Monet tutkimukset ovat vahvistaneet, että allergiset sairaudet eivät ole seurausta vain synnynnäisestä immuunijärjestelmän aktivoinnista 2

Ota yhteyttäoscar.xiao@wecistanche.comLisätietoja

3. Keskustelu

Atooppisen dermatiitin (AD) patogeneesiä ei täysin ymmärretä, mutta sairautta välittää epänormaali immuuniglobuliini E (IgE) -immuunivaste ihon esteen toimintahäiriössä. Näistä syöttösolut (MC) voivat aiheuttaa IgE-välitteisiä allergisia sairauksia, mukaan lukien AD. Kun syöttösolut aktivoituvat, ne vapauttavat kalvoon sitoutuneita sytoplasmisia hiukkasia, mikä johtaa useiden molekyylien vapautumiseen. Näillä molekyyleillä on tärkeä rooli AD:n patogeneesissä ja isännän puolustuksessa [27]. Koska syöttösolujen aktivoitumisen tai degranulaation estäminen auttaa säätelemään erilaisia ​​IgE-välitteisiä yliherkkyysreaktioita, syöttösolut ovat ihanteellisia kohteita allergialääkkeiden tutkimiselle. Tutkimuksessamme syöttösolut degranuloituvat vasteena yhdisteelle 48/80 ja kalsiumionoforille A23187 sekä anti-DNP/IgE plus DNP/HSA:lle. Havaitsimme, että viite esti tehokkaasti syöttösolujen degranulaatiovaikutusta osoittaen sen antiallergista reaktiota. Lisäksi solunsisäisen kalsiumin lisääntyminen ja MAPK:n aktivaatio estettiin referenssinä. Lisäksi DNCB:n aiheuttama ihon syöttösolujen tunkeutuminen ja yhdisteen 48/80 aiheuttama naarmuuntumiskäyttäytyminen vähenivät. Siksi neferiinin anti-atooppisen dermatiitin mekanismilla on kerrannaisvaikutus keratinosyytteihin ja syöttösoluihin.

La patogenia de la dermatitis atópica (DA) no se comprende por completo, pero la enfermedad está mediada por una respuesta inmunitaria anormal de la inmunoglobulina E (IgE) en la disfunción de la barrera cutánea. Entre ellos, los mastocitos (MC) pueden causar enfermedades alérgicas mediadas por IgE, mukaan lukien EA. Cuando los mastocitos se activan, liberan sus partículas citoplásmicas unidas a la membrana, lo que lleva a la liberación de una variedad de moléculas. Estas moléculas juegan un papel tärkeäe en la patogénesis de la EA y la defensa del huésped [27]. Debido a que la inhibición de la activación o desgranulación de los mastocitos ayuda a säännöllisesti varias reacciones de hipersensibilidad mediadas por IgE, los mastocitos son uno de los objetivos ideales para explorar fármacos antialérgicos. En nuestro estudio, los mastocitos se desgranulan en respuesta al compuesto 48/80 y al ionóforo de calcio A23187, y anti-DNP/IgE plus DNP/HSA. Encontramos que la referencia inhibió efectivamente el efecto de desgranulación de los mastocitos, mostrando su reacción antialérgica. Además, el aumento de calcio intracelular y la activación de MAPK fueron inhibidos por referencia. Además, también se redujeron la infiltración de mastocitos en la piel causada por DNCB y el Comportamiento de rascado causado por el compuesto 48/80. Por lo tanto, el mecanismo de la dermatitis antiatópica de la neferina tiene un efecto multiplicador sobre los queratinocitos y los mastocitos.

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja

Kudoksissa esiintyvien syöttösolujen sytoplasma on täynnä suuria, tiheitä ennalta muodostuneiden tulehdusvälittäjien hiukkasia[28]. Prosessia, jossa nämä välittäjäaineet vapautuvat syöttösoluissa olevista eritysrakeista, kutsutaan degranulaatioksi. Koska syöttösolujen degranulaation estäminen voi säädellä erilaisia ​​IgE-välitteisiä yliherkkyysreaktioita, syöttösolut ovat ihanteellisia kohteita allergialääkkeiden tutkimiselle [29,30]. Tuloksemme osoittavat, että referenssillä on erittäin hyvä vaikutus syöttösolujen degranulaatioon riippumatta antigeenin, reseptoristimulaattorin tai ionoforin käytöstä. Tämä osoittaa, että referenssi on mahdollinen allergian vastainen aine (kuva 2).

MC-aktivaatioindikaattoreina voidaan käyttää kaikkia esivarastoituja rakeita, vasta syntetisoituja välittäjäaineita ja jopa rakeita ja niiden komponentteja [31]. Lisäksi standardimenetelmänä on solunsisäisen Ca4t-pitoisuuden mittaus. Useimmat laboratoriossa yleisesti käytetyistä MC-eritystä lisäävistä aineista (esim. antigeeni, yhdiste 48/80) aiheuttivat solunsisäisen Ca2 plus -pitoisuuden nousun. Itse asiassa solunsisäisen Ca2 plus -pitoisuuden kasvu voi myös laukaista MC-degranulaation. Yleensä solunsisäisen Ca4t:n kasvu indusoidaan aktivoimalla MC yhdisteillä, kuten thapsigarginilla (erityisesti estävät Sarco/endoplasmista Ca2 plus ATPaasi, SERCA) pumpuilla ja ionoforeilla (eli ionomysiini ja A23187) [32,33]. Siksi Ca2t-riippuvaisessa MC-aktivaatiossa Ca2t-virtauksen mittausta pidetään myös menetelmänä MC-aktivaatio-olosuhteiden määrittämiseksi. MC-tutkimuksessa Furaa{15}} käytetään laajalti solunsisäisten Ca2 plus -muutosten määrittämiseen. Kokeissamme havaitsimme, että aktivoitujen syöttösolujen fluoresenssin intensiteetti vaimeni merkittävästi sen jälkeen, kun niitä oli käsitelty referenssillä (kuvio 3). Aiemmat raportit osoittivat, että solunsisäisen Ca4t-pitoisuuden nousu oli histamiinin vapautumisen mukaista [34]. Tästä syystä päättelemme, että vertailukäsittely estää myös histamiinin vapautumisen. Lisäkokeita tarvitaan tämän hypoteesin vahvistamiseksi.

Mastsoluilla on merkittävästi erilaiset toiminnalliset lähdöt.cistanche annostus redditNäitä ovat degranulaatio, arakidonihapon esiasteiden muodostuminen, kemotaksis ja sytokiinien tuotanto, ja ne ovat kaikki jossain määrin riippuvaisia ​​kalsiumsignaaleista, riippumatta stimulanteista [32]Aktivoitunut MC vapauttaa sytokiinejä, jotka ovat allergioiden ja tulehdussairauksien pääasiallisia välittäjiä. 35]. Aktivoituneiden syöttösolujen sytokiinien tuotanto on seurausta sytokiinigeenin transkription induktiosta näissä soluissa. Syötösolujen stimulaatio johtaa NF-kB:n ja AP-1:n aktivoitumiseen ja monien sytokiinien tuotantoon [36]. MAPK-kaskadisignalointireiteillä on olennainen rooli sytokiinien ilmentymisen säätelyssä. Näiden reittien aktivaatio PKC:n aktivoitumisen kautta PI:n vaikutuksesta johtaa useiden geenien aktivoitumiseen, mukaan lukien tulehdukselliset sytokiinigeenit, kuten IL-1, IL-6 ja TNF [37]. Viimeaikaiset tutkimuksemme ovat osoittaneet, että viite voi estää keratinosyyttien aktivoitumisen aiheuttamia sytokiinejä. Samaan aikaan havaitsimme myös, että MAPK:n aktivoitumisreitti estää myös viitekäsittelyn [18]. Nykyisessä tutkimuksessamme osoitimme, että viittaus voi myös vähentää sytokiinien ilmentymistä estämällä MAPK-aktivaation syöttösoluissa (kuvat 4 ja 5). NFkB:n aktivaatio vähenee myös MAPK:n aktivaation inhibition vuoksi (kuvio 6).

Cistanche voi estää ikääntymistä

Useat tutkimukset ovat raportoineet, että useiden sytokiinien määrä AD-potilailla on kohonnut, mikä johtaa ihon esteen toimintahäiriöön, mukaan lukien keratinosyyttien ja Th{0}}peräisten sytokiinien erittämät sytokiinit [38,39]. Lisäksi on raportoitu, että nämä eritetyt sytokiinit voivat myös vaimentaa tiukan liitoksen (T]) proteiinien ja terminaalisen erilaistumisgeenien, mukaan lukien filaggriinin (FLG), lorikriinin (LOR) ja involukriinin (IVL) ilmentymistä [39,40 ](Pro)filaggriinin ilmentyminen vähenee AD:ssa ja liittyy käänteisesti MC-tryptaasiin ja IL:ään-6[41]. IL-1 välittää kroonista tulehdusta hiirillä, joiden ihoeste on heikentynyt [35]. Aiemmassa tutkimuksessa raportoitiin, että FLG:n, IVL:n ja LOR:n ilmentymät vähenivät DNCB:n levittämisen jälkeen NC/Nga-hiirten selän iholle [42,43]. Tässä tutkimuksessa FLG:n, IVL:n ja LOR:n ilmentymät vähenivät huomattavasti kontrolliryhmän selän ihossa, mikä osoitti, että epidermaalinen este oli heikentynyt. Vertailuaineen antaminen sai merkittävästi talteen vähentyneet FLG-, IVL- ja LOR-ekspressiot DNCB-hoidon jälkeen, kun taas viiteannos lisäsi hieman IVL- ja LOR-ilmentymiä kontrolliryhmään verrattuna (kuvio 8). Tiedetään, että yhdiste 48/80 on tehokas ihon syöttösolujen aktivaattori. Yhdisteen 48/80 stimuloima ihovaste voi aiheuttaa naarmuuntumiskäyttäytymistä vapauttamalla histamiinia syöttösoluista [44]. Aktivoiduista syöttösoluista vapautuvalla histamiinilla on tärkeä rooli yhdisteen 48/80 aiheuttamassa verisuonten läpäisevyyden lisääntymisessä. Ihmisen kutinassa huomioidaan myös syöttösoluista erilaisten ärsykkeiden kautta vapautuva histamiini. tärkeä välittäjä. Siksi syöttösolujen degranulaation estäminen on tärkeä askel säädettäessä histamiinin vapautumista naarmuuntumiskäyttäytymisen aikana. Tässä tutkimusyhdisteessä 48/80 aiheutti ihon syöttösolujen tehokkaan aktivoitumisen. Kuitenkin esikäsittely referenssillä vähensi merkittävästi syöttösolujen degranulaatiotasoa (kuva 2).cistanche-uutteen edutNämä tulokset osoittavat, että naarmuuntumista estävä vertailuvaikutus saattaa johtua verisuonten läpäisevyyden vähenemisestä säätelemällä syöttösolujen degranulaatiota (kuvio 9).

Yleisesti on todettu, että AD-potilaat kärsivät ihoesteen toimintahäiriöstä, ihotulehduksesta tai molemmista, joten sopivia hoitomenetelmiä on vaikea löytää. Siksi yhdistelmähoitoa suositellaan yleensä. Viimeaikaiset tutkimuksemme ovat osoittaneet, että sillä ei koskaan ole immunomodulatorista toimintaa ja esteen korjauskykyä. Siksi tärkeä referenssipiirre AD-hoidossa tulevaisuudessa on ihon toiminnan ylläpitäminen sekä ihon kosteutuksen parantaminen ja suojaesteen korjaaminen. Viite voi myös vähentää allergeenien ja ärsyttävien aineiden aiheuttamaa naarmuuntumista. Lisäksi atooppinen marssi on ilmiöön liittyvä sairaus, joka esiintyy ja etenee askel askeleelta. Atooppinen dermatiitti nähdään usein lapsena. Ruoka-aineallergia ilmenee usein 1-2vuoden iän jälkeen. Allerginen nuha voi usein alkaa ennen koulua ja sen jälkeen. Astman oireita ilmaantuu eri aikoina, mutta suurin osa niistä on allergisen nuhan jälkeen. Lapsuuden jälkeen atooppinen ihottuma ja tietyt ruoka-aineallergiat voivat parantua tai hävitä. Allergista nuhaa ja astmaa ei ole helppo parantaa[45,46]. Siksi ne ovat sairauksien rinnakkaisilmiöitä. Referenssit sisältävät luonnontuotteissa on terapeuttista potentiaalia komorbiditeettiin ja niiden tehokkuutta niihin liittyvissä sairauksissa kannattaa tutkia jatkossa.

4. Materiaalit ja menetelmät

4.1. Rotan basofiiliset leukemiasolut

Rotan basofiiliset leukemiasolut (RBL{0}}H3) olivat lahja TLHwangilta, Chang Gung University, Taoyuan, Taiwan. RBL-2H3-solut ovat limakalvon syöttösoluja, joita käytetään antigeenin tai kalsiumionoforin aiheuttaman degranulaation, solunsisäisen Ca4t:n ja signaalitransduktion tutkimiseen [29]. Soluja viljeltiin EMEM:ssä, joka sisälsi 10 % FBS:ää, penisilliinin ja streptomysiinin kanssa 37 asteessa, 5 % C02:ssa. Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IM) ja fetal bovine seerum (FBS) ostettiin Thermo Fisher Scientificilta (GIBCOTM, New York, NY, USA).

4.2.MTT-määritys

Mittaukseen käytetään 3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5-difenyyli-2H-tetratsoliumbromidi (MTT) -määritystä solujen metabolinen aktiivisuus. RBL-2H3-solut kylvettiin 24-kuoppaviljelylevylle 5 × 10 plus/kuoppa. 24 tunnin lääkehoidon jälkeen lisättiin 30 µl MTI:tä kuoppaa kohti ja asetettiin 37 asteen soluinkubaattoriin 2-4 tunniksi, sitten purppuraiset formatsaanikiteet liuotettiin DMSO:hon. ELISA-lukijaa käytettiin absorbanssin intensiteetin mittaamiseen aallonpituudella 550 nm solujen elinkelpoisuustestinä.

4.3. Intrasellulaarisen Ca2 plus -tason mittaus

[Ca2t] Minut mitattiin fura-2:lla, kuten aiemmin on kuvattu[47].RBL-2H3-solut suspendoitiin uudelleen IMDM:ään, joka sisälsi 5 uM Fura 2-AM:a ja 1,2 mM CaClz:a 37 asteen lämpötilassa. 30 min. Fura{11}}-latauksen jälkeen keratinosyytit pelletoitiin ja suspendoitiin uudelleen tuoreeseen DMEM:iin. Erä (2 ml) siirrettiin sekoitettuun kyvettiin, joka sisälsi 1,2 mM CaClz. Fura-2-Ca-fluoresenssi määritettiin viritysaallonpituuksilla 340 ja 380 nm (emission aallonpituus, 505 nm) LS{{19Elmer LS }} spektrofluorometri (PerkinElmer Life and Analytical Sciences). Tiedot tallennettiin 5 sekunnin välein[47].

4.4. Kvantitatiivinen polymeeriketjureaktio (qPCR)

RBL{{0}}H3-solut istutettiin 3,5 cm:n viljelymaljaan. Sen jälkeen, kun solut kasvoivat 90-prosenttisesti täyteen, soluja kasvatettiin staattisessa tilassa 24 tuntia. Sen jälkeen kun soluja oli esikäsitelty referenssillä 20 minuuttia, niitä stimuloitiin TNF-a/IFN-y:lla 1 tai 24 tuntia, vastaavasti. Solut kaavittiin pois, sentrifugoitiin (16,000×g, 10 min, 4 astetta) ja supernatantti uutettiin. RNA puhdistettiin käyttämällä kokonais-RNA:n eristyspakkausta (GeneDirex@, Vegas, NV, USA). Script cDNA Synthesis Kitin (BIO-RAD) toimintamenettelyn mukaan reagenssit lisättiin järjestyksessä ja niitä käytettiin osoitettujen olosuhteiden mukaisesti RNA:n muuntamiseksi cDNA:ksi. Lisäksi käytettiin PowerUpTM SYBRTM Green Master Mixiä (Applied BiosystemsTM). Yhteensä 7,5 ul ddH20:ta, 2 ul cDNA:ta, 0,25 μLof eteenpäin suunnattuja ja käänteisiä alukkeita ja 10 ul SYBR GREENiä lisättiin ja sekoitettiin tasaisesti. Alukesekvenssit on esitetty taulukoissa 1 ja 2. Sitten RNA kvantifioitiin käyttämällä ABI StepOnePlusTM Real-time PCR System -järjestelmää.

4.5. Western Blot -määritys

Western blottausta käytetään solujen eri proteiinien muutosten analysointiin. RBL{{0}}H3-solut kylvettiin 3,5 cm:n viljelymaljaan. Sen jälkeen, kun solut olivat kasvaneet 90-prosenttisiksi täyteläisiksi ja niitä nälkiintyi 24 tuntia, niitä esikäsiteltiin referenssillä 20 minuuttia ja sitten stimuloitiin TNF-a:lla tai IFN-y:lla 30 minuutin tai 1 tunnin ajan, vastaavasti. Kaaviuksen jälkeen ne jauhettiin ultraäänellä ja sentrifugoitiin (13 200 rpm, 10 min, 4 astetta). Sentrifugoinnin jälkeen supernatantti otettiin ja proteiini kvantifioitiin Pierce-proteiinimäärityspakkauksella (Pierce, Rockford, IL, USA). Se suoritettiin elektroforeesilla 10-prosenttisella SDS-polyakryyliamidigeelillä ja sitten elektroporoitiin PVDF-kalvolla. Kun siirto oli suoritettu, PVDF-kalvo laitettiin TBS-T (Tris-puskuroitu suolaliuos/0,05 % Tween 20) -liuokseen, joka sisälsi 5 % rasvatonta maitojauhetta, ja ravisteltiin 1 tunnin ajan epäspesifisen sitoutumisen välttämiseksi. Sitten käytettiin TBS-T:tä pesuun 3 kertaa, 10 min joka kerta. Sitten lisättiin primaarisia vasta-aineita (1:1000 laimennus) ja sijoitettiin 4 asteeseen yön yli ja pestiin sitten 3 kertaa TBS-T:llä 10 minuutin välein. Kun oli lisätty sekundäärisiä vasta-aineita (laimennettuna 1:1000) 1 tunnin ajan, PVDF-kalvo pestiin 3 kertaa TBS-T:llä 10 minuuttia joka kerta. Lopuksi kehitettä lisättiin ja kalvo asetettiin kemialliseen luminesenssiuuttojärjestelmään (BIOSTEP Celvin") ampumista varten.

4.6. Dinitroklooribentseeni(2,4-Dinitroklooriben2eeni, DNCB) Atooppisen dermatiitin kaltainen ihotulehdus hiirillä

Ensin hiiret jaettiin neljään ryhmään: kontrolliryhmä, DNCB-ryhmä (negatiivinen ryhmä), vertailuryhmä (3 mg/kg ja 10 mg/kg) DNCB-ryhmän kanssa ja deksametasoni (0,2 mg/kg) DNCB-ryhmä (positiivinen ryhmä). Deksametasoni on kortikosteroidihormoni, joka voi vähentää turvotusta ja allergisia reaktioita. Tässä in vivo -kokeessa sekä referenssi että deksametasoni liuotettiin DMSO:hon, kun taas DNCB liuotettiin 75-prosenttiseen etanoliin ultraäänisokilla. Edellinen annettiin intraperitoneaalisella injektiolla, ja jälkimmäistä 100 ul laitettiin selän iholle ja 20 µl oikeaan korvaan. Kolme päivää ennen koetta hiiret nukutettiin ja takakarvat poistettiin, ja pieni mittausmagneetti (SCT-MAG-TF) upotettiin hiiren takajalkojen takaosaan.cistanche Tšingis-khaaniKolmen päivän levon jälkeen todettiin, että hiiret olivat hyvässä fyysisessä kunnossa ja iho selän karvanpoistoalueella normaali, ja koe aloitettiin. Kokeen aikana otettiin valokuvia, joilla tallennettiin ihon ulkonäön muutoksia. Ensimmäinen vaihe ({{0}} päivää) oli allergisen atooppisen dermatiitin kausi. Kun DNCB-ryhmän, vertailu- (3 ja 10 mg/kg) ja DNCB-koeryhmän sekä deksametasoni 0,2 mg/kg ja DNCB-koeryhmän hiirten perusarvot oli mitattu, 1 % DNCB:tä levitettiin tasaisesti selän iholle ja oikea korva. Viidentenä päivänä lääkereferenssi ja deksametasoni ruiskutettiin intraperitoneaalisesti. Toinen vaihe (päivä 5 - 14) oli atooppisen dermatiitin uudelleen induktio.vesisäiliön käyttöiän pidentäminenKolmessa koeryhmässä 0,5 prosenttia DNCB:tä levisi tasaisesti hiirien selän iholle ja oikealle korvalle. Seuraavana päivänä otettiin ja tallennettiin ihon fysiologiset arvot ja kuvat. Sen jälkeen kun hiiret oli lopetettu liiallisella hiilidioksidilla (C02) 15. päivänä, selän ihokudos poistettiin myöhempää kokeellista analyysiä varten.

4.7. Yhdiste 48/80-Indusoitu naarmuuntumiskäyttäytyminen BALB/c-hiirissä

Hiiren takaosan ihokarvat leikattiin ja 20 µl yhdistettä 48/80 injektoitiin ihonsisäisesti. Kontrollihiiret saivat sen sijaan suolaliuosta. Välittömästi injektion jälkeen eläin asetettiin havaintohäkkiin (halkaisija 11 cm, MicroAct, Neuroscience, Tokio, Japani), ja hiiren raapiminen havaittiin ja arvioitiin automaattisesti ja objektiivisesti. Naarmuuntumiskäyttäytymistä mitattiin 60 min. MicroAct käyttää seuraavia analyysiparametreja havaitakseen aaltoja, jotka vastaavat hiirten jatkuvaa naarmuuntumista: kynnys, 0,05 V; tapahtumaväli, 0,05 s; vähimmäiskesto 0,25 s; maksimitaajuus, 30 Hz; minimitaajuus, 5 Hz. 4.8. Tilastollinen analyysi

Tilastolliseen analyysiin käytettiin Sigma-Plot-ohjelmistoa (versio 10.0).cistanche nzTiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM, ja (*) ja (#) huomautuksina. Aineiston tilastollinen merkitsevyys analysoitiin parittomilla, kaksisuuntaisilla Studentin t-testeillä.p arvoilla, jotka olivat alle 0.05 ja 0,01 katsottiin merkitseviksi.

5. Johtopäätökset

Tässä tutkimuksessa totesimme, että referenssi estää tehokkaasti syöttösolujen degranulaatiota ja vähentää pro-inflammatoristen sytokiinien ilmentymistä, mikä voi vähentää atooppisen ihottuman kaltaisia ​​oireita, palauttaa ihosuojan ja vähentää ihon naarmuuntumista. Olemme lisäksi osoittaneet, että referenssi ei voi vaikuttaa vain ihon keratinosyytteihin, vaan myös vaikuttaa syöttösolujen aktivaatioon. Sillä on enemmän käyttömahdollisuuksia allergisissa ja tulehduksellisissa ihosairauksissa.

Tämä artikkeli on poimittu Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 10994. https://doi.org/10.3390/ijms222010994 https://www.mdpi.com/journal/ijms