MiR-199-3p tehostaa lihasten uusiutumista ja parantaa ikääntyneiden lihasten ja lihasdystrofiaa

Ota yhteyttä oscar.xiao@wecistanche.com saadaksesi lisätietoja

Parabioosikokeet viittaavat siihen, että nuorentumiseen ja ikääntymiseen liittyvät molekyylitekijät kiertävät veressä. Tässä osoitamme, että miR-199-3p, joka kiertää veressä soluttomana miRNA:na, on merkittävästi vähentynyt iäkkäiden hiirten veressä nuoriin hiiriin verrattuna; ja miR-199-3p:llä on kyky parantaa myogeenistä erilaistumista ja lihasten regeneraatiota. MiR-199-jäljitelmien, jotka tarjoavat miR-199-3p:tä, antaminen iäkkäille hiirille johti lihassäikeen liikakasvuun ja viivästyneen lihasvoiman menetykseen. Systeeminen miR-199-jäljitteiden antaminen mdx-hiirille, joka on Duchennen lihasdystrofian (DMD) tunnettu eläinmalli, paransi merkittävästi hiirten lihasvoimaa. Kaiken kaikkiaan veren soluttomalla miR-199-3p:llä voi olla ikääntymistä estävä vaikutus, kuten ahypertrofinen vaikutus ikääntyneissä lihassyissä, ja sillä voi olla potentiaalia uutena RNA-hoitona DMD:n ja ikään liittyvien sairauksien hoidossa. Löydökset tarjoavat meille uusia näkemyksiä verenkierrossa kiertävistä miRNA:ista ikään liittyvinä molekyyleinä.

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja

Elintoiminnot, kuten lihasvoima, hermoston toiminta, hengitystoiminta, suojautuminen infektioita vastaan ​​ja vastustuskyky sairauksia vastaan, heikkenevät ikääntymisen myötä. Tällaiseen toiminnalliseen heikkenemiseen liittyvät sairaudet ja toimintahäiriöt lisääntyvät ja niistä on tulossa suuria ongelmia ikääntyvien yhteiskunnissa. Erilaisia ​​muutoksia, kuten aineenvaihdunnan ja geenisäätelyn muutoksia, tapahtuu kehossa ikääntymisen myötä-3; ja tällaisten muutosten tutkiminen voi auttaa ymmärtämään ikääntymistä ja tarjota strategioita ikääntyvien yhteiskuntien ongelmien ratkaisemiseksi. Ikääntymiseen liittyviä biomolekyylejä (mukaan lukien geenit) on tunnistettu ja niistä voi olla hyötyä ikääntymisen tutkimuksessa; esim. -galaktosidaasi ja plolnk4a:n ilmentyminen liittyvät solujen vanhenemiseen4-6, ja hiirimalli, josta puuttuu klotho-geeni, tunnetaan ikääntymismallina, jossa on useita fenotyyppejä, jotka muistuttavat ihmisen ennenaikaista ikääntymistä.

Parabioosi on liitto kahden yksilön välillä, joilla on yhteinen verisuonijärjestelmä, ja se voidaan luoda kokeellisesti leikkauksella8. Parabioosilla tehdyt kokeet, joissa nuoret ja iäkkäät jyrsijät yhdistettiin jakamaan yhteisen verisuonijärjestelmän, osoittivat, että nuorten eläinten ikääntymisprosessi kiihtyi, kun taas vanhemmat eläimet nuoreutuivat9-12. Löydökset viittaavat vahvasti siihen, että tiettyjä nuorentumiseen ja ikääntymiseen liittyviä tekijöitä on läsnä ja veren mukana kiertää verisuonijärjestelmässä; tällaisia ​​verenkiertotekijöitä ei kuitenkaan vielä täysin ymmärretä3.

Cistanche voi estää ikääntymistä

MikroRNA:t (miRNA:t) ovat 21-23-nukleotidipituisia pieniä ei-koodaavia RNA:ita, jotka prosessoidaan pidemmistä transkripteistä (primaari-miRNA:t) pilkkomalla, mikroprosessorikompleksin ytimessä ja Dicerin sytoplasmassa, ja ne sisällytetään RNA-indusoitu vaimennuskompleksi (RISC)14,15. RISC:ssä oleva MiRNA toimii välittäjänä geenin vaimentamisessa, jossa miRNA:n kanssa osittain komplementaaristen lähetti-RNA:iden (mRNA:iden) translaatio estyy tai miRNA:lle lähes komplementaarisia sekvenssejä kuljettavat mRNA:t digestedl4,15.Cistanche-uute Anti-säteilySiten miRNA:illa on tärkeä rooli geenisäätelyssä estämällä niiden kohdegeeniekspressiota. Eläimistä ja kasveista on löydetty tuhansia miRNA-geenejä [katso microRNA-tietokanta (miRBase): http://www.mirbase.org/index.shtml]. MiRNA:iden ilmentymisprofiilia on tutkittu ja miRNA:iden kudos- ja kehitysvaihespesifistä ilmentymistä ja sairauteen liittyvää ilmentymistä on havaittul6-21. Geenisäätely, johon liittyy miRNA:ita, liittyy läheisesti erilaisiin elintoimintoihin ja elämänilmiöihin, mukaan lukien sairaudet14,16,21-24

MiRNA:t ovat läsnä solujen ulkopuolella sekä sisällä25. Esimerkiksi miRNA:t ovat läsnä veressä soluvapaina nukleotideina ja kiertävät verisuonijärjestelmässä2627. Sellaiset soluttomat miRNA:t (cf-miRNA:t) liitetään pieniin rakkuloihin, joita kutsutaan solunulkoisiksi vesikkeleiksi, tai ne liittyvät proteiineihin, jolloin ne saavat suojan solunulkoisilta nukleaaseilta25, 28. Joidenkin cf-miRNA:iden läsnäolo voi olla merkittävää; esimerkiksi merkittäviä assosiaatioita cf-miRNA:iden ja tiettyjen sairauksien välillä on havaittu26,27,29-31. Cf-miRNA:t voivat heijastaa muutoksia fyysisessä tilassa; siten tällaiset miRNA:t voivat olla potentiaalisia biomarkkereita elämän ylläpitojärjestelmien sekä sairauksien seurantaan.

Tässä tutkimuksessa tutkittiin cf-miRNA:iden ja ikääntymisen välisiä yhteyksiä, ja cf-miRNA:ita tutkittiin nuorten ja iäkkäiden hiirten veressä. Tulokset paljastivat muutoksia cf-miRNA:issa nuoren ja ikääntyneen hiiren veren välillä. Tällaisten miRNA:iden joukossa miR-199-3p oli huomattavasti alentunut ikääntyneessä veressä verrattuna nuoreen vereen. Mielenkiintoista on, että miR-19-3p:llä on kyky tehostaa lihasten erilaistumista ja regeneraatiota, ja sen antaminen iäkkäille hiirille johti lihassäiden laajentumiseen. Kun miR-199-3p vietiin mdx-hiiriin, Duchennen lihasdystrofian (DMD) eläinmalliin, hiirien lihasvoima parani huomattavasti. Tämä tutkimus tarjoaa uusia näkemyksiä verenkierrossa kiertävistä cf-miRNA:ista ikääntymisen, piilevän kyvyn ja lääketieteellisten sovellusten kannalta.

Tulokset

Cell-free miRNAs in the blood of young and aged mice. We investigated cf-miRNAs in the blood of young (6-week-old) and aged (>23-kuukauden ikäiset) C57BL/6J-hiiret, jotka käyttävät DNA-mikrosirua ikään liittyvien erojen tunnistamiseen. Cf-miRNA:iden profiilissa oli merkittäviä eroja nuorten ja ikääntyneiden hiirten välillä, eli havaittiin cf-miRNA:ita, jotka ovat puolueellisia kohti nuorta ja ikääntynyttä hiiren verta (taulukko 1). Tällaisista miRNA:ista myogeeniset miRNA:t (esim. miR-1 ja miR-133)1833 olivat läsnä miRNA-ryhmässä, jota on runsaasti nuoressa veressä; toisin sanoen myogeenisiä miRNA:ita oli huomattavasti vähemmän ikääntyneessä veressä (taulukko 1).cistanche herbaNuoren ja ikääntyneen veren miRNA:iden ero vahvistettiin kvantitatiivisella käänteistranskriptiopolymeraasiketjureaktiolla (qRT-PCR; kuva la), ja se toistettiin edelleen käyttämällä plasmasta eristetyistä pienistä vesikkeleistä, niin kutsutuista eksosomeista, uutettuja RNA-lähteitä ( Täydentävä kuva 1).

Soluviljelykokeet toisaalta paljastivat, että nuoren hiiren seerumilla oli kyky indusoida myogeenistä erilaistumista, ja kyky oli vahvempi kuin iäkkäillä hiirillä (kuvio 1b). Insuliinin kaltainen kasvutekijä I (IGF-I), joka on tärkein tekijä, joka pystyy indusoimaan myogeenistä erilaistumista veressä34,35, tutkittiin; ei kuitenkaan havaittu merkittävää eroa nuoren ja ikääntyneen veren välillä (kuvio lc). Siten muut tekijät kuin IGF-I nuoressa veressä voivat olla osallisia myogeeniseen erilaistumiseen.

miR-199-3p pystyy indusoimaan voimakkaasti myogeenistä erilaistumista. Tutkimme nuoressa veressä runsaasti esiintyvien miRNA:iden vaikutuksia myogeeniseen erilaistumiseen. Synteettiset miRNA-mimeetit vietiin C2C12-soluihin, hiiren myoblastisolulinjaan, ja myogeenisten erilaistumismerkkien, myogeniinin (Myog) ja myosiinin raskaan ketjun 1 (Myh1) geenien ilmentymistä tutkittiin. Tulokset olivat odottamattomia ja herättivät kiinnostuksemme: miR-199-3p, jonka ennustettiin negatiiviseksi miRNA:ksi vähäisen myogeenisen erilaistumisen vuoksi, indusoi merkittävästi Myogin ja Myh1:n ilmentymistä (kuvat 2a, b). Lisäksi miR-199-3p:n induktio oli voimakkaampaa kuin tavanomaisten myogeenisten miRNA:iden: myosiinin raskaan ketjun ilmentyminen miR-199-3p:n läsnä ollessa oli erityisen merkittävää (kuvat 2b, c).

Selvittääksemme miR-199-3p:n ja myogeenisen erilaistumisen välistä suhdetta tutkimme solun ja solunulkoisen (eksosomaalisen) miR-199-3p:n myogeenisen erilaistumisen aikana sekä miR-199-3p-estäjien vaikutuksia. erottelusta. Endogeenisen (sellulaarisen) miR-199-3p:n ilmentyminen lisääntyi erilaistumisen alkamisen jälkeen. Eksosomaalinen miR-19-3p nousi kerran ja pieneni sen jälkeen (täydentävä kuva 2a). Inhibiittorihoito tukahdutti myogeenisten erilaistumismerkkien, Myog, Myh1 ja kreatiinikinaasin (Ckm) ilmentymisen (täydentävä kuva 2b).cistanche peniksen kasvuNäin ollen havainnot viittaavat siihen, että miR{0}}p osallistuu myogeeniseen erilaistumiseen.

MiR{0}}-mimiikan suunnittelu. Suunnittelimme miR-199-mimeetit sellaisiksi, että ne voivat tehokkaasti tuottaa miR-199-3p:tä funktionaalisena välittäjänä (ohjaussäikeenä) geenin vaimentamisessa. Suunnitellut miRNA-mimiikit seulottiin ja miR199#4 valittiin päteväksi miR-199-mimeiksi (täydentävä kuva 3). Myöhemmin miR199#4:ää käytettiin sekä in vivo että in vitro -kokeissa.

miR-199-3p:n kohdegeenit myogeenisessä erilaistumisessa. Tunnistaaksemme miR-199-3p:n kohdegeenit myogeenisen erilaistumisen alaisena etsimme ehdokasgeenejä TargetScan-tietokannasta ja keskityimme Lin28b- ja Suz12-geeneihin, jotka molemmat ilmentyvät C2C12-myoblasteissa. Lin28b:llä ja Suz12:lla on oletettuja miR-199-3p-sitoutumissekvenssejä 3'-kääntämättömällä alueella (UTR; kuva 3a). Osoitimme, että oletetut sekvenssit ovat aitoja sitoutumiskohtia miR-19-3p:lle, käyttämällä lusiferaasireportterigeenejä, jotka kantavat sitoutumissekvenssit ja vastaavat yhteensopimattomat sekvenssit (kuvat 3a, b). Oletettuja sitoutumissekvenssejä kantavia lusiferaasigeenejä suppressoivat merkittävästi miR-199-3p [pLin28b-(81), pLin28-(983) ja pSuz12-(973)], kun taas yhteensopimattomat sekvenssit, joissa on emässubstituutiomutaatioita siemenalueella [pLin28b-(81)mut, -alueella, kumosivat sen suppressiovaikutuksen [pSuz{25}}(973)mut]. pLin28-(983)mut ja Kun miR-199-mimeettejä vietiin C2Cl2-soluihin, Lin28b:n ja Suz12:n ilmentyminen vaimeni jatkuvasti (kuva 3c). Sen arvioimiseksi, onko Lin28b:n ja/ tai Suz12 myötävaikuttaa suoraan myogeeniseen erilaistumiseen, Lin28b:n ja Suz12:n spesifinen esto suoritettiin geenin hiljentämisellä käyttämällä RNA-häiriötä (RNAi; kuvio 3d, e). Kuten odotettiin, myogeenisten erilaistumismarkkerien, kuten Ckm, Myh1 ja Myog, ilmentyminen lisääntyi Lin28b- ja Suz12-geenin hiljentämisessä (kuvio 3f, g).

Koska Lin28b on RNA:ta sitova proteiini, joka osallistuu miRNAs3637:n prosessoimiseen, tutkimme Lin28b:n kautta tapahtuvien miR-19-mimiikan vaikutuksia myogeeniseen miRNA-prosessointiin. MiR-1:n, tärkeimmän myogeenisen miRNA:n, tasoa tutkittiin, koska sen prekursorin prosessointia säätelee Lin28b37. Kypsytetty miR-1 lisääntyi merkittävästi miR-199-mimikkikäsittelyllä (kuva 3h), mikä viittaa siihen, että miR-199-3p voi säädellä miR-1:n toiminnallista ilmentymistä estämällä. kohteen Lin28b. Yhteenvetona havainnot viittaavat siihen, että miR-199-3p osallistuu myogeeniseen erilaistumiseen sen kohdegeenien, Lin28b ja Suz12, suppression kautta.

Lihasten regeneraation tehostaminen miR199#4:llä lihasvauriohiirillä.cistanche-salsan edutTutkimme miR-199-mimikon (miR199#4) vaikutuksia in vivo käyttäen lihasvauriomalleja (kuvat 4a, b). Kahdeksan viikon ikäisille C57BL/6J-hiirille injektoitiin BaClz:tä tibialis anterioriin (TA) lihasvaurion indusoimiseksi, ja miR19#4 annettiin vaurioituneisiin kohtiin 24 tuntia myöhemmin. Kaksi päivää miR199#4:n antamisen jälkeen myogeenisten markkerigeenien ilmentymistä tutkittiin. Myog-ekspressio lisääntyi merkittävästi ja myogeeninen erilaistuminen 1 (Myod1) ja myogeeninen tekijä 5 (Myf5) myös lisääntyivät miR199#4:n antamisella (kuvio 4c). Tiedot ovat yhdenmukaisia ​​edellä kuvattujen in vitro -tulosten kanssa (kuvio 2).

Regeneroituvien lihasten immunohistokemiallinen analyysi suoritettiin 9 päivää miR199#4:n antamisen jälkeen. Tutkittiin regeneroituvien lihassäikeiden (lihaskuitujen) poikkileikkausalueet, joille on tunnusomaista keskusytimet (kuvio 4b). MiR199#4:llä käsiteltyjen regeneroituvien lihaskuitujen keskimääräinen poikkileikkauspinta-ala oli suurempi kuin ei-hiljentävällä kontrolli-RNA-dupleksilla käsiteltyjen kontrollilihaskuitujen (nsCont; kuva 4d) eron lähestyessä tilastollista merkitsevyyttä. Keskimääräisen poikkileikkausalan lisäksi kokoon jaettu poikkileikkausalan histogrammi osoitti laajentuneiden lihaskuitujen lisääntymistä miR199#4:n läsnä ollessa (kuva 4e).

miR199#4:n hypertrofinen vaikutus ikääntyneisiin lihaskuituihin. Tutkimme miR199#4:n vaikutuksia iäkkäisiin hiiriin (noin 24 kuukauden ikäisiin). Ikääntyneiden hiirten lihasten miR-199-3p (kuva 5a), kuten verenkierrossa oleva cf-miR-19-3p, väheni merkittävästi nuoriin hiiriin verrattuna. Annoimme miR199#4:ää ikääntyneiden hiirten TA-lihaksille, ja 2 päivää myöhemmin TA-lihakset tutkittiin immunohistokemiallisella analyysillä (kuvio 5b). MiR199#4:llä käsiteltyjen myofiberien keskimääräinen poikkileikkauspinta-ala oli merkittävästi suurempi kuin nsContilla käsiteltyjen kontrollilihaskuitujen (kuvio 5c). Tämän mukaisesti kokojaettu histogrammianalyysi paljasti merkittävän lisääntymisen laajentuneissa myofibereissa miR199#4:n läsnä ollessa (kuvio 5d).

Koska verenkierto cf-miR-199-3p on vähentynyt ikääntyneillä hiirillä, siirsimme miR199#4:n ikääntyneiden hiirten kiertävään vereen häntäpään kautta. MiR19#4:n laskimonsisäisen annon jälkeen myofiberien poikkileikkausala tutkittiin ja analysoitiin, kuten edellä on kuvattu. Tulokset, kuten on esitetty kuviossa 5e, ovat yhdenmukaisia ​​tulosten kanssa, jotka saatiin miR199#4:n paikallisesta annosta ikääntyneille lihaksille (kuvio 5c, d).

On huomattava, että lihasvauriomallin ja ikääntyneiden hiirten välillä on eroa laajentuneissa lihassyissä. Keskeisiä ytimiä nähdään regeneroituvissa lihassäikeissä (kuvio 4b), mutta tällaisia ​​myofibrejä tuskin havaittiin iäkkäissä hiirissä, joita oli käsitelty miR199#4:llä (kuvio 5b). Tämä viittaa siihen, että olemassa olevat lihassäikeet voivat laajentua iäkkäillä hiirillä miR199#4-hoidon jälkeen. Oletimme, että toinen mekanismi, joka poikkeaa lihasten regeneraatiosta, saattaa liittyä myofiber-laajentumiseen iäkkäillä hiirillä, ja ehdotimme lihasatrofiareitin osallistumista.cistanche tubulosa annostus redditAtroginl- ja MuRFI-geenit liittyvät läheisesti lihasatrofiaan38, ja niiden ilmentymistasot ovat merkittävästi kohonneet ikääntyneissä lihaksissa nuoriin lihaksiin verrattuna (kuvio 6a). Tutkimme Atroginlin ja MuRFI:n tasoa ikääntyneiden hiirten lihaksissa miR199#4:n systeemisen annon jälkeen. Atroginl ja MuRFI vähentyivät merkittävästi eri lihaksissa miR19#4:n antamisen myötä (kuvio 6b), mikä viittaa siihen, että miR199#4:n aiheuttama lihasatrofiareitin tukahduttaminen voi aiheuttaa myofiber-laajenemista iäkkäillä hiirillä.

MiR199#4 viivyttää lihasvoiman menetystä iäkkäillä hiirillä. MiR199#4:n vaikutus lihasten toimintaan iäkkäillä hiirillä on kiinnostava. Tartunnan lujuustesti suoritettiin iäkkäillä hiirillä ennen ja jälkeen miR199#4:n systeemisen annon. Koe suoritettiin kaksoissokkomenetelmällä; RNA-injektio ja 100 prosentin pitotesti suoritettiin eri kokeiden toimesta jakamatta i-tietoja. C57BL/6-hiirille (80-viikon ikäisille) urospuolisille hiirille tehtiin pitotesti, sitten 1 viikkoa myöhemmin niille injektoitiin suonensisäisesti miR199#4:ää ja nsContia, ja pitotestattiin uudelleen. Muutos lihasvoimassa miR199#4-injektion jälkeen oli MiR199#4 parantaa mdx-hiirten lihasvoimaa. Koska miR199#4:llä on positiivinen vaikutus lihaksiin, teimme kokeen arvioidaksemme miR199#4:n antamisen vaikutusta mdx-hiirillä, joka on tunnettu DMD-eläinmalli32. Kahdeksan viikon ikäisille mdx-hiirille injektoitiin suonensisäisesti miR199#4:ää (1,6 mg/kg) kahdesti (1 viikon välein), ja pitotesti suoritettiin 1 viikko viimeisen annon jälkeen. Koe suoritettiin kaksoissokkomenetelmällä, kuten kuvassa 7 on esitetty. Tulokset (kuvio 8a) osoittavat merkittävän parannuksen lihasvoimassa miR199#4:llä hoidetuissa mdx-hiirissä verrattuna nsContilla käsiteltyihin mdx-hiiriin. Lisäksi miR199#4:llä käsiteltyjen mdx-hiirten veressä havaittiin kreatiinikinaasin (CK) aktiivisuuden ja soluttoman miR-1:n merkittävää laskua (kuvat 8b, c), jotka ovat mahdollisia merkkejä taudista. parannus.

Lääkkeen luovutusreagenssina atelokollageeni on viskoosia ja vaikeasti käsiteltävää, ja atelokollageenilla käsitellyt hiiret näyttivät kärsivän kielteisistä vaikutuksista vehikkelin vuoksi. Näin ollen etsimme vaihtoehtoja atelokollageenille parantaaksemme lääkkeenantojärjestelmäämme (DDS) ja löysimme DC-CHOL/DOPE-kationiset liposomit uutena DDS-reagenssina, joka on yhtä suuri tai parempi kuin atelokollageeni (täydentävä kuva 4). MiR199#4:n lääkejakauma kationisten liposomien kanssa osoitti, että annettu miR19#4 kuljetettiin lihakseen ja otettiin jatkuvasti suuria määriä maksaan (täydentävä kuva 5). Lihakseen kuljetettu solunulkoinen miR199#4 voi toimia välittäjänä geenien vaimentamisessa ja edistää lihasvoiman parantamiseen liittyvää geenisäätelyä.

Yritimme tunnistaa biomolekyylejä, jotka liittyvät parantumiseen miR199#4:n antamisen jälkeen. Erilaisia ​​DMD:hen liittyviä polypeptidejä tutkittiin Western blot -menetelmällä; tässä tutkimuksessa ei kuitenkaan havaittu selkeitä parantumiseen liittyviä signaaleja (täydentävä kuva 6). Keskustelemme tästä asiasta tarkemmin seuraavassa osiossa.

Keskustelu

Biomolekyylit muuttuvat laadullisesti ja määrällisesti ikääntymisen myötä--3. Tällaisten muutosten vangitseminen ja niiden tutkiminen on elintärkeää ikääntymisen ymmärtämiseksi, ja se voi paljastaa strategioita ikääntyvien yhteiskuntien ongelmien ratkaisemiseksi. Parabioositutkimukset, joissa nuoret ja iäkkäät eläimet yhdistetään jakaakseen yhteisen verisuonijärjestelmän, ovat antaneet tärkeitä tietoja ikääntymisestä ja nuorentumisesta9-l2. Löydökset viittaavat vahvasti siihen, että nuoressa ja ikääntyneessä kiertävässä veressä on nuorentavaa ja ikääntyvää tekijöitä. Aiemmat tutkimukset raportoivat erilaisia ​​​​molekyylejä ehdokkaiksi, jotka liittyvät nuorentumiseen ja ikääntymiseen, mutta tulokset ovat kiistanalaisia3.

In vitro -soluviljelykokeemme nuorilla ja ikääntyneillä seerumeilla ovat samanlaisia ​​kuin parabioosikokeet (kuva lb), ja havaitsimme miR-199-3p, joka muuttuu iän myötä, kiertävästä verestä; miRNA:n todettiin laskevan merkittävästi ikääntyneessä veressä (taulukko 1 ja kuva la). Lisäksi lihasten (solujen) miR-199-3p:n ilmentyminen vähenee huomattavasti ikääntyneissä lihaksissa nuoriin lihaksiin verrattuna (kuva 1). 5a); siten cf-miR-199-3p veressä voi korreloida lihaksen miR-199-3p:n kanssa. MiR-199-3p:n ilmentymisen väheneminen ikääntymisen myötä havaitaan myös mesenkymaalisissa kantasoluissa, jotka ovat peräisin rhesusmakakin luuytimestä39. Siksi solun miR-19-3p:n ilmentyminen voi olla ikään liittyvän hallinnan alaisena. Toisin kuin miR-19-3p, solujen myogeenisten miRNA-molekyylien, kuten miR-1 ja miR-133, ilmentyminen pysyy muuttumattomana nuorissa ja ikääntyneissä lihaksissa (kuva 5a), mutta taso Niiden solunulkoisten miRNA-molekyylien määrä veressä on merkittävästi vähentynyt iäkkäillä hiirillä (kuvio la). Ero miR-199-3p:n ja myogeenisten miRNA:iden (miR-1 ja-133) välillä saattaa heijastaa eroa cf-miRNA:n prosessoinnissa ja/tai cf-miRNA:iden ikääntymisessä. . Tämän eron selvittämiseksi on tehtävä lisätutkimuksia tulevaisuudessa.

Aiemmat tutkimukset viittaavat siihen, että miR{0}}p osallistuu erilaisiin solutoimintoihin ja elintärkeisiin ilmiöihin kohdegeeniensä tukahduttamisen kautta. esim. miRNA voi edistää endoteelin kärkisolujen proliferaatiota ja migraatiota ja moduloida murrosiän alkamista kohdennetun semaforiini-3A-geenin40 vaimennussäätelyn ja kohdegeenien (Cdc42, Map3k2, Map3k4, ja Taok1) mukana p38MAPK-reitissä41. Tässä tutkimuksessa on havaittu, että miR-19-3p osallistuu myogeeniseen erilaistumiseen sen kohdegeenien, Lin28b ja Suz12, suppression kautta (kuva 3). Lin28b on RNA:ta sitova proteiini ja estää miRNA:iden kypsymistä, mukaan lukien miR-1, joka on lihasspesifinen miRNA ja edistää myogeneesiä37. Lin28b:n suppressio miR-19-3p:llä aiheuttaa kypsyneen miR-1:n lisääntymisen (kuva 3), mikä saattaa mahdollistaa myogeenisen erilaistumisen edetä.

Suzl2 on polykombirepressiivisen kompleksin 2 (PRC2) ydinalayksikkö, joka osallistuu kromatiini42:n tukahduttamiseen. PRC2:n geenisäätely osallistuu kantasolujen ylläpitoon, alkionkehitykseen, solujen lisääntymiseen ja erilaistumiseen, mukaan lukien myogeeninen erilaistuminen42.PRC2:ta on läsnä hiljaisissa lihasspesifisissä lokuksissa, kuten myogissa ja lihaskreatiinikinaasissa (MCK) erilaistumattomissa myoblasteissa, mutta se on dissosioitunut sellaisista lokuksista erilaistuneissa myoputkissa43. Geenien hiljentäminen Suz12:ta vastaan ​​RNAi:n toimesta lisää myogeenisen geenin ilmentymistä (kuvio 3). Zeste homolog 2 (Ezh2) -proteiinin, toisen PRC2:n ydinalayksikön, tehostajan suppressio aiheuttaa myös myogeenistä erilaistumista44. Nämä havainnot viittaavat siihen, että PRC2:n muodostumisen estäminen sen ydinalayksiköiden suppressiosta voi laukaista genomisen tilan syntymisen lihasten erilaistumista varten. Siten miR-199-3p:n aiheuttama Suz12:n suppressio voi indusoida myogeenistä erilaistumista. Kaiken kaikkiaan miR-19-3p:llä voi olla tärkeä rooli myogeenisessä erilaistumisessa estämällä kahta itsenäistä reittiä, joihin osallistuvat Lin28b ja Suzl2, jotka kumpikin osallistuvat myoblastien erilaistumattoman tilan ylläpitämiseen.

miR-199-3p:n vaikutus myogeeniseen erilaistumiseen on osoitettu myös in vivo (kuva 4). Lihasvaurio laukaisee solujen lisääntymisen ja erilaistumisen lihasten uudistumisen seurauksena. MiR199#4:n, joka toimittaa miR-199-3p:tä, lisääminen vaurioituneisiin kohtiin tehosti lihasten regeneraatiota ja laajensi regeneroituvia lihaskuituja (kuva 4). Myogeenisen geenin ilmentyminen lisääntyi jatkuvasti miR199#4-käsittelyssä (kuvio 4). Käytännön näkökulmasta miR199#4 saattaa olla tehokas ja hyödyllinen kirurgisissa hoidoissa.

Kun miR199#4:ää annettiin iäkkäille hiirille, joilta puuttui verenkiertoa kiertävä miR-199-3p, hiirillä ilmeni huomattavasti laajentuneita myofibrejä (kuvio 5) ja viivästyi lihasvoiman menetys ikääntymisen myötä (kuvio 7). Ikääntyneiden hiirten laajentuneet myofiberit eroavat uusiutuvista lihassäikeistä, jotka suurenevat miR199#4:n läsnä ollessa; edellinen on peräisin olemassa olevista myofibreistä, ja jälkimmäinen on neo-myofibers (vastasyntyneiden myofibers). Siten lihaskuitujen laajentumisessa on erilaisia, itsenäisiä mekanismeja. Tutkimuksemme viittaa siihen, että (i) edellisessä tapauksessa lihasatrofian estäminen, joka johtuu Atroginlin ja MuRFI:n suppressiosta miR199#4-hoidolla, johtaa ikääntyneiden myofiberien suurenemiseen ja (ii) jälkimmäisessä tapauksessa kohdegeenien, Lin28b, suppressioon. ja Suz12, aiheuttavat uusiutuvien lihaskuitujen laajentumisen. Kaiken kaikkiaan erilaiset (useita) miR-19-3p:n säätelemät geenit voivat olla mukana lihasten hypertrofiassa eri tilanteissa. Löydökset viittaavat myös siihen, että miR-199-3p:llä voi olla ainakin ikääntymistä estävä vaikutus lihakseen ja että miR199#4:llä, joka toimittaa miR-199-3p:tä, voi olla potentiaalia uutena RNA-lääkkeenä ikääntymiseen liittyviin lihassairauksiin. kuten sarkopenia.

Perustuen miR199#4:n korkeaan tehokkuuteen lihaksiin, annoimme miR199#4:ää mdx-hiirille, joka on hyvin tunnettu DMD-malli, ja saimme merkittäviä tuloksia: miR199#4:n systeeminen antaminen paransi hiirten lihasvoimaa ~20 prosenttia ( kuva 8a). Ymmärtääksemme lihasvoiman palautumisen mekanismia yritimme tunnistaa biomolekyylejä, joihin miR-199-3p paransi (tai joihin vaikutti). Veren CK:n ja cf-miR-1:n (kuvat 8b, c) parannuksia lukuun ottamatta emme kuitenkaan pystyneet havaitsemaan tällaisia ​​parannuksia molekyylitasolla. Tämä havaitsemisvaikeus voi johtua monimutkaisesta solupopulaatiosta, joka koostuu regeneroituvien ja hajottavien lihassolujen sekoituksesta mdx-hiirissä. Vaikka miR199#4 johtaisikin parantumiseen, monimutkaisen solupopulaation aiheuttama korkea taustamelu peittäisi todisteita parantumisesta. Tämän ongelman ratkaisemiseksi on suoritettava laajempia tutkimuksia, joissa käytetään homogeenista lihassolupopulaatiota, joka on peräisin mdx-hiiristä tai keskittyen erilaisiin kudoksiin, mukaan lukien lihas.

Vaikka miR199#4:n lihasvoiman palautumisen molekyylimekanismi on edelleen tuntematon, miR19#4:n annos parantaa lihasvoimaa on huomionarvoinen. Kaksinkertainen ~1,6 mg/kg miR199#4:n antaminen paransi lihasvoimaa mdx-hiirillä. Tehokas annos näyttää olevan pienempi kuin antisense-oligonukleotidien annos eksonin ohittamiseen mutanttidystrofiinigeenejä vastaan ​​in vivo45-47. Syy siihen, miksi miR199#4 pystyy parantamaan lihasvoimaa tällaisilla pienemmillä annoksilla, voi johtua sen erilaisesta vaikutusmekanismista verrattuna antisense-oligonukleotideihin. MiR19#4:n vaikutusmekanismi on katalyyttinen geenin hiljentäminen. Sitä vastoin antisense-oligonukleotidien mekanismi perustuu fysikaaliseen hybridisaatioon. Siksi erot sopivissa annoksissa lääkkeen tehokkuuden osoittamiseksi voivat johtua erilaisista vaikutusmekanismeista.

Mekanismia, jolla elimet, kudokset tai solut vapauttavat miRNA:ita kiertävään vereen, ei vielä täysin ymmärretä, ja ikään liittyvä säätely tällaisten miRNA:iden vapautumiselle on myös epäselvä. Tämä tutkimus osoitti, että myogeeniset cf-miR-NA:t, mukaan lukien cf-miR-199-3p, kiertävät veren mukana verisuonijärjestelmässä ja vähenevät ikääntymisen myötä. Tällaisia ​​cf-miRNA:ita voi esiintyä eksosomeissa, eli ne ovat eksosomaalisia miRNA:ita.

Myogeeniset miRNA:t osallistuvat myogeeniseen erilaistumiseen, lihasten regeneraatioon ja lihasten homeostaasin ylläpitämiseen33. Aiemmat tutkimukset raportoivat, että myogeenisten miRNA:iden, kuten miR-1 ja miR-133, havaittiin lisääntyvän veressä vasteena fyysiselle harjoitukselle4849. Näiden raporttien perusteella aktiiviset nuoret hiiret voivat vapauttaa enemmän myogeenisiä miRNA:ita vereen kuin ikääntyneet hitaasti liikkuvat hiiret, ja tällaiset solunulkoiset miRNA:t, mukaan lukien cf-miR-199-3p, voivat edistää lihasten homeostaasin ylläpitämistä nuorilla hiirillä autokriinisen toiminnan kautta. . Solunulkoisen (eksosomaalisen) miRNA:n taso ei kuitenkaan aina korreloi solun miRNA-tason kanssa, ja myogeenisissä miRNA:issa ja miR-199-3p:ssä on havaittu eroja nuorten ja ikääntyneiden hiirten välillä (kuvat la ja 5a) sekä niiden aikana. myogeeninen erilaistuminen (täydentävä kuva 2a). Siten toisena mahdollisuutena on ajateltavissa, että ikään ja erilaistumiseen liittyvä eksosomien muodostumisen säätely voi vaikuttaa cf-miRNA:n tuotantoon; erityisesti eksosomien muodostumisessa voi olla eroja nuorten ja ikääntyneiden hiirten välillä. Näiden hypoteesien yhteydessä tarvitaan lisätutkimuksia myogeenisten miRNA:iden ikääntymiseen liittyvän vapautumisen selvittämiseksi vereen.

Vapautumismekanismin lisäksi, kun nuoret myogeeniset cf-miRNA:t, jotka sisältävät cf-miR-199-3p:tä, virtaavat ikääntyneeseen verenkiertojärjestelmään nuoresta verisuonijärjestelmästä parabioosin kautta, cf-miRNA:t voivat laukaista lihasten aktivoitumisen ja lihasten eston. atrofia ikääntyneiden puolella; tätä käsitystä tukevat todisteet vanhoista hiiristä, joille injektoitiin suonensisäisesti miR19#4:ää tässä tutkimuksessa (kuvat 5-7). Cf-miRNA:t veressä voivat liittyä ikään liittyvään homeostaattiseen toimintaan ja voivat edustaa muuttunutta homeostaasia. Kun tällaisia ​​cf-miRNA:ita esiintyy ektooppisesti, esimerkiksi kun nuoressa veressä olevat cf-miRNA:t siirretään ikääntyneeseen verenkiertojärjestelmään, joillakin cf-miRNA:illa voi olla nuorentavaa vaikutusta ikääntyneellä puolella, eli ne voivat tuottaa ikääntymistä estäviä vaikutuksia. Sitä vastoin ikääntyneessä veressä olevat cf-miRNA:t voivat edustaa muuttunutta homeostaasia ikääntymisen myötä. Kun tällaiset cf-miRNA:t siirretään nuoreen verenkiertojärjestelmään, jotkin cf-miRNA:t voivat laukaista ikääntymiseen liittyvää heikkenemistä ja voivat aiheuttaa ennenaikaista ikääntymistä nuorella puolella. Cf-miRNA:t, jotka ovat merkittävästi lisääntyneet ikääntyneessä veressä, edustavat ehdokkaita, jotka vaativat yksityiskohtaisen mekaanisen analyysin ikääntymisen ymmärtämiseksi ja estämiseksi.

Yhteenvetona voidaan todeta, että nykyinen tutkimuksemme on tarjonnut uusia näkemyksiä cf-miRNA:ista ikään liittyvinä molekyyleinä ja paljastanut uuden tutkimussuunnan ikääntymisen ja soluvapaiden funktionaalisten RNA:iden, mukaan lukien cf-miRNA:iden, välisen suhteen selvittämiseksi.

Tämä artikkeli on poimittu julkaisusta VIESTINTÄBIOLOGIA|(2021) 4:427|https://doi.org/10.1038/s42003-021-01952-2|www.nature.com/commsbio