MikroRNA:t muodostavat sosiaalisen immuniteetin: mahdollinen kohde termiitin Reticulitermes Chinensisin biologiselle torjumiselle

Abstrakti

Eusosiaaliset hyönteiset voivat käyttää erilaisia ​​käyttäytymis- ja fysiologisia taudintorjuntakeinoja välttääkseen, vastustaakseen ja sietääkseen taudinaiheuttajia läheisissä ja pakatuissa pesäkkeissään, joita kutsutaan sosiaaliseksi immuniteetiksi. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että useat molekyylit palvelevat hyönteisten sosiaalista immuniteettia, kuten kemiallisia hajuja, hyönteismyrkkyjä, immuunijärjestelmään liittyviä proteiineja jne. Kuitenkin, ohjaavatko mikroRNA:t (miRNA:t), joiden esiasteita Dicer-1 käsittelee, sosiaalista ja miten immuniteettia hyönteisyhdyskunnissa ei vielä tunneta. Tässä käytimme "isäntä-patogeeni" -järjestelmää (isäntä: Reticulitermes chinensis; patogeeni: Metarhizium anisopliae) tutkiaksemme miRNA:iden vaikutusta sosiaaliseen immuniteettiin termiittipesäkkeissä. Havaitsimme, että Dicer-1:n RNAi-välitteinen hiljentäminen johti miRNA-pitoisuuden laskuun, mikä esti merkittävästi hiilihydraatti- ja energia-aineenvaihduntaa ja vaikutti muihin elämän prosesseihin, kuten immuunivasteeseen ja hapetus-pelkistysreaktioihin termiitin koko kehossa. . Käyttäytymispuolustuksessa Dicerin hiljentäminen{4}} vähensi merkittävästi puolustavaa sosiaalista käyttäytymistä, kuten liikkumista, hoitoa, kannibalismia ja hautaamista termiittiryhmiin, kun he kohtasivat sienitartunnan. Fysiologisessa puolustuksessa Dicer-1-hiljentäminen ja miR- 71-5-stimulaatio johtivat termiittien sienenvastaisen toiminnan merkittävään vähenemiseen. Lisäksi sekä Dicer-1-hiljennetyt että miR-71-5-stimulanteilla käsitellyt termiittiryhmät osoittivat korkeaa kuolleisuutta sienikontaminaation aikana. Tuloksemme osoittivat miRNA:iden tärkeän roolin sosiaalisen immuniteetin muovaamisessa termiittipesäkkeissä, tarjoten näkemyksiä, jotka ovat välttämättömiä hyönteisten käyttäytymis- ja fysiologisten sairauksien suojautumismahdollisuuksien taustalla olevien mekanismien ymmärtämiseksi ja näin ollen perustana miRNA-pohjaiselle tuholaistorjuntalle.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Avainsanat Eusocial hyönteinen · Entomopatogeeniset sienet · Tautipuolustus · Dicer-1 · miR-71-5

Avain viesti

• miRNA-välitteiset geeniekspressiot, jotka liittyvät sosiaaliseen immuunijärjestelmään.

• miRNA:t vaikuttivat käyttäytymissairauksien puolustuskykyyn termiittiryhmissä.

• miRNA:t vaikuttivat termiittiyksilöiden fysiologiseen taudintorjuntaan.

• miRNA-pohjaisia ​​termisidejä voitaisiin pitää uusina keinoina biologiseen tuholaistorjuntaan.

Johdanto

Termiitit ovat taloudellisesti tärkeitä tuholaisia, jotka maksavat 30 miljardia dollaria maailmanlaajuisesti ja aiheuttavat maailmanlaajuista vahinkoa viljelykasveille, puille, puurakenteille ja selluloosamateriaaleille. Kemialliset torjunta-aineet tarjoavat tehokkaan keinon torjua termiittituholaisia, mutta ne aiheuttavat myös vakavia ongelmia, jotka uhkaavat ihmisten terveyttä ja ympäristöä. Biologinen torjunta on arvokas vaihtoehto näiden ongelmien ratkaisemiseksi. Useita entomopatogeenejä, kuten Metarhizium ja Beauveria, on käytetty menestyksekkäästi biologiseen tuholaistorjuntaan, mikä on järkevää ja tehokasta (Verma et al. 2009; Kumar ja Upadhyay 2021). Termiittien biologinen torjunta on kuitenkin epätyydyttävää, mikä johtuu pääasiassa termiittiyhdyskuntien ainutlaatuisesta taudinsuojelusta. Termiitit, jotka ovat eusosiaalisia hyönteisiä, ovat kehittäneet kollektiivisia käyttäytymis- ja yksilöllisiä fysiologisia puolustuskeinoja vastustaakseen tarttuvien patogeenien suurta leviämisriskiä tiiviisti pakattuneiden ja läheisesti sukulaisten pesäkavereiden keskuudessa (nimeltään "sosiaalinen immuniteetti") (Van Meyel et al. 2018; Liu et al. . 2019a). On hyvin dokumentoitu, että termiitillä on laaja valikoima käyttäytymispuolustuksia: välttäminen on ensimmäinen puolustuslinja ja auttaa estämään termiittejä pääsemästä saastuneille alueille (Yanagawa et al. 2015); hälytyskäyttäytyminen näkyy nopealla pitkittäisvärähtelyliikkeellä varoittamaan pesäkavereita patogeenien läsnäolosta (Rosengaus et al. 1999); taudinaiheuttajien saastuttamia pesäkavereita kohdentamalla voidaan tehokkaasti poistaa taudinaiheuttajat pesäkumppanin kynsinauhoista (Liu et al. 2019b); hautaaminen ja kannibalistinen käyttäytyminen rajoittavat patogeenien siirtymistä ruumiista alttiisiin pesäkavereihin (Sun et al. 2016). Fysiologiset vasteet, kuten immuunivasteet ja hapettumis-pelkistysreaktiot, palvelevat myös termiittitautia. Immuunivasteisiin kuuluvat humoraaliset immuniteettivälitteiset antimikrobiset peptidit (AMP:t) ja solujen immuniteettivälitteinen fagosytoosi ja kapseloituminen, jotka pystyvät estämään patogeenien replikaatiota ja leviämistä hyönteisten ruumiinontelossa (Hussain et al. 2013; Liu et al. 2015; Lopez-Uribe ym. 2016; Hong ym. 2018). Hapetus-pelkistysreaktiot lieventävät toksiinien ja reaktiivisten happilajien (ROS) aiheuttamia vahinkoja patogeeni-infektioiden aikana, mikä edistää hyönteisten sietokykyä (Liu ym. 2015; Zhao ym. 2020; Zhou ym. 2021). Lisäksi aiemmat tutkimukset termiittitautien puolustuskyvystä ovat osoittaneet, että jotkut suoliston symbiontit olivat tärkeä osa isännän fysiologista puolustusta (Rosengaus et al. 2014). Joitakin AMP-yhdisteitä voitaisiin käyttää ulkoisena desinfiointiaineena kynsinauhojen pinnalla ja pesämateriaaleissa, kun ne liittyvät käyttäytymiseen, kuten hoitoon ja pesimiseen (Bulmer et al. 2009; Hamilton ja Bulmer 2012). Siksi termiittien käyttäytymis- ja fysiologisen puolustuskyvyn heikentäminen voi olla keskeinen askel termiittien biotorjuntavaikutuksen parantamiseksi.

Cistanche-edut miehille - vahvistavat immuunijärjestelmää

Napsauta tästä nähdäksesi Cistanche Enhance Immunity -tuotteet

【Kysy lisää】 Sähköposti:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Sosiaalisen immuniteetin molekyyliperusta on raportoitu kasvavassa määrässä tutkimuksia. Useita molekyylejä, mukaan lukien kemialliset hajut, ulkoiset eritteet, antibiootit, immuuniproteiinit ja kemoreseptorit, jotka palvelevat hyönteisten käyttäytymistä ja fysiologista puolustusta, on tunnistettu useilla omiikkatekniikoilla ja kaasu/nestekromatografia-massaspektrometrialla (Seipke et al. 2011; Hussain et al. 2013; Terrapon ym. 2014; Liu ym. 2015; Sun ym. 2016; He ym. 2018). Termiittiryhmissä patogeenien ummehtunut haju lisää hoitokäyttäytymistä (Yanagawa et al. 2011). Termiittien ruumiiden kuolemanmerkit aiheuttavat joko kannibalismia tai hautauskäyttäytymistä (Sun ym. 2016). Ulkoiset eritteet otsa- ja sylkirauhasista ja hyödyllisten mikro-organismien välittämä antimikrobinen aktiivisuus auttavat termiittejä suojaamaan itseään, pesäkavereita ja jopa pesäkkeitä (Bulmer ym. 2009; Rosengaus ym. 2000, 2014; Chouvenc ym. 2013). Hyönteisten sosiaalista immuniteettia edistäviin geneettisiin ja biokemiallisiin mekanismeihin voitaisiin käyttää RNAi- ja geenien muokkaustekniikoita. Termiiteillä RNAi-välitteisen termisiinin, gramnegatiivisen sitovan proteiinin 2 (GNBP2), seleeniä sitovan proteiinin ja transglutaminaasi (TG) geenien hiljentämisen on osoitettu vähentävän merkittävästi termiittien antifungaalista aktiivisuutta ja lisäävän siten infektiokuolleisuutta (Hamilton). ja Bulmer 2012; Zhao ym. 2020; Zhou ym. 2021). Isositraattidehydrogenaasi (IDH) voi vaikuttaa termiittien aineenvaihduntaan, ja sen säätelyhäiriöt lisäävät apoptoottisia vaurioita, mikä johtaa korkeaan infektio- ja kuolleisuustasoon (Liu et al. 2020). Lisäksi GNBP2 ja TG palvelevat myös termiittien käyttäytymispuolustusta, vaikuttaen kannibalistiseen ja hoitokäyttäytymiseen (Zhao ym. 2020; Esparza-Mora ym. 2020). Sosiaalisen immuniteetin molekyyliperustaa on kuitenkin vielä ymmärrettävä selvästi, erityisesti molekyylimekanismia, joka ohjaa monimutkaisia ​​​​sosiaalisia käyttäytymismalleja vasteena tarttuville patogeeneille. Lisäksi sosiaalisen immuniteetin geneettinen ja biokemiallinen mekanismi keskittyy koodaavaan RNA:han, joka ohjaa hyönteisten sosiaalista immuniteettia, mutta vielä on epäselvää, osallistuvatko koodaamattomat RNA:t, kuten miRNA:t, hyönteisten sosiaalisen immuniteetin säätelyyn.

Dicer-1, RNaasi III -endonukleaasi, on välttämätön miRNA-biosynteesin viimeisessä vaiheessa. miRNA:t ovat endogeenisiä, 18–25 nt:n koodaamattomia RNA:ita, jotka säätelevät negatiivisesti geenien ilmentymistä transkription jälkeisellä tasolla muodostamalla emäsparin miRNA:iden siemenalueen ja kohde-mRNA:iden vastaavan alueen välillä (Gomez-Orte ja Belles 2009; Wang et al. 2013; Yang ym. 2014; Lucas ym. 2015). Koska miRNA:n tuotanto riippuu Dicer-1:sta, miRNA:iden toimintoja hyönteisten biologisten prosessien moduloinnissa voidaan tutkia Dicer-1:n toiminnallisilla häviöillä. Hedelmäkärpästen Dicer-1-mutantteja käyttämällä miRNA:iden on osoitettu toimivan alkion synnyssä ja hajuhermosolujen morfogeneesissä (Lee et al. 2004; Berdnik ym. 2008). Dicerin-1 RNAi-välitteisellä hiljentämisellä tutkijat ovat vahvistaneet, että miRNA:illa on keskeinen rooli kehitysprosessien säätelyssä hyönteisten muodonmuutoksissa, kuten torakoissa ja heinäsirkoissa (Gomez-Orte et al. 2009; Wang et al. 2013). Lisäksi miRNA:t ovat mukana myös hyönteisten käyttäytymisen muokkaamisessa. miR-8 ja miR-429 säätelevät viruksen aiheuttamaa kiipeilykäyttäytymistä vanupuuvillamaoissa säätelemällä suoraan BrZ2:n ilmentymistä (Zhang et al. 2018). miR-133 säätelee dopamiinisynteesiä ja estää siten käyttäytymisen aggregaatiota heinäsirkoissa (Yang et al. 2014). Tällaisten todisteiden perusteella miRNA:iden toiminnasta hyönteisten fysiologiassa ja käyttäytymisessä pyrimme määrittämään miRNA:iden vaikutuksen termiittien fysiologiaan ja sosiaaliseen immuniteettiin liittyvään käyttäytymiseen käyttämällä "isäntä-patogeeni" -järjestelmää (isäntä: Reticulitermes chinensis; patogeeni: Metarhizium anisopliae). Tutkimuksemme sisälsi pääasiassa kolme sosiaalisen immuniteetin tutkimuksen näkökohtaa: miRNA:iden vaikutus (1) sosiaalista immuniteettia ohjaaviin in vivo -molekyyleihin; (2) käyttäytymiseen liittyvä puolustusreaktio, kuten liikkuminen sienten saastuttamilla alueilla, hoito sienen saastuttamia pesäkavereita kohti ja kannibalismi/hautaaminen sienen saastuttamia ruumiita kohti; ja (3) fysiologinen puolustusvaste, kuten antifungaalinen aktiivisuus. Lisäksi testasimme miRNA-häiriön vaikutusta sienen saastuttamien termiittien kuolleisuuteen arvioidaksemme miRNA:iden vaikutusta termiittien biologiseen hallintaan. Tutkimuksemme paljasti potentiaalisen mekanismin, joka on taustalla käyttäytymis- ja fysiologisia sairauksia vastaan, ja uusia kohteita tuholaistorjuntaan.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

materiaali ja metodit

Termiitit

Kaikki kokeelliset termiitit tutkimuksessamme olivat termiitin R. chinensis työntekijöitä. Ne kerättiin Shizi Hilliltä Wuhan Citystä, Hubein maakunnasta, Kiinasta. Termiittejä kasvatettiin muoviastioissa (40×20×20 cm), jotka sisälsivät pieniä mäntypaloja laboratoriossa 25±1 asteen lämpötilassa, 80 % suhteellisessa kosteudessa ja 24 tunnin pimeydessä.

Entomopatogeenit, saastuneet termiitit ja ruumiit

Entomopatogeenistä sientä M. anisopliae (kanta IBCCM321.93) viljeltiin perunadekstroosiagarilla (PDA) 2 viikon ajan 25 ± 1 asteen lämpötilassa, 8 0 % suhteellisessa kosteudessa ja 24 tuntia pimeässä. Sienikonidit suspendoitiin 1 % Tween 80:lla ja säilytettiin 4 asteen lämpötilassa enintään 3–4 viikkoa. Ennen jokaista koetta konidiaalisesta suspensiosta testattiin itävyys. Havaitsimme, että termiittien saastuttamiseen käytetyn konidiaalisuspension itävyys oli yli 9 0 %. Sienillä saastuneiden termiittien valmistamiseksi termiittien vatsat kontaminoitiin 0,3 µl:n pisaralla konidiaalisuspensiota (108 konidia/ml) pipetillä (0,1–2,5 µl, Transferpette). Sen jälkeen sienen saastuttamat termiitit jäähdytettiin välittömästi 4 asteeseen yhdeksi tunniksi niiden liikkumisen estämiseksi sienen konidioiden saostamiseksi niiden kynsinauhoille (Liu et al. 2015). Sienillä saastuneiden ruumiiden valmistamiseksi termiitit kerättiin 1,5 ml:n sentrifugiputkeen ja jäädytettiin sitten nestetypessä 20 sekunniksi termiittien tappamiseksi. Ruumiit upotettiin konidisuspensioon (108 konidia/ml) ja asetettiin sitten steriiliin petrimaljaan, jossa oli kostea suodatinpaperi, 0 ja 2 päivän viljelyä varten (Sun et al. 2016).

dsRNA:n ja miRNA-simulantin synteesi

Dicer-1-fragmentti (1697 bp; lisämateriaali 1-teksti S1) monistettiin erityisillä alukkeilla (eteenpäin: 5′-CTG CGA CAG ATC ATT GCA CG-3′; käänteinen: 5′ -CAC TGG CTG TTT TGG CAC TC-3′), ja niiden PCR-tuotteet puhdistettiin käyttämällä AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit -sarjaa (Axygen Scientific, USA), kloonattiin pMD 18-T-vektoriin (TaKaRa, Japani) ja sitten transformoitu käyttämällä kemiallisesti pätevää DH5-solua (Tsingke Biotechnology, Kiina). Yksi pesäke lysogeny broth (LB) -elatusaineesta, jossa oli ampisilliinia, lähetettiin Tsingke Biotechnology Co. Ltd.:lle sekvensointia varten. Sekvenssikohdistus osoitti, että fragmenttimme oli Dicer-1. T7-promoottorisekvenssi (5'-GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG G-3') lisättiin Dicer-1 (519 bp; eteenpäin: 5') monistusalukkeiden 5'-päähän -GTG ATG CTG GAG TTG GGT TT-3′; Taakse: 5′-AGA ATG AGT CGC CCA ATG TC-3′) ja GFP (467 bp; eteenpäin: 5′-CTT GAA GTT GAC CTT GAT GCC-3′; Käänteinen: 5′-TGG TCC CAA TTC TCG TGG AAC- 3′) dsRNA-mallit (lisämateriaali 1-teksti S1). DsRNA-templaattien PCR-tuotteet uutettiin hydroksibentseeni/kloroformi/isoamyylialkoholilla (25:24:1) (Solarbio, Kiina). dsRNA luotiin käyttämällä T7 RNAi -transkriptiosarjaa (Vazyme Biotech, Kiina) ja puhdistettiin sitten hydroksibentseeni/kloroformi/isoamyylialkoholilla (50:49:1) (Solarbio). Lopuksi dsRNA arvioitiin käyttämällä agaroosigeelielektroforeesia ja NanoDrop 2000 -laitetta (Thermo Scientific, USA) ja säilytettiin 80 °C:ssa.

miR-71-5-simulantti oli pieni kaksijuosteinen RNA, joka oli suunniteltu miR-71-5-sekvenssin mukaisesti (21 nt, lisämateriaali 1-teksti S1). miR-71-5-simulantin templaatti koostui kahdesta kaksijuosteisesta DNA:sta, jotka sisälsivät T7-promoottorin: toisen luotiin oligonukleotidi A1 (5'-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GAA AGA CAT GGG TAA TGA GAA A -3′) ja oligonukleotidi A2 (5′-TTT CTC ATT ACC CAT GTC TTT CAC CCT ATA GTG AGT CGT ATT AGT GAT C-3′) käyttäen touchdown PCR:ää; toisen tuottivat oligonukleotidi B1 (5'-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CTC ATT ACC CAT GTC TTT CAA A-3') ja oligonukleotidi B2 (5'-TTT GAA AGA CAT GGG TAA TGA GAC CCT ATA GTG AGT CGT ATT AGT GAT C-3′) touchdown PCR:llä. Kontrollisimulantti suunniteltiin GFP-sekvenssin mukaan (19 nt, lisämateriaali 1-teksti S1). Kontrollisimulantin templaatin hankittiin myös kahdella kaksijuosteisella DNA:lla, jotka sisälsivät T7-promoottorin: toisen tuotti oligonukleotidi C1 (5'-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG CAA GCT GAC CCT GAA GTT AA{{33} }′) ja oligonukleotidi C2 (5'-TTA ACT TCA GGG TCA GCT TGC CCC TAT AGT GAG TCG TAT TAG TGA TC-3') käyttäen touchdown PCR:ää; toisen tuottivat oligonukleotidi D1 (5'-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ACT TCA GGG TCA GCT TGC AA-3') ja oligonukleotidi D2 (5'-TTG CAA GCT GAC CCT GAA GTT CCC TAT AGT GAG TCG TAT TAG TGA TC-3′) touchdown PCR:llä. MiR-71-5 ja kontrollisimulantit luotiin käyttämällä T7 RNAi -transkriptiosarjaa ja uutettiin sitten hydroksibentseeni/kloroformi/isoamyylialkoholilla (50:49:1). Uute arvioitiin agaroosigeelielektroforeesilla ja NanoDrop 2000 -laitteella ja säilytettiin -80 asteessa.

Cistanche-edut miehille - vahvistavat immuunijärjestelmää

dsRNA:n ruokinta

Termiittejä nälkiinnettiin 12 tuntia ennen ruokintaa (Zhou et al. 2008; Hamilton ja Bulmer 2012). Yhteensä 18 termiittiä asetettiin solupetrimaljaan (D =35 mm) suodatinpaperinpalalla (D =18 mm), joka oli kostutettu 60 μl:lla RNaasi-vapaata vettä, joka sisälsi 80 ug. dsDicer-1, 80 ug dsGFP, 60 ug miRNA-simulanttia tai 60 ug kontrollisimulanttia. Dicer-1 dsRNA-syötteen biotesteissä termiittien annettiin niellä kostutettua paperia 24 tunnin ajan ennen kokeita. GFP:llä käsiteltyjä termiittejä pidettiin kontrolleina. MiRNA-simulanttiruokintabiomäärityksissä termiittien annettiin niellä kostutettua paperia 48 tunnin ajan ennen kokeita. Kontrollisimulantilla käsiteltyjä termiittejä pidettiin kontrolleina.

RT-qPCR

Viittä tai kuutta replikaattia kolmesta pesäkkeestä käytettiin geeniekspressioon käyttämällä RT-qPCR:ää. Kolme termiittiä replikaattia kohden käsittelyä kohti yhdistettiin RNA:n kokonaisuuttoa varten käyttämällä Direct-zol™ RNA Miniprep Kit -sarjaa (Zymo Research, USA). Uutetun RNA:n puhtaus ja konsentraatio määritettiin käyttämällä NanoDrop 2000:ta. RNA muutettiin cDNA:ksi käyttämällä PrimeScript™ RT Reagent Kit -sarjaa gDNA Eraserilla (Perfect Real Time) (Takara, Japani). RT-qPCR suoritettiin QuantStudio™ 3 Real-Time PCR Systemillä (Thermo Scientific) käyttäen ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mixiä (Vazyme Biotech). Tietyt alukkeet on lueteltu lisämateriaalissa 2-taulukossa S1.

miRNA-pitoisuus

Kuutta toistoa kolmesta pesäkkeestä käytettiin miRNA:iden pitoisuuden määrittämiseen käyttämällä MiPure Cell/Tissue miRNA Kit -sarjaa (Vazyme Biotech, Kiina). Kolme termiittiä replikaattia kohden käsittelyä kohti yhdistettiin miRNA:ita varten. Uutettujen miRNA:iden puhtaus ja pitoisuus määritettiin käyttämällä NanoDrop 2000 -laitetta.

De novo -sekvensointi ja transkriptioanalyysi

Fifteen termites from three colonies per treatment were pooled for total RNA extraction using TRIzol Reagent (Invitrogen Life Technologies, USA). The concentration, quality, and integrity of the total RNA were determined using a NanoDrop spectrophotometer (Thermo Scientific). Sequencing libraries were generated using the TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit (Illumina, USA) and sequenced on a HiSeq platform (Illumina) by Shanghai Personal Biotechnology Cp. Ltd. (China). Sequencing data were filtered by Cutadapt (v1.15) software. For the transcriptome sequencing project without a reference genome, Trinity (v2.5.1) software was used to montage clean reads for the transcripts for later analysis. NR (NCBI non-redundant protein sequences), GO (Gene Ontology), KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome), Egg NOG (Evolutionary genealogy of genes: Non-supervised Orthologous Groups), and Swiss-Prot databases were used for gene functional annotation. Furthermore, DESeq (1.30.0) was used to analyze the differentially expressed genes under the condition of |log2FoldChange(FC)|>1 ja s<0.05. The genes were then mapped to GO terms, and the terms with significant enrichment were calculated by hypergeometric distribution under the condition of p<0.05 to reveal the possible functions of the candidate genes. Additionally, the genes were mapped to KEGG pathways to determine their possible functions. 

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Liikkuminen

Yhdeksän kopiota kolmesta pesäkkeestä analysoitiin Dicer{0}}hiljennettyjen ja GFP-käsiteltyjen termiittien liikeetäisyyden vertaamiseksi. Kun dsDicer-1 tai dsGFP oli syötetty suun kautta yhden päivän ajan, yksi termiitti per replikaatti käsittelyä kohti asetettiin uuteen solupetrimaljaan (D =90 mm) suodatinpaperinpalalla, joka oli kostutettu konidiaalisuspensiolla. (108 konidia/ml). Sitten käytimme mustaa merkkiä seurataksemme termiitin liikettä läpinäkyvällä kannella 10 sekunnin ajan. Liikeetäisyys mitattiin ruudukkopaperilla (1×1 mm).

Hoito

Kolmesta pesäkkeestä analysoitiin yhdeksän replikaattia Dicer{0}}hiljennettyjen ja GFP-käsiteltyjen termiittien hoitokäyttäytymisen vertaamiseksi. Kun dsDicer-1 tai dsGFP oli syötetty suun kautta yhden päivän ajan, kolme termiittiä toistoa kohden käsittelyä kohti asetettiin uuteen solupetrimaljaan (D =35 mm) kostutetulla suodatinpaperilla (D{{) 4}} mm) ja sitten kontaminoitunut sienikonidioilla (108 konidia/ml). Käyttäytymistä kuvattiin 15 minuutin ajan HD-digitaalikameralla (SONY, Japani). Videot skannattiin 10 sekunnin välein sen havaitsemiseksi, esiintyikö sienen saastuttamien termiittien välillä hoitokäyttäytymistä (termiittien suuta pesäkaverin ruumiita kohti).

Kannibalismi

Yhdeksästä kopiota kolmesta pesäkkeestä analysoitiin Dicer{{0}} vs. GFP:n vaikutuksesta kannibalistiseen käyttäytymiseen sienen saastuttamia ruumiita kohtaan. Kuusi termiittiä toistoa kohden käsittelyä kohden asetettiin solupetrimaljaan (D=35 mm), jossa oli pala kosteaa suodatinpaperia (D=18 mm), joka sisälsi dsDicer-1- tai dsGFP:tä. Heille annettiin yksi päivä ruokkia suun kautta dsRNA:ta, ja sitten yksi sienen saastuttama ruumis, jota inkuboitiin 0 päivää, asetettiin petrimaljaan, jossa kuusi käsiteltyä termiittiä kasvatettiin. Yhden päivän yhdessä kasvatuksen jälkeen sienen saastuttama ruumis joko syötiin kokonaan (korkea testitulos=2), syötiin osittain (matala testitulos=1) tai sitä ei syöty (ei testitulosta{10). }}) (Lisämateriaali 1-Kuva S1) kuudelta termiitiltä.

Hautaaminen

Kahdesta pesäkkeestä saadut yhdeksän replikaattia analysoitiin Dicer-1 vs. GFP:n vaikutuksesta sienten saastuttamien ruumiiden hautauskäyttäytymiseen. Kuusi termiittiä toistoa kohden käsittelyä kohden asetettiin solupetrimaljaan (D=35 mm), jossa oli pala kosteaa suodatinpaperia (D=18 mm), joka sisälsi dsDicer-1- tai dsGFP:tä. Heille annettiin yksi päivä ruokkia dsRNA:ta suun kautta. Sitten yhtä sienen saastuttamaa ruumista inkuboitiin 2 päivää ja petrimaljaan, jossa kuusi käsiteltyä termiittiä kasvatettiin, lisättiin maaperää. Yhden päivän yhdessä kasvatuksen jälkeen sienen saastuttama ruumis joko haudattiin kokonaan (korkea testitulos=2), osittain haudattu (matala testitulos=1) tai ei haudattu (ei testitulosta{10). }}) (Lisämateriaali 1-Kuva S2) kuudelta termiitiltä.

Antifungaalinen aktiivisuus

Kuudesta toistosta kolmesta pesäkkeestä analysoitiin Dicer{{0}} ja miR-71-5 vaikutus termiittien kykyyn estää sienikasvua. Viisi termiittiä toistoa kohden käsittelyä kohti yhdistettiin ja murskattiin käyttämällä nestemäistä typpeä ja liuotettiin sitten 1 00 µl:aan 0,9-prosenttista suolaliuosta. Homogenaattia sentrifugoitiin nopeudella 6 000 x g viisi minuuttia 4 asteessa, jolloin saatiin 80 µl supernatanttia. Sitten supernatantti sentrifugoitiin uudelleen, jolloin saatiin 50 µl supernatanttia. Antifungaalista aktiivisuutta varten käytettiin 96-kuoppamikrolevyä näytteiden, kasvukontrollien ja standardinollaisten kokeiden absorbanssin mittaamiseen sienen kasvun vähenemisen laskemiseksi: (1) 50 μl perunadekstroosia (PD), 2 Näytettä varten sekoitettiin µl sienikonidioita (108 konidia/ml) ja 5 µl supernatanttia kuoppaa kohti; (2) 50 µl perunadekstroosia (PD), 2 µl sienikonidioita (108 konidia/ml) ja 5 µl 0,9 % suolaliuosta kuoppaa kohden sekoitettiin sienikasvun hallintaa varten; (3) 50 µl perunadekstroosia (PD) ja 7 µl 0,9 % suolaliuosta kuoppaa kohti sekoitettiin standardinollaa varten. 24 tunnin viljelyn jälkeen vakiolämpötilaisessa ravistelijassa (150 rpm 25 ± 1 asteessa) mittaus suoritettiin mikrolevyspektrofotometrillä (600 nm; Thermo Scientific).

Eloonjääminen

Jotta määritettäisiin dsDicer{0}}-ruokinnan vaikutus termiittien eloonjäämiseen, käytettiin kolmen pesäkkeen termiittejä määrittämään Dicer-1-hiljennetyn (yhteensä 42 termiittiä, 14 termiittiä per pesäke) ja GFP- käsiteltyjä (42 termiittiä yhteensä, 14 termiittiä per pesäke) termiittejä sienikontaminaation aikana. Kontrollissa käytettiin 56 termiittiä kahdesta pesäkkeestä Dicer-1-hiljentettyjen (yhteensä 28 termiittiä, 14 termiittiä per pesäke) ja GFP-käsiteltyjen termiittien (yhteensä 28 termiittiä, 14 termiittiä pesäkettä kohti) selviytymisen määrittämiseksi. Kokeita suoritettaessa seitsemän termiittiä kasvatettiin petrimaljassa (D =35 mm) suodatinpaperilla (D =18 mm), joka oli kostutettu RNaasi-vapaalla vedellä, joka sisälsi dsDicer{{17} } tai dsGFP, kun taas termiittejä saastutettiin sienellä ja kasvatettiin sitten kymmenen päivän ajan niiden eloonjäämisen päivittäistä tarkkailua varten. MiR-71-5-simulantin oraalisen ruokinnan vaikutuksen määrittämiseksi termiittien eloonjäämiseen käytettiin kolmen pesäkkeen termiittejä miR-71-5:n (yhteensä 42 termiittiä, 14 termiittiä per pesäke) ja kontrollin ( Yhteensä 42 termiittiä, 14 termiittiä pesäkettä kohti) simulantilla käsitellyt termiitit sienikontaminaation aikana. Lisäksi 56 termiittiä kahdesta pesäkkeestä käytettiin määrittämään miR- 71-5 (yhteensä 28 termiittiä, 14 termiittiä pesäkettä kohti) ja kontrollin (yhteensä 28 termiittiä, 14 termiittiä per pesäke) simulantilla käsiteltyjen termiittien selviytymistä. Kokeita suoritettaessa seitsemän termiittiä kasvatettiin petrimaljassa (D=35 mm) suodatinpaperilla (D=18 mm), joka oli kostutettu RNaasi-vapaalla vedellä, joka sisälsi miR{{35} } simulantti tai ohjaussimulantti. Kahden päivän suun kautta ruokinnan jälkeen termiitit saastuivat sienellä ja kasvatettiin sitten kymmenen päivän ajan niiden eloonjäämisen päivittäistä tarkkailua varten. Kuolleet termiitit poistettiin ajoissa.

Tilastollinen analyysi

Kaikki data-analyysit suoritettiin IBM SPSS:n versiossa 19. Shapiro–Wilk-testiä käytettiin sen selvittämiseen, olivatko aineistot jakautuneet normaalisti. Koska geenin ilmentyminen, kannibalismi ja hautaustiedot jakautuivat epänormaalisti, käytettiin Wilcoxon-testiä. Vaihtoehtoisesti tiedot miRNA-konsentraatiosta, liikkumisesta, hoidosta ja antifungaalisesta aktiivisuudesta jakautuivat normaalisti, ja käytettiin parillista t-testiä. Eloonjäämistä analysoitiin Kaplan–Meier-menetelmällä eliniän osalta eri hoito-olosuhteissa. Merkitystaso oli p<0.05 in this study.

Tulokset

Dicer-1:llä vaimennettujen termiittien mRNA-ekspressioprofiili

Dicer{{0}}:n vaikutuksen määrittämiseksi termiittien geeniekspressioprofiiliin suoritettiin Dicer-1-hiljennettävien termiittien mRNA-sekvensointi. Yhden päivän dsDicer-1 suun kautta syöttämisen jälkeen Dicer-1 ilmentyi (kuva 1A; n=6, p < 0,05; Wilcoxon-testi) ja siten miRNA-konsentraatio (kuvio 1B; df =5, s<0.05; paired t-test) were significantly decreased in termites. A total of 1262 mRNAs were significantly altered in the whole bodies of Dicer-1-silenced termites (upregulated: 562 mRNAs; downregulated: 700 mRNAs; Fig. 1C and Supplementary material 2-Table S2). The differentially expressed genes (DEGs) were mapped to the salivary secretion, glycolysis, citrate cycle, and 29 other KEGG pathways (Fig. 1D–F and Supplementary material 2-Table S3). In addition, the DEGs were clustered into the ATP generation from ADP, structural constituent of the cuticle, defense response, glutathione transferase activity, oxidation–reduction process, and 171 other GO terms (Fig. 2 and Supplementary material 2-Table S4).

Kuva 1 Geeniekspressioprofiili Dicer-1--lisensoitujen termiittien koko kehossa. Dicer-1-lauseke. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM. *s<0.05. B The concentration of miRNAs. The data are shown as the mean±SEM. *p<0.05. C The number of diferentially expressed genes (DEGs). D The DEGs mapped to salivary secretion. ATP1B, Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta; ATP2B, Plasma membrane calcium-transporting ATPase 1; PKC, Protein kinase C alpha type; CALM, Calmodulin-like protein; LYZ, Lysozyme C. E The DEGs mapped to glycolysis. GPI, Glucose-6-phosphate isomerase; PFKC, ATP-dependent 6-phosphor fructokinase; TIM, Triosephosphate isomerase; GAPDH, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; PGK, Phosphoglycerate kinase; MINPP1, Multiple inositol polyphosphate phosphatase 1; GPMA, 2,3-bisphosphoglycerate-dependent phosphoglycerate mutase; ENO, Enolase. F DEGs mapped to citrate cycle. PCK, phosphoenolpyru vate carboxykinase [GTP]; PYC, pyruvate carboxylase; MDH1, malate dehydrogenase; SUCD, succinate–CoA ligase [ADP-forming]. Red letters indicate upregulation; blue letters indicate downregulation

Kuva 2 Lämpökartat DEG:istä, jotka on ryhmitelty puolustukseen liittyviin GO-termeihin. ATP-sukupolvi ADP:ltä. B Kynsinauhojen rakenteellinen osa. C Puolustusvastaus. D Glutationitransferaasiaktiivisuus. E Hapetus-pelkistysprosessi

mRNA-seq:n DEG:ien RT-qPCR-varmennus

Glykolyysi, sitraattisykli ja ATP:n muodostuminen ADP:stä liittyivät hiilihydraatti- ja energia-aineenvaihduntaan, jossa kahdeksan DEG:tä (glyseraldehydi{0}}fosfaattidehydrogenaasi, 2,3-bisfosfoglyseraattiriippuvainen fosfoglyseraattimutaasi, enolaasi, triosefosfaatti-isomeraasi, ATP-riippuvainen 6-fosfofruktokinaasi, fosfoenolipyruvaattikarboksykinaasi [GTP], sukkinaatti-CoA-ligaasi [ADP:tä muodostava] alfa-alayksikkö-2 ja malaattidehydrogenaasi) todettiin säätelevän merkittävästi Dicerin tason alenemisen jälkeen. -1 hiljentäminen (kuvat 3A–H; n=6, p < 0,05; Wilcoxon-testi), joka viittaa glykolyysihäiriöihin, sitraattikiertoon, ATP:n muodostumiseen ja siten hiilihydraatti- ja energia-aineenvaihduntaan koko kehossa Dicer{12}}hiljennetyistä termiiteistä. DEG:t (defensiini ja terminisiini) puolustusvasteessa koodaamat AMP:t. Näiden geenien ilmentyminen lisääntyi merkittävästi Dicer-1-hiljennetyissä termiiteissä verrattuna GFP:llä käsitellyihin termiitteihin (kuva 3I, J; n=5 tai 6, p<0.05; Wilcoxon test). In the oxidation–reduction process, cytochrome P450 9e2 and peroxiredoxin-4 were significantly altered after Dicer-1 silencing in termites (Fig. 3K, L; n = 6, p<0.05; Wilcoxon test). These results implied an important effect of Dicer-1 on the immune response and oxidation–reduction reaction in whole-body of the termites. The effect of Dicer‑1 on behavioural disease defences in termite groups 

Määrittääksemme Dicerin-1 vaikutuksen käyttäytymisvasteeseen sienikontaminaation suhteen, testasimme Dicer-1-hiljennetyillä termiiteillä neljää tärkeää käyttäytymispuolustusta, liikkumista, hoitoa, kannibalismia ja hautaamista. Tuloksemme osoittivat, että liikkuvuus (kuva 4A, t=7.013, df=8, p<0.01; paired t-test; Supplementary material 1-Fig. S3 and Video S1), grooming (Fig. 4B, t=5.949, df=8, p<0.01; paired t-test; Supplementary material 1-Fig. S4 and Video S2), cannibalistic (Fig. 4C, n =9, p<0.05; Wilcoxon test; Supplementary material 1-Fig. S1 and Video S3) and burial (Fig. 4D; n=9, p<0.05; Wilcoxon test; Supplementary material 1-Fig. S2 and Video S4) behaviors were significantly reduced in Dicer-1-silenced termites compared to GFP-treated termites, suggesting an important role of Dicer-1 in driving behavioral disease defenses in termite colonies.

Kuvio 3 mRNA-sekvenssin DEG:ien RT-qPCR-varmennus. A-H Hiilihydraatti- ja energia-aineenvaihduntaan liittyvät geenit. I–J Immuunivasteeseen liittyvät geenit. K-L Hapettumis-pelkistysreaktioihin liittyvät geenit. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM. *s<0.05

Dicer-1:n ja miR-71-5:n vaikutus termiittien sienilääkkeisiin

Määrittääksemme miRNA:iden vaikutuksen fysiologiseen vasteeseen sienikontaminaatioon testasimme Dicer{0}}hiljennettyjen termiittien antifungaaliset kokonaisvaikutukset. Tuloksemme osoittivat, että antifungaalinen aktiivisuus väheni merkittävästi (kuva 5A; t=−3,046, df=5, p<0.05; paired t-test) in Dicer-1-silenced termites. Furthermore, miR-71-5 was selected for further testing to determine its role in physiological defense, which was chosen according to the comparative profiling of miRNAs and mRNAs in fungus-contaminated versus naive termites and miRNA-mRNA analysis (data unpublished). We found that the antifungal activity (Fig. 5B; t=−4.000, df=5, p<0.05; paired t-test) was significantly reduced in termites treated with miR-71-5 simulants compared to those treated with simulant controls. These results suggested that miRNAs played an important role in driving physiological disease defenses in termites.

Kuva 4 MiRNA-säätelyhäiriön vaikutus puolustavaan sosiaaliseen käyttäytymiseen termiittiryhmissä. Dicerin liikkumis-, B-hoito-, C-kannibalistinen ja D-hautauskäyttäytyminen-1-hiljennetty verrattuna GFP-käsitellyihin termiittiryhmiin. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM. *s<0.05, **p<0.01

Kuva 5 MiRNA-dysregulation vaikutus fysiologiseen puolustukseen termiittiyksilöissä. Dicer{1}}vaimennettujen vs. GFP-käsiteltyjen termiittien antifungaalinen vaikutus. B miR-71-5:n antifungaalinen vaikutus verrattuna simulantilla käsiteltyihin termiitteihin. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM. *s<0.05

Dicer-1 ja miR-71-5 vaikuttivat sienten saastuttamien termiittien selviytymiseen

Koska sekä dsDicer-1- että miR-71-5-simulantit johtivat termiittien sienenvastaisen aktiivisuuden vähenemiseen, testasimme niiden potentiaalia termiittien biologiseen torjuntaan. Havaitsimme, että Dicer-1-hiljennetyt termiitit, jotka ovat saastuttaneet sieniä, osoittivat merkittävästi vähemmän eloonjäämistä verrattuna muihin hoidetuihin termiitteihin (dsDicer-1+sieni vs. dsGFP+sieni: χ2=81.839, s.<0.001; dsDicer-1+fungus vs dsDicer-1+Tween 80: χ2=63.070, p<0.001; dsDicer-1+fungus vs dsGFP+Tween 80: χ2=65.474, p<0.001). GFP-treated termites contaminated with fungus showed significantly decreased survival compared to the termites without fungal contamination (dsGFP+fungus versus dsDicer-1+Tween 80: χ2=58.636, p<0.001; dsGFP+fungus versus dsGFP+Tween 80: χ2=68.849, p<0.001). There was no significant difference between dsDicer-1- and dsGFP-treated termites without fungal contamination (χ2=2.037, p=0.154) (Fig. 6A). Additionally, the survival of fungus-contaminated termites treated with the miR- 71-5 simulant was signifcantly decreased compared to that of other treated termites (miR-71-5+fungus vs. control+fungus: χ2=63.593, p<0.001; miR-71-5+fungus vs. miR- 71–5+Tween 80: χ2=60.585, p<0.001; miR-71-5+fungus vs. control+Tween 80: χ2=67.129, p<0.001). The survival of fungus-contaminated termites treated with the simulant control was significantly decreased compared to that of the termites without fungal contamination (control+fungus vs. miR-71-5+Tween 80: χ2=61.065, p<0.001; control+fungus vs. control+Tween 80: χ2=68.064, p<0.001). There was no significant difference in survival between termites treated with the miR-71-5 simulant and simulant control without fungal contamination (miR-71-5+Tween 80 vs. control+Tween 80: χ2=1.000, p=0.317) (Fig. 6B). These results suggested a good effect of miRNAs coupled with entomopathogens in biologically controlling termites.

Keskustelu

miRNA:t suorittavat useita tehtäviä, kuten säätelevät hiilihydraatti- ja energia-aineenvaihduntaa, immuunivastetta, hapetus-pelkistysreaktioita ja muita elämänprosesseja termiittien koko kehossa. Kuten odotettiin, termiiteissä nautittu dsDicer-1 johti Dicer-1-hiljentymiseen ja vähensi sitten miRNA-pitoisuutta, mikä viittaa miRNA-säätelyhäiriön onnistuneeseen induktioon. Transkriptioanalyysi osoitti, että Dicer-1 hiljentäminen liittyi 32 KEGG-polkuun ja 175 GO-termiin. Sosiaalisissa hyönteisyhdyskunnissa syljen erite voi toimia ulkoisena desinfiointiaineena ja toimia yhdessä sosiaalisen käyttäytymisen, kuten trofallaksian, hoitoon ja pesimisen kanssa jälkeläisten, pesäkavereiden ja pesäkkeiden hoitamiseksi (Bulmer ym. 2009; Hamilton et al. 2011). Hamilton ja Bulmer 2012). Glykolyysi, sitraattisykli ja ATP:n muodostuminen ADP:stä osallistuvat hiilihydraatti- ja energia-aineenvaihduntaan. Koska immuunivasteiden lisääntyminen ja sosiaalisen käyttäytymisen suorittaminen ovat energeettisesti kallista, hiilihydraatti- ja energia-aineenvaihdunnan häiriöt vaikuttavat negatiivisesti näihin prosesseihin (Liu ym. 2020; Hassan ym. 2021a, b; Xu ym. 2021a, b). Kynsinauhojen rakenteellinen ainesosa assosioituu hyönteisten kynsinauhojen kanssa muodostaen ensimmäisen esteen, joka estää patogeenien tunkeutumisen hemocoeliin (Syazwan et al. 2021). Useat puolustusvasteeseen, glutationitransferaasiaktiivisuuteen ja hapetus-pelkistysprosessiin osallistuvat DEG:t pystyvät koodaamaan antimikrobisia peptidejä (AMP:ita), detoksifikaatioproteiineja ja antioksidanttientsyymejä lisäämään hyönteisten vastustuskykyä ja toleranssia patogeeneja vastaan ​​(Liu et al. 2015, 2019a). Nämä puolustukseen liittyvät toiminnot edistävät todennäköisesti sosiaalista immuniteettia termiittipesäkkeissä. Loput KEGG-reitit ja GO-termit liittyivät hermostoon, ruoansulatusjärjestelmään, pitkäikäisyyteen, kehitykseen jne. (Lisämateriaali 2-Taulukko S3 ja S4). Lisäksi osa DEG:istä (esim. hiilihydraatti- ja energia-aineenvaihduntageenit) Dicer-1 hiljennetyissä termiiteissä olivat mikrobeista (lisämateriaali 2-taulukko S2), jotka olivat mahdollisesti suolen symbiontteja ja saattavat olla tärkeitä komponentteja osallistuvat isäntien elämänprosesseihin. Siksi miRNA:illa on todennäköisesti globaali vaikutus termiitin koko kehoon.

Kuva 6 MiRNA-dyssääntelyn vaikutus sienen saastuttamien termiittiryhmien eloonjäämiseen. Dicer{2}}hiljennettyjen vs. GFP-käsiteltyjen termiittien selviytyminen sienikontaminaation kanssa tai ilman; B MiR-71-5:n eloonjääminen verrattuna simulantilla käsiteltyihin verrokkitermiitteihin sienikontaminaation kanssa tai ilman. Eri kirjaimet osoittavat merkittäviä eroja, s<0.05

Hiilihydraatti- ja energia-aineenvaihdunta, immuunivaste ja hapettumis-pelkistysreaktiot ovat tärkeitä miRNA:ille sosiaalisen immuniteetin edistämisessä. Eläinten käyttäytyminen on energiasta riippuvainen prosessi, ja siksi jotkin energian estäjät saavat eläimet liikkumaan hitaasti ja jopa kuolevat (Davidson 1930; Schuler ja Casida 2001). Termiittipesäkkeissä glykolyysin tai sitraattisyklin häiriöt johtavat alentuneisiin ATP-tasoihin ja estävät liikkumiskäyttäytymistä (Hassan ym. 2021a, b; Xu et al. 2021a, b). Sitraattikierron häiriöt vähentävät myös termiittien antifungaalista aktiivisuutta, mikä lisää infektioita ja kuolleisuutta (Liu et al. 2020). Lisäksi, koska termiitin suolistossa olevien symbionttien on raportoitu osallistuvan isännän tautipuolustukseen tarjoamalla entsyymejä (Rosengaus et al. 2014) ja metaboliitteja (Inagaki ja Matsuura 2018), suoliston symbionttien aineenvaihduntahäiriöt todennäköisesti vähentävät symbionteista peräisin olevaa immuunikompetenssia. ja siten heikentynyt termiittitautien puolustus. Tutkimuksessamme kahdeksan metabolista geeniä todettiin merkittävästi heikentyneeksi, mikä viittaa glykolyysin ja sitraattisyklin häiriöihin Dicer-1-hiljenneiden termiittien koko kehossa. Ehdotimme, että miRNA-välitteinen hiilihydraatti- ja energia-aineenvaihdunta oli tärkeä biokemiallinen mekanismi sosiaalisen immuniteetin edistämisessä ja että tämän prosessin häiriintyminen todennäköisesti heikensi käyttäytymis- ja fysiologisia sairauksien puolustusta termiittipesäkkeissä. Hyönteisten immuunijärjestelmä indusoi suuren määrän efektorimolekyylejä torjumaan patogeenejä in vivo. Defensiinit ovat kompakteja, runsaasti kysteiiniä sisältäviä ja proteaasiresistenttejä AMP:itä, joilla on laajakirjoinen aktiivisuus bakteereja, sieniä ja muita loisia vastaan ​​(Weber 2021). Termisiini on termiitteille spesifinen antifungaalinen defensiini, jonka hiljentäminen johtaa sientenvastaisen aktiivisuuden vähenemiseen ja siten sienten saastuttamien termiittien lisääntyneeseen kuolleisuuteen (Hamilton ja Bulmer 2012). Hyönteisten vieroitus- ja antioksidanttijärjestelmät toimivat usein yhdessä immuunijärjestelmän kanssa, mikä vähentää tehokkaasti toksiinien ja ROS:n riskiä isäntä-patogeenivuorovaikutuksessa (Syazwan et al. 2021). Sytokromi P450 -mono-oksygenaasit vastaavat patogeenien toksiinien hapettumisen ja aineenvaihdunnan katalysoinnista ja vapaita radikaaleja eli ROS:ia tuottavista (Shankar ja Mehendale 2014). Peroksiredoksiiniperheeseen kuuluu antioksidatiivisia entsyymejä, jotka katalysoivat ROS:n pelkistystä (Xu et al. 2021a; b). Tuloksemme vahvistivat, että Dicer-1-hiljentäminen muutti merkittävästi defensiinin, trisiinin, sytokromi P450 9e2:n ja peroksiredoksiinin-4 geeniekspressiota, mikä osoittaa, että miRNA:illa oli tärkeä rooli immuunivasteen säätelyssä ja hapetus-pelkistysreaktiot koko termiitin kehossa. Siksi ehdotamme, että hiilihydraatti- ja energia-aineenvaihdunta, immuunivaste ja hapetus-pelkistysreaktiot voivat osallistua miRNA-muotoisen sosiaalisen immuniteetin ohjausmekanismiin, ja niiden häiriintyminen voi vaikuttaa negatiivisesti sosiaaliseen immuniteettiin termiittipesäkkeissä.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Itse asiassa miRNA-dysregulaatiolla on kielteisiä vaikutuksia liikkumiseen ja siten käyttäytymiseen termiittipesäkkeissä. Toisin kuin yksinäiset hyönteiset, sosiaaliset hyönteiset ovat kehittäneet runsaasti käyttäytymispuolustuksia, jotka yhdessä havaitsevat patogeenien läsnäolon, rajoittavat patogeenien leviämistä ja vähentävät yksilöiden infektioriskiä (Van Meyel ym. 2018; Liu ym. 2019a). Vanhemmat työntekijät tekevät vaarallisia pesän ulkopuolella tehtäviä ja ovat helposti saastuneita. Kun ne ovat saastuneet, pesäkaverit pyrkivät yhdistämään saastuneita työntekijöitä ja hoitamaan niitä (Liu ym. 2019b). Sekä saastuneet työntekijät että heidän omaishoitajansa lisäävät etäisyyttä muihin naiiveihin pesäntovereihin. Hoitotyöntekijät vievät sikiöt syvemmälle pesäkkeen syvyyteen lisätäkseen etäisyyttä saastuneista työntekijöistä (Stroeymeyt ym. 2018). Nämä tulokset osoittavat, että pesäkkeen jäsenten välisen fyysisen etäisyyden lisääminen on tehokas strategia patogeenien leviämisen rajoittamiseksi [jota kutsutaan "organisaatioimmuniteetiksi" (Liu et al. 2019a)], ja liikkumisen pitäisi olla tärkeä sosiaalinen käyttäytyminen, koska se mukauttaa etäisyys saastuneiden yksilöiden ja naiivien pesäkavereiden välillä. Hassan ja kollegat havaitsivat, että termiitit paransivat merkittävästi liikkumistaan ​​sienitaminaation aikana, mikä osoittaa edelleen liikkumista vasteena taudinaiheuttajille (Hassan et al. 2021a, b). Lisäksi hoito-, kannibalistinen ja hautauskäyttäytyminen ovat hyvin tunnettuja saastuneiden yksilöiden ja ruumiiden hoidossa sosiaalisissa hyönteisyhdyskunnissa. Sienillä saastuneilla termiiteillä hoitokäyttäytyminen tapahtuu välittömästi ennen itämistä (Liu et al. 2019b). Sitä vastoin kannibalistista käyttäytymistä esiintyy vasta sen jälkeen, kun saastuneet yksilöt sairastuvat näkyvästi (Davis ym. 2018). Ruumiinhoidossa tuoreita ruumiita pidetään usein ravitsemuksellisena palkkiona ja ne aiheuttavat kannibalismia tuottamalla varhaisen kuoleman vihjeen. Sen sijaan rappeutuneita ruumiita pidetään tartuntariskinä ja ne aiheuttavat hautaamista tuottamalla myöhäisiä kuolemanmerkkejä (Sun ym. 2016). Tässä havaitsimme, että Dicer{12}}-hiljentäminen esti merkittävästi liikkumista ja muita liikkeitä, kuten hoito-, kannibalistista ja hautauskäyttäytymistä, mikä viittaa siihen, että miRNA-sääntelyhäiriöillä oli yleinen vaikutus termiittien liikkeisiin ja näin ollen se vaikutti käyttäytymiseen patogeenejä, patogeeneja vastaan. saastuneita pesäkavereita ja patogeenien saastuttamia ruumiita termiittipesäkkeissä. Ajomekanismin kannalta miRNA-välitteistä hiilihydraatti- ja energia-aineenvaihduntaa voitaisiin pitää yhtenä tärkeimmistä biokemiallisista tekijöistä (katso yllä oleva keskustelu). Siksi miRNA: t voivat muokata termiittien käyttäytymispuolustuksia.

miRNA-säätelyhäiriöillä oli myös kielteisiä vaikutuksia termiittien fysiologiseen puolustuskykyyn. Termiitit lisäävät normaalisti antifungaalista kykyään säätelemällä immuunigeenien fysiologista puolustuskykyään (Liu et al. 2015). Suoliston symbionteista peräisin olevat sienilääkkeet antavat termiiteille kyvyn estää sienten kasvua ja parantaa niiden fysiologista puolustuskykyä (Rosengaus et al. 2014). Siksi sientenvastainen kokonaisaktiivisuus oli tehokas indikaattori termiittien fysiologisista taudeista. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että immuunigeenien lisäksi myös hiilihydraattiaineenvaihdunnan ja antioksidanttigeenien on raportoitu olevan tärkeitä termiittien antifungaaliseen toimintaan vaikuttavia komponentteja (Liu ym. 2020; Zhao ym. 2020; Zhou ym. 2021). Defaunoidut termiitit olivat alttiimpia sienikontaminaatiolle (Rosengaus et al. 2014). Vaikka immuunigeenien, kuten defensiinin ja trisiinin, ilmentyminen lisääntyi, Dicer-1--välitteinen miRNA-häiriön säätely vähensi hiilihydraattiaineenvaihdunnan ja antioksidanttigeenien ilmentymistä termiiteissä tai suoliston symbionteissa ja vähensi siten merkittävästi termiittien sienien vastaista kokonaisaktiivisuutta. Lisäksi miR-71-5-simulantilla käsitellyt termiitit osoittivat myös sientenvastaisen kokonaisaktiivisuuden laskua, mikä viittaa edelleen miRNA-säätelyhäiriön negatiiviseen vaikutukseen termiittien fysiologiseen puolustuskykyyn. Lisäksi termiittiryhmät, joita ruokittiin joko dsDicer-1- tai miR-71-5-simulantilla, olivat alttiimpia sienikontaminaatiolle, mikä osoitti infektiokuolleisuuden lisääntymistä. Siksi miRNA: t voivat muokata sosiaalista immuniteettia ohjaamalla sekä käyttäytymis- että fysiologisia sairauksien puolustusta termiittipesäkkeissä.

Kuva 7 Mahdolliset sosiaalisen immuniteetin taustalla olevat mekanismit termiittipesäkkeissä ja uudet kohteet biologiseen tuholaistorjuntaan. miRNA:t vaikuttavat laajalti koko termiittien kehoon, mukaan lukien A-hiilihydraatti- ja energia-aineenvaihdunta, B-immuunivaste, C-hapetus-pelkistysreaktiot jne. D Hiilihydraatti- ja energia-aineenvaihdunnalla on raportoitu olevan tärkeitä tehtäviä sekä käyttäytymisen että antifungaalisen toiminnan säätelyssä termiitissä. Siksi miRNA-välitteinen hiilihydraatti- ja energia-aineenvaihdunta oli todennäköisesti yksi geneettisistä ja biokemiallisista tekijöistä, jotka ohjasivat käyttäytymiseen (kuten liikkuminen, hoito, kannibalismi ja hautaaminen) ja fysiologisia (sientenvastainen aktiivisuus) tautipuolustuksia termiittipesäkkeissä. E Immuunivaste auttoi termiittejä estämään patogeenien lisääntymistä ja leviämistä kehon ontelossa. Hapetus-pelkistysreaktio suojeli termiittejä toksiinien ja ROS:n aiheuttamilta vaurioilta "isäntä-patogeeni" -vuorovaikutuksilta. Siksi miRNA-välitteisellä immuunivasteella ja hapetus-pelkistysreaktiolla on tärkeä rooli fysiologisen taudin puolustamisessa termiiteissä. F-miRNA:t muovasivat sosiaalista immuniteettia ohjaamalla käyttäytymis- ja fysiologisia sairauksien puolustusta termiittipesäkkeissä. Kohdistamalla miRNA:ita voisimme keinotekoisesti lisätä termiittipesäkkeiden herkkyyttä entomopatogeeneille ja siten tehostaa termiittien biologista torjuntaa.

Tietojemme mukaan tämä on ensimmäinen raportti miRNA:iden mahdollisesta mekanismista sosiaalisen immuniteetin taustalla termiittipesäkkeissä. miRNA:t voivat vaikuttaa syljeneritykseen, hiilihydraattien ja energian aineenvaihduntaan, kynsinauhojen muodostumiseen, immuunivasteisiin, hapetus-pelkistysreaktioihin jne. Niiden joukossa hiilihydraatti- ja energia-aineenvaihdunta on todennäköisesti tärkeä biokemiallinen tekijä ohjattaessa käyttäytymispuolustuksia, kuten liikkumista, hoitoa, kannibalismia, ja hautaaminen termiittipesäkkeisiin. Lisäksi hiilihydraatti- ja energia-aineenvaihdunta, immuunivaste ja hapetus-pelkistysreaktiot osallistuvat todennäköisesti termiitin fysiologisten puolustusten, kuten sienilääkkeiden, edistämiseen.

Siksi miRNA-muotoinen sosiaalinen immuniteetti voi vaikuttaa termiittipesäkkeiden herkkyyteen entomopatogeenisille sienille; näin ollen miRNA:t voivat olla tehokkaita kohteita termiittien biologiselle torjumiselle (kuvio 7). Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että RNAi-välitteinen kohdegeenien hiljentäminen voi johtaa hyönteisten kuolemaan, ja sillä on huomattava potentiaali hyönteisten tuholaistorjuntaan. Termiittituholaistorjunnassa Zhou et ai. (2008) kohdensivat ensin endoglukanaasi- ja heksameerigeenejä dsRNA-syötteen kautta, mikä osoittaa RNAi-pohjaisten termisidisten torjunta-aineiden toteutettavuuden. Tappavan vaikutuksen tehostamiseksi termiittipesäkkeissä on käytetty RNAi-pohjaisia ​​termisidejä yhdistettynä tarttuviin entomopatogeenisiin sieniin. Trisiinin, GNBP2:n, TG:n, IDH:n ja muiden Metarhiziumiin yhdistettyjen koodaavien geenien RNAi-välitteinen hiljentäminen voi merkittävästi lisätä pesäkavereiden herkkyyttä sosiaalisesti siirtyneille sienikonidioille ja siten johtaa lisääntyneeseen infektiokuolleisuuteen (Hamilton ja Bulmer 2012; Liu et al. 2020; Zhao ym. 2020; Zhou ym. 2021). Tutkimuksessamme osoitimme, että on mahdollista kohdistaa pieniä ei-koodaavia RNA:ita ruokinnan avulla termiittien biologisen valvonnan optimoimiseksi Metarhiziumia käyttämällä. Verrattuna dsRNA:ihin, jotka kohdistuvat spesifisesti geeniin, miRNA:t pystyivät kohdistamaan useisiin geeneihin, joilla oli samat tai erilaiset toiminnot, joten niillä oli laaja-alainen vaikutus termiittien elämänprosesseihin. Siksi miRNA:ita kohdentamalla termiittiryhmät osoittivat heikentynyttä käyttäytymis- ja fysiologista tautien puolustuskykyä sekä ryhmä- että yksilötasolla, mikä viittaa termiittien sosiaalisen immuniteetin laaja-alaiseen estoon. Kohdistamalla miRNA: hin termiittiryhmien kuolleisuus oli korkea sienikontaminaation aikana, mikä viittaa siihen, että miRNA:ita voitaisiin käyttää termiittimyrkkyinä parantamaan termiittien biologista torjuntaa heikentämällä heidän sosiaalista immuniteettiaan. Siksi miRNA:ita voitaisiin pitää mahdollisina uusina kohteina tuhohyönteisten torjunnassa.

Viitteet

Berdnik D, Fan AP, Potter CJ, Luo L (2008) MicroRNA-käsittelypolku säätelee hajuhermosolujen morfogeneesiä. Curr Biol 18:1754-1759. https://doi.org/10.1016/j.cub.2008.09.045

Bulmer MS, Bachelet I, Raman R, Rosengaus RB, Sasisekharan R (2009) Targeting an antimikrobial efector toiminto insect immuniteetissa tuholaistorjuntastrategiana. Proc Natl Acad Sci USA 106:12652-12657. https://doi.org/10.1073/pnas.0904063106

Chouvenc T, Efstathion CA, Elliott ML, Su NY (2013) Maanalaisen termiitin ulostepesästä nouseva laajennettu tautiresistenssi. Proc R Soc B 280:20131885. https://doi.org/10.1098/ rspb.2013.1885

Davidson WM (1930) Rotenoni kontaktihyönteismyrkkynä. J Econ Entomol 23:868–874. https://doi.org/10.1093/JEE/23.5.{8}}

Davis HE, Meconcelli S, Radek R, McMahon DP (2018) Termiitit muokkaavat kollektiivista käyttäytymisvastettansa infektion vaiheen perusteella. Sci Rep 8:14433. https://doi.org/10.1038/ s41598-018-32721-7

Esparza-Mora MA, Davis HE, Meconcelli S, Plarre R, McMahon DP (2020) Erittyneen immuunimolekyylin estäminen häiritsee termiittien sosiaalista immuniteettia. Edessä Ecol Evol 8:75. https://doi.org/10. 3389/fevo.2020.00075

Gomez-Orte E, Belles X (2009) MicroRNA-riippuvainen metamorfoosi hemimetabolaanihyönteisissä. Proc Natl Acad Sci USA 106:21678–21682. https://doi.org/10.1073/pnas.0907391106

Hamilton C, Bulmer MS (2012) Molekulaariset antifungaaliset puolustukset maanalaisissa termiiteissä: RNA-interferenssi paljastaa terminaalin ja GNBP:iden in vivo roolit luonnollisesti tavattua patogeeniä vastaan. Dev Comp Immunol 36:372-377. https://doi.org/10.1016/j.dci. 2011.07.08

Hamilton C, Lejeune BT, Rosengaus RB (2011) Trophallaksia ja ennaltaehkäisy: puuseppämuurahaisen sosiaalinen immuniteettiCamponotus pennsylvanicus. Biol Lett 7:89–92. https://doi.org/10.1098/rsbl. 2010.0466

Hassan A, Huang Q, Mehmood N, Xu H, Zhou W, Gao Y (2021a) Muutos termiittien liikkumisessa ja allogroomingissa vasteena patogeenisten sienien aiheuttamaan infektioon. J Econ Entomol 114:1256–1263. https://doi.org/10.1093/jee/toab071

Hassan A, Huang Q, Xu H, Wu J, Mehmood N (2021b)fosfofruktokinaasigeeni heikentää glykolyysiä ja aiheuttaa epänormaalia liikkumista maanalaisessa termiitissäReticulitermes chinensisSnyder. Insect Mol Biol 30:57-70. https://doi.org/10. 1111/imb.12672

He S et al (2018) Termiittisotilaat edistävät sosiaalista immuniteettia syntetisoimalla voimakkaita suun eritteitä. Insect Mol Biol 27:564-576. https://doi.org/10.1111/imb.12499

Hong M, Hwang D, Cho S (2018) Hemosyyttimorfologia ja solujen immuunivaste termiitissä (Reticulitermes speratus). J Insect Sei 18:46. https://doi.org/10.1093/jisesa/iey039

Hussain A, Li YF, Cheng Y, Liu Y, Chen CC, Wen SY (2013) Immuuniin liittyvä transkriptioCoptotermes formosanusShirakin työntekijät: puolustusmekanismi. PLoS ONE 8:e69543. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0069543

Inagaki T, Matsuura K (2018) Termiittien ja suoliston mikrobien välinen laajennettu keskinäisyys: ravitsemussymbiontit edistävät pesän hygieniaa. Sci Nat 105:52. https://doi.org/10.1007/ s00114-018-1580-y

Kumar S, Upadhyay RK (2021) Erilaisten bioorgaanisten ainesosien termiitin vastainen potentiaali, erityisesti Asteraceae-perheessä. WJPR 10:1109–1149. https://doi.org/10.20959/wjpr2 0213-19977

Lee YS et al (2004) Erilliset roolitDrosophilaDicer-1 ja Dicer-2 siRNA/miRNA-hiljennysreiteissä. Cell 117:69–81. https://doi.org/10.1016/S0092-8674(04)00261-2

Liu L, Li GH, Sun PD, Lei CL, Huang QY (2015) Kokeellinen verifiointi ja molekyyliperusta aktiiviselle immunisaatiolle sienipatogeeneja vastaan ​​termiitissä. Sci Rep 5:15106. https://doi.org/ 10.1038/srep15106

Liu L, Wang W, Liu YL, Sun PD, Lei CL, Huang QY (2019a) Allogrooming-käyttäytymisen vaikutus yksilön synnynnäiseen immuniteettiin maanalaisessa termiitissäReticulitermes chinensis(Isoptera: Rhinotermitidae). J Insect Sei 19:6. https://doi.org/10.1093/jisesa/ iey119

Liu L, Zhao XY, Tang QB, Lei CL, Huang QY (2019b) Sosiaalisen immuniteetin mekanismit sieni-infektioita vastaan ​​eusosiaalisissa hyönteisissä. Toksiinit 11:244. https://doi.org/10.3390/toxins11050244

Liu L, Wang CC, Zhao XY, Guan JX, Lei CL, Huang QY (2020) Isositraattidehydrogenaasivälitteiset aineenvaihduntahäiriöt häiritsevät aktiivista immunisaatiota sienipatogeenejä vastaan ​​eusosiaalisissa termiiteissä. J Pest Sci 93:291-301. https://doi.org/10.1007/ s10340-019-01164-y

Lopez-Uribe MM, Sconiers WB, Frank SD, Dunn RR, Tarpy DR (2016) Vähentynyt solujen immuunivaste sosiaalisissa hyönteislinjoissa. Biol Lett 12:20150984. https://doi.org/10.1098/rsbl.2015. 0984

Lucas KJ, Zhao B, Liu S, Raikhel AS (2015) Fysiologisten prosessien säätely mikroRNA:illa hyönteisissä. Curr Opin Insect Sci 11:1–7. https://doi.org/10.1016/j.cois.2015.06.004

Rosengaus RB, Jordan C, Lefebvre ML, Traniello JFA (1999) Patogeenien hälytyskäyttäytyminen termiitissä: Uusi viestintämuoto sosiaalisissa hyönteisissä. Naturwissenschaften 86:544–548. https://doi.org/ 10.1007/s001140050672

Rosengaus RB, Lefebvre ML, Traniello JFA (2000) Sieni-itiöiden itämisen estäminen nasutitermesillä: todisteita sotilaan puolustavien eritteiden mahdollisesta antiseptisestä roolista. J Chem Ecol 26:21-39. https://doi.org/10.1023/A:1005481209579

Rosengaus RB, Schultheis KF, Yalonetskaya A, Bulmer MS, DuComb WS, Benson RW, Thottam JP, Godoy-Carter V (2014) Symbiontista peräisin olevat -1,3-glukanaasit sosiaalisessa hyönteisessä: keskinäisyys ravitsemuksen ulkopuolella . Front Microbiol 5:607. https://doi.org/10.3389/fmicb. 2014.00607

Schuler F, Casida JE (2001) Hyönteismyrkky kohde kompleksin I PSST-alayksikössä. Pest Manag Sci 57:932-940. https://doi.org/10. 1002/ps.364

Seipke RF et al (2011) YksiStreptomycessymbiont valmistaa useita sienilääkkeitä tukemaan sienenviljelymuurahaistaAcromyrmex oktospinosus. PLoS ONE 6:e22028. https://doi.org/10.1371/journ al.pone.0022028

Shankar K, Mehendale HM (2014) Cytochrome P450. Julkaisussa: Wexler P (toim.) Encyclopedia of toxicology. Academic Press, s. 1125–1127 Stroeymeyt N, Grasse AV, Crespi A, Mersch DP, Cremer S, Keller L (2018) Sosiaalisen verkoston plastisuus vähentää taudin leviämistä eusosiaalisessa hyönteisessä. Science 362:941-945. https://doi.org/10.1126/ science.aat4793

Sun Q, Haynes KF, Zhou XG (2016) Dynaamiset muutokset kuolemanvihjeissä muokkaavat ruumiinhallinnan riskejä ja etuja sosiaalisessa hyönteisessä. Funct Ecol 31:697–706. https://doi.org/10.1111/1365- 2435.12754

Syazwan SA, Lee SY, Sajap AS, Lau WH, Omar D, Mohamed R (2021) VuorovaikutusMetarhizium anisopliatja sen isäntä, maanalainen termiittiCoptotermes curvignathusinfektioprosessin aikana. Biology 10:263. https://doi.org/10.3390/biolo gy10040263

Terrapon N et al (2014) Molecular jälkiä vaihtoehtoisesta sosiaalisesta organisaatiosta termiittigenomissa. Nat Commun 5:3636. https://doi.org/10. 1038/ncomms4636

Van Meyel S, Körner M, Meunier J (2018) Sosiaalinen immuniteetti: miksi meidän pitäisi tutkia sen luonnetta, kehitystä ja toimintoja kaikissa sosiaalisissa järjestelmissä. Curr Opin Insect Sci 28:1–7. https://doi.org/10.1016/j. cois.2018.03.004

Verma M, Sharma S, Prasad R (2009) Biologiset vaihtoehdot termiittien torjuntaan: katsaus. Int Biodeter Biodegr 63:959–972. https:// doi.org/10.1016/j.ibiod.2009.05.009

Wang YL, Yang ML, Jiang F, Zhang JZ, Kang L (2013) MikroRNA:sta riippuvainen kehitys paljasti RNA-häiriövälitteisen geenin vaimentamisenLmDicer1vaeltavassa heinäsirkassa. Insect Sci 20:53–60. https://doi.org/10.1111/j.{5}}.2012.01542.x

Weber F (2021) Antiviraalinen luontainen immuniteetti: esittely. Julkaisussa: Bamford DH, Zuckerman M (toim.) Encyclopedia of virology. Elsevier, s. 577–583 Xu H, Huang QY, Gao YY, Wu J, Hassan A, Liu YT (2021a)IDHknockdown muuttaa termiitin ravinnonhakukäyttäytymistäOdontocetes formosanuserilaisissa sosiaalisissa yhteyksissä. Curr Zool 67:609. https://doi.org/10.1093/cz/zoab032 Xu Z, Zeng X, Li M, Liao J, Chen Q (2021b) MicroRNA-383 edistää reaktiivisten happilajien aiheuttamaa autofagiaa vähentämällä peroksiredoksiini 3:a ihmisen glioomassa U87 solut. Exp Ther Med 21:439. https://doi.org/10.3892/etm.2021.9870

Yanagawa A, Fujiwara-Tsujii N, Akino T, Yoshimura T, Yanagawa T, Shimizu S (2011) Entomopatogeenien ummehtunut haju tehostaa termiitin sairauksien ehkäisykäyttäytymistäCoptotermes formosanus. J Invertebr Pathol 108:1–6. https://doi.org/10.1016/j.jip.2011. 06.001

Yanagawa A, Imai T, Akino T, Toh Y, Yoshimura T (2015) Patogeenisen sienen hajumerkit vaikuttavat termiittien liikesuuntaan,Coptotermes formosanus. J Chem Ecol 41:1118–1126. https://doi.org/10.1007/s10886-015-0649-8

Yang ML et al (2014) MicroRNA-133 estää käyttäytymisen aggregaatiota säätelemällä dopamiinisynteesiä heinäsirkoissa. PLoS Genet 10:e1004206. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004206