Bakteerirakkulat estävät viruksen replikaation makrofageissa TLR{0}}TRIF-akselin kautta

Abstrakti

Gram-negatiiviset bakteerit erittävät luonnollisesti nanokokoisia ulkokalvorakkuloita (OMV), jotka ovat tärkeitä viestinnän ja patogeneesin välittäjiä. Isäntäsolujen OMV:n otto aktivoi TLR-signaloinnin kuljetettujen PAMP-solujen kautta. Tärkeinä immuunisoluina alveolaariset makrofagit sijaitsevat ilman ja kudosten rajapinnassa, jossa ne muodostavat ensimmäisen puolustuslinjan sisäänhengitettyjä mikro-organismeja ja hiukkasia vastaan. Tähän mennessä tiedetään vähän alveolaaristen makrofagien ja patogeenisten bakteerien OMV:iden välisestä vuorovaikutuksesta. Immuunivaste OMV:tä vastaan ​​ja taustalla olevat mekanismit ovat edelleen vaikeaselkoisia. Täällä tutkimme primääristen ihmisen makrofagien vastetta bakteerivesikkeleille (Legionella pneumophila, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella enterica, Streptococcus pneumoniae) ja havaitsimme vertailukelpoista NF-KB-aktivaatiota kaikissa testatuissa vesikkeleissä. Sitä vastoin kuvaamme differentiaalista tyypin I IFN-signalointia, jossa on pitkittynyt STAT1-fosforylaatio ja voimakas Mx1-induktio, joka estää influenssa A -viruksen replikaation vain Klebsiella-, E.coli- ja Salmonella OMV -viruksille. OMV:n aiheuttamat antiviraaliset vaikutukset olivat vähemmän ilmeisiä endotoksiinittomilla Clear coli OMV:illä ja polymyksiinillä käsitellyillä OMV:illä. LPS-stimulaatio ei voinut jäljitellä tätä antiviraalista tilaa, kun taas TRIF-knockout kumosi sen. Tärkeää on, että OMV-käsitellyistä makrofageista saatu supernatantti indusoi antiviraalisen vasteen alveolaarisissa epiteelisoluissa (AEC), mikä viittaa OMV-indusoituun solujen väliseen kommunikaatioon. Lopuksi tulokset validoitiin ex vivo -infektiomallissa ihmisen primaarisella keuhkokudoksella. Yhteenvetona voidaan todeta, että Klebsiella-, E.coli- ja Salmonella OMV:t indusoivat antiviraalista immuniteettia makrofageissa TLR{11}}TRIF-signaloinnin kautta vähentääkseen viruksen replikaatiota makrofageissa, AEC:issä ja keuhkokudoksessa. Nämä gramnegatiiviset bakteerit indusoivat antiviraalista immuniteettia keuhkoissa OMV:iden kautta, millä voi olla ratkaiseva ja valtava vaikutus bakteeri- ja virusyhteisinfektion tuloksiin.

cistanche-kasveja lisäävä immuunijärjestelmä

Avainsanat

Solunulkoiset rakkulat, ulkokalvorakkulat, bakteeri- ja virusperäinen infektio, keuhkokuume, makrofagit, keuhkorakkuloiden epiteelisolut, virusten vastainen synnynnäinen immuniteetti

Johdanto

Ulkokalvorakkuloita (OMV) vapauttavat luonnollisesti gram-negatiiviset bakteerit, joiden halkaisija on jopa 300 nm. Gram-positiiviset bakteerit pystyvät yhtä lailla vapauttamaan kalvovesikkelejä (MV:t). Biogeneesinsä seurauksena nämä lipidikaksoiskalvorakenteet sisältävät periplasmisen sisällön lisäksi bakteerien (ulomman) kalvon pääkomponentteja, kuten lipidejä, proteiineja ja gram-negatiivisten bakteerien tapauksessa lipopolysakkarideja (LPS). [1]. Bakteeriviestinnän roolinsa lisäksi OMV:t on yhdistetty patogeenisiin vaikutuksiin ja virulenssitekijöiden kuljettamiseen, esim. VacA Helicobacter pylorista, Shiga-toksiini Shigella dysenteriae -bakteerista tai ClyA enterohemorragisesta Escherichia colista [2]. Näiden OMV:iden osoitettiin manipuloivan epiteelisolu- ja immuunivasteita. Bakteerien endotoksiinin läsnäolo OMV:n pinnalla yhdessä muiden kuljetettuihin patogeeneihin liittyvien molekyylikuvioiden (PAMP) kanssa tekee niistä tehokkaita stimulaattoreita immuunisoluille, koska ne voivat silti tunnistaa vastaavat reseptorinsa [3]. Tolllike-reseptorien (TLR) ja Nod-kaltaisten reseptorien sitoutuminen synnynnäisissä immuunisoluissa voi laukaista pro-inflammatoristen ja immunosäätelevien sytokiinien vapautumisen, mukaan lukien neutrofiilien kerääntyminen tai epiteelisolukerrosten tiukkojen liitoskohtien katkeaminen [4]. Yksi tärkeä keuhkojen immuunisolutyyppi on alveolaariset makrofagit (AM), jotka sijaitsevat ilma-kudosrajapinnassa keuhkorakkuloissa. Hengitettyjen hiukkasten nielemisen kautta AM:t edustavat ensimmäistä puolustuslinjaa mikro-organismeja ja hiukkasia vastaan ​​fagosytoosin ja hajoamisen kautta. Kun patogeenit kohtaavat, makrofagit esittelevät antigeenejä adaptiivisille immuunisoluille ja vapauttavat tulehdusta edistäviä sytokiineja. Siten ne voivat vaikuttaa tyypin I ja II alveolaarisiin epiteelisoluihin (AEC) ja muihin immuunisoluihin (Lisätiedosto 1: Kuva S1A). Useat PAMP:t voivat aktivoida AM:t indusoimaan solunsisäistä signalointia ja erilaisten geenien ilmentymismallien indusoimista erilaisten immuunireseptorien kautta [5, 6], mikä johtaa MyD88- tai TRIF-signalointiin, jotka molemmat puolestaan ​​indusoivat erilaisia ​​geenien alaryhmiä (Lisätiedosto 1 : Kuva S1B). Lisäksi ne täyttävät muita tehtäviä keuhkojen homeostaasissa ja patogeneesissä, mikä tekee niistä keskeisen signalointikeskuksen ja keuhkojen immuniteetin järjestäjän. Influenssavirukset kuuluvat Orthomyxoviridae-heimoon ja aiheuttavat ylä- ja alahengitystieinfektioita, jotka vaihtelevat lievistä vaikeisiin tapauksiin. Vaikka useimmat kausi-influenssavirusinfektiot ovat itsestään ohimeneviä, joillekin potilaille kehittyy keuhkokuume ja akuutti hengitysvaikeusoireyhtymä, jonka arvioidaan johtavan jopa 650 000 vuotuiseen kuolemaan maailmanlaajuisesti [7]. Influenssa A -virus (IAV) infektoi pääasiassa hengitysteiden epiteelisoluja ja replikoituu niissä. Virusinfektio johtaa kuviontunnistusreseptorin (PRR) aktivoitumiseen ja signalointiin useiden transkriptiotekijöiden kautta, nimittäin ydintekijä kappa B:n (NF-κB) ja interferonin säätelytekijän (IRF) -3/7, jotka indusoivat tyyppiä I ja III. interferonien (IFN) tuotanto. Tämä huomattava IFN-vaste indusoi siten solujen "viruksenvastaisen tilan" auto- ja parakriinisellä tavalla [8]. Lisäksi useita muita sytokiineja ja kemokiineja erittyy infektion yhteydessä. Tämä tiukasti säädelty isännän puolustussytokiiniverkosto värvää immuunisolupopulaatioita infektiokohtaan ja järjestää synnynnäisiä ja mukautuvia immuunivasteita [9]. IAV voi kuitenkin infektoida myös AM:ita, mikä johtaa dramaattisesti vähentyneeseen AM:iden määrään akuutin infektion aikana, ja ne on saatava uudelleen käyttöön infektion ratkaisemiseksi. Synnynnäisten immuunisolujen aktivoituminen ja tulehdusta edistävien sytokiinien erittyminen johtavat uusien synnynnäisten solujen kerääntymiseen, jotka hallitsevat infektiota ja käynnistävät kudosten korjauksen [10, 11]. Täällä analysoimme makrofagien vastetta bakteerien ekstrasellulaarisiin vesikkeleihin ja niiden vaikutusta myöhempään IAV-infektioon.

cistanche-lisän edut - kuinka vahvistaa immuunijärjestelmää

Napsauta tästä nähdäksesi Cistanche Enhance Immunity -tuotteet

【Kysy lisää】 Sähköposti:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

materiaali ja metodit

Kemikaalit ja vasta-aineet

Hamin F12-elatusaine saatiin GE Healthcare Europelta (Freiburg, Saksa). RPMI-1640, DMEM, GlutaMAX, Penicillin/Streptomycin ja FCS ostettiin Life Technologiesilta (Darmstadt, Saksa). PBS hankittiin Capricorn Scientific GmbH:lta (Ebsdorfergrund, Saksa). Opti-MEM saatiin Thermo Fisher Scientificilta (Frankfurt, Saksa). Forbol-12-myristaatti-13--asetaatin (PMA) toimitti Sigma-Aldrich Chemie (München, Saksa). LPS (Salmonella Minnesota R595, TLR-laatu) saatiin Enzo Life Sciencesilta (Lausen, Sveitsi). Pam3CSK4 ostettiin Invivogenilta (San Diego, USA). JAK-inhibiittori Ruksolitinibi hankittiin yhtiöltä Biozol Diagnostics Vertrieb GmbH (Eching, Saksa). Polymyksiini B ostettiin Merck Milliporelta (Billerica, USA). Vasta-aineet saatiin Abcamilta (Cambridge, UK): Mx1 (ab95926), influenssan nukleoproteiini (9G8); Solusignalointi (Cambridge, UK): fosfo-IRF-3 (Ser396)(4D4G), phospho-TBK-1 (Ser172)(D52C2), TBK-1 (61223S), fosfo- STAT1 (Tyr)(58D6), STAT1 (D1K9Y), hiiren anti-kani (L27A9), IRAK-1 (4359S), fosfo-p38 (Tr180/Tyr182)(9211S), p38 (9212S); Thermo Fisher Scientific: vuohen anti-hiiri (Alexa for 488); ProteinTech: anti-IRF-3 (66670-1) tai Santa Cruz Biotechnology (Heidelberg, Saksa): -aktiini (C4), anti-hiiri (mIgGκBPHRP, sc-516102). Kaikki muut käytetyt kemikaalit olivat analyyttistä laatua ja hankittu kaupallisista lähteistä.

Bakteeriviljely ja OMV/MV-valmistus

L. pneumophila -kantaa Corby-villityyppiä käsiteltiin aiemmin kuvatulla tavalla [12]. K. pneumoniae (#700721/MGH78578), E.coli (#25922) ja S. enterica serovar Typhimurium (#14028) saatiin American Type Culture Collectionista (Rockville, MD, USA). ClearColi™ BL21 oli BioCat GmbH:lta (Heidelberg, Saksa). S. pneumoniae D39 Δcps toimitti ystävällisesti Sven Hammerschmidt. Bakteereja kasvatettiin agarmaljoilla yön yli (MacConkey: Kp, Ec, Sal; LB: Clear coli; veriagarlevyt: Sp) ja käytettiin sitten nestemäisten väliaineiden siirrostamiseen (LB: Kp, Ec, Sal, Clear coli; THY: Sp) . Bakteereja kasvatettiin myöhäiseen logaritmiseen vaiheeseen saakka 37 asteessa jatkuvassa ravistelussa (MaxQ 6000, Thermo Fisher Scientific, Karlsruhe, Saksa; paitsi Sp). Sitten bakteeriviljelmät sentrifugoitiin kolme kertaa (4 500 x g, 15 min, 4 astetta; Multifuge X3R, Thermo Fisher Scientific). Jäljelle jääneet bakteerit poistettiin steriilisuodatuksella 0,22 um:n huokosten läpi. Supernatantti konsentroitiin 100 kDa:n molekyylipainon katkaisusuodattimilla (Merck KGaA, Darmstadt, Saksa) ja vesikkelit puhdistettiin joko ultrasentrifugoinnilla tai kokoekskluusiokromatografialla (SEC). Ultrasentrifugointia varten supernatantti ultrasentrifugoitiin nopeudella 100 000 x g, 3 tuntia, 4 astetta. Kun saatu OMV/MV-pelletti oli pesty steriilillä PBS:llä, ultrasentrifugointi toistettiin ja vesikkelipelletti liuotettiin steriiliin PBS:ään. Proteiinipitoisuus määritettiin Pierce BCA -proteiinimäärityssarjalla valmistajan ohjeiden mukaisesti (Thermo Fisher Scientific), ja stimulaatiokokeissa käytettiin yhtä suuria proteiinimääriä. SEC:tä varten supernatantti konsentroitiin 500 ul:aan ja ladattiin alkuperäisiin/70 nm Gen 2 -pylväisiin (IZON Science LTD, Lyon, Ranska), jotka esipestiin 10 ml:lla PBS:ää valmistajan ohjeiden mukaisesti. Vesikkelit eluoitiin käyttämällä steriiliä PBS:ää ja 500 ui:n fraktiot kerättiin. Vesikkelit eluoitiin fraktioissa 7–12, mikä määritettiin nanovirtaussytometrialla (nFCM; NanoFCM Co., Ltd, Nottingham, UK). Yhdistetyt rakkuloita sisältävät fraktiot väkevöitiin 200–400 µl:ksi käyttämällä molekyylipainon katkaisusuodattimia (Merck KGaA). Kaikkien valmisteiden vesikkelikonsentraatio määritettiin nFCM:llä ja yhtä suuria määriä vesikkelejä käytettiin stimulaatiokokeissa. Molempien puhdistusmenetelmien OMV/MV-valmisteet tarkastettiin bakteerien kontaminaatioiden varalta maljaamalla ja varastoimalla erissä -20 astetta.

NFC

nFCM:ää varten Nano Analyzer (NanoFCM Co., Ltd, Nottingham, UK), joka oli varustettu 488 nm:n laserilla, kalibroitiin 200 nm polystyreenihelmillä (NanoFCM Co.) määritellyllä pitoisuudella 2,08 × 10^8 hiukkasta/ml ja sitä käytetään myös referenssinä hiukkaspitoisuudelle. Lisäksi koon vertailustandardina vesikkelien koon kalibroinnissa käytettiin neljää erikokoista monodisperssiä piidioksidihelmiä (NanoFCM Co.). Juuri suodatettu (0,1 um) 1 x PBS analysoitiin taustasignaalina ja vähennettiin muista mittauksista. Jokainen jakautumishistogrammi tai pistekaavio johdettiin 1 minuutin ajan kerätyistä tiedoista 1 kPa:n näytepaineella. OMV-näytteet laimennettiin suodatetulla (0,1 µm) 1 × PBS:llä, mikä johti optimaalisiin 2 500–12 000 tapahtumien hiukkaslukuihin. Hiukkaspitoisuus ja kokojakauma laskettiin käyttämällä nFCM-ohjelmistoa (NF Profession V1.08).

Transmissioelektronimikroskooppi (TEM)

Hiilipäällysteiset kupariritilät (400 mesh) hydrofilisoitiin hehkupurkauksella (PELCO easiGlow, Ted Pella, USA). Viisi ui näytteitä levitettiin hydrofilisoiduille ritleille ja värjättiin 2 % (w/v) uranyyliasetaatilla lyhyen pesuvaiheen jälkeen kahdesti tislatulla vedellä. Näytteet analysoitiin JEOL JEM-2100 -transmissioelektronimikroskoopilla käyttämällä 120 kV:n kiihdytysjännitettä. Kuvat hankittiin F214 FastScan CCD -kameralla (TVIPS, Gauting, Saksa).

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Soluviljely

Ihmissolulinjat (THP-1, A549, BEAS2B, Calu-3, HCC827) saatiin American Type Culture Collectionista. Madin-Darby Canine Kidney II -solut (MDCK II) ostettiin ECACC-Sigma-Aldrichilta (Darmstadt, Saksa). THP-1 Dual™ (Dual) ja THP-1 Dual™ TRIF-KO (TRIF−/−) -solut hankittiin Invivogen Europelta (Toulouse, Ranska). Soluja viljeltiin Ham's F12:ssa, DMEM:ssä tai RPMI:ssä, jota oli täydennetty 1 mM natriumpyruvaatilla, 2 mM glutamiinilla sekä 10 % lämpöinaktivoidulla FCS:llä soluviljelyolosuhteissa. THP-1 Dual™-soluja viljeltiin RPMI-1640:ssa, johon oli lisätty 1 % penisilliini/streptomysiiniä, 2 mM glutamiinia, 10 % lämpöinaktivoitua FCS:ää, 100 µg/ml Normocin™ ja 25 mM HEPES-puskuri. THP-1-, Dual- ja TRIF−/−-solut erilaistuivat makrofagien kaltaisissa soluissa lisäämällä 20 nM PMA:ta 24 tunnin ajan.

Mx1:n kloonaus SparQ-vektoriin

Mx1:n koodaava sekvenssi luotiin THP-1 cDNA:sta Phusion PCR:llä käyttäen Phusion High-Fidelity DNA Polymerasea (New England Biolabs, Ipswich, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. An HAtag was added by fusing the HA coding sequence to the reverse primer (sense: 5′-atcggaTTCGAAATGGTTGTT TCCGAAGTGGAC-3′, antisense: 5′-tccgatGCGGCC GCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAA CCGGGGAACTGGGCAAG-3′). PCR-fragmentti sekä SparQ-vektori (Addgene, Watertown, USA) digestoitiin BstbI- ja Notl-restriktioentsyymeillä (Thermo Fisher Scientific) ja ligoitiin T4 DNA Ligaasilla (New England Biolabs) SparQ-vektoriin.

HEK293T-solujen transfektio ja lentivirustuotanto

HEK293T-solut transfektoitiin SparQ-vektorilla, joka oli laimennettu Opti-MEM:iin, joka sisälsi Mx1-sekvenssin ja GFP-sekvenssin, viruspakkausvektorin psPAX2 ja vaippaplasmidin pVSV-G (Addgene) Lipofectamine 2000:lla (Thermo). Fisher Scientific) valmistajan protokollan mukaisesti. Lentivirus tuotettiin ja virusta sisältävää supernatanttia kerättiin joka päivä 72 tunnin ajan. Supernatantti suodatettiin käyttämällä 0,45 um:n suodatinta ja THP{10}}-solut transdusoitiin (katso alla). Tyhjää SparQ-vektoria ilman Mx1-sekvenssiä käytettiin solujen transduktioon vastaavan kontrollisolulinjan muodostamiseksi (VC=vektorikontrolli).

THP-1-solujen transduktio

THP-1-solut transdusoitiin lentiviruksella HEK293T-soluviljelmän suodatetusta supernatantista (katso edellä). Polybreeniä (4 ug/ml, Sigma-Aldrich) lisättiin parantamaan transduktiotehokkuutta. Soluja inkuboitiin enintään kuusi päivää. GFP-positiiviset solut lajiteltiin virtaussytometrialla.

BDM:ien eristäminen ja erottaminen

Ihmisen monosyytit terveiltä luovuttajilta eristettiin magneettisella CD14-positiivisella valinnalla perifeerisen veren mononukleaarisoluista ja erilaistettiin verestä peräisin oleviksi makrofageiksi (BDM) 1 % ihmisen ABseerumin läsnä ollessa, kuten aiemmin on kuvattu [13].

Makrofagien OMV/MV-stimulaatio

Ihmisen primäärisiä makrofageja tai erilaistuneita THP{0}}-soluja inkuboitiin puhdistettujen OMV:iden/MV:iden kanssa (kukin 1 µg/ml ultrasentrifugoinnilla puhdistetuille vesikkeleille ja 1, 000 SEC-puhdistetuille vesikkeleille (MOV)). rakkulat) jopa 20 tunnin ajan täydellisessä elatusaineessa. Lisäinhibiittorin levitys suoritettiin 1 tunti ennen vesikkelikäsittelyä. Te-stimuloituja makrofageja käytettiin joko proteiinin tai RNA:n eristämiseen tai myöhemmissä infektiokokeissa. Saatua sytokiinia sisältävää supernatanttia käytettiin ELISA- tai LDH-analyysiin tai steriilisuodatettiin ja käytettiin epiteelisolujen stimulaatioon.

Viruksen puhdistus ja virustitraus

Viruksen puhdistus ja virustitraus suoritettiin MDCK II -soluissa edellä kuvatulla tavalla [14]. Virustiitteri määritettiin plakkimäärityksellä, kuten aiemmin on kuvattu [15]. Lyhyesti sanottuna konfluentit MDCK II -solut infektoitiin sarjalaimennetulla viruksella tai kudossupernatantilla (MDCK II -viljelyväliaineessa ilman FCS:ää). Viruksen annettiin adsorboitua soluihin 1 tunnin ajan 37 asteessa. Kymmenen, ymppi korvattiin tuoreella elatusaineella (täydennettynä 1 ug/ml TPCK-käsiteltyä trypsiiniä (IAV:lle) ja 1 % Avicel® PH-101:a (Sigma-Aldrich)). MDCK II -solut värjättiin kristallivioletilla tai viruksella infektoidut solut värjättiin primaarisella vasta-aineella (1:2, 000) (hiiren anti-influenssa A -nukleoproteiini, MCA400, Bio-Rad, Saksa) ja sekundaarisella vasta-aineella ( 1:4,000) (Goat Anti-Mouse IgGHRP, 170–6516, Bio-Rad, Saksa) plakkimääritystä varten. Plakit laskettiin manuaalisesti ja ilmaistiin plakkia muodostavina yksikköinä (pfu) per ml.

Cistanche-edut miehille - vahvistavat immuunijärjestelmää

Virusinfektio

20 tunnin esistimuloinnin jälkeen bakteerivesikkeleillä tai sytokiinia sisältävällä supernatantilla solut infektoitiin IAV- tai vesicular stomatitis -viruksella (VSV). Makrofagit infektoitiin H1N1:llä (A/WSN/33) tai VSV:llä, kun taas epiteelisolut infektoitiin H1N1:llä (A/Hamburg/2009/PDM) molemmat tuoreessa alustassa ilman FCS:ää. 1 tunnin inokuloinnin jälkeen vapaa virus poistettiin ja elatusaine korvattiin TPCK-trypsiiniä sisältävällä väliaineella IAV:tä varten tai tyhjällä elatusaineella VSV:tä varten. Soluja inkuboitiin jopa 48 tuntia monisyklisen replikaation mahdollistamiseksi.

Ihmisen PCLS:n valmistus

Keuhkokudosta hankittiin potilailta, joille tehtiin keuhkosyövän vuoksi lohkoleikkaus Hannover Medical Schoolissa (MHH, Hannover, Saksa). Kokeissa käytettiin vain kudosta makroskooppisesti ja mikroskooppisesti taudista vapaista keuhkojen osista. Ihmisen tarkkuusleikatut keuhkoviipaleet (PCLS) valmistettiin edellä kuvatulla tavalla [16]. Kahta kudosviipaletta per kuoppa viljeltiin 24-kuoppalevyllä upotetuissa olosuhteissa (DMEM/F12 täydennettynä 1 % penisilliini/streptomysiinillä) 37 asteessa, 5 % C02:ssa yön yli.

PCLS:n IAV-infektio

PCLS:ää stimuloitiin 1 µg/ml L. pneumophilasta tai K. pneumoniaesta puhdistettua OMV:tä laimennettuna DMEM/F12:een täydennettynä 1 % penisilliini/streptomysiinillä 37 asteessa, 5 % CO2 2 0 tunnin ajan. Elatusaine poistettiin ja PCLS siirrostettiin 25,000 pfu/kuoppa 250 µl:ssa influenssavirusta A/California/04/2009 (H1N1pdm). PCLS:itä inkuboitiin 35 asteessa ja heiluteltiin 15 minuutin välein rokotuksen aikana homogeenisen virusinfektion mahdollistamiseksi. Myöhemmin siirroste heitettiin pois ja korvattiin DMEM/F12:lla, jota oli täydennetty 1 % penisilliini/streptomysiinillä. 48 tunnin inkubaation jälkeen supernatantti kerättiin viruksen havaitsemista, LDH:n vapautumista ja sytokiinien kvantifiointia varten. Näytteitä sytokiinimittauksia varten täydennettiin 0,2-prosenttisella proteaasi-inhibiittoriseoksella (P1860, Sigma-Aldrich, München, Saksa) ja säilytettiin 80 asteessa analyysiin asti. PCLS jäädytettiin ja säilytettiin 80 asteessa RNA:n puhdistukseen asti, kuten aiemmin on kuvattu [17].

LDH

LDH:n vapautumismääritys suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti käyttämällä Pierce™ LDH Cytotoxicity Assay -sarjaa, joka saatiin Rochelta (Mannheim, Saksa) tai Cytotoxicity Detection KitPLUS (LDH) (Roche, Merck). Absorbanssi mitattiin käyttämällä mikrolevylukijaa infinite F200Pro (Tecan, Männedorf, Sveitsi).

ELISA

Sytokiinit CXCL8/IL-8, CXCL10/IP-10 ja IL-1 määritettiin soluttomasta supernatantista käyttämällä kaupallisesti saatavia ELISA-pakkauksia (R&D Systems, Wiesbaden, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. ohjeet.

QUANTI-blue™ -määritys

SEAP:n reportteriaktiivisuuden määrittämiseksi soluviljelmän supernatantissa THP-1 Dual™:sta ja vastaavista TRIF−/−-soluista suoritettiin QUANTI-Blue™-määritys valmistajan protokollan mukaisesti. Lyhyesti sanottuna soluviljelmän supernatantti kerättiin solujen OMV:illä stimuloinnin jälkeen. Ensin QUANTI-Blue™ -liuos ja soluviljelmän supernatantti annosteltiin rasvapohjaiselle 96-kuoppalevylle. Inkuboinnin jälkeen 37 asteessa 150 minuuttia optinen tiheys 630 nm:ssä määritettiin mikrolevylukijalla infinite F200Pro.

QUANTI-luc™ -määritys

Lucia-lusiferaasin reportteriaktiivisuuden määrittämiseksi soluviljelmän supernatantissa THP{0}} Dual™:sta ja vastaavista TRIF−/−-soluista suoritettiin QUANTI-Luc™-määritys valmistajan protokollan mukaisesti. Lyhyesti sanottuna soluviljelmän supernatantti annosteltiin valkoiselle rasvapohjaiselle 96-kuoppalevylle (BRAND GmbH & Co. KG, Wertheim, Saksa). QUANTI-Luc™-määritysliuos lisättiin ja luminesenssimittaus suoritettiin välittömästi 0,1 s:n lukuajalla mikrolevylukijalla infinite F200Pro.

Western blot

Proteiinin ilmentymisen tai fosforylaation määrittämiseksi suoritettiin Western Blot kuten aiemmin on kuvattu [18].

RNA:n valmistus ja reaaliaikainen PCR

Geeniekspressioanalyysiä varten RNA:n eristäminen suoritettiin fenoli-kloroformiuutolla ja käänteiskopioitiin aiemmin kuvatulla tavalla [12]. Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR suoritettiin sitten ViiA7:ssä (Thermo Fisher Scientific), jossa oli Luna Universal qPCR Master Mix (New England BioLabs) ja erityisiä alukepareja. 2−ΔΔCT-menetelmää [19] käyttämällä laskettiin x-kertainen induktio ja tulokset normalisoitiin vastaaviin kontrollisoluihin. 18S: fwd: 5′-GACTCTTTCGAGGCCCTGTA-3′, rev: 5′-CACCAGACTTGCCCTCCAAT-3′ CXCL8: fwd: 5′-ACTGAGAGTGATTGATTGAG}, GTCCACT}-5′7′TTCACT} TC{ {20}}′ IFI44: fwd: 5′-TATCCAGACAGAGCAGCTACC-3′, rev: 5′-ATAGAGAAGGCTAAGCCGCTTC-3′ IFIT1: fwd: 5′-AC{{ATGGACA1}v: 5′-ACGGACA1}v: ′-TCTGGACACTCCATTCTATAGCG-3′ IFNA1: fwd: 5′-ACAGGAGGACCTTGATGCTC-3′, rev: 5′-TCTGCTGGATCAGCTCATGG-3′ fAAGAACNB:'w 4}}′ , kierros: 5′-TGTCCTTGAGGCAGTATTCAAG-3′ IL1B: fwd: 5′-AGCTCGCCAGTGAAATGATGG-3′, kierros: 5′-CAGGTCCTGGAAGGAGTATTCAAG{{5AG′′GCC1}2 CAAGATGTGTCA{{ 58}}′, kierros: 5′-CACCATTTCTCCAGGGGCAT-3′ Mx1: fwd: 5′-GGGCTTTGGAATTCTGTGGC-3′, kierros: 5′-CCTTGGAATGATG{{GG6CT8'5:GATG{{GG6CT8'5:GATG -GAAATTTCAAACAGCTGCACAAAG -3′, kierros: 5′-AATATGAGTGCAGACCGTGC-3′ RPS18: fwd: 5'-GCGGCGGAAAATAGCCTTTG-3′, kierros: GATC5}′ACCATT{-GATC5}′ACCATT

Immunofluoresenssi

THP{{0}}-solut erotettiin kansilasilla lisäämällä 20 nM PMA:ta ja inkuboitiin OMV:iden/MV:iden kanssa 20 tuntia. Sen jälkeen solut infektoitiin H1Nl:llä (A/WSN/33; infektion monikertaisuus (MOI) 0,1) 4 tunnin ajan. 15 minuutin fiksaation jälkeen 3 % paraformaldehydillä objektilasit pestiin kolme kertaa PBS:llä ja permeabilisoitiin 0,2 % triton X-100:lla TBS:ssä (10 min, huoneenlämpötila). Salpauksen jälkeen (1 % BSA:ta TBS:ssä/0,2 % triton X-100) soluja inkuboitiin -NP-vasta-aineen kanssa (1:250, estoliuoksessa). Sekundaarista vasta-ainetta (1:1000) yhdessä DAPI:n (1:2000) kanssa inkuboitiin 1 tunti pimeässä. Kiinnitetyt peitinlasit analysoitiin fluoresenssimikroskoopilla (AxioVision, Zeiss, Jena, Saksa).

Eettinen lausunto

Ihmisen keuhkokudosviipaleilla tehdyt kokeet hyväksyttiin Hannover Medical Schoolin (MHH, Hannover, Saksa) eettisessä komiteassa, ja ne ovat Maailman lääketieteellisen liiton eettisen koodin (numero 2701–2015) mukaisia. Kaikki potilaat tai heidän lähiomaiset antoivat kirjallisen tietoisen suostumuksen keuhkokudoksen käyttöön tutkimuksessa. Kaikki verenluovuttajat antoivat tietoon perustuvan kirjallisen suostumuksen (eettinen hyväksyntänumero: 161/17).

Kuva 1 Bakteerivesikkeleiden ja vasteen karakterisointi ihmisen makrofageissa. A Bakteerien ekstrasellulaaristen rakkuloiden erottaminen vapaista proteiineista kokoekskluusiokromatografialla eri bakteerisupernatanteista (Legionella pneumophila (Lp), Klebsiella pneumoniae (Kp), Escherichia coli (Ec), Salmonella enterica serovar Typhimurium (Sal) ja Streptococcus pneumoniae (Sp) ). Vesikkelikonsentraatio kussakin fraktiossa määritettiin nanovirtaussytometrialla (nFCM) ja proteiinit kvantifioitiin BCA:lla. B Puhdistettujen OMV:iden/MV:iden rakkuloiden kokojakaumat määritettiin NFC:llä. C TEM-kuvat puhdistetuista OMV:istä/MV:istä. Mittakaavapalkki=50 nm. D-G ​​BDM:itä stimuloitiin eri bakteereista peräisin olevilla OMV:illä/MV:illä (kukin 1 µg/ml) tai jätettiin käsittelemättä kontrolliksi jopa 48 tunniksi. D CXCL8:n vapautuminen määritettiin ELISA:lla ja se esitetään yksikkönä ng/ml. IL1B:n (E) ja IL12B:n (F) ilmentyminen määritettiin qPCR:llä, tulokset normalisoidaan RPS18:aan ja on kuvattu suhteessa käsittelemättömiin kontrollisoluihin. G 1 tunnin inkuboinnin jälkeen bakteerivesikkelien kanssa IRAK-1, p38 ja TBK-1 ekspressio ja fosforylaatio määritettiin Western Blotilla. Esitetään edustavat tulokset neljästä biologisesti riippumattomasta toistosta. Palkit edustavat keskiarvoja + SEM kolmesta (B) neljään (D–F) riippumattomaan kokeeseen. Tilastot: 2-tapa ANOVA (DF); *s<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001; ns=not significant; n=3–4

Tilastot

Tiedot esitetään keskiarvoina + SEM vähintään kolmen biologisesti riippumattoman kokeen osalta. Käytettiin Prism 6.{6}}7 (GraphPad, La Jolla, USA). Yksi- tai kaksisuuntaiset ANOVA-testit suoritettiin parittomille näytteille. P-arvot Alle tai yhtä suuri kuin 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitseväksi. Ellei toisin mainita, testit suoritettiin verrattuna vastaavaan kontrolliin (*).

Tietojen ja materiaalien saatavuus

Kaikki tämän tutkimuksen aikana tuotetut tai analysoidut tiedot sisältyvät tähän artikkeliin ja sen lisätiedostoon.

Tulokset

OMV:iden / MV:iden aiheuttama makrofagien tulehdusta edistävä aktivointi

Ihmisen primaaristen verestä peräisin olevien makrofagien (BDM) luontaisen immuunivasteen testaamiseksi eri bakteerien OMV:ille/MV:ille, Legionella pneumophila (Lp), Klebsiella pneumoniae (Kp), Escherichia coli (Ec), Salmonella enterica serovar Typhimurium (Sal) rakkuloille. ) ja Streptococcus pneumoniae (Sp) eristettiin kokoekskluusiokromatografialla (SEC). Fraktioista analysoitiin vesikkeleiden lukumäärä nanovirtaussytometrillä (nFCM) ja proteiinien läsnäolo BCA:lla (kuvio 1A). Vesikkelit fraktioista 7–12 yhdistettiin ja käytettiin kokeisiin. OMV:illä/MV:illä oli vertailukelpoinen kokojakaumaprofiili (kuva 1B), ne eivät eronneet keskimääräisestä koosta (Lisätiedosto 1: Kuva S2A), ne konsentroituivat tasaisesti (Lisätiedosto 1: Kuva S2B) ja ne visualisoitiin transmissioelektronilla. mikroskopia (TEM; kuva 1C). BDM:itä stimuloitiin OMV:illä/MV:llä jopa 48 tuntia, mikä vastaa eri bakteerien yhtäläisiä vesikkelipitoisuuksia (Lisätiedosto 1: Kuva S2C). BDM:ien inkubointi vesikkeleillä ei ollut sytotoksista (Lisätiedosto 1: Kuva S2D). OMV:t/MV:t indusoivat laajasti CXCL8:n ilmentymistä ja vapautumista makrofageista (Lisätiedosto 1: Kuvat S3A ja 1D), kun taas IL1B:n ja IL12B:n mRNA:n induktio oli ajasta ja lajista riippuvaista (kuvio 1E+F). IL-1:n vapautuminen riippui lajeista, joista bakteerivesikkelit eristettiin (Lisätiedosto 1: Kuva S3B). Vaikka p38:n fosforylaatio oli vertailukelpoinen BDM:issä 1 tunnin vesikkeli-inkuboinnin jälkeen, vain gramnegatiivisten bakteerien aiheuttamat OMV:t aiheuttivat IRAK-1:n hajoamisen ja TBK-1 fosforylaatio, mutta eivät grampositiivisten MV:t (kuva 1). 1G ja lisätiedosto 1: S4A-D).

Kuvio 2 Bakteerien ekstrasellulaariset vesikkelit aktivoivat tyypin I interferonivasteen BDM:issä. BDM:itä stimuloitiin OMV:illä/MV:illä (kukin 1 ug/ml) eri bakteereista tai jätettiin käsittelemättä kontrolliksi. IRF-3:n fosforylaatio ja ilmentyminen määritettiin 1 tunnin OMV/MV-inkuboinnin jälkeen Western Blot -menetelmällä. Edustava tulos kolmesta biologisesti riippumattomasta toistosta esitetään. IFNA1:n (B), IFNB:n (C), IFIT1:n (E) ja IFI44:n (F) ilmentyminen mitattiin qPCR:llä, tulokset normalisoidaan RPS18:aan ja ne on kuvattu suhteessa käsittelemättömiin kontrollisoluihin. D STAT1:n fosforylaatio määritettiin Western Blotilla 2 tunnin OMV/MV-stimulaation jälkeen. Esitetään neljän biologisesti riippumattoman toiston edustava tulos. G STAT1:n fosforylaatio ja Mx1:n ilmentyminen määritettiin Western Blot -menetelmällä 20 tunnin bakteerivesikkelistimulaation jälkeen. Kuvassa on edustavia tuloksia neljästä biologisesti riippumattomasta toistosta. Palkit edustavat keskiarvoja + SEM neljästä riippumattomasta kokeesta. Tilastot: 2-tapa ANOVA; *s<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; n=4

NF-κB:n ja AP-1:n ja niiden alavirran kohteiden aktivoinnin lisäksi PRR-signalointi voi johtaa IRF:ien aktivoitumiseen. Siten IRF-3:n fosforylaatio määritettiin. Kp/Ec/SalOMV:t lisäsivät IRF-3:n fosforylaatiota BDM:issä (kuva 2A), mikä johti IFN I:n ilmentymiseen (kuva 2B+C), STAT1:n alavirran fosforylaatioon (kuva 2D ja lisätiedosto 1): S4E) ja interferonin stimuloimien geenien (ISG:t; IFIT1, IFI44 ja Mx1; kuviot 2E-G) induktio. Koska fosforylaatiotapahtumat ovat tyypillisesti lyhytaikaisia ​​ja niillä tiedetään olevan kriittinen rooli immuunisignalointikaskadien kytkemisessä päälle ja pois, STAT1:n fosforylaatiota tutkittiin myös 20 tuntia Kp/Ec/SalOMV:iden lisäämisen jälkeen (kuva 2G ja lisätiedosto 1: S4F+G). Kokeet osoittivat, että OMV:t eivät vain aktivoi tulehdusta edistävää signalointia makrofageissa, vaan myös antiviraalista signalointia indusoituu.

OMV-esi-inkubaatio muuttaa IAV:n replikaatiota makrofageissa

Mx1 on hyvin tunnettu antiviraalinen tekijä, joka estää IAV:n replikaatiota [20], joka ilmentyi makrofagien Kp/Ec/SalOMV-käsittelyssä. Siksi oletimme, että OMV-esikäsittely muuttaa viruksen replikaatiota. IAV-infektiokokeet suoritettiin THP-1-soluissa, jotka ilmentävät samanlaisia ​​Mx1-tasoja Kp/Ec/SalOMV-käsittelyn jälkeen mRNA- ja proteiinitasoilla (Lisätiedosto 1: Kuva S5A+B) ja indusoivat STAT1:n fosforylaation , kun taas STAT1-proteiinin kokonaismäärä pysyy vakaana (Lisätiedosto 1: Kuva S5C), H1N1-kannan (A/WSN/33) kanssa, joka saastuttaa ja replikoituu makrofageissa [21]. THP-1-solujen esistimulaatio LpOMV/SpMV:llä lisäsi IAV-replikaatiota 24 tuntia infektion jälkeen (pi) verrattuna infektoituneeseen kontrolliin (--), kun taas esikäsittely Mx1--indusoivilla OMV:illä (Kp) /Ec/Sal) esti IAV-replikaation (kuvio 3A). Vaikka TLR2/1-agonisti Pam3CSK4-esikäsittely saattoi jäljitellä vaikutusta, joka havaittiin LpOMV/SpMV:llä, joiden molempien tiedetään lähettävän signaalia TLR2/1:n kautta [12, 22, 23], liukoinen LPS TLR4-agonistina ei tuottanut Kp/Ec:tä. /SalOMV-efekti (Lisätiedosto 1: Kuva S5D). Erot IAV-kuormassa esikäsittelyn jälkeen voitiin havaita myös immunofluoresenssivärjäyksellä viruksen nukleoproteiinia (NP) vastaan ​​(kuvio 3B). Kp/Ec/SalOMV-esikäsittely esti IAV:n replikaation ja NP-positiivinen alue pieneni merkittävästi (kuvio 3C). Tätä ei voitu havaita LpOMV/SpMV-esikäsittelyn jälkeen. Sen tutkimiseksi, riittääkö Mx1-induktio havaittuun estyneeseen IAV-replikaatioon, Mx1 yli-ilmennettiin (sukupuoli) vakaasti THP-1-makrofageissa OMV-esistimulaation matkimiseksi (Lisätiedosto 1: Kuva S5E). Mx1oex-solujen IAV-infektio johti immunofluoresoivan NP-positiivisen alueen pienenemiseen 4 h pi (kuva 3D) ja viruksen replikaation vähenemiseen 6 h pi verrattuna tyhjään vektorikontrolliin (VC) (kuva 3E), vaikkakin pienempään. OMV-esistimulaatioon verrattuna (kuvio 3A). Yhteenvetona voidaan todeta, että Kp/Ec/SalOMV aktivoi makrofageja klassisella tulehdusta edistävällä tavalla ja indusoi antiviraalisia geenejä, mikä johti IFN-/-reseptorin (IFNAR) aktivaatioon, STAT1:n alavirran fosforylaatioon ja Mx1:n ekspressioon, mikä voi suoraan häiritä IAV:n replikaatiota ( Kuva 4A). JAK/STAT-signaloinnin tärkeyden vahvistamiseksi havaitulle antiviraalisen vasteen induktiolle käytettiin JAK-inhibiittoria (JAKi) ennen vesikkelistimulaatiota. JAK-inhibitio ei muuttanut Kp/SalOMV-indusoitua CXCL8-ilmentymistä (kuvio 4B), mutta vähensi merkittävästi Mx1:tä mRNA:ssa (kuvio 4C) ja proteiinitasoa jopa IAV-infektion jälkeen (kuvio 4D ja lisätiedosto 1: S6A). Vastaavasti JAKi käänsi OMV:n indusoiman viruksen replikaation eston (kuvio 4E).

Kuva 3 Mx1-indusoivat OMV:t estävät influenssa A -viruksen replikaation THP-1-soluissa. Influenssa A -viruksen replikaatio erilaistuneissa THP-1-soluissa. Solut joko esikäsiteltiin OMV:illä/MV:illä (kukin 1 µg/ml) tai jätettiin käsittelemättä kontrollia varten (–). 20 tunnin esikäsittelyn jälkeen solut infektoitiin A/WSN/33(H1N1):llä (MOI 0.001) 24 ja 48 tunnin ajan. IAV:n replikaatio määritettiin qPCR:llä 18S:ksi normalisoitua IAV-NP:tä vastaan. Kolmesta viiteen riippumattoman kokeen keskiarvot ± SEM esitetään. B Erilaistuneita THP-1-soluja esikäsiteltiin OMV:illä/MV:illä (kukin 1 µg/ml) tai jätettiin käsittelemättä kontrollia varten (–). 20 tunnin esi-inkuboinnin jälkeen solut infektoitiin A/WSN/33(H1N1):llä (MOI 0,1) 4 tunnin ajan. Kiinnittämisen jälkeen solut värjättiin -influenssa-NP-vasta-aineella (keltainen) ja DAPI:llä (sininen). Edustava tulos neljästä biologisesti riippumattomasta kokeesta esitetään. C NP-positiivisen (NP+) alueen kvantifiointi (B). Palkit edustavat neljän riippumattoman kokeen keskiarvoja + SEM. D THP-1-soluja, jotka yliekspressoivat stabiilisti Mx1:tä (Mx1oex) ja tyhjiä vektorikontrollisoluja (VC), infektoitiin influenssaviruksella A/WSN/33(H1N1) (MOI 0,1) 4 tunnin ajan. Kiinnityksen ja immunofluoresenssivärjäyksen jälkeen -influenssa NP:llä NP+-alue kvantifioitiin ja se on kuvattu suhteessa VC-soluihin. Palkit näyttävät neljän riippumattoman kokeen keskiarvot + SEM. E Mx1oex- ja VC-solut infektoitiin A/WSN/33(H1N1):llä (MOI 0,001) 6 tunnin ajan. Viruksen replikaatio määritettiin plakkimäärityksellä ja tulokset on kuvattu plakkia muodostavina yksikköinä (pfu) per ml. Palkit edustavat neljän riippumattoman kokeen keskiarvoja + SEM. Tilastot: 2-tapa-ANOVA (A), 1-tapa-ANOVA (C), pariton t-testi (D+E); *s<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; n=3–5

Antiviraalinen vaste OMV:lle on TLR4-TRIF-riippuvainen

Mukana olevan PRR:n ​​tunnistamiseksi kaupallisia immuuniagonisteja käytettiin yksinään tai yhdessä LPS:n kanssa matkimaan OMV:itä. Kuitenkaan peilattua Mx1-induktiota ei havaittu KpOMV:illa (Lisätiedosto 1: Kuva S7), mikä viittaa makrofagien differentiaaliseen ja pitkittyneeseen aktivaatioon OMV:iden toimesta niiden ligandikoostumuksen tai PRR:ien avaruudellisen esityksen vuoksi. Osallistuneet immuunireseptorit arvioitiin edelleen THP-1-reportterisoluilla NF-KB- ja IRF-signaloinnin suhteen (kuvio 5A). KpOMV-käsittelyn jälkeen THP-1-solut osoittivat merkittävästi lisääntynyttä Mx1-proteiinin ilmentymistä (kuva 5B ja lisätiedosto 1: S6B), joka hävisi TRIF-puutteellisissa (TRIF−/−) THP-1-soluissa ( Kuva 5B ja lisätiedosto 1: S6B). Sama havaittiin IRF-reportterin kohdalla (kuva 5C), kun taas NF-KB-reportteriaktivaatio ja CXCL8-induktio olivat korkeat sekä THP-1- että TRIF-/--soluissa stimulaation jälkeen (kuva 5D+E). STAT-riippuvainen IFIT1-, IFI44- ja Mx1-geenin ilmentyminen indusoitui KpOMV-stimulaatiolla THP-1-reportterisoluissa (kuvio 5E), kun taas se väheni merkittävästi yhtä stimuloiduissa TRIF-/--soluissa (kuvio 5E). Lisä-IAV-infektio esistimulaation jälkeen johti heikentyneeseen viruksen replikaatioon, kun taas TRIF-deleetio pelasti IAV-replikaation (kuvio 5F). Sen tutkimiseksi, herättävätkö KpOMV:t yleisen antiviraalisen vasteen makrofageissa, solut infektoitiin vesicular stomatitis -viruksella (VSV), joka replikoitui kontrollisoluissa, mutta estyi esikäsitellyissä KpOMV-soluissa ja voidaan pelastaa myös TRIF-deleetiolla (kuvio 1). 5G). Koska LPS:n tunnistaminen TLR4:n kautta on välttämätöntä endosytoosille ja TRIF-aktivaatiolle, OMV:n pinnalla oleva LPS neutralisoitui lipopeptidiantibiootilla Polymyxin B (PB), mikä johti 50 % vähentyneeseen Mx1-induktioon (kuvat 6A+B ja lisätiedosto 1). : S6C), mutta ei merkittävää eroa NF-KB-riippuvaisessa CXCL8-transkriptiossa (kuvio 6C). Viruksen replikaatio pelastettiin perustasolle KpOMV+PB-esistimulaatiolla (kuvio 6D). Koska PB:n LPS-tunnistuksen inhibitio ei riittänyt Mx1:n täydelliseen estämiseen, endotoksiinittomasta Clear colista (Cc) peräisin olevat OMV:t eristettiin ja niitä käytettiin esistimulaatioon. Cc ilmentää muuttunutta lipidi A:ta eikä voi indusoida aktivoitua TLR4/MD2-kompleksia [24]. CCOMV:t eivät indusoineet Mxl:tä (kuvio 6A+B ja lisätiedosto 1: S6C) eivätkä vähentäneet IAV:n replikaatiota makrofageissa (kuvio 6D). On hyvin tunnettua, että solunulkoisten rakkuloiden eristäminen differentiaalisen ultrasentrifugoinnin avulla johtaa kontaminanttien (esim. proteiinien tai bakteerisolujen lisäosien) eristykseen yhdessä rakkuloiden kanssa. MISEV2018-ohjeiden [25] mukaisesti avainkokeet toistettiin OMV:illä, jotka oli eristetty ultrasuodatuksen (UF) ja kokoekskluusiokromatografian (SEC) yhdistelmällä. THP-1-reportterisolujen stimulointi UF-SEC-puhdistetuilla KpOMV-soluilla johti Mx1:n (lisätiedosto 1: kuva S8A) ja IRF-reportterin (kuva S8B) induktioon, kun taas se katosi TRIF−/−-makrofageissa ( Lisätiedosto 1: kuva S8A+B). IAV:n replikaatio estettiin esikäsitellyissä KpOMV-soluissa ja pelastettiin TRIF-deleetion jälkeen (lisätiedosto 1: kuva S8C). KpOMV:t indusoivat NF-KB-reportteriaktiivisuutta solujen TRIF-tilasta riippumatta (lisätiedosto 1: kuva S8D).

Kuva 4 JAK-signaloinnin esto pelastaa influenssa A -viruksen replikaation makrofageissa. OMV aktivoi TRIF-IRF-signaloinnin makrofageissa, mikä puolestaan ​​indusoi IFN:n ilmentymistä ja vapautumista myöhemmän IFNAR-signaloinnin kanssa. IFNAR signaloi JAK/STAT:n kautta ja indusoi ISG:iden ilmentymistä, joista yksi on Mx1. Tämä johtaa IAV-replikaation estoon. B–E THP-1 -soluja esi-inkuboitiin 1 tunti 10 µM JAK-estäjän (JAKi) kanssa ennen OMV:iden (1 µg/ml; Kp/Sal) lisäämistä 2{{22 ajan }} h. B–C CXCL8:n (B) ja Mx1:n (C) ilmentyminen määritettiin qPCR:llä ja tulokset normalisoidaan RPS18:aan ja kuvataan suhteessa käsittelemättömään kontrolliin. Palkit näyttävät kolmen tai neljän riippumattoman kokeen keskiarvot + SEM. D+E OMV:llä esikäsitellyt solut infektoitiin lisäksi IAV:lla (MOI 0,001). D Western blot osoittaa Mx1-proteiinin ilmentymisen 0–3 tuntia infektion jälkeen (pi). E Viruksen replikaatio määritettiin plakkimäärityksellä 24 tuntia infektion jälkeen. Palkit näyttävät neljän riippumattoman kokeen keskiarvot + SEM. Tilastot: 1-tapa ANOVA (B+C+E); *s<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001; *compared to DMSO control, # as depicted in the graph; ns=not significant; n=4

Kuvio 5 OMV:t indusoivat antiviraalista signalointia makrofageissa TRIF:n kautta. THP-1 Kaksoisreportterisolut indusoivat erittyneen alkion alkalisen fosfataasin (SEAP) ilmentymisen NF-KB-reitin aktivoitumisen jälkeen ja Lucia-lusiferaasin ilmentymisen ja erittymisen IRF-reitin aktivoituessa. Lisäksi TRIF (harmaat palkit) erotettiin ja sen jälkeen stimuloitiin -/- soluilla, joilla on stabiili TRIF-adapterimolekyylin poisto. (BF) THP-1-reportterisolut (=kaksoisviivat; mustat palkit) ja TRIF−/−-solut KpOMV (1 µg/ml) 20 tunnin ajan tai jätetty käsittelemättä kontrolliksi. Ilmoitetun ajan jälkeen supernatantti, RNA ja/tai proteiinit kerättiin. B Edustava Western Blot -kuva Mx1-proteiinin ilmentymisestä. C+D Lucia-reportteriaktiivisuus (C) ja SEAP-reportteriaktiivisuus (D) määritettiin soluviljelmän supernatantista. Samaa supernatanttia käytettiin molempien raportoijien aktiivisuuden määrittämiseen. E Suhteellinen mRNA:n ilmentyminen STAT- ja NF-KB-riippuvaisille kohdegeeneille (ylhäältä alas: IFIT1, IFI44, Mx1, CXCL8) määritettiin qPCR:llä ja tulokset normalisoidaan RPS18:aan ja kuvataan suhteessa stimuloimattomaan kaksoiskontrolliin. Taittomuutokset muutettiin log2. Solut infektoitiin lisäksi A/WSN/33(H1N1):llä (MOI 0.1) 24 tunnin ajan (F) tai VSV:llä (MOI 0.1) 12 tunnin ajan (G). Viruksen replikaatio määritettiin plakkimäärityksellä. Palkit näyttävät neljän (C-F) - viiden (G) riippumattoman kokeen keskiarvot + SEM. Tilastot: 2-tapa ANOVA (C–G); *s<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; * compared to unstimulated Dual control, # as depicted in the graph; ns=not signifcant; n=4–5

Kuvio 6 OMV-indusoitu Mx1-ilmentyminen katoaa LPS:n estämisen jälkeen. THP-1-soluja inkuboitiin 20 tuntia OMV:iden (1 µg/ml; Kp tai Clear coli (Cc)) kanssa yksin tai yhdessä 20 µg/ml polymyksiini B:n (PB) kanssa tai jätettiin käsittelemättä. valvontaa varten. Mx1-proteiinin ilmentyminen määritettiin Western Blotilla. Edustava tulos kolmesta biologisesti riippumattomasta kokeesta esitetään. Mx1 B:n ja CXCL8 C:n ilmentyminen määritettiin qPCR:llä. Palkit näyttävät neljän riippumattoman kokeen keskiarvot + SEM. D THP-1-soluja inkuboitiin 20 tuntia OMV:iden (1 µg/ml; Kp tai Cc) kanssa yksin tai yhdessä 20 µg/ml PB:n kanssa tai jätettiin käsittelemättä kontrollia varten ja sitten infektoitiin lisäksi A/WSN/33:lla. (H1N1) (MOI 0,001). Viruksen replikaatio määritettiin plakkimäärityksellä 24 tuntia infektion jälkeen. Palkit näyttävät neljän riippumattoman kokeen keskiarvot + SEM. Tilastot: 1-tapa ANOVA B–D; *s<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; *compared to control, #compared to KpOMV; ns=not significant; n=3–4

OMV:iden IAV:n replikaatiota estävä vaikutus on siirrettävissä AEC:ihin

Koska makrofagit eivät ole pääsolutyyppi IAV:n replikaatiolle keuhkoissa ja koska IFN I toimii myös parakriinisesti, IAV:n replikaatiovaikutuksen siirrettävyys AEC:ihin testattiin, koska nämä solut, toisin kuin makrofagit, eivät reagoi suoraan OMV:ihin/MV:ihin ( Lisätiedosto 1: kuva S9). Supernatantti (SN) KpOMV-käsitellyistä makrofageista indusoi Mxl:n A549-soluissa, toisin kuin LpOMV-SN (kuvio 7A), kun taas CXCL8 indusoitiin molempien jälkeen (kuvio 7B). KpOMVSN vähensi viruksen replikaatiota (kuvio 7C), mikä oli linjassa makrofaagikokeiden ja Mx1-induktiomallin kanssa. Vahvistaakseen havaitun IAV:ta rajoittavan vaikutuksen riippuvuuden JAK/STAT-signalointiin, KpOMV-SN yhdistettiin JAKi:n kanssa, estäen Mx1-induktion KpOMV-SN-hoidossa (kuvio 7A) ja palauttaen IAV-replikaation (kuvio 7C). Immuuniprosessien monimutkaisen säätelyn jäljittelemiseksi keuhkoissa perustettiin ihmisen tarkkuusleikattujen keuhkoviipaleiden (PCLS) ex vivo IAV-infektio. Lp/KpOMV:t eivät olleet sytotoksisia PCLS:lle (kuvio 8A), ja OMV-esistimulaation ja IAV-infektion yhdistelmä johti Mx1-induktioon (kuvio 8B) ja CXCL10:n vapautumiseen (kuvio 8C). KpOMV:t mutta eivät LpOMV:t vähensivät merkittävästi IAV:n replikaatiota PCLS:ssä (kuvio 8D). Havaitut vaikutukset poistuivat infektiosta UV-inaktivoidulla IAV:lla (kuvat 8A-C). Löytömme johtavat keuhkotulehduksen malliin, jossa AM:t reagoivat gramnegatiivisten bakteerien OMV:iin indusoimalla IFN I:tä, indusoiden antiviraalisia vasteita autokriinisesti AM:issä ja parakriinisesti AEC:issä in vitro ja ex vivo PCLS-mallissa. (kuvio 8E).

Kuva 7 OMV:iden influenssa A -viruksen replikaatiota estävä vaikutus on siirrettävissä AEC:ihin. THP-1-soluja inkuboitiin LpOMV:n tai KpOMV:n kanssa 20 tuntia tai jätettiin käsittelemättä kontrollia varten. Supernatantti (SN) steriilisuodatettiin ja sitä käytettiin A549-solujen esistimulaatioon 20 tunnin ajan yksin tai yhdessä 10 uM JAKi:n kanssa. A+B Mx1 (A) ja CXCL8 B:n ilmentyminen määritettiin qPCR:llä infektion ajankohtana (0 h pi). Pylväät osoittavat neljän riippumattoman kokeen keskiarvot + SEM normalisoituna käsittelemättömiin kontrollisoluihin. C Esikäsitellyt A549-solut infektoitiin lisäksi influenssaviruksella A/Hamburg/5/2009(H1N1pdm) (MOI 0,01) 24 tunnin ajan. Viruksen replikaatio määritettiin plakkimäärityksellä. Palkit ovat neljän riippumattoman kokeen + SEM keskiarvoja. Tilastot: 1-tapa ANOVA; **s<0.01, ****p<0.0001; * compared to control-SN; # compared to KpOMV-SN; n=4

Keskustelu

Havaitsimme, että eri bakteerien vesikkelit indusoivat makrofageissa differentiaalista signalointia, joka pystyy rajoittamaan IAV:n replikaatiota myöhemmässä infektiossa. Kirjallisuuden mukaisesti eristetyt OMV:t Lp:stä, Kp:stä, Ec:stä ja Salista ja MV:t Sp:stä olivat kooltaan vertailukelpoisia [26–28]. Bakteerirakkuloiden kanssa inkuboidut makrofagit eivät osoittaneet sytotoksisuutta [29, 30], mutta ne aiheuttivat tulehdusta edistävän vasteen. Kaikki vesikkelit laukaisivat p38:n fosforylaation ja CXCL8:n ja IL-1:n vapautumisen primäärisistä ihmisen makrofageista, kun taas IFN I:n induktiossa ja niiden alavirran signaloinnissa oli eroja. Me ja muut osoitimme jo, että LpOMV-signaalit TLR2:n kautta [12, 22] ja myös SpMV:t indusoivat selkeän aktivaatiokuvion makrofageissa [31]. LpOMV:t/SpMV:t aktivoivat tulehdusta edistäviä NF-KB-kohdegeenejä, kuten on kuvattu alkuperäbakteerille [12, 22, 31]. Silti Kp/Ec/SalOMV:iden tunnistaminen provosoi NF-κB-kohdegeenien lisäksi IRF-3-fosforylaation indusoitumisen alavirran IFNB-ilmentymisellä ja STAT1:n pitkäkestoisen fosforylaation sekä ISG:iden induktion, mikä väitti aktiivisuutta. IFNAR-JAK/STAT-signalointi. OMV:t kantavat LPS:ää pinnallaan, mutta OMV:iden tulehdusta edistävää kapasiteettia ei voitu jäljitellä puhtaalla LPS:llä. Me ja muut havaitsimme, että makrofagit ovat herkempiä OMV:ille verrattuna samaan määrään puhdasta LPS:ää [32, 33]. OMV:t sisältävät joukon immuuniagonisteja, joita tarvitaan vahvan immuunivasteen indusoimiseen [32]. Kaupalliset TLR- ja RIG-I-agonistit eivät yksinään tai yhdessä LPS:n kanssa kyenneet jäljittelemään vaikutusta. Aiemmin osoitettiin, että LPS:llä ladatut liposomit indusoivat TRIF-IRF-3:n pidempään aktivoitumista makrofageissa verrattuna vapaaseen LPS:ään [34]. Käyttämällä TRIF-/- makrofageja osoitimme ISG-induktion riippuvuuden tästä adapterimolekyylistä. Lisäksi endotoksiinittomat CCOMV:t tai OMV:t yhdistettynä LPSmasking PB:hen olivat riittäviä kumoamaan makrofagien vasteen. Tämä osoittaa OMV:iden tunnistamisen TLR4:n kautta ja sitä seuraavaa endosytoosia ja TRIF-signalointia. Vastaavasti Kp/Ec/SalOMV:t pystyivät indusoimaan makrofagien tulehdusta edistävän aktivaation TLR4:n kautta, mikä johti MyD88-signalointiin ja NF-KB-riippuvaiseen geeniekspressioon sekä TRIF-signalointiin IFN I-vasteella. Tämä on linjassa kirjallisuuden kanssa, joka osoittaa, että TLR4 ja TRIF yhdessä tarvitaan Neisseria meningitidis OMV:iden immunogeenisyyteen hiirillä [35]. Koska tyypin I IFN:t ovat antiviraalisten vasteiden pääsäätelijöitä, oletimme, että Kp/Ec/SalOMV:iden tunnistaminen vaikuttaa IAV:n replikaatioon. Osoitimme, että makrofagit estivät tehokkaasti IAV- ja VSV-replikaation TRIF-aktivoivan OMV-esikäsittelyn jälkeen, kun taas TRIF-/- pelasti viruksen replikaation. IFNAR-signalointiin kohdistuvan vaikutuksen määrittämiseksi JAK1/2:n esto yhdistettynä OMV:iin esti onnistuneesti STAT1-riippuvaisen Mx1-induktion ja pelasti viruksen replikaation makrofageissa. KpOMV:iden yhdistelmä PB:n kanssa tai endotoksiinittomien CCOMV:iden käyttö ei vähentänyt IAV:n replikaatiota makrofageissa, koska ne eivät kyenneet indusoimaan antiviraalisia geenejä. Koska ultrasentrifugoinnilla saadut solunulkoiset vesikkelivalmisteet sisältävät rakkuloiden rinnalla vapaita proteiini- ja bakteerisoluliitoksia, OMV-valmisteita tuotettiin lisäksi ultrasuodatuksen ja kokoekskluusiokromatografian yhdistelmällä [25].

Kiinan yrtti cistanche kasvi-Antitumor

Saadut puhtaat vesikkelivalmisteet pystyivät yhtä lailla indusoimaan TRIF-IRF-signalointia alavirran Mx1-induktiolla ja estivät viruksen replikaation väittäen suoraa vesikkelivaikutusta. Vaikka pankkiautomaatit ovat ensimmäinen puolustuslinja keuhkoissa, suurin osa IAV-infektiosta ja replikaatiosta ihmisen keuhkoissa tapahtuu AEC:issä [36]. Siksi AEC:itä stimuloitiin OMV:illä, mutta ne eivät reagoineet stimulaatioon kuten makrofagit. Vain keuhkoputken epiteelisolulinja BEAS2B vastasi CXCL8-ilmentymiseen, mutta siitä puuttui Mx1-induktio. Koska pystyimme osoittamaan TLR4:stä ja TRIF:stä riippuvan antiviraalisen geenin ilmentymisen makrofageissa, oletamme, että neljä testattua epiteelisolulinjaa eivät ekspressoi TLR4:ää samassa määrin kuin makrofagit ja että ne eivät pystyneet endosytoosiin OMV:itä TLR4-aktivaation jälkeen. Tämä on sopusoinnussa kirjallisuuden kanssa, joka osoittaa, että eristetyt ihmisen AEC:t eivät reagoi LPS:ään kuten parilliset AM:t [37]. Kun liitimme antiviraalisen tilan OMV-esi-inkuboinnin yhteydessä IFN I:hen, käytimme OMV-stimuloitujen makrofagien supernatanttia AEC:iden esistimulaatioon. KpOMV-stimuloitujen makrofagien vakioitu väliaine, toisin kuin suora vesikkelistimulaatio, indusoi Mx1-ekspression näissä soluissa ja vähensi IAV-replikaatiota myöhemmissä infektiokokeissa. Supernatantti LpOMV-käsitellyistä makrofageista indusoi CXCL8:n epiteelisoluissa, mutta ei aiheuttanut Mx1-induktiota eikä muutoksia viruksen replikaatiossa. Käsitellyllä väliaineella havaitun vaikutuksen antamiseksi IFN I:lle supernatantti yhdistettiin JAK1/2-inhibiittoriin, joka esti Mx1-induktion, eikä sillä ollut vaikutusta viruksen replikaatioon. Koska eri solutyyppien vuorovaikutus ihmisen keuhkoissa on monimutkaisempaa, eikä sitä voida täysin jäljitellä ilmastoiduilla väliaineilla, laajensimme lähestymistapaamme ihmisen distaalisen keuhkokudoksen elinkelpoisiin osiin, joita on käytetty laajalti isännän ja patogeenin vuorovaikutuksia koskevissa tutkimuksissa, mukaan lukien influenssavirus ja bakteeri-infektiot [38–41]. Käytettyjen in vitro -mallien vastakohtana ihmisen ex vivo -keuhkokudos säilyttää keuhkojen kolmiulotteisen arkkitehtuurin ja mahdollistaa fysiologisen vuorovaikutuksen keuhkoissa olevien solutyyppien välillä, mutta siitä puuttuu mahdollisuus uusien rekrytoitujen immuunisolujen sisäänvirtaukseen. KpOMV-stimuloidun PCLS:n peräkkäinen infektio IAV:lla vähensi viruskuormaa verrattuna esikäsittelemättömiin kontrolleihin. Koska kaikki in vitro testatut AEC:t eivät reagoineet suoraan bakteerivesikkelistimulaatioon, oletamme, että tässä ex vivo -mallissa AM:t ovat hallitseva reagoiva solutyyppi. Koska myöhempään infektioon valittiin influenssaisolaatti, joka saastuttaa ja replikoituu yksinomaan AEC:issä, voidaan olettaa, että kyseessä on parakriininen antiviraalinen vaikutus, joka on peräisin AM:istä ja siirtyy AEC:ihin. Tässä saatujen tietojen perusteella ehdotamme seuraavaa mallia (kuva 8E): Gram-negatiivisten bakteerien OMV:t voivat aktivoida ihmisen makrofageja klassisella tulehdusta edistävällä tavalla ja antiviraalisesti pohjustaa niitä TLR4:n ja TRIF:n kautta onnistuneen endosytoosin jälkeen. rakkuloita. IFN I:n vapautuminen voi puolestaan ​​tehdä makrofageista ja/tai AEC:istä antiviraalisia IFNAR- ja JAK/STAT-signaloinnin kautta. Näiden solujen myöhempi infektio aiheuttaa Mx{31}}välitteisen viruskuorman vähenemisen. Koska meillä ei ollut pääsyä ensisijaisiin ihmisen AM:ihin, kokeet suoritettiin käyttämällä ihmisen BDM:itä mallina. Kun otetaan huomioon näiden makrofagien erilainen kehitysalkuperä ja pohjustus, on mahdollista, että AM:t olisivat osoittaneet heikompaa tulehdusta edistävää vastetta toisin kuin BDM: t. Bakteerivesikkelejä käytetään jo rokotusstrategioissa erilaisia ​​keuhkokuumeen aiheuttavia patogeenejä vastaan ​​(katso [42]). Näin ollen OMV:t eivät ole vain työkalu mahdollisille systeemisille rokotusstrategioille isäntäbakteerejaan vastaan, vaan niitä voitaisiin myös käyttää paikallisesti virusinfektioiden torjumiseen aktivoimalla paikallisia synnynnäisiä immuunisoluja. Tulevia in vivo -tutkimuksia tarvitaan sen testaamiseksi, voidaanko näitä in vitro -löydöksiä soveltaa muihin viruspatogeeneihin. Lisäksi on huomattava, että mahdollisesti esiintyvää endotoksista vastetta on seurattava kriittisesti, jotta vältetään liioitellut immuunivasteet in vivo. Tyypin I IFN:n induktiota on valvottava tiukasti, sillä terveillä henkilöillä osoitettiin, että TLR7-agonistin inhalaatio oli alun perin hyvin siedetty ensimmäisen annoksen jälkeen, mutta johti lisääntyneeseen TNF- ja IFN I -vasteeseen ja influenssan kaltaisiin oireisiin. , toisen annoksen jälkeen [43]. Haitallisten vaikutusten torjumiseksi saatetaan tarvita geneettisesti muunneltuja OMV-versioita, jotka saavat aikaan tasapainoisen immuunivasteen ja saavuttavat hyvän sovellettavuuden. Yhdessä esittelemme tässä mallin siitä, kuinka OMV:t voivat indusoida antiviraalista signalointia ihmisen makrofageissa ja kuinka tätä voidaan käyttää estämään IAV:n replikaation.

Kuva 8 KpOMV vähentää influenssa A -viruksen replikaatiota ihmisen tarkasti leikatuissa keuhkoviipaleissa. Ihmisen PCLS:ää inkuboitiin 1 µg/ml OMV:n (Lp/Kp) kanssa 20 tuntia ja infektoitiin sitten lisäksi influenssa A/California/04/2009 (H1N1pdm) 48 tunnin ajan. Viruksen UV-inaktivointi toimi kontrollina. Sytotoksisuus määritettiin kvantifioimalla PCLS:stä vapautunut LDH, ja se esitetään prosentteina kokonaishajoamiseen verrattuna. B Mx1:n ilmentyminen kvantifioitiin qPCR:llä ja se esitetään suhteessa RPS18:aan ja käsittelemättömään kontrolli-PCLS:ään. C CXCL10:n vapautuminen määritettiin ELISA:lla ja se on esitetty yksikkönä ng/ml. D Viruksen replikaatio määritettiin plakkimäärityksellä, ja se esitetään yksikössä pfu/ml. Palkit näyttävät keskiarvot kolmesta viiteen biologisen toiston + SEM. E Ehdotettu malli OMV:iden antiviraalisen immuniteetin induktiolle keuhkoissa. Tilastot: 1-tapa-ANOVA (AC), Friedman-testi (D); *s<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001; * compared to IAV infected, but not pre-treated PCLS, # as depicted in the graph; ns=not significant; n=5

Viitteet

1. Kulp A, Kuehn MJ. Erittyneiden bakteerien ulkokalvorakkuloiden biologiset toiminnot ja biogeneesi. Annu Rev Microbiol. 2010;64:163–84.

2. Ellis TN, Kuehn MJ. Bakteerien ulkokalvorakkuloiden virulenssi ja immunomodulatoriset roolit. Microbiol Mol Biol Rev. 2010;74(1):81–94.

3. Giordano NP, Cian MB, Dalebroux ZD. Ulkokalvon lipidien eritys ja synnynnäinen immuunivaste gramnegatiivisia bakteereja vastaan. Infektoi immuuni. 2020. https://doi.org/10.1128/IAI.{5}}.

4. Mancini F, et ai. OMV-rokotteet ja TLR-agonistien rooli immuunivasteessa. Int J Mol Sei. 2020. https://doi.org/10.3390/ijms21124416.

5. Hu G, Christman JW. Pääkirjoitus: alveolaariset makrofagit keuhkojen tulehduksessa ja erottelussa. Front Immunol. 2019; 10:2275.

6. Grassin-Delyle S, et ai. Maksun kaltaisten reseptorien rooli ihmisen keuhkojen makrofagien sytokiinien tuotannossa. J Inte Immun. 2020;12(1):63–73.

7. Influenssa (kausiluonteinen) tietosivu. 2018; https://www.who.int/news-room/ fact-sheets/detail/influenza-(kausiluonteinen)

8. Crotta S, et ai. Tyypin I ja tyypin III interferonit ohjaavat redundantteja monistussilmukoita indusoidakseen transkription allekirjoituksen influenssa-infektoituneessa hengitysteiden epiteelissä. PLoS Patog. 2013;9(11): e1003773.

9. Bals R, Hiemstra PS. Keuhkojen synnynnäinen immuniteetti: kuinka epiteelisolut taistelevat hengitysteiden patogeenejä vastaan. Eur Respir J. 2004;23(2):327–33.

10. Helft J, et ai. Ristikkäin esiintyvät CD103+-dendriittisolut ovat suojattuja influenssavirusinfektiolta. J Clin Invest. 2012;122(11):4037–47.

11. Ghoneim HE, Thomas PG, McCullers JA. Alveolaaristen makrofagien ehtyminen influenssainfektion aikana helpottaa bakteerien superinfektioita. J Immunol. 2013;191(3):1250–9.

12. Jung AL, et ai. Legionella pneumophila -peräiset ulkokalvovesikkelit edistävät bakteerien replikaatiota makrofageissa. PLoS Patog. 2016;12(4): e1005592.

13. Lindhauer NS, et ai. Tribolium castaneum defensinin antibakteerinen vaikutus Streptococcus pneumoniaen in vitro -infektiomallissa. Virulenssi. 2019;10(1):902–9.

14. Danov O, et ai. Tupakansavu vaikuttaa dendriittisolupopulaatioihin, epiteelin estetoimintoon ja immuunivasteeseen H1N1-virusinfektiolle. Front Med. 2020. https://doi.org/10.3389/fmed.2020.571003.

15. Matrosovich M, et ai. Uusi matalaviskositeettinen peittoalusta virusplakkimäärityksiin. Virol J. 2006;3:63. 16. Neuhaus V, et ai. Aineiden sytotoksisten ja immunomoduloivien vaikutusten arviointi ihmisen tarkkuusleikatuissa keuhkoviipaleissa. J Vis Exp. 2018. https://doi.org/10.3791/57042. 17. Niehof M, et ai. RNA:n eristäminen eri lajien tarkkuusleikatuista keuhkoviipaleista (PCLS). BMC Res Notes. 2017;10(1):121.

18. Schulz C, et ai. THP-1-peräiset makrofagit tekevät keuhkojen epiteelisoluista hyporesponsiivisia Legionella pneumophila -systeemibiologiselle tutkimukselle. Sci Rep. 2017;7(1):11988.

19. Livak KJ, Schmittgen TD. Suhteellisten geeniekspressiotietojen analyysi käyttäen reaaliaikaista kvantitatiivista PCR:ää ja 2(-Delta Delta C(T)) -menetelmää. menetelmät. 2001;25(4):402–8. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262.

20. Haller O, et ai. Mx GTPaasit: dynamiinin kaltaiset synnynnäisen immuniteetin antiviraaliset koneet. Trends Microbiol. 2015;23(3):154–63. 21. Anastasia M, et ai. Influenssa A/WSN/1933(H1N1) -viruksen NS1-proteiinin C-pää moduloi antiviraalisia vasteita infektoituneissa ihmisen makrofageissa ja hiirissä. J Gen Virol. 2015;96(8):2086–91.

22. Jager J, et ai. Legionella pneumophilan ulkokalvorakkuloiden fuusio eukaryoottisten kalvojärjestelmien kanssa on mekanismi patogeenitekijöiden kuljettamiseksi isäntäsolukalvoille. Cell Microbiol. 2015;17(5):607–20.

23. Lammers AJ, et ai. TLR2:n rooli isännän vasteessa pneumokokkikeuhkokuumeeseen pernan puuttuessa. BMC Infect Dis. 2012. https://doi. org/10.1186/1471-2334-12-139.

24. Mamat U, et ai. Endotoksiiniton proteiinituotanto – ClearColi™-tekniikka. Nat Methods. 2013; 10:916.

25. Théry C, et ai. Vähimmäistietoa solunulkoisten rakkuloiden tutkimuksiin 2018 (MISEV2018): International Society for Extracellular Vesicles -järjestön kannanotto ja päivitys MISEV2014-ohjeisiin. J Extracell rakkulat. 2018;7(1):1535750. https://doi.org/10.1080/20013078.2018. 1535750. 26. Bonnington KE, Kuehn MJ. Ulkokalvorakkuloiden tuotanto helpottaa lps:n uusiutumista ja ulkokalvon ylläpitoa salmonellassa ympäristömuutosten aikana. MBio. 2016. https://doi.org/10.1128/mBio. 01532-16.

27. Jasim R, et ai. Ulkokalvorakkuloiden lipidominen analyysi polymyksiinille herkistä ja resistenteistä kliinisistä klebsiella pneumoniae -isolaateista. Int J Mol Sei. 2018. https://doi.org/10.3390/ijms19082356.

28. Olaya-Abril A, et ai. Streptococcus pneumoniaen tuottamien suojaavien ekstrasellulaarisista kalvoista peräisin olevien vesikkeleiden karakterisointi. J Proteomiikka. 2014; 106:46–60.

29. Kuhn T, Koch M, Fuhrmann G. Probiomimetics-uudet lactobacillus-mimicking mikropartikkelit osoittavat anti-inflammatorisia ja esteitä suojaavia vaikutuksia ruoansulatuskanavan malleissa. Pieni. 2020;16(40): e2003158.

30. Mehanny M, et ai. Immuunisolut sisäistävät nopeasti streptokokkien solunulkoiset kalvovesikkelit ja muuttavat niiden sytokiinin vapautumista. Front Immunol. 2020; 11:80.

31. Volgers C, et ai. THP-1-makrofagien ja hengitysteiden patogeenien makrofagiinfektion aikana vapauttamien kalvorakkuloiden immunomoduloiva rooli. BMC Microbiol. 2017;17(1):216.

32. Ellis TN, Leiman SA, Kuehn MJ. Luonnollisesti tuotetut Pseudomonas aeruginosan ulkomembraanirakkulat saavat aikaan voimakkaan synnynnäisen immuunivasteen sekä lipopolysakkaridi- että proteiinikomponenttien yhdistetyn tunnistamisen kautta. Infektoi immuuni. 2010;78(9):3822–31.

33. Alaniz RC, et ai. Kalvovesikkelit ovat Salmonella typhimuriumin immunogeenisiä faksimilejä, jotka aktivoivat tehokkaasti dendriittisoluja, käynnistävät B- ja T-soluvasteita ja stimuloivat suojaavaa immuniteettia in vivo. J Immunol. 2007;179(11):7692–701.

34. Watanabe S, Kumazawa Y, Inoue J. Liposomaalinen lipopolysakkaridi aloittaa TRIF-riippuvaisen signalointireitin CD14:stä riippumattomana. PLoS ONE. 2013;8(4): e60078.

35. Fransen F, et ai. TLR2:n ja TLR4:n erilainen vaikutus immuunivasteeseen Neisseria meningitidis- tai Bordetella pertussis -bakteerin vastaisella rokotteella immunisoinnin jälkeen. PLoS ONE. 2010;5(12): e15692.

36. Travanty E, et ai. Ihmisen keuhkojen primaarisolujen erilaiset herkkyydet H1N1-influenssaviruksille. J Virol. 2015;89(23):11935–44.

37. Mubarak RA, et ai. Pro- ja anti-inflammatoristen vasteiden vertailu ihmisen primaarisissa hengitysteiden epiteelisoluissa ja alveolaarisissa makrofageissa. Respir Res. 2018;19(1):126.

38. Wu W, et ai. Luontainen immuunivaste H3N2- ja H1N1-influenssavirusinfektiolle ihmisen keuhkojen elinviljelymallissa. Virologia. 2010; 396(2):178–88.

39. Wu W, et ai. Influenssa A(H1N1)pdm09-virus suppressoi RIG-I:n aiheuttamia synnynnäisiä antiviraalisia vasteita ihmisen keuhkoissa. PLoS ONE. 2012;7(11): e49856.

40. Delgado-Ortega M, et ai. Luontainen immuunivaste H3N2-alatyypin sikainfluenssavirukselle vastasyntyneen sian henkitorven soluissa, alveolaarisissa makrofageissa ja tarkasti leikatuissa keuhkoviipaleissa. Vet Res. 2014; 45:42.

41. Kolbe U, et ai. Varhainen sytokiinien induktio pseudomonas aeruginosa -infektiossa hiiren tarkasti leikatuissa keuhkoviipaleissa riippuu bakteerien elinkelpoisuuden havaitsemisesta. Front Immunol. 2020. https://doi.org/10.3389/fmmu. 2020.598636.

42. Jung AL, et ai. Isäntä- ja bakteeriperäisten ekstrasellulaaristen rakkuloiden kliininen rooli keuhkokuumeessa. Adv Drug Deliv Rev. 2021. https://doi.org/10. 1016/j.addr.2021.05.021.

43. Delaney S, et ai. Siedettävyys ihmisillä selektiivisen TLR7-agonistin AZD8848 inhalaatioannoksen jälkeen. BMJ Open Respir Res. 2016;3(1): e000113.