Kukkauutteet monikäyttöisinä väriaineina kosmetiikkateollisuudessa Osa 2

Ota yhteyttäoscar.xiao@wecistanche.comLisätietoja

Monia luonnontuotteita käytetään perinteisissä lääketieteellisissä järjestelmissä kivun ja tulehduksen oireiden lievittämiseen, [61] Siksi analysoitujen uutteiden vaikutusta lipoksigenaasi- ja proteinaasiaktiivisuuden estämiseen tutkittiin. Analysoiduilla pitoisuuksilla (100-500 ug/ml) CTE-vesiuute osoitti voimakkaimman kyvyn estää proteinaasia (kuvio 4) (57 prosenttia pitoisuudella 500 ug/ml). Tätä aktiivisuutta verrattiin hyvin tunnettuun proteinaasi-inhibiittoriin diklofenaakkiin, jota käytettiin kontrollina (noin 89 prosentin esto korkeimmalla testatulla pitoisuudella). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kuitenkin GGE- ja KTE-uutteelle (noin 56 prosenttia ja 53 prosenttia, vastaavasti korkeimmilla pitoisuuksilla). PRE- ja PGE-uutteilla havaittiin pienempi proteinaasin esto. Toisessa testissä, jossa mitattiin kykyä estää lipoksigenaasia, vesipitoiset uutteet KTE:stä ja CTE:stä osoittavat korkeimmat arvot (noin 67 prosenttia ja 64 prosenttia esto, vastaavasti pitoisuudella 500 ug/ml). Diklofenaakkia käytettiin myös kontrollina. GGE-, PGE- ja PRE-uutteilla on myös merkittävästi korkeat arvot (vastaavasti 60 prosenttia, 57 prosenttia ja 54 prosenttia) Huomattiin myös, että kyky estää LOX- ja proteinaasientsyymejä riippuu uutteen pitoisuudesta (kuva 5).

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että monet polyfenoliyhdisteet vaikuttivat merkittävästi monien kasviuutteiden anti-inflammatoriseen vaikutukseen[62]. Tutkimukset ovat osoittaneet ROS:n osallistumisen tulehdusprosessiin, ja fenoliyhdisteet, kuten galli- ja kiiniinihappo, voivat estää arakidonihapon aineenvaihduntaa estämällä lipoksigenaasiaktiivisuuden aktiivisuutta, tai ne voivat toimia arakidonihapon aikana muodostuvien reaktiivisten vapaiden radikaalien poistajana. [63]. BenSaad et ai. osoittavat, että P. granatumista eristetty ellagiinihappo, gallushappo ja punikalagiini A&B estivät typpioksidin (NO), prostaglandiini E2 (PGE2) ja interleukiini 6 (IL-6) tuotantoa lipopolysakkaridien (LPS) indusoimassa RAW 267.4 makrofagit. Se, toimivatko nämä yhdisteet ainoana aineena vai synergistisenä vaikutuksena, on edelleen kysymys [64]. Koska monilla flavonoideilla on anti-inflammatorisia ominaisuuksia niiden luontaisen antioksidanttisen käyttäytymisen vuoksi, ne ovat olleet osallisena erilaisissa tulehdushäiriöissä.flavonoidin uuttomenetelmä pdf,Erityisesti kversetiini on kiinnostavin molekyyli, koska se häiritsee tiettyjä biologisia reittejä. Lisäksi tutkimukset viittaavat siihen, että se voi vähentää useisiin malleihin liittyvää tulehdusprosessia erilaisten mekanismien kautta[65]. Erityisesti AMP-aktivoitu proteiinikinaasi ja histoni/proteiinideasetylaasi (AMPK/SIRT1) -reitti johtavat mielenkiintoisempaan tulehduksen hallintaan. Siten AMPK-aktivaattorit voivat vähentää makrofagien tulehdusta. Kversetiini ja muut flavonoidit AMPK:n ja SIRT1:n aktivaattoreina voivat vähentää tulehdusta häiritsemällä tätä reittiä [66]. On myös osoitettu, että kversetiinillä ja kversetiinimonoglukosidilla on suurempi LOX-inhibitiopotentiaali [67] Nair et ai. ovat osoittaneet KTE-uutteen anti-inflammatorisia ominaisuuksia arvioimalla kversetiiniosan sisältävien flavonolien, kuten manghasliini Qu 3-[2G] ramnosyylirutinosidin, Qu 3-O-dirhamnosidin ja rutiinin, läsnäoloa. Nämä molekyylit ovat osoittaneet vahvaa COX-2-aktiivisuuden estoa ja osittaista ROS-suppressiota. Yleensä CTE:ssä läsnä olevat polyfenolit osoittivat anti-inflammatorisia ominaisuuksia LPS:n aiheuttamassa tulehduksessa RAW 264.7 -makrofagisoluissa[68].

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja

2.5.Sytotoksisuuden arviointi

Uusia kosmeettisia raaka-aineita luotaessa yksi tärkeimmistä ominaisuuksista on niiden käytön turvallisuus. Kosmetiikassa käytettävien aineiden on oltava myrkyttömiä erityisesti ihosoluille, kuten keratinosyyteille ja fibroblasteille. Analysoitujen uutteiden myrkyllisyyden määrittämiseen HaCaT- ja BJ-soluille on käytetty kahden tyyppisiä testejä.flavonoiditEnsimmäisessä tutkimuksessa, jossa käytettiin neutraalin punaisen oton määritystä, voimme arvioida analysoiduilla uutteilla käsiteltyjen solujen elinkelpoisuuden. Tämä väriaine pääsee elävän solun lysosomeihin ja vapautuu kuolleiden solujen sytoplasmaan. Havaittiin (kuvio 6), että CTE-uutteella on suurin kyky lisätä sekä HaCaT- että BJ-solujen proliferaatiota. Verrattuna kontrolliin tämä uute saavutti noin 20 prosenttia ja 40 prosenttia korkeammat arvot kuin testattu parametri pitoisuuksilla 250 µl/ml (HaCaT ja B】) ja 500 µl/ml (BJ-solut). GGE-uutteelle pitoisuuksilla 100 ja 250 µl/ml ja KTE-uutteelle pitoisuutena 500 µl/ml oli tunnusomaista vähäinen toksinen vaikutus BJ-soluihin. Muilla uutteilla oli positiivinen vaikutus näiden solujen elinkelpoisuuteen. PRE- ja PGE-uutteet pitoisuuksilla 100 µl/ml eivät eronneet merkittävästi kontrollista, ja ne lisäsivät BJ-solujen proliferaatiota noin 10-15 prosenttia verrattuna kontrolliin pitoisuuksilla 250 ja 500 µl/ ml. Keratinosyyttien tapauksessa solujen elinkelpoisuuden vähenemistä ei havaittu. PGE-, PRE- ja CTE-uutteilla havaittiin lisääntymisen lisääntyminen pitoisuuden kasvaessa, kun taas solujen elinkelpoisuuden väheneminen osoitettiin KTE- ja GGE-uutteiden pitoisuuden kasvaessa.

Toinen testi, joka suoritettiin testattujen uutteiden sytotoksisuuden määrittämiseksi, oli resatsuriinitesti (Alamar Blue). On osoitettu (kuvio 7), että solujen elinkelpoisuus riippuu sen uutteen pitoisuudesta, jonka kanssa soluja inkuboitiin. Fibroblastien tapauksessa PRE-, PGE- ja CTE-uutteet lisäävät solujen lisääntymistä ja lisäävät niiden pitoisuutta. Korkeimmalla analysoidulla pitoisuudella (500 µl/ml) havaittiin noin 20 prosenttia korkeampi proliferaatio verrattuna kontrolliin.hesperidiinin käyttöKTE- ja GGE-uutteiden tapauksessa havaittiin solujen elinkelpoisuuden väheneminen uutteiden pitoisuuden lisääntyessä. Nämä uutteet osoittivat hieman myrkyllistä vaikutusta BJ:hen pitoisuuksilla 250 ja 500 µl/ml. Keratinosyyttien tapauksessa havaittiin samanlainen analysoitujen uutteiden vaikutus ihosoluihin, mutta niiden lisääntymiskyky ei ollut yhtä voimakas kuin fibroblastien tapauksessa. Suurin kyky lisätä keratinosyyttien proliferaatiota havaittiin CTE-uutteella koko analysoitujen pitoisuuksien alueella. Samanlaiset arvot saatiin PRE-uutteelle pitoisuudella 250 µl/ml ja PGE-uutteelle pitoisuudella 500 µl/ml. KTE-uute osoitti merkittävästi korkeamman toksisen vaikutuksen HaCa-soluihin kuin GGE-uute.

Analysoitujen uutteiden myrkyllisyyttä ihosoluille ei ole aiemmin testattu laajasti. Uutteista tai niiden tärkeimmistä vaikuttavista aineista, erityisesti syöpäsoluista, on tehty vain muutamia sytotoksisuustutkimuksia. Aiempien tutkimusten kirjoittajat ovat osoittaneet, että näillä uutteilla ei yleensä ole myrkyllistä vaikutusta ihosoluihin, ja niiden kyky lisätä solujen lisääntymistä johtuu useimmiten korkeasta polyfenoli-, antosyaani- ja flavonoidien pitoisuudesta [45,69-73 ]. Jotkut kirjoittajat ilmoittivat myös, että uutteiden sisältämät yksittäiset komponentit voivat vaikuttaa ihosoluihin myrkyllisesti, kun taas uutteella ei kokonaisuutena ole. Ali Hijazi et ai. [69] osoittivat, että Punica granatumista uutetut alkaloidit ovat myrkyllisiä normaaleille ja syöpäsolulinjoille, kun taas koko uute on vähemmän myrkyllistä. Nasirin et al. [70] osoittaa, että Punica granatum -kukkauutte voi olla hyödyllinen haavan paranemisprosessin nopeuttamisessa, koska se pystyy lisäämään ihosolujen lisääntymistä. Aiemmassa tutkimuksessamme [45] osoitettiin, että analysoiduista kasveista saaduille vesi-etanoliuutteille oli ominaista suurempi kyky lisätä BJ-solujen proliferaatiota, ja KTE- ja GGE-uutteet osoittivat pienempiä toksisia vaikutuksia näihin soluihin. .kadonnut empire cistancheVesi-etanoliuutteiden vaikutus HaCaT-soluihin oli samanlainen kuin puhtaiden vesiuutteiden, mutta etanolilla saaduilla uutteilla havaittiin hieman edullisemmat proliferaatioominaisuudet kuin vesiuutteilla. Molempien analysoitujen uutteiden koostumuksen erot voivat aiheuttaa eroja niiden myrkyllisyydessä. Kuten näkyy, vesiuutteet eivät ole yhtä runsaasti bioaktiivisia aineosia kuin vesi-etanoliuutteet. Suurimmat erot havaitaan rutiinin ja isokersitriinin pitoisuuksissa.

Cistanche voi estää ikääntymistä

2.6.Auringonsuojakertoimen määrittäminen

UV-säteilyn epäsuotuisat vaikutukset iholle voivat paljastua sekä pian altistuksen jälkeen että jopa vuosia myöhemmin. Auringon säteilyllä on immuunivastetta heikentävä vaikutus, joka nopeuttaa ihon ikääntymisprosessia ja kaikki siihen liittyvät seuraukset, mukaan lukien lisääntynyt karsinogeneesi[74]. Tällä hetkellä havaitut trendit osoittavat kasvavaa tarvetta kehittää tuotteita, joille on tunnusomaista paitsi erittäin korkea käyttöturvallisuus, myös monitoimisuus siinä mielessä, että tuotteissa on ihon säteilysuojaus laajemmin kuin tähän mennessä käytetty. Joillakin kasviaineilla on tässä korvaamaton rooli, sillä ne pystyvät paitsi tarjoamaan aurinkosuojaa myös neutraloimaan jo olemassa olevia auringon säteilyn negatiivisia vaikutuksia ihoon [75-77]. Suoritettu tutkimus osoitti, että analysoiduille kasviuutteille PRE, PGE, KTE, CTE ja GGE on ominaista korkeat SPF-kertoimet.

Kertoimien (SPF) analyysi suoritettiin saaduille vesiuutteille edellä mainituista kasveista konsentraatioilla 10 ja 50 mg/ml. Jokaisen tutkitun kasvin korkeampi uutteen pitoisuus johti merkittävästi korkeampaan SPF-arvoon.mikronisoitu puhdistettu flavonoidifraktio 1000 mg käyttötarkoituksiaUutteiden välinen vertailu osoittaa, että korkeimmat SPF-arvot havaittiin KTE-uutteella, mikä pätee molemmille tutkituille pitoisuuksille. Toinen mielenkiintoinen havainto on, että jopa alemmissa tutkituista pitoisuuksista KTE-uutteen SPF oli edelleen korkea, kun taas muiden uutteiden arvot laskivat huomattavasti. Tämä on selvää, kun analysoimme, kuinka paljon KTE:n tulos oli muita otteita korkeampi. Konsentraatiolla 50 mg/ml SPF oli kertoimella 1,2 korkeampi (verrattuna PGE:hen, CTE:hen) lähes kertoimeen 1,9 (verrattuna PRE:hen, GE:hen). Sama laskelma pitoisuudelle 10 mg/ml antaa kertoimet välillä 1,4 (verrattuna PGE:hen) vaihteluvälin tekijöihin 2-3 (verrattuna CTE:hen, GGE:hen), jopa tekijöihin, kuten 10 verrattuna PRE. KTE-uutteeseen keskittyessä voidaan huomata, että uutteen pitoisuuden pieneneminen kertoimella 5 (arvosta 50 mg/ml arvoon 10 ml/ml) johtaa SPF-arvon laskuun tekijällä 3,4. , mikä tarkoittaa, että SPF laskee hitaammin kuin pitoisuus. Yllä oleva osoittaa, että KTE-uute voi olla tehokas myös pieninä pitoisuuksina käytettynä (kuva 8).

2.7. Transepidermaalisen vedenhäviön (TEWL) ja ihon kosteutuksen mittaukset

Kasviraaka-aineiden laajan biologisen ja farmakologisen aktiivisuuden ansiosta uutteiden sisältämät kasviaineet vaikuttavat merkittävästi ihon tilaan. Erityisesti puhumme tässä sekundaaristen metaboliittien vaikutuksesta ihomme tilaan [78,79].

Tutkimuksen seuraavassa vaiheessa suoritettiin nesteytys- ja TEWL-analyysit. Testattujen uutteiden vaikutus ihoon arvioitiin. Mittaukset tehtiin kahdella aikavälillä 60 ja 360 min uutteen konsentraatiolle 10 mg/ml. TEWL-mittauksessa suurin prosentuaalinen lasku osoitettiin PGE-uutteella, jossa kontrolliarvo 13,9 putosi arvoon 8,71, mikä johti 37 prosentin laskuun. Kannattaa myös analysoida KTE-uute tästä näkökulmasta, sillä tämä oli korkeimmat SPF-arvot. KTE-uutteen osalta TEWL-kontrolliarvo laski arvoon 10,22, mikä tarkoittaa 26 prosentin laskua (kuva 9A).

Toisen instrumenttimittauksen tapauksessa kuitenkin osoitettiin, että analysoidut uutteet lisäävät kosteutta verrattuna kontrollinäytteeseen sekä 60 että 360 minuutin kuluttua.

Analyysien tuloksena havaittiin, että analysoidut PRE-, PGE-, KTE-, CTE- ja GGE-uutteet lisäävät ihon kosteutta (kuva 9B). Kosteuttavien ominaisuuksien lisääntyminen havaittiin yhdessä uutteen pitoisuuden kasvun kanssa valmisteissa. Voimakkaimmat kosteuttavat ominaisuudet on havaittu PRE- ja PGE-uutteilla, jotka ovat 32 prosenttia ja 29 prosenttia 60 minuutin jälkeen ja 21 prosenttia ja 22 prosenttia 360 minuutin jälkeen. Alhaisin ihon kosteustaso on kuitenkin todettu KTE-uutteelle, joka on 18 prosenttia 60 minuutin jälkeen ja lähes 3 prosenttia 360 minuutin jälkeen.

2.8. Sovellusanalyysi

2.8.1. Uutteiden väriparametrien määrittäminen

Kasvien kukkien vaikuttavia aineita voidaan luonnollisen värinsä ansiosta käyttää luonnollisina väriaineina monissa kaupallisissa tuotteissa, kuten kosmetiikassa ja elintarvikkeissa. Saatujen uutteiden värianalyysi suoritettiin (taulukko 5).

PRE-, KTE- ja CTE-uutteilla havaittiin olevan suurin potentiaali luonnonkosmeettisina pigmentteinä. Korkeimmat väriarvot (C*) havaittiin kuitenkin CTE:lle. H-asteparametrin arvon perusteella havaittiin, että juuri tämän uutteen keltainen väri havaitaan ja näkyy paljaalla silmällä. KTE- ja PRE-uutteiden tapauksessa alhaisesta C*-arvosta (2,8) huolimatta näiden uutteiden väri on selvästi nähtävissä paljaalla silmällä, ja se määriteltiin PRE-uutteen osalta punaisen violetiksi ja KTE-uutteen siniviolettiksi. PGE:n ja GGE:n vesiuutteet olivat väriltään punertavia ja hieman oransseja ja saadut kroma-arvot olivat tasolla 1,3. Tämän värin osalta nämä arvot eivät olleet paljaalla silmällä merkittävästi havaittavissa.

2.8.2. Kosmeettisten tuotteiden väriparametrien määrittäminen uutteiden perusteella

Viime vuosina on ollut vahva tarve kehittää uusia luonnollista alkuperää olevia väriaineita erityisesti elintarvike- ja kosmetiikkateollisuudessa. Verrattuna synteettisesti saatuihin väriaineisiin niillä voi olla pienempi kielteinen vaikutus ihmisten terveyteen ja ympäristöön [80]. Saatuja uutteita käytettiin malli misellimeikinpoistonesteen formuloinnissa. Jokaisessa formulaatiossa niitä käytettiin 1 prosentin pitoisuutena. Mallikosmetiikan väriparametrien tulokset on esitetty taulukossa 6.

Havaittiin, että 1 prosentin vesiuutteiden lisääminen PRE:stä, PGE:stä, CTE:stä ja GGE:stä vaikutti merkittävästi meikinpoistoaineen väriin. Jokainen näyte oli väriltään selvästi nähtävissä paljaalla silmällä. PRE-uute muutti kosmeettisen aineen värin oranssiksi ja PGE-, CTE- ja GGE-uute keltaiseksi.

Mahdollisuuden käyttää analysoituja uutteita mahdollisina väriaineina vahvistavat △Uute/perusmeikinpoistoaineella varustetun meikinpoistoaineen suhteellisen korkeat arvot, mikä viittaa mallikosmetiikan värin merkittävään muutokseen vertailun uutetta lisättäessä. perusnäytteeseen (ilman uutteiden lisäämistä). Kirjallisuustiedot [73] osoittavat, että jos AE-arvot ovat korkeammat kuin 5, alasti aatto havaitsee värin ja se nähdään väriefektinä. PRE-, KTE- ja CTE-uutteita sisältäville meikinpoistoaineille saatiin AE-arvot 8,83, 9,17 ja 8,14. PGE- ja GGE-uutteita sisältävien tuotteiden tapauksessa uutteessa ei havaittu merkittävää vaikutusta valmisteen väriin. AE:n arvot ovat välillä 2.{12}}.82. Tämä tarkoittaa, että värieron huomaa vain kokenut tarkkailija [80,81].

3. Materiaalit ja menetelmät

3.1. Kasvimateriaali ja uuttamismenettely

Tutkimuksessa käytetty kasvimateriaali oli P. rhoeas L.:n, P. granatum L.:n, C.ternatea L.:n, C. tinctorius L.:n ja G. globosa L.:n kuivakukkia, jotka saatiin paikallisesta yrttikaupasta. . Uuttoprosessi suoritettiin ultraäänihauteessa (Digital Mgtrasonic Cleaner, Berliini, Saksa), joka suoritettiin Yang et al.[82] kuvaamalla menetelmällä. Testattujen kasvien vesiuutteiden valmistukseen käytettiin 10 grammaa kuivia kukkia ja 100 g vettä. Prosessi suoritettiin 20 minuuttia huoneenlämpötilassa. Saadut uutteet kerättiin sitten ja suodatettiin kolme kertaa Whatman No. 1 -suodatinpaperin läpi. Suodatuksen jälkeen uutteet haihdutettiin alennetussa paineessa 40 °C:ssa. Kuivatuista uutteista valmistettiin varastoliuos konsentraatiolla 100 mg/ml ja säilytettiin pimeässä 4 asteessa jatkoanalyysiin asti. Käytetään seuraavia lyhenteitä: PRE – Papaver rhoeas -uute, PGE - Punica granatum -uute, GGE - Gomprena globosa -uute, CTE - Carthamus tinctorius -uute, KTE - Clitoria ternatea -uute.

3.2. Bioaktiivisten yhdisteiden määritys HPLC-UV-ESI-MS:llä

Saadut uutteet analysoitiin niiden tärkeimpien bioaktiivisten yhdisteiden määrittämiseksi käyttämällä HPLC:tä (DionexUltiMate 300{{20}} RS Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, USA), kytkettynä massaspektrometrillä (4000 QTRAP, AB Sciex, Concord, ON, Kanada), joka on varustettu sähkösumutusionisaatiolähteellä (ESI) ja kolminkertaisella kvadrupoli-ioniloukkumassalla analysaattori. Kromatografinen erotus saavutettiin gradienttikäänteisfaasijärjestelmällä. Lisäksi Phenomenexiltä ostettiin 100 × 4,6 mm:n kromatografinen pylväs Kinetex 3,5 μm XB-C18 100 A, jossa oli isobutyylisivuketjut ja TMS-päätteen staattinen faasi, jota käytettiin samanlaisen koostumuksen suojakolonnin kanssa ja pidettiin 30 asteessa. . Binääristä liuotinjärjestelmää, joka sisälsi 0,1 % (o/v) vesipitoista muurahaishappoa liuottimena A ja metanolia liuottimena B, käytettiin gradienttitilassa 19,1 minuutin ajan ajoajan aikana. Käytetyt eluointiolosuhteet olivat seuraavat: 0.0-15.0 min 25-100 prosenttia B,15.0-17.0 min 100 prosenttia B,17.0-17.1 min. 100-25 prosenttia B,17.1-19.1 min 25 prosenttia B. Liikkuvan faasin virtausnopeus oli 0,6 ml/min ja injektiotilavuus 10 μL. Eluenttia seurattiin sähkösumutusionimassaspektrometrillä (ESI-MS) negatiivisen ionin tilassa ja skannattiin m/z:stä 20 - 1000 Da. Kvantitointianalyysiä varten kolminkertainen kvadrupoli MS-detektori toimi usean reaktion monitoroinnin (MRM) skannaustilassa. Optimaaliset massa-analysaattorin olosuhteet ja tuote-ionien valinta yksittäisille yhdisteille määritettiin kokeellisesti. Tätä tarkoitusta varten lisättiin tutkittujen yhdisteiden standardiliuoksia (1 ng/ml) liikkuvan faasin koostumuksessa käyttäen infuusiopumppua, joka toimii jatkuvalla näytteensiirrolla. Sen jälkeen kun oli varmistettu, että oikea esiaste-ioni oli valittu, deklusterointipotentiaali (DP), sisääntulopotentiaali (EP), törmäyskennon poistumispotentiaali (CXP) ja törmäysenergia (CE) optimoitiin kullekin MRM-siirtymälle (taulukko S1). Kahta MRM-siirtymää tarkkailtiin, yksi kvantifiointia ja yksi vahvistusta varten. MS-parametrit asetettiin seuraavasti: kapillaarilämpötila 600 C, verhokaasu 35 psi, sumutinkaasu 60 psi ja kuivauskaasu 50 psi. Bioaktiivisten yhdisteiden määritykseen käytettiin negatiivista ionisaatiomoodin lähdejännitettä -4500 V. Verhona ja törmäyskaasuna käytettiin typpeä. Tietojen analysointi käsiteltiin Analyst 1.5.1 -ohjelmistolla. Valittujen yhdisteiden tunnistaminen tehtiin kunkin yksittäisen yhdisteen molekyylimassan ja anionien fragmenttien perusteella ja varmistettiin MS2-fragmentoinnilla. Yhdeksän yhdisteen identiteetit määritettiin yhdessä niiden kemiallisen kaavan, deprotonoituneiden molekyyli-ionien ja kunkin yksittäisen piikin tunnusomaisten fragmentti-ionien kanssa. Kuusi yhdistettä kvantifioitiin perustuen kalibrointikäyrään, joka luotiin käyttämällä analyyttisten standardien voimakkaimpien MRM-siirtymien huippualueita. Detektorivasteen lineaarisuus kvantitatiivisille yhdisteille osoitettiin injektoimalla kalibrointistandardeja kahdeksalla pitoisuustasolla, jotka vaihtelivat välillä 0,01 ug/ml - 2 ug/ml. Kalibrointikäyrät olivat lineaarisia korrelaatiokertoimien (R) ollessa yli 0,99. Jos näytteet eivät osuneet CMS-detektorin lineaariselle alueelle, näytteet laimennettiin.

Kiniinihapon, gallushapon, kofeiinihapon, kofeoyylikiniinihappojen (CQA, kaksi isomeeriä: 3- ja 5-CQA) ja kversetiinin analyyttiset standardit ostettiin Sigma-Aldrichilta, St. Louis, MO, USA. ). Kaikki käytetyt standardit olivat analyyttistä laatua (2 suurempi tai yhtä suuri kuin 99 prosentin puhtaus).

Standardikantaliuokset valmistettiin punnitsemalla ja liuottamalla tarkasti 20 mg kutakin standardia 10 ml:aan LC-MS-luokan metanolia, jolloin saatiin 2 mg/ml konsentraatio. Sarjalaimennokset 2.{{10}} ug/ml, 1,5 ug/ml, 1.0 ug/ml, 0,5 ug/ml,0 Sitten valmistettiin 0,1 ug/ml, 0,05 ug/ml, 0,02 ug/ml ja 0,01 ug/ml käyttämällä LC-MS-luokan metanoliliuosta. Kvantitointiraja (LOQ) määriteltiin arvoksi 0,01 ug/ml.

LC-MS/MS-määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Saadut tiedot esitettiin keskiarvoina ± keskihajonnat.

3.3. Antioksidanttiominaisuuksien määritys

3.3.1.ABTS· plus Scavenging Assay

Ensin valmistettiin ABTS-liuos sekoittamalla 19,5 mg ABTS:ää ja 3,3 mg kaliumpersulfaattia 7 ml:n kanssa fosfaattipuskuria (pH{5}},4) ja liuotettiin 16 tuntia pimeässä. Sitten liuos laimennettiin absorbanssitasolle noin 1.0. Absorbanssit mitattiin aallonpituudella 入=734 nm. Seuraavaksi 20 ml KTE-, PGE-, PRE-, CTE- ja GGE-uutteita (10 100 250 500 ug/ml) sekoitettiin 980 ml:aan laimennettua ABTSe ​​plus -liuosta ja inkuboitiin sitten 10 minuuttia pimeässä. Seuraavassa vaiheessa valmistettujen näytteiden absorbanssi mitattiin aallonpituudella 入=734 nm käyttämällä UV/VIS-spektrofotometriä Aquamate Helion (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Aihiona käytettiin tislattua vettä. ABTS plus huuhtelu laskettiin yhtälöstä (1):

jossa: As – näytteen absorbanssi; Ac – kontrollinäytteen absorbanssi. Mittaukset suoritettiin kolmena kappaleena kullekin uutetulle näytteelle. Menettelyn ovat kuvanneet Gawel-Beben et ai. [83].

3.3.2. DPPH Radical Scavenging Assay

Uutteiden kyky poistaa vapaita radikaaleja suoritettiin käyttämällä menetelmää, jonka ovat kuvanneet Brand-Williams et ai. [84]. Se perustuu 1,1-difenyyli-2-pikryylihydratsyyli (DPPH) -radikaalin käyttöön. Ensin 33 µl uutteiden vesiliuoksia pitoisuuksilla 100 ug/ml sekoitettiin 167 µl:aan DPPH:n (4 mM) metanoliliuosta ja siirrettiin 96-kuoppalevylle, sitten sekoitettiin ravistamalla. Sen jälkeen näytteiden absorbanssi mitattiin aallonpituudella 517 nm. Mittaukset tehtiin 5 minuutin välein 30 minuutin ajan UV-VIS Filter Max入=5 spektrofotometrillä (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Kullekin uutteelle suoritettiin kolme riippumatonta toistoa. Kontrollina käytettiin vettä DPPH-liuoksen kanssa. Antioksidanttikapasiteetti ilmaistiin prosentteina DPPH:n estämisestä käyttämällä yhtälöä (2):

jossa: As – näytteen absorbanssi; Ac – kontrollinäytteen absorbanssi. Mittaukset suoritettiin kolmena kappaleena kullekin uutetulle näytteelle.

3.3.3. Reaktiivisten happilajien (ROS) solunsisäisten tasojen havaitseminen

Analysoitujen uutteiden kyvyn määrittää solunsisäinen reaktiivisten happilajien tuotanto HaCaT- ja BJ-soluissa käytettiin fluorogeenistä H, DCFDA-väriä. Tällä yhdisteellä on kyky päästä soluihin passiivisen diffuusion avulla, jossa se deasetyloituu solunsisäisten esteraasien toimesta ei-fluoresoivaksi yhdisteeksi. Jos solussa on reaktiivisia happilajeja, tämä yhdiste muuttuu erittäin fluoresoivaksi DCF:ksi. ROS:n solunsisäisen tason määrittämiseksi HaCaT:issä ja BJ:ssä solut kylvettiin 96-kuoppalevyille. Sitten soluja viljeltiin inkubaattorissa 24 tuntia. DMEM-elatusaine poistettiin ja korvattiin 10 µM H2DCFDA:lla (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), joka oli liuotettu seerumivapaaseen DMEM-elatusaineeseen. HaCaT- ja BJ-soluja inkuboitiin H:ssa, DCFDA:ssa 45 minuuttia ja sitten niitä inkuboitiin uutteiden kanssa konsentraatioissa∶ 100, 250 ja 500 ug/ml. 1 mM vetyperoksidilla (H2O2) käsiteltyjä soluja käytettiin positiivisina kontrolleina. Kontrollinäytteet olivat soluja, joita ei ollut käsitelty testatuilla uutteilla. DCF-fluoresenssi mitattiin 90 minuutin välein käyttämällä FilterMax F5 -mikrolevylukijaa (Thermo Fisher Scientific) maksimivirityksellä 485 nm ja emissiospektreillä 530 nm [85].

3.4. Matriisimetallipeptidaasien eston arviointi

3.4.1.Anti-elastaasiaktiivisuuden määrittäminen

Matriksin metalloproteinaasin, neutrofiilielastaasin (NE) inhiboimisen mahdollisuuden määrittämiseksi käytettiin fluorometristä kittiä (Abcam, ab118971). Testi suoritettiin pakkaukseen liitettyjen ohjeiden mukaisesti ja menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Niziol-Lukaszewska et ai. [86]. Analyysit suoritettiin tavallisella 96-kuoppalevyllä, jossa oli kirkas litteä pohja. Analyysissä käytettiin kasviuutteita pitoisuuksina 100 ja 250 ug/ml. Aluksi NE-entsyymiliuokset, NE-substraatti ja inhibiittorikontrolli (SPCK) valmistettiin ohjeiden mukaisesti. Laimennettu NE-liuos lisättiin kaikkiin kuoppiin ja sitten testinäytteet, inhibiittorikontrolli ja entsyymikontrolli (määrityspuskuri) lisättiin seuraaviin kuoppiin. Sen jälkeen näytteet sekoitettiin ja inkuboitiin 37 asteessa 5 minuuttia. Sillä välin valmistettiin reaktioseos sekoittamalla määrityspuskuri ja NE-substraatti. Seos lisättiin jokaiseen kuoppaan ja sekoitettiin perusteellisesti. Fluoresenssi mitattiin välittömästi viritysaallonpituudella 入=400 nm ja emissiolla 入=505 nm käyttämällä mikrolevylukijaa (FilterMax F5, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Analyysin kyky estää NE-aktiivisuutta näytteet laskettiin yhtälöstä (3):

Lopputulos oli kolmen riippumattoman mittauksen aritmeettinen keskiarvo.

3.4.2. Anti-kollagenaasiaktiivisuuden määritys

Saatujen uutteiden kyvyn inhiboida kollagenaasiaktiivisuutta arvioimiseksi käytettiin fluorimetristä kittiä (Abcam, Cambridge, UK, ab211108). Testi suoritettiin pakkaukseen liitettyjen ohjeiden mukaisesti ja menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Niziol-Lukaszewska et ai. [86]. Analyysit suoritettiin tavallisella 96-kuoppalevyllä, jossa oli kirkas litteä pohja. Analyysissä käytettiin kasviuutteita pitoisuuksina 100 ja 250 ug/ml. Ensin kollagenaasi (COL) liuotettiin kollagenaasianalyysipuskuriin (CAB). Sitten analysoidut näytteet lisättiin COL:iin ja CAB:hen. Inhibiittorikontrollinäytteet valmistettiin sekoittamalla kollagenaasi-inhibiittori (1,10-fenantroliini (80 mM) kollagenaasin ja CAB-puskurin kanssa. Entsyymikontrollikuopat valmistettiin sekoittamalla laimennettua COL:ia CAB:n kanssa. CAB-puskuria käytettiin taustakontrollina Sitten näytteitä inkuboitiin huoneenlämmössä 15 minuuttia. Valmistettiin reaktioseos sekoittamalla kollagenaasisubstraatti CAB:n kanssa. Tällä tavalla valmistettu reaktioseos lisättiin kaikkiin analysoituihin näytteisiin ja sekoitettiin huolellisesti. Sen jälkeen mitattiin fluoresenssi viritysaallonpituus 490 nm ja emissio 520 nm Mittaus suoritettiin kineettisessä tilassa 60 minuuttia 37 C:ssa. Saatujen uutteiden kyky estää COL-aktiivisuutta laskettiin yhtälöllä (4):

3.5. Tulehdusta ehkäisevien ominaisuuksien määrittäminen

3.5.1. Proteiinien denaturaation esto

PRE-, PGE-, KTE-, CTE- ja GGE-uutteiden proteinaasia estävä aktiivisuus suoritettiin Sakat et al.[87] menetelmän mukaisesti, jota Gunathilake et ai.[88] modifioivat. Lyhyesti sanottuna reaktioliuos (2 ml) koostui 1 ml:sta 1 % trypsiiniä 2{{10}} mM Tris-HCl-puskurissa (pH7,4) ja 1 ml:sta testinäytettä ({{17} },02 ml uute 0,980 ml vettä). Liuosta inkuboitiin (37 astetta 5 minuuttia), ja sitten lisättiin 1 ml 0,8 % (w/v) kaseiinia ja seosta inkuboitiin edelleen 20 minuuttia. Inkuboinnin lopussa lisättiin 2 ml 70-prosenttista perkloorihappoa saattamaan reaktion loppuun. Seos sentrifugoitiin ja supernatantin absorbanssi mitattiin aallonpituudella 210 nm puskuria vastaan ​​nollanäytteenä. Fosfaattipuskuriliuosta käytettiin kontrollina. Proteiinien denaturoitumisen estoprosentti laskettiin käyttämällä seuraavaa kaavaa:

missä A1= kontrollinäytteen absorptio ja A2= testinäytteen absorptio.

3.5.2. Lipoksigenaasiaktiivisuuden esto

Saatujen uutteiden kyky inhiboida lipoksigenaasiaktiivisuutta määritettiin käyttämällä menetelmää, jonka ovat kuvanneet Sarvesvaran et ai. 【89】. Ensin 10 µl kasviuutteita eri pitoisuuksina (100, 250 ja 500 ug/ml) sekoitettiin 96-kuoppalevyllä 160 µl:n 100 mM PBS:n ja 20 µl:n kanssa soijapavun lipoksigenaasiliuosta (167 U/). ml) Näytteitä inkuboitiin 25 asteessa 10 minuuttia ja tämän ajan jälkeen lisättiin 10 µl natriumlinolihappoa reaktion käynnistämiseksi. Sitten näytteiden absorbanssi mitattiin aallonpituudella 234 nm 3 minuutin aikana joka minuutti käyttäen FilterMax F5-mikrolevylukijaa (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Diklofenaakkia käytettiin positiivisena kontrollina. Lipoksigenaasiaktiivisuuden eston prosenttiosuus laskettiin yhtälöstä (6):

jossa: Kuten testatun näytteen absorbanssi, Ac on negatiivisen kontrollin absorbanssi.

Lopputulos oli kolmen riippumattoman mittauksen aritmeettinen keskiarvo.

3.6. Sytotoksisuusanalyysi

3.6.1. Soluviljely

Tässä tutkimuksessa käytettiin kahta ihosolulinjaa: normaaleja ihmisen keratinosyyttejä (HaCaT) ja fibroblasteja (BJ). HaCaT:t saatiin CLSCell Lines Servicestä (CLS Cell Lines Service GmbH, Eppelheim, Saksa) ja BJ:t American Type Culture Collectionista ( Manassas, VA, USA). Soluja kasvatettiin Dulbeccon Modification of Eagle's Mediumissa (DMEM, Biological Industries, Cromwell, CO, USA) natriumpyruvaatin, L-glutamiinin ja korkean glukoosipitoisuuden (4,5 g/l) kanssa. Elatusaine rikastettiin myös 10 prosentilla naudan sikiön seerumia (Gibco, Waltham, MA, USA) ja 1 prosentilla antibiootteja (100 U/ml penisilliiniä ja 1000 ug/ml streptomysiiniä, Gibco) mikrobikontaminaation estämiseksi. Soluja kasvatettiin inkubaattorissa 37 asteessa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 95 prosenttia ilmaa ja 5 prosenttia hiilidioksidia.

3.6.2. Alamar Blue Assay

Kun viljellyt solut (HaCaT ja BJ) olivat saavuttaneet halutun konfluenssin, DMEM-elatusaine imettiin viljelypulloissa. Pohjaan kiinnitetyt solut pestiin kahdesti steriilillä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella. Solukerros irrotettiin trypsiinillä ja sitten solut asetettiin tuoreeseen DMEM-elatusaineeseen. Solut maljattiin 96-kuoppalevyille (VWR, Radnor, PE, USA) ja levyjen pohjalle kiinnittämisen jälkeen solut käsiteltiin uutteilla (100, 250 ja 500 ug/ml). Soluja inkuboitiin 24 tuntia.

Sytotoksisuustesti suoritettiin Alamar Blue -määrityksellä (Sigma, R7017, Life Technologies, Bleiswijk, Alankomaat). Inkuboinnin jälkeen kuoppiin lisättiin resatsuriiniliuosta pitoisuutena 60 uM, minkä jälkeen levyt asetettiin inkubaattoriin 37 asteeseen 2 tunniksi. Tämän ajan jälkeen fluoresenssi on mitattu (入=570nm）). Jokainen uutekonsentraatio suoritettiin kolmessa toistossa.

3.6.3. Neutraalipunaisen sisäänoton määritys

Neutral Red Uptake Assay on toinen testi, jota käytetään PRE:n, PGE:n, KTE:n, CTE:n ja GGE:n sytotoksisuuden määrittämiseen. Ensin valmistettiin96-kuoppalevyt, jotka on kuvattu edellisessä osiossa. Kun solut oli altistettu uutteille 24 tuntia, ne imettiin pois ja korvattiin neutraalilla punaisella väriaineella (40 ug/ml) ja inkuboitiin 2 tuntia. Tämän ajan kuluttua solut pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella. Seuraavassa vaiheessa värinpoistopuskuria (150 µl) lisättiin kuoppiin. Sitten neutraalin punaisen dve:n sisäänotto määritettiin mittaamalla optinen tiheys (OD) 540 nm:ssä. Jokainen uutekonsentraatio suoritettiin kolmessa toistossa.

3.7. Auringonsuojakertoimen määritys (in vitro)

Auringonsuojakerroin (SPF) määritettiin mittaamalla uutteiden vesiliuoksen absorbanssi pitoisuuksilla 10 ug/ml ja 50 ug/ml aallonpituusalueella 290-320 nm 5-nm välein. Saatuista tuloksista SPF laskettiin Mansur-yhtälöstä [90]: missä∶ EE（λ）—eryteemivaikutusspektri, I（入）—auringon intensiteettispektri, ABS（入） — aurinkosuojatuotteen absorbanssi, CF— korjauskerroin (=10), E (N) × I (λ) — käytettiin Sayren määrittämiä arvoja [91].

3.8. Transepidermaalisen vedenhäviön (TEWL) ja ihon kosteutuksen mittaukset

TEWL- ja ihon kosteusmittaukset suoritettiin käyttämällä TEWAmeter TM 300 -anturia ja Corneometer CM 825 -anturia, joka oli yhdistetty MPA-sovittimeen (Courage plus Khazaka Electronic, Köln, Saksa). Tutkimukseen osallistui viisi vapaaehtoista. Kyynärvarressa iho, kuusi aluetta (koko 2 × 2 cm) merkittiin Viiteen paikkaan 0,2 ml testattuja kasviuutteita, kuudenneksi oli kontrolli (ei käsitelty millään näytteellä) 60 ja 360 min jälkeen , otettiin nestetaso- ja TEWL-mittaukset Lopullinen tulos oli aritmeettinen keskiarvo (jokaisesta vapaaehtoisesta) viidestä riippumattomasta mittauksesta (ihon kosteus) ja 20 mittauksesta (TEWL).

3.9. Uutteita sisältävien mallikosmetiikan (meikinpoistoaineen) valmistus

Mallikosmetiikka (meikinpoistoaine) valmistettiin. Kaikki käytetyt komponentit olivat EcoCert- ja COSMOS-vaatimusten mukaisia. Koostumus on esitetty taulukossa 7.

Tuote valmistettiin sekoittamalla aineosat (kohdasta 1 kohtaan 6) huoneenlämpötilassa, kunnes saatiin homogeeninen neste. Viimeisessä vaiheessa formulaation pH säädettiin. Meikinpoistoaine jaettiin osiin. Kuhunkin osaan lisättiin 1 prosentin määrä uutteen kantaliuoksia ja sekoitettiin perusteellisesti.

3.10. Uutteita sisältävien uutteiden ja kosmetiikan (meikinpoistoaineet) väriparametrien määrittäminen

Näytteitä uutteista ja kosmeettisista uutteista testattiin huoneenlämmössä 48 tuntia valmistuksen jälkeen. Väriparametrien (CIELAB-koordinaatit) arvioimiseen käytettiin CHROMA METER CR-400 -laitetta (Konica Minolta, Sensing Inc., Tokio, Japani). Kansainvälinen valaistuskomissio määritteli CIELAB-järjestelmän vuonna 1978. Se perustuu kolmeen väriattribuuttiin: L*, a*,b, jossa L* on Munsell-järjestelmän arvoon verrannollinen kirkkausmuuttuja ja a* ja b* ovat kromaattisia koordinaatteja. A*- ja b*-koordinaatit osoittavat paikat punaisella/vihreällä ja keltaisella/sinisellä akselilla (plus a=punainen, -a=vihreä; plus b=keltainen, - b =sininen).

Saatujen tietojen perusteella: L*, a* ja b* laskettiin seuraavat väriparametrit: kroma (C*) ja sävy (h). Käytettiin seuraavia yhtälöitä:

4. Johtopäätökset

Saatujen tulosten perusteella voidaan päätellä, että testatuissa kasviuutteissa on useita positiivisia ominaisuuksia, joiden ansiosta niitä voidaan käyttää kosmetiikan valmistuksessa turvallisena ja bioaktiivisena ainesosanaan. On osoitettu, että nämä kasvit ovat rikas polyfenolien lähde, mikä antaa niille antioksidanttisia ominaisuuksia. PRE osoitti parhaan kyvyn poistaa vapaita radikaaleja, mikä johtuu luultavasti siitä, että se sisältää eniten polyfenoleja muihin kasveihin verrattuna. PGE ja PRE osoittivat parhaan kyvyn vähentää ROS-tuotantoa soluissa. Lisäksi kasveilla ei ole sytotoksista aktiivisuutta. Kaikki testatut uutteet osoittivat estävää vaikutusta elastaasi- ja kollagenaasientsyymeihin, ja P. granatumilla ja GGE:llä oli suurin estävä vaikutus. Tämä saattaa viitata siihen, että näitä kasveja voidaan käyttää kosmetiikassa ikääntymisprosesseja hidastavina aineina. Lisäksi saadut tulokset osoittavat, että näillä kasveilla on anti-inflammatorisia ominaisuuksia. Tässä tapauksessa CTE ja KTE näyttivät olevan parhaita. KTE ja PGE osoittivat suojaavaa vaikutusta UV-säteilyä vastaan, jopa alhaisilla pitoisuuksilla. Suuremmilla pitoisuuksilla kaikilla kasveilla oli UV-suojavaikutus. Lisäksi kasveilla oli positiivinen vaikutus ihon kosteuttamiseen ja ne vähensivät transepidermaalista vedenhukkaa. PRE-, KTE- ja CTE-uutteita voidaan käyttää tehokkaina väriaineina kosmetiikkatuotteissa. Edellä mainittuja uutteita sisältävälle mallinesteelle meikinpoistoon oli ominaista voimakas ja ajan mittaan vakaa väri. PGE- ja GGE-uutteita sisältävien kosmetiikkatuotteiden värin voivat havaita vain kokeneet tarkkailijat, eivätkä ne poikkea merkittävästi kosmeettisesta nollanäytteestä ilman uutteen lisäystä. Kaikki saadut tulokset huomioon ottaen voidaan päätellä, että Papaver rhoeasa, Clitoria ternateaa ja Carthamus tinctoriusta voidaan menestyksekkäästi käyttää keltaisen, oranssin, sinisen ja violetin väriaineen lähteenä turvallisten kosmetiikkatuotteiden valmistuksessa, ja Lisäksi sillä on positiivinen vaikutus ihoon.

Tämä artikkeli on poimittu julkaisusta Molecules 2022, 27, 922. https://doi.org/10.3390/molecules27030922 https://www.mdpi.com/journal/molecules