Uusi näyttö telomeeriproteiinin TRF2:n ilmentymisen säätelijöille, jotka tunnistetaan pienille molekyyleille, jotka heikentävät TRF2-riippuvaista immunosuppressiota ja kasvaimen kasvua

Ota yhteyttäoscar.xiao@wecistanche.comLisätietoja

Yksinkertainen yhteenveto:Telomeerinen proteiini TRF2 (telomeerinen toistoa sitova tekijä 2) on lisääntynyt ihmisen syövissä ja siihen liittyy huono ennuste. TRF2:n onkogeeniset ominaisuudet riippuvat sen sisäisestä telomeerisuojausroolista, mutta myös solun ulkoisista vaikutuksista immunosuppressiivisten ja angiogeenisten toimintojen kautta. Siksi TRF2:n kohdistaminen näyttää lupaavalta terapeuttliselta syövän vastaiselta strategialta. Tässä tutkimuksessa kehitimme solupohjaisen menetelmän TRF2-inhibiittoreiden seulomiseksi, minkä ansiosta voimme tunnistaa kaksi yhdistettä, jotka heikentävät TRF2:n pro-onkogeenisiä ominaisuuksia in vivo.

Tiivistelmä: Telomeerinen toistoa sitova tekijä 2 (TRIF2) on shelteriiniproteiinikompleksin alayksikkö, joka sitoutuu ja suojaa telomeerejä ei-toivotun DNA-vauriovasteen (DDR) aktivaatiolta. TRF2:n ilmentymisellä on keskeinen rooli ikääntymisessä ja syövässä, koska se vähenee solujen vanhenemisen aikana ja yli-ilmenee onkogeneesin aikana. TRF2:ta yli-ilmentävien syöpien ennuste on usein huono. Syöpäsoluissa TRF2:lla on useita toimintoja, mukaan lukien telomeerisuojaus ja ei-solun autonomiset roolit, mikä edistää uusangiogeneesiä ja immunosuppressiota.puritaanit c-vitamiiniEsittelemme tässä alkuperäisen seulontastrategian, joka mahdollistaa pienten molekyylien tunnistamisen, jotka vähentävät tai lisäävät TRF2:n ilmentymistä. Seulomalla pieni kirjasto elintarvike- ja lääkeviraston (FDA) hyväksymiä lääkkeitä, tunnistimme kaksi molekyyliä (AR-A014418 ja aleksidiini-2HCl), jotka heikensivät kasvaimen kasvua, uusangiogeneesiä ja immunosuppressiota alentamalla TRF2:n ilmentymistä hiiressä. ksenograftimalli. Nämä tulokset tukevat kemoterapeuttista strategiaa vähentää TRF2:n ilmentymistä aggressiivisten ihmisen kasvainten hoitamiseksi ja validoivat tämän solupohjaisen määrityksen, joka pystyy seulomaan mahdollisia syövän vastaisia ​​ja ikääntymistä estäviä molekyylejä moduloimalla TRF2:n ilmentymistasoja.

Avainsanat:TRF2; syöpä; ikääntyminen; solupohjainen seulontamääritys; uusangiogeneesi; immuunivasteen heikkeneminen

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja

1. Esittely

Telomeerit ovat erikoistuneita nukleoproteiinirakenteita, joita löytyy lineaaristen kromosomien päistä ja joita säätelevät telomeeriin liittyvät tekijät, kuten telomeraasi, shelteriiniproteiinikompleksit ja ei-koodaava telomeeritoistoa sisältävä RNA [1]. Oikein säädeltynä telomeerit suojaavat kromosomeja epävakaudelta ja vanhenemiselta. Telomeerinen DNA:n lyhentyminen tapahtuu osana ohjelmoitua fysiologista kehitystä ja ikääntymistä [2]. Kuitenkin liiallinen telomeeri-DNA:n lyheneminen aiheuttaa harvinaisia ​​progeroidioireyhtymiä, kuten dyskeratosis congenita [3]. Lisäksi säätelemättömät telomeeritilat ovat osallisena lukuisissa sairauksissa, jotka ovat yleisiä koko väestössä, mukaan lukien lähes kaikki syöpätyypit ja useat rappeuttavat sairaudet [4]. Siten farmakologisten hoitojen kehittäminen tiettyihin telomeerikomponentteihin on lupaavaa tällaisten sairauksien ehkäisyssä ja hoidossa.

Telomeerien ja syövän osalta elintärkeät DNA-vauriovasteen (DDR) tarkistuspisteet epäonnistuvat joskus. tämä voi johtaa liialliseen telomeerisen DNA:n lyhenemiseen ja poikkeaviin kromosomien uudelleenjärjestelyihin, mikä puolestaan ​​voi edistää onkogeneesiä. Lisäksi telomeraasin noususäätely on avaintapahtuma noin 90 prosentissa kaikista syövistä, koska se voi antaa syöpäsoluille rajattoman kasvun [5]. Tästä syystä telomeraasin esto on ollut useiden syövänhoitojen kehittämiseen tähtäävien tutkimusten kohteena [6]. Viimeaikaisesta edistymisestä huolimatta telomeraasilääkkeiden kliinisessä käytössä on joitain rajoituksia. Esimerkiksi syöpäsolujen lisääntymisen pysäyttämiseksi on saavutettava kriittisesti lyhyt telomeerinen DNA:n pituus, ja lyhennettyjen telomeerien anti-onkogeeniset vaikutukset menetetään, jos p53-kasvainsuppressorigeeniä ei ole [7,8]. Tämä viivejakso vähentää terapeuttista tehoa ja lisää ikääntymistä edistäviä sivuvaikutuksia rajoittamalla solujen uusiutumista ja suosimalla vaihtoehtoisten rekombinaatioon perustuvien telomeerien pidentymismekanismien aktivoitumista [9,10].SistancheSiksi telomeraasien vastaiset strategiat voivat sopia paremmin sellaisten syöpäsolujen kohdistamiseen, joissa jo on kriittisiä lyhyitä telomeerejä [11].

Telomeraasin lisäksi muutokset shelteriinikompleksialayksiköiden (TRF1, TRF2, RAP1, TIN2, TPP1 ja POT1) ilmentymisessä ja aktiivisuuksissa ovat mukana kasvaimen muodostumisessa ja joissain tapauksissa telomeerin pituudesta riippumatta [12-16]. Siten shelteriinin kohdistaminen syövän hoitoon voisi olla mielenkiintoinen vaihtoehto telomeraasin vastaisille toimenpiteille. Shel-teriini-alayksikkö TRF2 edustaa mielenkiintoista ehdokasta; TRF2 yli-ilmenee useissa ihmisen pahanlaatuisissa kasvaimissa, sekä syöpä- että verisuonisoluissa, ja tämä liittyy tyypillisesti huonoon ennusteeseen [17-20]. Erityisesti TRF2:n yli-ilmentyminen voi edistää kasvainten muodostumista ei-solun autonomisesti, mikä johtaa immunosuppressioon ja neoangiogeneesiin[13,18-20]Erityisesti TRF2:n lisääntyminen luo tehokkaan immunosuppressiivisen mikroympäristön. Muuttamalla heparaanisulfaattiproteoglykaanien ilmentymistä TRF2 värvää ja aktivoi suoraan myeloidista peräisin olevia suppressiivisia soluja (MDSC:t) TLR2-reitin kautta [21]. Vaikka TRF2:n yli-ilmentyminen syöpäsoluissa estää voimakkaasti NK-solujen rekrytoitumista kasvaimen mikroympäristöön säätelemällä HSPG-synteesiä[13], TRF2:n yli-ilmentymisen aiheuttama MDSC:n TLR2-aktivaatio johtaa NK-solujen immuunivalvonnan voimakkaaseen estoon ja voimakkaaseen laskuun. NK-solujen degranulaatio, IFNgamma-tuotanto ja tappaminen [21].mikä on cistancheSiten TRF2:n yli-ilmentyminen vaimentaa voimakkaasti kasvainten vastaisen immuunivalvonnan varhaista vaihetta estämällä suoraan NK-solujen rekrytointia ja epäsuorasti NK-solujen toimivuutta MDSC-riippuvaisen immunosuppressiivisen mikroympäristön muodostamisen kautta. Näin ollen TRF2:n kohdistaminen syöpiin voisi olla arvokas usean osuman strategia soluautonomisten ja ei-soluautonomisten prosessien kautta edistämällä vanhenemista sekä heikentämällä neoangiogeneesiä ja immuunipakoa.

cistanche voi estää ikääntymistä

Tähän mennessä kaikki tunnistetut pienet yhdisteet, jotka kohdistuvat TRF2:een, heikentävät sen kykyä suojata kromosomien päitä DDR:ltä, mikä aiheuttaa mahdollisia ikääntymistä edistäviä sivuvaikutuksia [22]. Aikaisempi työmme osoitti, että TRF2:n ilmentymisen osittainen vähentäminen voi kääntää tuumorigeenisyyden hiirimalleissa ei-solu-autonomisten vaikutusten kautta indusoimatta DDR:tä[13]. Siksi päätimme, että keskittyminen ylimääräisen TRF2:n vähentämiseen sen yli-ilmentymisestä johtuvissa syövissä voisi olla mielenkiintoinen strategia syövän hoidossa ilman ikääntymistä edistäviä sivuvaikutuksia. Tässä tutkimuksessa esittelemme alkuperäisen seulontaalustan pienten yhdisteiden tunnistamiseksi, jotka kohdistuvat TRF2-stabiilisuuteen. Osoitamme, että kaksi parasta osumaa estivät TRF2:n yli-ilmentymisen kasvaimia aiheuttavaa aktiivisuutta. Tämä tutkimus osoitti, että TRF2:n ilmentymistä voidaan moduloida farmakologisesti ja että seulontamäärityksemme on luotettava menetelmä sellaisten lääkkeiden valintaan, jotka kykenevät moduloimaan TRF2:n ilmentymistasoja ja joilla on mahdollisia syöpää ja ikääntymistä estäviä ominaisuuksia.

2. Materiaalit ja menetelmät 2.1. Solut

Ihmisen alkion munuaisten (HEK)293-T-solut (ATCC CRL-1573) ja BJ-HELTRAs-solut[13] kasvatettiin Dulbeccon modifioidussa kotkan elatusaineessa (DMEM) (Lonza, Levallois Perret, Ranska), jota oli täydennetty 10 prosenttia vasikan sikiön seerumia (FCS), 100 IU/ml penisilliiniä ja 100 ug/ml streptomysiiniä (Invitrogen, Cergy Pontoise, Ranska).

2.2.SDS-PAGE ja Western Blotting

Kokonaissolulysaatit valmistettiin, erotettiin elektroforeesilla ja blotattiin kuten aiemmin on kuvattu [14]. Lyhyesti sanottuna solut kerättiin ja hajotettiin lyysipuskurissa (8,76 g/l NaCl 10 mM Tris-HCL pH 7,2, 0,1 % SDS, 0,1 % Triton X -100,10 g/l natriumdeoksikolaattia, 5 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA), 1{{50}} ug/ml leupeptiinia, 1 mM AEBSF:a ja 19 ug/ml aprotiniini). Sitten näytteet titrattiin käyttämällä BCA-proteiinimäärityspakkausta (Interchim, Monlucon, Ranska). Näytteitä (60 ug/kaista) kuumennettiin 95 asteessa 5 minuuttia latauspuskurissa (500 mM Tris-HCl, 100 mM DTI, 2 % SDS, 0,1 % bromifenolisininen, 10 % glyseroli pH 6,8). Sitten näytteet ladattiin 10-prosenttisille polyakryyliamidigeeleille ja ajettiin 45 minuuttia 160 V:lla. Proteiinit siirrettiin sitten Immobilon-FL-kalvoille (Millipore, New Yorkin osavaltion osavaltio, USA) käyttämällä Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell -solua (Bio- Rad, Hercules, CA, USA). Kalvot estettiin 1 tunnin ajan Intercept Blocking -puskurissa (LI COR, Lincoln, NE, USA) ennen kuin niitä inkuboitiin yön yli 4 asteessa primääristen vasta-aineiden seoksella (mouselgGl anti-TRF2 laimennettuna 1:een: 250;ja kanin IgGanti-Beta-aktiinia laimennettuna suhteessa 1:10,000) Intercept Blocking -puskuriin, joka sisältää 0,5 prosenttia Tween20:tä. Kun kalvoja oli pesty 0,1 % Tween20:ssa PBS:ssä, niitä inkuboitiin 1 tunti huoneenlämmössä Intercept-estopuskurissa, joka sisälsi 0,25 % Tween20:tä sekundaaristen vasta-aineiden seoksen kanssa: vuohen anti-hiiri IRDye 680 anti-TRF2-vasta-aineelle ja vuohen anti-kanin IRDye. 800CW anti-beeta-aktiinivasta-aineelle (1:15, 000 laimennus).Anti-aging -vesisäiliöKäytetyt primaariset ja sekundaariset IRDye-vasta-aineet on lueteltu alla vasta-ainetaulukossa (taulukko 1). Lopuksi proteiinivyöhykkeet visualisoitiin käyttämällä LiCor Odyssey 9120 -kuvausjärjestelmää (LI-COR). TRF2:n ilmentyminen mitattiin normalisoimalla TRF2-vyöhykkeen intensiteetti aktiinijuovan ja taustan intensiteetiksi.

2.3. Kloonausstrategia

Ihmisen TRF2-cDNA-sekvenssi kloonattiin BamHI/BclI-restriktiokohtien väliin lentiviruksen SFFV-GPR-plasmidissa, joka on HIV-SFFV-GFP-WPRE-johdannainen [23]. SFFV-GPR-plasmidi sisältää pernan fokusta muodostavan viruksen (SFV) promoottorin, joka kontrolloi GPR:n polykistronista geeniä, joka sisältää cDNA-sekvenssejä vihreälle fluoresoivalle proteiinille (GFP), puromysiiniresistenssiproteiinille ja Tag-red fluorescent protein (RFP)-T (S158T-mutatoitu tunniste). -RFP), kukin erotettu E2- ja T2 Picornaviridae -sekvensseillä. hTRF2-cDNA insertoitiin RFP-T:n C-terminaaliseen alueeseen RFP-TRF2-fuusioproteiinin ilmentymisen mahdollistamiseksi.

2.4. Lentivirustuotanto

Lentiviruksen tuotantoa varten 5 × 10* HEK 293-T-solut transfektoitiin 8,6 ug:lla tyhjää SFFV-GPR- tai RFP-TRF2--ilmentävää SFFV-GPR-vektoria ja 8,6 ug:lla Lentiä. - Delta 8,91 ja 2,8 ug VSV-g:tä kalsiumfosfaattivälitteisen transfektion kautta. Transfektoituja soluja viljeltiin DMEM:ssä, jota oli täydennetty 10 prosentilla FCS:llä, 37 asteessa 5 prosentin CO2:lla 10- cm:n astioissa. Äskettäin konstruoidut virukset sisältävät supernatantit kerättiin 48 tunnin kuluttua ja vietiin sitten 045- μm Millipore-suodattimen läpi. Virustitrauksen jälkeen käytettiin suhdetta 1–1 (virus∶solu) infektoimaan BJ-HELTRAs-solulinja, joka valittiin sen vastustuskyvyn perusteella TRF2-virheitä vastaan[13].cistanche benefíciosKlooni, joka ekspressoi GFP:tä ja fuusioitua RFP-TRF2-proteiinia kohtalaisiin tasoihin, eristettiin sitten fluoresenssiaktivoidulla solulajittelulla (FACS).

2.5. Virtaussytometrinen seulonta

BJ-HELTRAs-klonaalisia linjasoluja, jotka sisälsivät SFFV-GPR-vektorin ja ilmentävät RFP-TRF2-fuusioproteiinia, viljeltiin 96-kuoppalevyillä DMEM-elatusaineessa, jota oli täydennetty 10 prosentilla FCS:llä ja 1 prosentilla penisilliini/streptomysiiniä. 24 tunnin lääkekäsittelyn jälkeen solut trypsinoitiin ja pestiin fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), joka sisälsi 0,5 mM EDTA:ta ja 2 % FCS:ää, ennen kuin ne kiinnitettiin 0,5 % formaldehydillä (FA). Kiinteät solut altistettiin sitten virtaussytometriaan käyttämällä FacsCalibur korkean suorituskyvyn näytteenottajaa (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).

2.6. Reaaliaikainen kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (RT-qPCR)

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit -pakkausta (Qiagen, Venlo, Alankomaat). Käänteistranskriptio suoritettiin käyttämällä Superscript II -käänteistranskriptaasia (Invitrogen) 1 ug:n kanssa kokonais-RNA:ta. Kunkin geenin ilmentyminen normalisoitiin GAPDH:n ekspressioksi. Käytettiin seuraavia alukkeita: hTRF2 Fw 5'-GCTGCCTGACTIGAACAGT-3';hTRF2 Rv 5'-CCGTTCTCAACCAACCACCCTC-3';hGAPDHFw5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3'hGAPDCCAGACAC-3'hGAPDCCACCCACAC-3'hGAPDCCACCCACAT 14}}. 2.7. AlamarBlue

Tasapohjaisessa 96-kuoppalevyssä 5 × 103 solua kuoppaa kohden kylvettiin 200 ul:aan DMEM-lisäainetta, jota oli täydennetty 10 prosentilla FCS:llä. 24 tuntia lääkehoidon jälkeen lisättiin 10 ui AlamarBluea (Bio-Rad) ja absorbanssi mitattiin aallonpituudella 570 nm ja 600 nm 36 tunnin ajan Spectrostar Nano -levynlukijalla (BMGLabtech, Ortenberg, Saksa). AlamarBluen hapettumis-pelkistysprosentti määritettiin valmistajan kuvauksen mukaisesti.

2.8. Eläimet

Kokeet suoritettiin 8- - 12-viikon ikäisillä NMRI-nude-naarashiirillä Janvier Labsista (Ranska). Kaikki hiirikokeet suoritettiin paikallisten ja kansainvälisten institutionaalisten ohjeiden mukaisesti, ja ne ovat joko IRCANin ja alueellisen (CIEPAL Cote d'Azur #187 ja #188) ja kansallisen (Ranskan tutkimusministeriön #03482.01/02482.2) hyväksymiä. ja #02973.01/02973.2)viranomaiset.

2.9. Kasvaimen kasvukokeet

Jokaiseen NMRI-nude-hiiriin injektoitiin ihonalaisesti selkään 1 x 106 BJ-HELTRAs-solua suspendoituna 100 µl:aan PBS:ää (n=8 hiirtä ryhmää kohden). Hiiriä käsiteltiin päivinä 16, 18, 20 ja 22 intraperitoneaalisilla injektioilla, joissa oli 100 ul DMSO:ta (45 prosenttia), aleksidiini-2HCl:a (1 mg/kg) tai AR-A014418:aa (5 mg/kg), sitten seurattiin päivään 26 asti. Kasvaimen ulkonäkö arvioitiin tunnustelemalla joka päivä. Kasvaimen koko mitattiin 2-3 päivän välein jarrusatulalla. Kasvaimen tilavuus määritettiin sitten käyttämällä hemiellipsoidikaavaa: π × (L × 1 × h)/6, jossa L vastaa kasvaimen pituutta, I leveyttä ja h vastaavasti korkeutta.

2.10.Matrigel Plug Assays

BJ-HELTRAs-soluja käsiteltiin DMSO:lla (1 prosentti), aleksidiini-2HCl:lla (1 uM) tai AR-A014418 (10 µM）) 2 päivän ajan. Sitten 100 µl 1 × 10 astetta käsiteltyjä soluja, jotka oli suspendoitu PBS:ään yhdessä 400 ul:n kanssa vähennetty kasvutekijä Matrigel (Corning, New York, USA), inokuloitiin ihonalaisesti NMRI-nude-hiirten selkään isofluraanipuudutuksessa. Päivänä 5 inokuloinnin jälkeen Matrigel-tulpat kerättiin ja tunkeutuvat solut kerättiin entsymaattisella dissosiaatiolla dispaasilla (Corning), kollagenaasi A:lla (Roche, Bale, Sveitsi) ja DNAseI (Roche) -digestiolla 30 minuutin ajan 37 asteessa [13 ]. Soluja kyllästettiin 15 minuuttia jäillä Fe-Block anti-CD16/CD32-vasta-aineilla (klooni 2.4G2) ennen värjäystä kytketyillä vasta-aineilla 30 minuuttia 4 asteessa. Käytetyt konjugoidut vasta-aineet on lueteltu vasta-ainetaulukossa. Solut pestiin PBS:ssä, jossa oli 0,5 mM EDTA:ta, 2 % FCS:ää ja kiinnitettiin 0,5 % FA:lla. Värjäytyneet solut analysoitiin käyttämällä ARIA III -sytometriä DIVA6-ohjelmiston (BD Biosciences) ja FlowJo 10 (LLC) kanssa.

2.11. Tilastot

Kaikki kaaviot ja tilastolliset analyysit tuotettiin käyttämällä GraphPad Prism -ohjelmistoa (San Diego, CA, USA). Kaikki tulokset on esitetty keskiarvona ± keskihajonta (sd) tai keskiarvo ± keskiarvon standardivirhe (SEM). Merkittävät erot keskiarvojen välillä määritettiin käyttämällä Mann-Whitneyn kaksisuuntaista testiä. Log-rank-testiä (Mantel-Cox) käytettiin kasvaimen ottamisen määrittämiseen. Jokaisen testin osalta s<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Tulokset

3.1.TRF2:ta inhiboivien molekyylien tunnistaminen

Seuloaksemme lääkkeitä, jotka pystyvät moduloimaan TRF2-proteiinitasoja, käytimme lentivirusjärjestelmää GFP-geenin ja TRF2:n N-päähän fuusioidun RFP:n yhteistranskriptoimiseksi. Noudattamalla muualla kuvattua yleistä strategiaa [23] rakensimme GRT-lentiviruksen, jossa SFFV-promoottori kontrolloi GFP:tä koodaavan polykistronisen geenin, puromysiiniresistenssiproteiinin ja joko RFP-TRF2:n tai RFP:n ilmentymistä vain kontrollina (kuva 1A). Näin ollen kaikki transdusoidut solut ilmensivät sekä GFP:tä että RFP-TRF2:ta. Tämä järjestelmä suunniteltiin tunnistamaan lääkkeet, jotka moduloivat TRF2:n ilmentymistä mittaamalla RFP-intensiteetti virtaussytometriaa käyttäen, kun taas GFP-intensiteetti toimii sisäisenä kontrollina reportterikonstruktin transkriptiolle.

Transdusoimme GRT-lentivirukset ihmisen BJ-HELTRAs-fibroblasteihin, jotka SV40 ja hTERT tekivät kuolemattomiksi ja Ras v12 teki onkogeenisiksi [13]. Sekä TRF2:n ylös- että alas-säätelyn mittausten helpottamiseksi puromysiiniresistentti klooni, joka ilmensi kohtalaisesti sekä GFP- että RFP-TRF2-proteiineja, eristettiin käyttämällä FACS-lajittelua ja nimettiin GRI-BJ-HELTRA:ksi (kuvio 1A). Positiivisena kontrollina käsittelimme GRT-BJ-HELTRAs-soluja 10 uM gemsitabiinilla, joka on aiemmin kuvattu TRF2-stabiilisuuden modulaattori [24], 24 tunnin ajan. Vaikka tyhjällä vektorilla transdusoiduissa soluissa ei havaittu RFP-modulaatiota, RFP/GFP-keskimääräisen fluoresenssin intensiteetin (MFI) suhteen havaittiin merkittävästi pienenevän gemsitabiinilla käsitellyissä GRT-BJ-HELTRAs-soluissa verrattuna DMSO-käsiteltyyn kontrolliin (82 prosenttia). ohjauksesta;s<0.0001)(figure 1b).moreover,="" gemcitabine="" specifically="" diminished="" rfp-trf2="" protein="" levels="" without="" affecting="" gfp="" levels="" (figure="" s1a).="" of="" note,="" we="" observed="" here="" that="" gemcitabine="" is="" reducing="" trf2="" level="" in="" contrast="" to="" the="" published="" work[24],="" a="" difference="" that="" may="" be="" explained="" by="" cell="" type="" differences="" in="" the="" dna="" damage="" response="" induced="" by="" gemcitabine="" since="" trf2="" stability="" can="" be="" altered="" in="" a="" p53-dependent="" manner="" [25].="" this="" effect="" was="" further="" confirmed="" by="" western="" blotting="" analyses="" where="" we="" observed="" that="" endogenous="" trf2="" levels="" were="" affected="" by="" gemcitabine="" treatment="" on="" untrans-duced="" bj-heltras="" cells="" (figure="" s1b).therefore,="" grt-bj-heltras="" cells="" enabled="" detection="" of="" specific="" variations="" in="" trf2="" protein="" levels="" induced="" by="" drug="" treatment.="" or="" gemcitabine="" (right="" panel)(n=""><0.001;two-tailed student'st="" test).="" (c)representative="" rfp/gfp="" flow="" cytometry="" plots="" of="" trf2="" vector-transduced="" bj-heltras="" cells="" treated="" with="" 10="" um="" of="" alexidine-2hcl,="" ar-a014418="" or="" dmso="" (left="" panel).="" box-plot="" quantification="" of="" rfp-trf2="" fusion="" (trf2="" vector)="" proftein="" levels="" following="" treatment="" with="" dmso,="" alexidine-2hcl="" or="" ar-a014418(right="" panel)(n=""><0.05;mann-whitney test).(d)representative="" western="" blotting="" showing="" reduced="" trf2="" protein="" levels="" following="" treatment="" with="" 10="" um="" alexidine2hcl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="" treatment="" in="" untransduced="" bj-heltras="" cells="" (left="" panel;="" full="" western="" lolotting="" image="" is="" presented="" in="" figure="" s2a).="" quantification="" of="" trf2="" protein="" levels="" after="" treatment="" with="" 10="" μm="" alexidine-2hccl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="" treatment="" （right="" panel)(n="2;mean" +="" standard="" error="" of="" the="" mean).(e)quarntification="" of="" trf2="" mrna="" levels="" analyzed="" by="" rt-qpcr="" after="" treatment="" with="" 10="" um="" alexidine-2hcl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="">

Virtaussytometriaa käyttämällä seuloimme sitten 396 Food and Drug Administrationin (FDA) hyväksymää farmakologista yhdistettä, jotka pystyvät kohdistamaan kuuteen pääluokkaan biologisia prosesseja: ionikanavat, fosfataasit, kinaasit, epigeneettiset tekijät, tumareseptoriligandit ja Wnt-reitti (kuva S1C). ).GRT-BJ-HELTRAs-soluja käsiteltiin ensin 10 uM:lla kutakin 396 yhdistettä tai DMSO:ta 24 tunnin ajan ennen virtaussytometria-analyysiä (kuvio S1D). Tässä tapauksessa 84 yhdisteen havaittiin moduloivan TRF2-proteiinitasoja (kuvio S1D, oikea paneeli; taulukko S1), ja niitä käytettiin toissijaisessa seulonnassa (kuvio S1E; ​​taulukko S1). Tässä toissijaisessa seulonnassa sen lisäksi, että GRT-BJ-HELTRAs-soluja käsiteltiin 10 uM:lla valittuja yhdisteitä, transdusoimattomia BJ-HELTRAs-soluja tai tyhjällä vektorilla transdusoituja BJ-HELTRAs-soluja käsiteltiin samalla tavalla väärien positiivisten, jotka säteilevät punaista. tai vihreä autofluoresenssi tai vaikuttaa RFP- tai GFP-proteiineihin. 18 parasta yhdistettä valittiin sitten määrittämään niiden kyky moduloida endogeenisen TRF2:n ilmentymistä transdusoimattomissa BJ-HELTRAs-soluissa Western blottingin perusteella (kuvio S2A, B Taulukko S1). Määritimme osumat yhdisteiksi, jotka moduloivat vähintään 20 prosenttia TRF2-annoksesta (joko ylös tai alas). Näitä kriteerejä käyttäen Western blot -menetelmällä arvioiduista 18 lääkkeestä 9 alensi ja yksi lisäsi endogeenisen TRF2-proteiinin tasoa (kuva S2A, taulukko S1). Tämän jälkeen päätimme valita näistä lääkkeistä kaksi yhdistettä in vivo -kokeita varten. torjua TRF2:n yli-ilmentymisen pro-onkogeenisiä vaikutuksia. DDR-aktivaation ja sivuvaikutusten välttämiseksi ei-tuumorigeenisissä soluissa valitsimme yhdisteitä, joiden TRF2-annostusta ei ole laskettu korkeimpaan tai alhaisimpaan. Niistä AR ja AD vastasivat näitä kriteerejä. Molemmat yhdisteet vähensivät RFP-TRF2:ta GRT-BJ-HELTRAs-soluissa virtaussytometrisesti analysoituna (kuva 1C), endogeenisen TRF2-proteiinin tasoja Western blot -analyysillä (kuvio 1D; kuva S2A, B) ja TERF2-mRNA-tasoja RT:llä määritettynä. -qPCR (kuvio 1E). Lisäksi käsittely AR:n ja AD:n vastaavilla LD50-pitoisuuksilla vähensi TERF2-mRNA:n ilmentymistä sekä BJ-HELTRAs-soluissa että TRF{53}}yli-ilmentävissä BJ-HELTRAs-soluissa (kuva S3A-C).

3.2.AR-A014418 ja Aleksidiini-2HCl käänsivät korkeiden TRF2-ilmentymistasojen aiheuttaman tuumorigeenisyyden

Seuraavaksi arvioimme AR:n ja AD:n vaikutusta kasvaimen kasvuun. Valvoaksemme niiden kykyä kohdistaa TRF{0}}yli-ilmentäviin syöpiin analysoimme AR:n ja AD:n mahdollisia kasvainten vastaisia ​​vaikutuksia sekä tavallisiin BJ-HELTRAs-soluihin että TRF2-yli-ilmentäviin BJ-HELTRAs-soluihin. BJ-HELTRAs-solut transdusoitiin TRF2lenti-virusvektorilla tai tyhjällä vektorilla ja injektoitiin sitten ihonalaisesti nude-hiiriin. Hiiriä käsiteltiin sitten DMSO:lla 1 mg/kg AD tai 5 mg/kg AR päivää 16, 18, 20 ja 22 injektion jälkeen [26, 27] (kuvio 2A). Kuten aiemmin on raportoitu [13,21], TRF2:n yliekspressio edisti kasvaimen alkuvaihetta. muodostuminen ja kasvu in vivo (kuvio 2B-D; s<0.05). treatment="" with="" neither="" ar="" nor="" ad="" impacted="" tumor="" volume="" in="" bj-heltras="" cells="" transduced="" with="" the="" empty="" vector="" (figure="" 2e,="" upper="" panels)="" neither="" tumor="" growth="" rate(figure="" 2f-h).="" by="" contrast,="" both="" drugs="" induced="" a="" significant="" decrease="" in="" the="" tumor="" volume="" of="" trf2-overexpressing="" xenografted="" tumors,="" leading="" to="" significantly="" smaller="" tumor="" sizes="" at="" day="" 26="" (figure="" 2e,middle=""><001)but also="" of="" the="" tumor="" growth="" rate="" (figure="" 2f-h)="" at="" each="" time-point.="" furthermore,="" the="" vol-ume="" and="" growth="" rates="" of="" trf2-overexpressing="" tumors="" treated="" by="" the="" two="" drugs="" returned="" to="" levels="" similar="" to="" those="" of="" the="" control="" tumors,="" thus="" demonstrating="" the="" trf2-specific="" selectivity="" of="" ar="" and="" ad="" (figure="" 2e,lower="" panels).these="" results="" show="" that="" ar="" and="" ad="" treatment="" reversed="" specifically="" the="" tumorigenicity="" conferred="" by="" trf2="" overexpression.="" or）="" were="" injected="" subcutaneously（1×10°cells/100μl）into="" nmri="" nude="" mice.="" the="" mice="" were="" then="" treated="" with="" dmso,alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg)="" or="" ar-a014418(5="" mg/kg)="" at="" days16,18,20="" and="" 22="" post-injection,="" then="" followed="" up="" until="" day="" 26="" (n="8" mice="" per="" group).(b-d)="" the="" percentage="" of="" tumor-free="" mice="" (b)="" and="" tumor="" volumes(c)="" were="" determined="" at="" the="" indicated="" time="" points="" in="" mice="" injected="" with="" bj-heltras="" cells="" overexpressing="" trf2(trf2="" vector)="" or="" empty="" vector.="" tumor="" take="" based="" on="" palpability="" was="" determined="" at="" the="" indicated="" time="" points="" and="" is="" represented="" as="" a="" percentage="" of="" tumor-free="" mice.p="" values="" were="" determined="" using="" the="" log-rank="" mantel-cox="" test(*=""><0.05). tumor="" volumes="" were="" assessed="" at="" different="" time-points="" (mean="" ±="" standard="" deviation);="" tumor="" volume="" at="" d.ay="" 15="" is="" represented="" in="" (d).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><><><0.001). (e)="" tumor="" volumes="" were="" followed="" as="" in="" (c)="" after="" repetitive="" treatments="" with="" dmso,="" alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg),="" or="" ar-a014418(5mg/kg).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><0.0001;ns: not="" significant).(f-h)="" tumor="" growth="" rate="" of="" ar-a014418(5mg/kg)treated="" mice(f,h)="" or="" alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg)(g,h)="" treated="" mice="" were="" determined="" by="" considering="" the="" last="" day="" before="" treatment="" for="" empty="" vector="" or="" trf2="" vector="" as="" 100%.="" variations="" of="" the="" growth="" rate="" in="" both="" treatments="" over="" the="" time="" are="" represented="" in="" (f,g)="" and="" for="" each="" time-point="" (h).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><><><>

3.3.AR-A014418 ja aleksidiini-2HCI:llä estetty TRF2-riippuvainen immunosuppressio ja uusangiogeneesi

Sen määrittämiseksi, voisivatko AR:n ja AD:n kasvaimia estävät vaikutukset kohdistaa TRF2:n ei-soluautonomiin onkogeenisiin ominaisuuksiin, tutkimme immuunisolujen infiltraatiota ja aktivaatiota sekä angiogeneesiä hoidetuissa kasvaimissa. Käsittelimme normaaleja ja TRF{2}}yliekspressoivia BJ-HELTRAs-soluja (kuva S3A) 1 uM:lla AD:ta, 10 uM:lla AR:ta tai DMSO:ta 48 tunnin ajan ennen niiden subkutaanista Matrigel-injektiota nude-hiiriin. Matrigel-tulpat kerättiin sitten 5 päivää injektion jälkeen kasvaimen mikroympäristön analysoimiseksi virtaussytometrialla (kuvio 3A). Kuten odotettiin [13,21], TRF2:n yli-ilmentyminen ei muuttanut globaalia immuunisolujen (CD45 plus solu) infiltraatiota (kuvio 3B; kuva S4A), mutta esti luonnollisten tappajasolujen (NK) värväämistä (kuva 3C; kuva S4B) ja NK:n toimintaa. (Kuva 3C-E; Kuva S4C) ja lisää MDSC-tunkeutumista (kuvio 3F). Erityisesti TRF2-yliekspressoivissa BJ-HELTRAs-soluissa hoito jommallakummalla lääkkeellä lisäsi globaalia immuuni-infiltraatiota (kuva 3B; kuva S4A) sekä kasvaimen sisäisten NK-solujen määrää ja toimivuutta (kuva 3C-E; kuva S4B, C). Erityisesti molemmat lääkkeet pelastivat täysin TRF2:n yli-ilmentymisen aiheuttaman NK-soluvälitteisen immuunivalvonnan (CD107a plus ja CD69 plus NK-solu) inhibition (kuvio 3C). Tämä liittyi MDSC:n rekrytoinnin dramaattiseen vähenemiseen (kuvio 3F; kuva S4D) ja monosyyttien ja makrofagien lisääntyneeseen rekrytointiin (kuvio 3G).

Kuten aiemmin on raportoitu [14,20], kasvaimen angiogeneesi oli suurempi TRF2-yli-ilmentävissä kasvaimissa verrattuna kontrollikasvaimiin. Vaikka TRF2-yli-ilmentyminen lisäsi CD31- ja CD{5}}endoteelisolujen määrää kasvainkerroksessa (kuva 3H; kuva S4E), eroa ei havaittu tyhjän vektorin tai TRF{8}}yli-ilmentävien kasvainten välillä kummallakaan lääkkeellä hoidon jälkeen. TRF2-vektoria (TRF2-vektoria) tai tyhjää vektoria käsiteltiin 1 uM:lla aleksidiini-2HCl:a tai 10 µM:lla AR-A014418:aa tai DMSO:a 2 päivää ennen ihonalaista Matrigel-injektiota (1 × 10 asteen soluja) nude-NMRI-hiiriin ( n=8). Immuuni- ja endoteelisolujen infiltraatio arvioitiin sitten 5 päivää injektion jälkeen virtaussytometrialla. (BH). Matrigel-tulpan immuunitunkeutumisen virtaussytometrinen analyysi. Matrigel-tulppien elävien solujen joukossa tunkeutuneiden immuunisolujen lukumäärät esitetään. Immuunisolujen kokonaisinfiltraatio (CD45 plus solut) on esitetty kohdassa (B); luonnollinen tappajasolu (NK) (NKp46 plus solut) infiltraatio on esitetty kohdassa (C); aktivoitujen NK-solujen (CD107a plus ja CD69 plus NK-solut) infiltraatio on esitetty kohdassa (D, E); myeloidiperäisten suppressorisolujen (MDSC;CD11b plus GR1 plus ))-infiltraatio on esitetty kohdassa (F);monosyytti-makrofagi-infiltraatio näkyy (G) ja endoteelisolujen infiltraatio näkyy (H).p Arvot määritettiin käyttämällä Mann- Whitneyn testi (*s<><><0.001;n =="" 8="" mice="" per="">

4. Keskustelu

Tässä raportoimme solupohjaisen määrityksen kehittämisestä yhdisteiden seulomiseksi, jotka moduloivat telomeeriproteiinin TRF2 ekspressiota. Seulomalla pienen kirjaston FDA:n hyväksymiä molekyylejä tunnistimme yhdisteitä, jotka voivat joko lisätä tai vähentää TRF2:n ilmentymistasoja. Havaitsimme, että AD ja AR vähensivät TRF2:ta ja osoittivat kasvaintenvastaista aktiivisuutta, joka oli spesifistä TRF2:ta yli-ilmentäville kasvainsoluille. AR- ja AD-hoito osoitti edelleen niiden TRF2-spesifistä aktiivisuutta, mikä pelasti immunosuppression ja neoangiogeneesin, jonka TRF2:n yli-ilmentyminen aiheutti. Hämmästyttävää on, että se tosiasia, että globaali immuuni-infiltraatio lisääntyy TRF2:ta yli-ilmentäville kasvaimille AR- tai AD-hoidon jälkeen, viittaa siihen, että nämä lääkkeet tehostavat immuunivastetta, kun TRF2 on yli-ilmentynyt. Nämä lääkkeet estävät TRF2-yli-ilmentymisen immunosuppressiivista vaikutusta palauttamalla NK-solujen toiminnallisuuden (CD107a ja CD69 plus NK-solut) ja vähentävät voimakkaasti MDSC-infiltraatiota. Tämä viittaa siihen, että nämä lääkkeet heikentävät TRF2-riippuvaista spesifistä ohjelmaa, joka laukaisee immuunijärjestelmän paeta ja immunosuppression, ja voivat lisätä vaaraan liittyvien molekyylien (DAMP) vapautumista, jotka tehostavat immuunivastetta erityisesti, kun TRF2 on yli-ilmentynyt. Huomaamme, että AR ja AD pelastivat TRF2:n yli-ilmentymisen immunosuppressiiviset ja pro-angiogeeniset toiminnot, kaksi TRF2-yli-ilmentymisen ominaisuutta, jotka osoitimme aiemmin DDR-riippumattomina. Siten oletimme, että AR- ja AD-vaikutukset kasvaimen kasvuun ovat DDR-riippumattomia, mekanismi, joka on edelleen kuvattava täysin lisätutkimuksissa. Tämä konseptitodistustutkimus tarjoaa todisteita siitä, että TRF2:n ilmentymisen farmakologinen vähentäminen voisi olla arvokas syövän vastainen strategia

Vaikka seulontamenetelmässä tarkasteltiin TRF2-proteiinin tasoja transkriptitasoista riippumatta, molemmat lääkkeet alensivat endogeenisen TERF2-mRNA-tasoja, mikä viittaa siihen, että AR ja AD kohdistuvat useisiin TRF2-säätelytasoihin. Tätä tukee AR on Wnt-signaloinnin estäjä [28], joka on TERF2-transkription aktivaattori [29]. Yleisemmin sanottuna Wnt-signalointireittiin kohdistuvat lääkkeet rikastuivat seulontavaiheiden aikana (kuva S1B-D). Kuinka AD, mitokondrioihin kohdistuva aine, vaikuttaa TRF2-ilmentymiseen, on vielä määritettävä. Koska syövillä, joilla on korkea TRF2-taso, on huono ennuste ja niillä on lisääntynyt vastustuskyky kemoterapialle [21], AR ja AD ovat kiinnostavia terapeuttisia aineita sellaisille kasvaimille. Mahdollisuus erottaa TRF2:n telomeeriset ja pro-onkogeeniset aktiivisuudet[13] nostaa esiin mahdollisuuden farmakologisesti heikentää TRF2:ta, mikä tuottaa monihakuisia syövän vastaisia ​​etuja ilman haitallisia ikääntymistä edistäviä sivuvaikutuksia. Siksi tulevat tutkimukset ovat perusteltuja näiden lääkkeiden synergististen vaikutusten määrittämiseksi TRF2:n ilmentymistasoihin kliinisissä tutkimuksissa.

Vaikka TRF2 on lisääntynyt monissa ihmisen syövissä [13, 21], sen ilmentyminen vähenee monien kudosten normaalin ja patologisen ikääntymisen aikana [30, 31] Lisäksi useat raportit, jotka koskevat TRF2-säätelyhäiriön hiirimalleja, korostavat TRF2:n merkitystä ikääntymisen ja syövän risteys [31-35]. Siksi tässä kuvatulla seulontamenettelyllä tunnistetut molekyylit ovat mielenkiintoisia lääkeehdokkaita sekä syövän vastaisina aineina TRF2:n alasäätelyä varten, kuten tässä tutkimuksessa vahvistettiin, että mahdollisesti ikääntymistä ehkäisevinä aineina lisäämällä TRF2:ta.

Tämä artikkeli on poimittu julkaisusta Cancers 2021, 13, 2998. https://doi.org/10.3390/cancers13122998 https://www.mdpi.com/journal/cancers