ml) lisättiin kuhunkin seokseen ja inkuboitiin sitten 37 asteessa 4 viikkoa. Sen jälkeen reagoimattomat sokerit poistettiin dialyysillä tislattua vettä vastaan ​​kahden päivän ajan 4 asteessa. BSA-AGE-tasot määritettiin fluoresenssispektrofotometrialla (Ex370/Em 440 nm; malli LS 30, PerkinElmer LAS Ltd., Buckinghamshire, UK)[32]. BSA-proteiinin glykaatio pelkistämällä sokereita ja MGO:ta oli positiivinen kontrolli (BSA glykoitunut), kun taas BSA:n inkubaatiota aminoguanidiinilla (1 mg/ml) käytettiin negatiivisena kontrollina (BSA glykoitu-AG). Määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

2.2.2. Fruktosamiinimääritys

Fruktosamiinitaso määritettiin nitro blue tetrazolium (NBT) -määrityksellä [33], joka perustuu fruktosamiinin kykyyn pelkistää NBT:tä, jolloin muodostuu formatsaani, värillinen lopputuote alkalisissa olosuhteissa. Kymmenen mikrolitraa joko kontrollia tai glykoitua BSA:lla inkuboitua SME-konsentraatiota (BSA-SME) lisättiin 90 µl:aan NBT:tä 2,5 mM:ssa, valmistettuna karbonaattipuskurissa (0,1 M; pH 10,3); kaikkia inkuboitiin 37 °C:ssa 30 minuuttia. Absorbanssi 530 nm:ssä mitattiin. Fruktosamiinipitoisuudet (nmol/mg) laskettiin formatsaanin standardikäyrän mukaisesti.

2.2.3. Karbonyyliryhmien muodostumisen ja tioliryhmien häviämisen määritys BSA-AGE:issa

Karbonyyliryhmän pitoisuus mitattiin BSA-SME- ja kontrollinäytteistä Levinen et al. [34]. Liuos, jossa oli 2,4-dinitrofenyylihydratsiinia (DNPH; 10 mM) 400 µl:ssa 2,5 M HCl:a, lisättiin 100 µl:aan jokaista näytettä ja inkuboitiin pimeässä 60 minuuttia huoneenlämpötilassa.cistanche benefíciosSitten lisättiin 500 µl trikloorietikkahappoa (20 % w/v) ja pidettiin jäissä 5 minuuttia. Näytteitä sentrifugoitiin nopeudella 4000 rpm 15 minuuttia ja proteiinipelletti pestiin kolme kertaa etyyliasetaatti/etanolilla (1:1 v/v). Sen jälkeen näytteet suspendoitiin 250 µl:aan guanidiinihydrokloridia 6 M:ksi. Karbonyyliryhmien pitoisuus (nmol/mg proteiinia) laskettiin spektrofotometrialla 370 nm:n absorbanssilla (EON, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) käyttäen DNPH:n absorptiokerroin (22 000 M-1 cm-1).

Ellmanin menetelmän mukaisesti suoritettiin tioliryhmän vähenemisen määritys BSA-SME- ja kontrollinäytteistä. Lyhyesti sanottuna 10 µl 5,5'-disulfaanidiyylibis(2-nitrobentsoehappoa) (DNTB;10 mM, valmistettu PBS:ssä) 50 µl:n kanssa glykoituneita näytteitä inkuboitiin 15 minuuttia huoneenlämpötilassa, sitten mitattiin absorbanssi 410 nm:ssä. Vapaiden tioliryhmien taso laskettiin käyttämällä L-kysteiinin standardikäyrää (0.{12}} μM) ja ilmaistiin yksikkönä nmol/mg proteiinia [34].

2.3. Pk-yritysten vaikutus diabeettisten rottien verkkokalvoon 2.3.1. Diabetes-induktio rotilla

Käytettiin Wistar-urosrottia, jotka painoivat 250 ± 10 g(N=40), jotka olivat paastonneet 8 tuntia. Annos intraperitoneaalisesti streptotsotosiinia (60 mg/kg) sitraattipuskurissa (10 mM, pH 4,5) (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA) annettiin [35]. Kolme päivää myöhemmin glukoositaso mitattiin (glukometri; ACCU-CHEK aktiivinen; Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Saksa) ottamalla hännästä pisara verinäytettä. Eläimet, joiden glykeemiset tasot olivat yli 350 mg/dl, otettiin mukaan tutkimukseen. Veren glukoosi mitattiin viikoittain 12 viikon ajan.

2.3.2. Kokeellinen suunnittelu

Streptotsotosiinilla indusoidut diabeettiset rotat (STZ) jaettiin satunnaisesti seuraaviin ryhmiin (n =10): STZ käsiteltiin mahansisäisesti 2 ml:lla juomavettä (STZ); STZ käsitelty SME:llä annoksella 400 mg/kg (STZ-SME); normoglykeemiset rotat (NG); ja STZ, joka oli käsitelty 50 mg/kg aminoguanidiinilla (AG; Sigma-Aldrich, Inc.) (STZ-AG). STZ-AG:ta käytettiin anti-AGE-referenssiryhmänä. Määrätyt annokset annettiin 24 tunnin välein (kello 9.00) 12 viikon ajan. Glykeemistä tasoa kaikissa ryhmissä tarkkailtiin viikoittain. SME-annostusohjelma 400 mg/kg perustui seuraavaan: 7 g SME:tä saadaan 100 g:sta tuoretta pinaattia (tietoja ei ole esitetty). Tämä määrä vastaa 70 kg:n keskimääräisen ihmisen päivittäistä kulutusta amerikkalaisessa ruokavaliossa [36], mikä vastaa 100 mg:aa uutetta painokiloa kohti.Cistanche-uute Anti-säteilyToisaalta rottien kiihtyneen aineenvaihdunnan erojen vuoksi on suositeltavaa lisätä minkä tahansa luonnollisen uutteen kulutus jopa 6,4-kertaiseksi vertailututkimuksissa ihmisillä [37]. Käyttämämme annos 400 mg/kg perustui pääasiassa tuloksiin, jotka saatiin Wistar-rotilla indusoidun sydänlihaksen nekroosin mallissa, joka osoitti, että SME:n anti-inflammatorinen vaikutus on merkittävämpi annoksella 300 mg/kg [12].

2.3.3. Histologiset ja immunohistokemialliset arvioinnit

Enukleoidut silmät kiinnitettiin neutraaliin formaliiniin ja dehydratoitiin sitten lajiteltuihin alkoholeihin ja upotettiin parafiiniin. 2 μm:n histologiset leikkeet asennettiin sähkövaratuille objektilaseille, niistä poistettiin vaha ja ne hydratoitiin uudelleen antigeenin talteenottoliuokseen (K035; 10 × sitraattipuskuri, pH 6; Diagnostic BioSystems, Pleasanton, CA, USA). Käytettiin polymeeripohjaista immuunitunnistusjärjestelmää (PolyVuemouse/rabbit DAB-tunnistusjärjestelmä, Diagnostic BioSystems). Seuraavia primaarisia vasta-aineita käytettiin: gliafibrillaarinen hapan proteiini (anti-GFAP; MAB360; Chemicon International, Inc., Temecula, CA, USA); verisuonten endoteelikasvutekijä (anti-VEGF;sc-7269; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA), S100 kalsiumia sitova proteiini B (anti-S100B; ab52642; Abcam PLC, Cambridge, UK) ja aktivoitujen B-solujen ydintekijä kappa-kevytketjun tehostaja (anti-NF-kB p65;sc-8008). Kaikki laimennokset olivat 1:200 ja niitä inkuboitiin yön yli 4 asteessa. Toissijainen vasta-aine (Mouse/Rabbit PolyVueTM) lisättiin toimittajan ohjeiden mukaisesti.cistanche herbaLeikkeet värjättiin DAB plus/kromogeenisubstraatilla ja hematoksyliinillä. Histologiset havainnot ja kuvien ottaminen suoritettiin Carl Zeiss -mikroskoopilla (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Saksa).

Immunofluoresenssivärjäystä varten objektilaseja inkuboitiin yön yli 4 °C:ssa seuraavien primääristen vasta-aineiden kanssa: karboksimetyylilysiini (anti-CML; ab124145; Abcam PLC, Cambridge, UK), AGE-reseptori (anti-RAGE; sc{4}}), NADPH oksidaasi 4 (anti-Nox4;ab133303), 3-nitrotyrosiini (anti-NT; ab110282) ja typpioksidisyntaasi (indusoituva) (anti-iNOS; A00368-1; Boster Bio, Pleasanton, CA , USA). Sitten käytettiin seuraavia sekundaarisia vasta-aineita: anti-RAGE, vuohen anti-hiiri-lgG(FITC)-konjugoitu (1:200; Santa Cruz, Biotechnology, Inc.); anti-CML ja anti-NT, hiiren anti-kanin IgG-PE (SC-3753); ja anti-iNOS:lle ja anti-Nox4:lle m-IgGkBP-PE (Sc{29}}). Kaikkia inkuboitiin huoneenlämmössä 60 minuuttia. Myöhemmin leikkeet kiinnitettiin alustaan, joka sisälsi 4',6-diamidiini-2'-fenyyli-indolidihydrokloridia (DAPI). Anti-CML- ja anti-RAGE-vasta-aineet hybridisoitiin yhdessä samassa objektilasissa. Fluoresenssikuviin käytettiin FLoidTM Cell Imaging Stationia (Life technology Carlsbad, San Diego, CA, USA).

2.3.4. Apoptoosin arviointi

Verkkokalvon solujen apoptoosi havaittiin terminaalisen deoksinukleotidyylitransferaasin (TdT) -välitteisen deoksiuridiinitrifosfaatin (dUTP) nick-end-leimaus (TUNEL) -määrityksen mukaisesti käyttämällä In Situ Cell Death Detection Kit -sarjaa, TMR (tetrametyyli-rodamiini{{). 3}}dUTP) punainen, versio 12 (12156792910; Roche Diagnostics). Lyhyesti sanottuna objektilasit, joista oli poistettu vaha, hydratoitiin ja huuhdeltiin kahdesti PBS:llä. Sitten niitä inkuboitiin TUNEL-reaktioseoksen kanssa kostutetussa ilmakehässä 60 minuuttia 37 °C:ssa. Sen jälkeen leikkeet kiinnitettiin DAPI:lla ja niitä tarkkailtiin fluoresenssimikroskopiassa (FLoidTM Cell Imaging Station). TUNELin IOD laskettiin verkkokalvon kerroksille.

2.3.5. Lipidiperoksidaatiomääritys

Malondialdehydi (MDA) -tasojen arvioimiseksi verkkokalvon kudoksessa homogenoitiin noin 3 mg tuoretta kudosta (n=3) ja prosessoitiin aiemmin raportoidulla tavalla [38]. MDA-tasot kvantifioitiin pakkauksen toimittajan ohjeiden mukaisesti (OXItek-TBARS-määrityspakkaus, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA).

2.4. Tilastollinen analyysi

Tilastollista analyysiä varten kaikki verkkokalvon mikrokuvat otettiin magnitudilla 200× 100 μm:n etäisyydellä näköhermon alueen ulkopuolella. Noin 40 kuvaa per eläinryhmä (n=7) analysoitiin. Kuva-analyysi suoritettiin ohjelmistolla Image-Pro Premier Version 9.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA). Käytimme GraphPad Prism -ohjelmistoa (La Jolla, CA, USA; versio 8.0). Kuvissa on esitetty arvot laatikko- ja viiksikuvaajilla (mediaani, ensimmäinen-kolmas kvartiili, minimi-maksimiarvo) gangliosolukerrokselle (GCL), sisäiselle ydinkerrokselle (INL) ja ulommalle ydinkerrokselle (ONL). Keskiarvo ja keskihajonta (keskiarvo ± SD) on esitetty liitteessä A (taulukot A1-A3). Kaikissa tapauksissa suoritettiin yksisuuntainen ANOVA-testi, jota seurasi Tukeyn testi. s<0.05 was="" considered="" statistically="">