Lysosomaalinen lipidiperoksidaatio säätelee kasvaimen immuniteettia

Palmitoyyliproteiinitioesteraasi 1:n (PPT1) estäjien, kuten DC661, aiheuttama lysosomaalinen esto voi aiheuttaa solukuoleman, mutta tämän mekanismia ei täysin ymmärretä. Ohjelmoituja solukuolemareittejä (autofagia, apoptoosi, nekroptoosi, ferroptoosi ja pyroptoosi) ei vaadittu DC661:n sytotoksisen vaikutuksen saavuttamiseksi. Katepsiinien esto tai raudan tai kalsiumin kelatointi ei pelastanut DC661--indusoitua sytotoksisuutta. PPT1:n esto aiheutti lysosomaalisen lipidien peroksidaatiota (LLP), mikä johti lysosomaaliseen kalvon permeabilisaatioon ja solukuolemaan, jonka antioksidantti N-asetyylikysteiini (NAC) saattoi kumota, mutta ei muut lipidien peroksidaatioantioksidantit. Lysosomaalista kysteiinin kuljettajaa MFSD12 tarvittiin NAC:n lysosomaaliseen kuljetukseen ja LLP:n pelastamiseen. PPT1-inhibiitio tuotti solun sisäisen immunogeenisyyden kalretikuliinin pintaekspression kanssa, joka voitiin kääntää vain NAC:lla. DC661-käsitellyt solut vaikuttivat naiiveihin T-soluihin ja tehostivat T-soluvälitteistä toksisuutta. Hiiret, jotka oli rokotettu DC661-käsitellyillä soluilla, aiheuttivat adaptiivisen immuniteetin ja kasvaimen hyljinnän "immuunikuumissa" kasvaimissa, mutta eivät "immuunikylmissä" kasvaimissa. Nämä havainnot osoittavat, että LLP ajaa lysosomaalista solukuolemaa, ainutlaatuista immunogeenistä solukuoleman muotoa, mikä osoittaa tietä immunoterapian ja lysosomaalisen eston rationaalisiin yhdistelmiin, joita voidaan testata kliinisissä tutkimuksissa.

Cistanche tubulosa-Antitumorin edut

Johdanto

Rohkaiseva aktiivisuus kliinisissä kokeissa, joihin liittyy lysosomaalista inhibiittoria hydroksiklorokiinia (HCQ) (1), palmitoyyliproteiinitioesteraasi 1:n (PPT1) tunnistamista klorokiinijohdannaisten molekyylikohteena (2) ja uusien PPT1-estäjien tuomista kliiniseen käyttöön. tutkimuksissa (3, 4), on tarve ymmärtää mekanismi, jolla lysosomaaliset inhibiittorit indusoivat solukuolemaa, ja lysosomaalisen eston vaikutus kasvaimen immuniteettiin. HCQ:lle kuvattu lysosomaalisen solukuoleman kanoninen mekanismi sisältää lysosomaalisen kalvon permeabilisaation (LMP), katepsiinien vuotamisen ja kaspaasivälitteisen apoptoosin aktivoitumisen (5, 6). Olemme aiemmin osoittaneet, että lysosomaalinen estäjä DC661 tunkeutuu soluihin happamassa kasvainmikroympäristössä ja lokalisoituu lysosomiin tehokkaammin kuin HCQ (2, 7). DC661 tuottaa voimakkaan solukuoleman monissa syöpäsolulinjoissa (2). DC661 sitoo ja estää PPT1:tä, vähentää happamuutta lysosomista ja estää autofagiaa. DC661 indusoi myös LMP:tä ja lisää pilkkoutuneen kaspaasi 3:n tasoja (2, 7). Viime vuosina on määritelty uusia solukuoleman mekanismeja, joilla on immunogeenisiä seurauksia ja joihin kuuluvat nekroptoosi, ferroptoosi ja pyroptoosi (8). Lysosomista riippuvaisen autofagian on osoitettu hajottavan MHC-luokan I (9) sekä immunoproteasomin komponentteja (10), mikä viittaa siihen, että autofagian esto voi tehostaa antigeenin prosessointia. Lysosomaalisen eston ja siitä johtuvan solukuoleman immunogeenisiä vaikutuksia ei kuitenkaan ole täysin karakterisoitu. Tämän tietovajeen korjaamiseksi tutkimme DC661:n vaikutuksia kanonisiin solukuoleman mekanismeihin määrittääksemme, onko lysosomaalinen solukuolema sen solukuoleman muoto vai yksinkertaisesti jonkin muun vakiintuneen mekanismin esiaste. Havaitsimme, että HCQ ja DC661 indusoivat merkittävän lisäyksen vain pienessä määrässä proteiineja melanoomaproteomissa ja useimmat näistä olivat autofagiaan ja apoptoosiin liittyviä proteiineja. Ohjelmoidun solukuoleman estäjät (apoptoosi, nekroptoosi, ferroptoosi ja pyroptoosi) eivät lieventäneet sytotoksisia vaikutuksia DC661:n aiheuttaman lysosomaalisen vajaatoiminnan jälkeen. Lysosomaalinen lipidiperoksidaatio (LLP) on LMP:n aiheuttaman solukuoleman päätekijä, joka liittyy kalretikuliinin (CALR) ilmentymiseen solun pinnalla. Tämä solukuoleman muoto voidaan kääntää vain käyttämällä antioksidanttia N-asetyylikysteiiniä (NAC). NAC-aktiivisuutta heikensi lysosomaalisen kysteiinin tuojan MFSD12:n esto. LLP sai aikaan immunogeenisiä fenotyyppejä, jotka edistävät T-soluvälitteistä tappamista. Nämä havainnot osoittavat, että lysosomaalinen solukuolema on potentiaalisesti ainutlaatuinen immunogeenisen solukuoleman muoto.

cistanche-kasveja lisäävä immuunijärjestelmä

Tulokset

Lysosomaalinen esto indusoi merkittäviä muutoksia proteomissa, jotka liittyvät autofagiaan ja apoptoosiin. Lysosomaalisten estäjien sytotoksisten vaikutusten selvittämiseksi arvioimme vakuolaarisella H+-ATPaasi-inhibiittorilla bafilomysiini-A1:llä käsiteltyjen haimasyöpäsolulinjojen A375P, RKO paksusuolensyövän ja MIA PaCa-2 elinkelpoisuuden. 00 nM); PPT1-estäjät DC661 (3 μM) tai HCQ (10 μM tai 30 μM); palmitaattia jäljittelevä heksadekyylisulfonyylifluoridi (HDSF; 60 µM); katepsiini-inhibiittorit pepstatiini A (PepA; 10 ug/ml), E64 (PepA; 10 ug/ml) tai PepA+E64; ja lysosomaalista kalvoa rikkovaa Leu-Leu-metyyliesterihydrobromidia (20 µM) 48 tunnin ajan. Vain bafilomysiini-A1 ja DC661 aiheuttivat merkittävää laskua solujen elinkelpoisuudessa syöpäsolulinjoissa (kuva 1A ja täydentävä kuva 1A; lisämateriaalia saatavilla verkossa tämän artikkelin yhteydessä; https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1), DC661:n tuottamana syvällisempää solujen elinkelpoisuuden vähenemistä kuin bafilomysiini-A1. Näiden tietojen ja klorokiinijohdannaisten farmakologisten lääkemäisten ominaisuuksien perusteella keskitimme tutkimuksemme klorokiinijohdannaisiin työkaluina lysosomaalisen solukuoleman ymmärtämiseen. Puolueetonta globaalia proteomianalyysiä sovellettiin A375P-melanoomasoluihin, joita oli käsitelty DC661:llä (3 μM) tai vähemmän tehokkaalla HCQ:lla (10 μM tai 30 μM) 24 tunnin ajan. 4 264 korkean luotettavuuden kvantitatiivisesta proteiinista vain 87 ja 55 proteiinia lisääntyivät merkittävästi DC661:llä (3 µM) ja HCQ:lla (30 µM). lisäksi 14 ja 15 proteiinia vähenivät merkittävästi DC661:llä (3 μM) ja HCQ:lla (30 μM) (absoluuttinen kertamuutos suurempi kuin 2; q < 0,05) DC661:llä (3 μM) tai HCQ:lla (30 μM). , verrattuna ajoneuvon ohjaukseen. Pienempi HCQ-annos (10 µM) ei osoittanut merkittäviä proteiinimuutoksia vehikkelikontrolliin verrattuna. 50 parasta proteiinia, jotka lisääntyivät merkittävästi DC661-hoidon jälkeen, liittyivät pääasiassa autofagiaan ja apoptoosiin, ja samanlaisia ​​muutoksia havaittiin suuremmalla HCQ-annoksella (kuva 1B). Näistä syistä päätimme keskittyä jatkotutkimuksiin tehokkaampaan DC661:een. Esimerkkejä suurimmista autofagiaan ja apoptoosiin liittyvistä proteiinimuutoksista olivat tax1-sitova proteiini 1 (TAX1BP1; lisääntynyt 15--kertaisesti); BCL2-vuorovaikuttava proteiini 3 (BNIP3; lisääntynyt 6--kertaiseksi); BRCA1-geenin 1 proteiinin naapuri (NBR1; lisääntynyt 12--kertaiseksi); sekvestosomi-1 (SQSTM1/p62; lisääntynyt 5-kertaisesti); ydinreseptorin koaktivaattori 4 (NCOA4; lisääntynyt 3--kertaiseksi); ja LC3B (MAP1LC3B; lisääntynyt 3--kertaiseksi). Apolipoproteiini B-100 (APOB; lisääntynyt 66--kertaiseksi) oli peräisin vasikan sikiön seerumista, eikä sitä tutkittu enempää. Immunoblottaus vahvisti, että hoito DC661:llä tai korkeammilla HCQ-pitoisuuksilla lisäsi merkittävästi autofagialastireseptorien NBR1, TAX1BP1, SQSTM1/p62 ja NCOA4 ilmentymistä annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (lisäkuva 1, B ja C). PPT1:n CRISPR/Cas9 KO A375P-soluissa fenokopioi DC661:n vaikutukset näihin proteiineihin verrattuna niiden WT-vastineisiin (täydentävä kuva 1D). Kuitenkin autofagia-lastireseptorien ilmentyminen ja DC661-hoidon aiheuttamat suhteelliset lisäykset vaihtelivat paksusuolen syövän, haimasyövän ja muiden melanoomasolulinjojen välillä, joissa DC661 osoittaa sytotoksisuutta (täydentävä kuva 1E). Tämä viittasi siihen, että autofagia-lastireseptorit itse, vaikka ne lisääntyivät proteiinitasolla, eivät todennäköisesti ole vastuussa solukuolemasta DC661-hoidon jälkeen. Tämän vahvistamiseksi keskityimme autofagia-lastireseptoreihin TAX1BP1 ja BNIP3, koska niillä on tunnettuja proapoptoottisia vaikutuksia syöpäsoluissa (kuva 1C). TAX1BP1 on autofagian lastiadapteri (11) ja säätelee myös proteiinisynteesin estäjien tai DNA:ta vaurioittavien aineiden indusoimaa apoptoosia syöpäsoluissa (12). TAX1BP1:n tuhoutuminen siRNA:lla (kuva 1D) ei vaikuttanut DC{119}}-indusoituun sytotoksisuuteen lyhytaikaisissa (kuva 1E) ja pitkän aikavälin elinkelpoisuusmäärityksissä (kuva 1F). Nämä tulokset osoittivat, että TAX1BP1:llä ei ole olennaista roolia DC{126}}välitteisessä sytotoksisuudessa. BNIP3 on proapoptoottinen proteiini, joka heikentää mitokondrioiden bioenergetiikkaa ja säätelee mitofagiaa (13). BNIP3:n tehokas tuhoutuminen (kuva 1G) ei vaikuttanut DC{131}}indusoituun sytotoksisuuteen (kuvat 1, H ja I). Nämä tulokset osoittivat, että DC661:n sytotoksiset vaikutukset ovat riippumattomia BNIP3:n ilmentymisestä. Seuraavaksi tutkimme autofagosomien tuotantoon tarvittavien kanonisten autofagiageenien solujen tyhjentämisen vaikutuksia DC661:n tehokkuuteen kaatamalla unc{136}}, kuten autofagiaa aktivoivan kinaasi 1:n (ULK1) ja autofagiaan liittyvän geenin 7 (ATG7). ULK1:n tai ATG7:n tehokas tuhoutuminen (lisäkuva 2, A ja B) esti autofagista virtausta (täydentävä kuva 2C), mutta ei vaikuttanut DC{146}}-indusoituun sytotoksisuuteen (kuva 1, J–M). Nämä tulokset osoittivat, että olennaisen ydinautofagiakoneiston puuttuminen ei kumoa DC661:n sytotoksisia vaikutuksia. DC661:n lysosomaalinen esto indusoi useita ohjelmoituja solukuolemareittejä. Kanoninen näkemys on, että lysosomaalinen solukuolema johtuu apoptoosista (5). Immunoblottaus paljasti, että DC661-hoito johti kaspaasin -3, -7 ja -9 aktivaatioon ja PARP-1:n pilkkoutumiseen, mikä vahvistaa, että DC661 aktivoi apoptoosin (kuva 2A). Pan-kaspaasin estäjä Z-VAD-FMK esti DC661:n kaspaasin aktivoitumisen, mutta ei estänyt LC3B:n ja p62:n kertymistä, mikä osoittaa, että apoptoosin aktivaatio ja autofagian salpaus ovat erotettavissa lysosomaalisen eston jälkeen (kuva 2B). Apoptoosin estäminen ZVAD-FMK:lla ei tehostanut tai rajoittanut DC661:n sytotoksisuutta, mikä viittaa siihen, että apoptoosi on välttämätön lysosomaalisen solukuoleman kannalta (kuvio 2, C ja D). DC661:n sytotoksiset vaikutukset olivat samankaltaisia ​​Bax/Bak-kaksois-KO primaarisissa luuydinsoluissa, jotka eivät kyenneet käymään läpi apoptoosia, ja WT-soluissa (kuvio 2E). Apoptoosin esto ei vaikuttanut DC661-indusoituun sytotoksisuuteen myöskään paksusuolensyövän ja haimasyövän soluissa (täydentävä kuva 2, D–F). Koska havaitsimme apoptoosin välttämättömäksi DC661-indusoidussa solukuolemassa, tutkimme, aiheuttaako DC661 nekroptoosia, toista ohjelmoidun solukuoleman muotoa, jota säätelevät reseptoriin vuorovaikuttava proteiinikinaasi (RIPK) ja sekalinjainen kinaasidomeenin kaltainen proteiini ( MLKL). RIPK:n ja MLKL:n fosforyloituneiden ja aktivoitujen muotojen tasot nousivat DC661-hoidon jälkeen 0,1–1 μM (kuva 2F). Konsentraatiolla 3 µM DC661:tä ei esiintynyt fosforyloitua RIPK1:tä, mutta pysyvää fosforyloitua MLKL:ää, mikä viittaa siihen, että tällä korkeammalla pitoisuudella voi esiintyä muita solukuoleman muotoja. Esikäsittely RIPK1-estäjillä necrostatin{186}} tai necrostatin-1s tai MLKL-estäjän nekrosulfonamidilla esti RIPK1:n fosforylaation DC661-hoidon (1 µM) jälkeen melanoomasoluissa (kuva 2G), mutta ei pelastanut DC{{192:ta }}indusoitu sytotoksisuus melanoomasoluissa (kuvio 2H) tai paksusuolen syövässä tai haimasyöpäsoluissa (täydentävä kuva 2G). Nämä havainnot viittaavat siihen, että nekroptoosi aktivoituu, mutta se on tarpeeton DC{195}}välitteisen solukuoleman vuoksi.

Kuva 1. Lysosomaalinen autofagian esto indusoi merkittäviä muutoksia apoptoosissa ja autofagiaproteiineissa. (A)

Lysosomit ovat yksi tärkeimmistä raudan varastointipaikoista. Epäsäännelty solunsisäinen rauta-aineenvaihdunta yhdistettynä vähentyneeseen pelkistyskykyyn voi laukaista ei-apoptoottisen solukuoleman, joka tunnetaan nimellä ferroptoosi. Ferroptoosin tunnusmerkki on prostaglandiini-endoperoksidisyntaasi 2:n (PTGS2), kationinkuljetussäätelijähomologin 1 (CHAC1) ja kysteinyyli-tRNA-syntetaasin (CARS) lisääntyminen (14). Kaikki kolme näistä ferroptoosimarkkereista lisääntyivät transkriptionaalisesti DC661-käsittelyllä (kuva 3A), mikä viittaa siihen, että lysosomaalinen esto indusoi ferroptoosia. DC661 indusoi fluoresenssisiirtymän C11-BODIPY-käsitellyissä A375P-soluissa, mikä osoittaa ferroptoosille ominaista lipidiperoksidaatiota. Tämä DC661-indusoitu muutos kääntyi merkittävästi päinvastaiseksi, kun ferroptoosi-inhibiittorit ferrostatiini-1 tai huuliroksstatiini-1 annettiin tehokkaana pitoisuutena (kuva 3B ja täydentävä kuva 3A), mikä osoittaa edelleen, että DC661 aiheuttama ferroptoosi. Ferroptoosin esto ei kuitenkaan pelastanut DC661:een liittyvää sytotoksisuutta (kuvio 3, C ja D). Syöpäsolujen yhteiskäsittely rautakelaattorilla deferoksamiinilla (DFO) ja DC661:llä ei pelastanut DC661:n sytotoksisuutta (kuvio 3E). Hoito ferrostatiinilla-1, huulikorksstatiinilla-1 tai DFO:lla ei pelastanut DC661:n lyhytaikaisen elinkelpoisuuden tai pitkäaikaisen klonogeenisen kasvun estoa melanooma-, paksusuolen- ja haimasyöpäsoluissa (täydentävä kuva 3, B –E ja lisäkuva 4, A–D). Nämä tiedot osoittavat, että ferroptoosi on aktivoitu, mutta se on tarpeeton DC661-välitteisen solukuoleman vuoksi. Pyroptoosi on ohjelmoidun solukuoleman muoto, joka liittyy tulehdusvasteeseen, johon liittyy gastriinia (GSDM) prosessoivien kaspaasien aktivoituminen, mikä mahdollistaa huokosten muodostumisen plasmakalvolle ja myöhemmän vaurioon liittyvien molekyylikuvioiden, kuten korkean liikkuvuuden, vapautumisen. ryhmälaatikko 1 (HMGB1). DC661-hoito useissa melanoomasolulinjoissa (A375P, A375, WM35 ja WM793) johti pyroptoosille tyypillisen initiaattorikaspaasin-8 ja -9 sekä teloittajakaspaasin-7 aktivoitumiseen ja muodostumiseen. täyspitkän GSDME:n pilkkominen, saman verran kuin tunnetut pyroptoosin indusoijat PLX4720 ja PD0325901 (täydentävä kuva 5A). DC661 tuotti voimakkaamman solunulkoisen HMGB1:n vapautumisen kuin tunnettu pyroptoosin indusoija, BRAF ja MEK:n esto 1 % FBS:ssä (15), mikä kuvastaa aktivoidun pyroptoosin toiminnallista seurausta. Seuraavaksi testasimme, parantaisiko pyroptoosin estäminen GSDME KO:lla DC661:n sytotoksisia vaikutuksia. DC661-hoito indusoi LC3II:n ja SQSTM1/p62:n kertymistä ja kaspaasin aktivaatiota, mutta HMGB1:n vapautuminen kumottiin lähes kokonaan GSDME-KO WM35-ihmissoluissa, mikä osoittaa, että pyroptoosin estämisen toiminnallinen seuraus saavutettiin (kuva 3F). DC661-käsittely tuotti kuitenkin saman sytotoksisuuden YUMM1.7 WT:ssä, tyhjässä vektorissa (EV) ja Gsdme KO1- ja KO2-soluissa sekä 10 %:n että 1 %:n FBS-olosuhteissa (kuvio 3G ja täydentävä kuva 5B). Yksi yleinen seuraus useista solukuoleman muodoista on LDH:n vapautuminen. DC661 lisäsi merkittävästi LDH:n vapautumista, eikä tätä voitu kumota apoptoosin, nekroptoosin tai ferroptoosin estämisellä (täydentävä kuva 5C). Nämä tulokset osoittivat, että DC661 indusoi useita solukuoleman muotoja, mukaan lukien apoptoosin ja pyroptoosin sekä nekroptoosin ja ferroptoosin, mutta mitään näistä solukuoleman muodoista ei vaadita DC{73}}-indusoituun solukuolemaan. Katepsiinin esto tai kalsiumkelaatio ei estä solukuolemaa lysosomaalisen kalvon läpäisevyyden aiheuttamasta solukuolemasta. Osoitettuamme, että kaspaasin aktivaatio (jota tarvitaan apoptoosiin ja pyroptoosiin) on välttämätön DC661--indusoidussa solukuolemassa, oletimme, että katepsiinin vapautuminen lysosomeista voisi aiheuttaa kaspaasista riippuvaisen solukuoleman. PPT1:n kemiallinen (DC661) tai geneettinen (PPT1 siRNA [siPPT1]) esto aiheutti lysosomaalisen kalvon läpäisevyyden (LMP), kun taas HDSF, vähemmän voimakas irreversiibeli PPT1:n estäjä, joka kuluu nopeasti soluviljelmässä, ei pystynyt indusoimaan LMP:tä mitattuna. galektiini-3-positiivinen puncta (kuva 4A). LMP johtaa katepsiinien ja muun lysosomaalisen sisällön vapautumiseen sytoplasmaan, ja sen uskotaan olevan lysosomiin perustuvan solukuoleman keskeinen proksimaaliominaisuus. DC661:n indusoima LMP liittyi merkittävään lisääntymiseen sytoplasmisessa katepsiini-L-aktiivisuudessa, joka estyi merkittävästi kysteiiniproteaasi-inhibiittorilla E64 (kuvio 4B). Aiemmat raportit ovat ehdottaneet, että katepsiinin vapautuminen murtuneista lysosomeista edistää kaspaasin aktivaatiota, mikä johtaa apoptoottiseen solukuolemaan (16–18). Täydellinen katepsiinin esto ei estänyt kaspaasin pilkkoutumista (kuva 4C) eikä pelastanut DC661--indusoitua sytotoksisuutta lyhyt- ja pitkäaikaisissa elinkelpoisuusmäärityksissä melanoomassa (kuva 4, D ja E), paksusuolensyövässä ja haimasyövässä syöpäsolut (lisäkuva 6, A–C). Nämä tulokset vastustavat kanonista näkemystä lysosomaalisesta solukuolemasta katepsiinivälitteisen solukuoleman aiheuttamana. Katepsiinin vapautumisen vuotavista lysosomeista lisäksi kalsiumin vapautuminen lysosomeista on osallisena solujen toimintahäiriöihin, kun PPT1 on heikentynyt (19). DC661-käsittely johti laajaan kalsiumin vapautumiseen, joka kumosi solun pysyvän kalsiumin (Ca{101}}) kelaattorin BAPTA-AM:n esikäsittelyllä. (Kuva 4F). Erityisesti BAPTA-AM ei estänyt DC661-indusoitua LMP:tä (kuva 4G) tai kaspaasin pilkkoutumista (lisäkuva 6, D ja E) ja mikä tärkeintä, se ei pelastanut DC{108}}indusoitua sytotoksisuutta ( Kuva 4H). Nämä löydökset havaittiin myös sekä RKO- että MIA PaCa-2-solulinjoissa, joissa ei havaittu merkittäviä eroja IC50-arvoissa BAPTA-AM:lla ja DC661:llä (täydentävä kuva 6F), mikä viittaa siihen, että LMP:hen liittyvä solukuolema ei riipu kalsiumista tai katepsiineista.

Kuva 2. DC661-indusoitu apoptoosi ja nekroptoosi. (A)

Kuva 3. DC661-indusoitu ferroptoosi ja pyroptoosi. (A)

LLP ajaa LMP:tä. Todettuaan tärkeimpien solukuolemareittien (apoptoosi, nekroptoosi, ferroptoosi ja pyroptoosi), katepsiinien (PepA ja E64) ja ionikelaattoreiden (BAPTA-AM [Ca2+] ja DFO [Fe{{3}) estäjät. }]) ei estänyt DC661:n aiheuttamaa solukuolemaa, ja kun havaitsimme todisteita C-11-BODIPY:n aiheuttamasta lipidiperoksidaatiosta, suoritimme globaalin lipidomianalyysin 2 ja 4 tuntia DC661-hoidon jälkeen. DC661 indusoi varhaista ja jatkuvaa 3--10--kertaista kasvua kaikissa lysofosfolipidiluokissa (kuva 5A). Sitä vastoin fosfolipidiluokissa havaittiin minimaalisia tai ei ollenkaan muutoksia, mukaan lukien fosfatidyylikoliini, fosfatidyylietanoliamiini, fosfatidyyliseriini, fosfatidyyli-inositoli, fosfatidyyliglyseroli ja fosfatidihappo (täydentävä kuva 7A). Lysofosfolipidilajeja voidaan tuottaa ROS:lla, joka hapettaa tyydyttyneen rasvahappoketjun, jonka fosfolipaasit sitten pilkkovat (20). Sen määrittämiseksi, voisivatko antioksidantit estää ROS-välitteisen lipidivaurion, tutkimme DC661--indusoitua sytotoksisuutta pan-ROS-sieppaajan N-asetyylikysteiinin (NAC) (21, 22) ja oletettujen lipidiperoksidaatioestäjien Troloxin (23) läsnä ollessa. ) ja C-vitamiini (askorbiinihappo) (24, 25). Toisin kuin muut tähän mennessä testatut aineet, yhteiskäsittely NAC:lla pelasti DC661--aiheisen sytotoksisuuden useissa solulinjoissa (kuva 5B ja täydentävä kuva 7B). Pitkäaikaiset CFU-määritykset osoittivat, että NAC, toisin kuin kaikki tässä testatut solukuoleman estäjät, ionikelaattorit ja katepsiini-inhibiittorit, esti DC661:n sytotoksiset vaikutukset A375P-, RKO-, MIA PaCa-2-, B16F10- ja MC38-soluissa ( Kuva 5C ja lisäkuva 7C). Mielenkiintoista on, että Trolox ja C-vitamiini eivät pelastaneet DC661:n sytotoksisuutta ihmisen melanoomassa, paksusuolensyövässä, haimasyöpäsoluissa ja hiiren melanoomassa ja paksusuolen syöpäsoluissa (kuva 5D ja täydentävä kuva 7, D – H). Tämä ero sai meidät testaamaan, vaikuttivatko NAC, Trolox ja C-vitamiini LMP:hen. Tuloksemme osoittivat, että NAC oli ainoa antioksidantti, joka vähensi merkittävästi DC661--indusoitua LMP:tä (kuva 5E). Oletimme, että LLP ohjaa LMP:n tuotantoa DC661:n avulla, jonka NAC voi kumota, mutta Trolox ja C-vitamiini eivät. Tutkiaksemme LLP:n prosessia käytimme fluoresoivaa koetinta FOAM-LPO (26), joka paikantuu spesifisesti lysosomiin ja tuottaa spektrisiirto 586 nm:stä 512 nm:iin (punaisesta vihreään), kun se altistetaan lipidiperoksideille. Havaitsimme, että DC661 indusoi LLP:tä kontrolliin verrattuna (kuvio 5F). NAC vähensi lipidiperoksidaatiota DC661-käsiteltyjen melanoomasolujen lysosomeissa, kun taas Trolox ja C-vitamiini eivät pystyneet vähentämään LLP:tä (kuva 5F). NAC:lla, Troloxilla ja C-vitamiinilla ei yksinään ollut merkittävää vaikutusta lipidien peroksidaatioon. PPT1:n tuhoaminen (täydentävä kuva 8A) tai käsittely korkeilla HCQ-pitoisuuksilla (lisäkuva 8B) indusoi myös LMP:tä, jonka NAC pystyi kääntämään, kun taas ULK1:n kemiallinen esto ei indusoinut LMP:tä (täydentävä kuva 8C). Tärkeää on, että siPPT1:n kaatuminen sisälsi myös LLP:n, joka voitiin kääntää NAC:lla (täydentävä kuva 8D). Nämä tulokset osoittivat, että PPT1:n esto indusoi LLP:tä, jonka NAC voi pelastaa, ja se on todennäköisesti syy PPT1--estämisen aiheuttamaan LMP:hen. Lisäksi nämä havainnot viittasivat siihen, että LLP on kriittinen lysosomaalisten solujen kuolemalle.

Kiinan yrtti cistanche kasvi-Antitumor

MFSD12:n kysteiinin tuonti lysosomeihin heikentää lysosomaalisten solujen kuolemaa. Kolmesta lipidiperoksidaatio-inhibiittorista vain NAC esti LLP:tä. Äskettäinen raportti osoitti, että pääasiallinen fasilitaattori-superperhedomeeni, joka sisältää 12:ta (MFSD12), on olennainen komponentti lysosomien ja melanosomien kysteiinin tuojassa (27). Arvelimme, että NAC tai sen metaboliitti kysteiini kuljetetaan lysosomiin MFSD12:n kautta, jossa kysteiini hapettuu disulfidiksi, kysteiiniksi. Tämän hypoteesin testaamiseksi vertailimme NAC:n kykyä pelastaa DC661-sytotoksisuutta siNT- ja siMFSD12 A375P-hGal3-EGFP-soluissa. Tuloksemme osoittivat, että NAC pelasti DC661-indusoidun LMP:n siNT-soluissa, mutta ei pelastanut LMP:tä siMFSD12-soluissa (kuva 6A). NAC vähensi DC661-käsiteltyjen siNT-A375P-solujen, mutta ei siMFSD12-solujen, LLP:tä. siMFSD12-soluilla, joita oli käsitelty DMSO:lla tai NAC:lla, oli lisääntynyt perus-LLP (kuvio 6B) verrattuna siNT-soluihin. Vaikka NAC pelasti DC661:n sytotoksisuuden siNT-soluissa, NAC:n kyky pelastaa DC661:n sytotoksisuus kumottiin kokonaan siMSFD12-soluissa (kuvio 6C). Tämä osoitti, että MFSD12 knockdown estää NAC:n sytoprotektiiviset vaikutukset DC661:tä vastaan. NAC deasetyloituu sytosolissa olevalla asylaasilla (28). Sen määrittämiseksi, aiheuttaako NAC-käsittely kysteiinin tai kystiinin kertymistä lysosomeihin, käytimme lysosomaalista immunosaostustekniikkaa (Lyso-IP) (29) lysosomien puhdistamiseen DMSO- ja NAC-käsitellyistä A375P-soluista (kuva 6D ja täydennyskuva 9A). kohdennettu metabolomiikka NAC:n ja siihen liittyvien metaboliittien kvantifioimiseksi. Kuten odotettiin, NAC havaittiin NAC-käsitellyssä kokosolulysaatissa ja siihen liittyvissä sitoutumattomissa fraktioissa. L-kysteiinitasot nousivat oleellisesti NAC-käsitellyissä lysosomeissa. L-kystiini oli havaittavissa vain NAC-käsitellyistä lysosomeista. Hämmästyttävästi emme havainneet merkittävää glutationin (vähennetty) nousua NAC-käsitellyissä ryhmissä (kuvio 6E); tämä oli yllättävää, koska yleisesti uskotaan, että NAC-käsittely lisää glutationin tuotantoa ja korjaa redox-tasapainoa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että MFSD12-tuojan kautta lysosomeihin tuotu kysteiini on kriittinen LLP-, LMP- ja lysosomaalisten solukuolemien pelastamiselle. LLP on immunogeeninen. Jotkut DC661:n indusoiman säädellyn solukuoleman muodot (pyroptoosi, nekroptoosi, ferroptoosi) on tunnistettu immunogeenisiksi. Aikaisemmin immunogeeninen solukuolema on kuvattu kemoterapialääkkeille tyypillisten ominaisuuksien perusteella, joihin kuuluvat vaurioon liittyvien molekyylimallien näyttäminen, mukaan lukien CALR:n ilmentyminen solun pinnalla ja HMGB1-proteiinin ja adenosiinitrifosfaatin (ATP) vapautuminen (30). CALR toimii "syö minua" -signaalina, kun se altistuu solun pinnoille solustressin aikana. HMGB1:n ja ATP:n solunulkoinen vapautuminen toimii "löydä minut" -signaalina, jonka fagosyyttisolut tunnistavat. Vertailimme kahta mallia: B16F10-soluja, jotka syngeenisissä kasvainmalleissa ovat lähes täysin vailla kasvaimeen infiltroivia lymfosyyttejä, ja MC38-soluja, joissa syngeenisissä kasvainmalleissa on kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä. Ensin osoitimme, että DC661- tai siPpt1-käsittely indusoi merkittävästi pinta-CALR-ilmentymistä, joka voidaan täysin kumota NAC-yhteishoidolla MC38-soluissa (kuvat 7, A ja B). Samanlaisia ​​löydöksiä havaittiin B16F10-soluissa (kuvio 7C). Pääasiallisten solukuolemareittien (apoptoosi, nekroptoosi, ferroptoosi ja pyroptoosi) estäjät eivät pystyneet estämään CALR:n pintaekspressiota (kuvio 7D). Sen määrittämiseksi, johtuuko DC661:n aiheuttama immunogeeninen solukuolema MHC-luokan I noususäätelystä, B16F10- ja MC38-soluja käsiteltiin DC661:llä (3 μM) tai DMSO:lla 24 tunnin ajan. Havaitsimme, että DC661-hoito ei lisännyt MHC-luokan I ilmentymistä ja immunoproteasomin noususäätelyä (kuvio 7E ja täydentävä kuva 9, B ja C).

Kuva 4. Katepsiinin esto tai kalsiumkelaatio ei estä DC661--indusoitua solukuolemaa. (A)

Ymmärtääksemme autofagian estämisen vaikutukset T-solujen esikäsittelyyn, suoritimme in vitro -aloitus- ja yhteisviljelykokeen käyttämällä C57BL6/J-pernasoluja, kuten aiemmin on kuvattu (31). Esikäsittelyä varten altistimme pernasolut DC661-- tai DMSO-käsitellyille B16F10- tai MC38-soluille. Seuraavaksi näitä pohjustettuja pernasoluja viljeltiin elävien B16F10- tai MC38-solujen kanssa ja sytotoksisuus mitattiin (kuvio 8A). DC661-käsitellyillä B16F10-soluilla pohjustetut pernasolut tuottivat merkittävän lisäyksen IFN-tasoon verrattuna DMSO-käsitellyille B16F10-soluille altistettuihin pernasoluihin. Pohjustettu T-soluvälitteinen proliferoituvien B16F10-solujen tappaminen lisääntyi merkittävästi DC661-pohjustetuissa splenosyyteissä verrattuna DMSO-pohjustettuihin pernasoluihin (kuvio 8, B ja C). DC661:llä käsitellyt MC38-solut tuottivat vielä enemmän IFN- ja pohjustettujen T-solujen sytotoksisuutta verrattuna B16F10-soluihin (kuvio 8, D ja E). NAC-yhteiskäsittely DC661:llä kykeni kumoamaan kokonaan IFN:n vapautumisen pernasoluista ja tylsästi pohjustetun T-solusytotoksisuuden (kuvio 8, F ja G). Kalretikuliinin tuhoaminen siCalrilla MC38-soluissa (täydentävä kuva 9D) kumosi DC661-hoidon esikäsittelytehokkuuden ja vähensi merkittävästi pohjustettujen T-solujen sytotoksisuutta (kuvio 8, H ja I). Yhdessä nämä tiedot tukevat LLP:hen liittyvän CALR-ylössäätelyn mekaanista roolia kasvainsolujen T-soluimmuniteetin edistämisessä. Seuraavaksi laajensimme nämä in vitro -löydökset in vivo -kasvainrokotustutkimukseen immunokompetenteilla ja immuunipuutoshiirimalleilla. Tätä määritystä varten in vitro pakastesulatetut tai DC{40}}käsitellyt B16F10- tai MC38-solut injektoitiin ihonalaisesti vasempaan kylkeen immunokompetenttien C57BL/6- tai NOD/SCID-hiirien suojaamiseksi uudelleenaltistumiselta samantyyppisillä elävillä kasvainsoluilla. 7 päivää myöhemmin oikeaan kylkeen (kuva 9A). DC661-käsitellyt B16F10-solut eivät pystyneet estämään kasvaimen hylkimistä huolimatta in vitro -määrityksistä, mikä viittaa siihen, että DC661 aiheutti immunogeenisen solukuoleman (kuvio 9B ja täydentävä kuva 9E). Sitä vastoin yhden kyljen siirrostaminen DC661-käsitellyillä MC38-soluilla edisti vastakkaiselle kyljelle istutettujen elävien MC38-solujen täydellistä hylkimistä (kuva 9C ja täydentävä kuva 9F). Sen määrittämiseksi, oliko adaptiivinen immuniteetti kriittinen rokotevaikutukselle, jonka DC661 näytti olevan MC38-kasvainten kanssa, toistimme kokeen NOD/SCID-hiirillä. Hämmästyttävästi havaitsimme, että DC661-käsitellyt MC38-solut eivät indusoineet uusiutuvien kasvainten hylkimistä immuunipuutteellisissa NOD/SCID-hiirissä (kuva 9D ja täydentävä kuva 9G), mikä osoittaa, että havaittu rokotevaikutus vaati adaptiivista immuniteettia. Tämän löydön kestävyyden testaamiseksi valitsimme toisen hyvin tunnetun immunogeenisen hiiren syöpäsolulinjan, CT26:n, ja suoritimme rokotuskokeen kuten edellä. Kuten odotettiin, DC661-käsiteltyjen CT26-solujen istuttaminen hiiren toiseen kylkeen tuotti rokotteen kaltaisen vaikutuksen ja esti toiseen kylkeen istutettujen elävien CT26-solujen kasvun (kuva 9E ja täydentävä kuva 9H). Havaintomme viittaavat siihen, että DC661-indusoitu LLP on kriittinen LMP-välitteiselle immunogeeniselle solukuolemalle, joka kumoutuu lysosomaalisen kuljettajan MFSD12:n kysteiinin tuomalla lysosomiin (kuva 9F).

Keskustelu

Lysosomin esto näyttää olevan lupaava terapeuttinen lähestymistapa prekliinisissä tutkimuksissa, ja HCQ:n kliiniset tutkimukset ovat tuottaneet rohkaisevia mutta ristiriitaisia ​​tuloksia (1, 32). PPT1 on HCQ:n molekyylikohde, ja tehokkaammat PPT1-estäjät, kuten DC661 (2) ja GNS561 (3), indusoivat LMP-välitteisen solukuoleman in vitro. Lysosomaalisten solujen kuoleman tarkkaa mekanismia ja sen roolia kasvaimen immunogeenisyydessä ei ole täysin selvitetty. Kasvainten vastainen immuniteetti paranee, kun autofagian esto yhdistetään immunoterapian kanssa (9, 10, 31). Ehdotettuihin mekanismeihin solun sisäiselle immunogeenisyydelle autofagian estämisen jälkeen kuuluvat MHC-luokan I ja immunoproteasomin noususäätely, jotka molemmat tukevat parannettua antigeenin prosessointia ja esittelyä. Lisäksi autofagiaproteiinien häviäminen tai autofagian esto klorokiinilla lisäsi CD8+ T-soluvastetta nostamalla MHC-luokan I pintatasoja dendriittisoluissa (33). Osoitimme aiemmin, että systeeminen PPT1-inhibiitio voi repolarisoida makrofagit M2-fenotyypistä M1-fenotyyppiin. PPT1-estäjät voivat lisätä STING-tasoja, mikä johtaa IFN:n vapautumiseen ja T-soluvälitteisen tappamisen lisääntymiseen melanoomamalleissa (31). Täällä osoitimme, että LLP itse tuottaa kasvainsoluille ominaisen immunogeenisen solukuoleman muodon. Havaitsimme, että lysosomaalinen esto aiheutti hyvin vähän proteiinimuutoksia syöpäsoluissa, ja merkittävimmin kohonneita proteiineja olivat autofagia-lastireseptorit ja apoptoosin säätelijät. Lähestymistapamme, joka kohdistui joihinkin näistä geeneistä eri toimintoihin, osoitti, että lääkkeiden aiheuttamat proteiinit eivät todennäköisesti olleet solukuoleman pääsäätelijät. ULK1:n tai ATG7:n geneettinen esto ei myöskään pelastanut DC661:n sytotoksisuutta. Osoitimme, että lysosomaalinen esto aktivoi useita ohjelmoidun solukuoleman muotoja, mukaan lukien apoptoosi, nekroptoosi, ferroptoosi ja pyroptoosi, mutta jokainen näistä oli välttämätön lääkkeiden aiheuttaman sytotoksisuuden vuoksi. Huomaa, että ohjelmoidut solukuolemamekanismit voivat olla päällekkäisiä ja useiden solukuolemamekanismien kohdentaminen voi tarjota sytosuojauksen solukuolemaa vastaan ​​lysosomaalisen kalvon läpäisevyyden jälkeen. Työmme on sulkenut pois katepsiinista ja kalsiumista riippuvat mekanismit lysosomaalisten solukuolemien kannalta ja korostanut LLP:n merkitystä solukuoleman kriittisenä tekijänä. Löysimme todisteita LLP:stä, joka oli palautuva antioksidantilla, joka kuljetettiin lysosomiin, NAC ja oli kriittinen lysosomaalisen kalvon läpäisevyyden ja sytotoksisuuden kannalta. NAC oli ainoa aine, joka pystyi lieventämään tai kääntämään DC661-indusoitua solukuolemaa, ja tämä kapasiteetti riippui lysosomaalisen kysteiinin kuljettajan MFSD12:n läsnäolosta. Lysosomaalisen tunkeutumisen puute on todennäköistä, miksi muut oletetut lipidiperoksidaation estäjät, Trolox ja C-vitamiini, eivät kyenneet estämään DC661:n sytotoksisuutta. NAC muuttuu kysteiiniksi, joka tuodaan lysosomeihin ja hapettuu disulfidimuotoonsa, kystiiniksi. Kystiini viedään sytosoliin toisen lysosomaalisen kuljettajan, kystinoosin, avulla, jossa se pelkistyy kysteiiniksi, joka mobilisoi uudelleen sisäiset ravintolähteet, aktivoi rapamysiinikompleksin 1 kohteen uudelleen ja edistää autofagiaa (34). Tämä kysteiinin hapettumis-pelkistyskierto kystiiniksi (lysosomit) ja takaisin kysteiiniksi (sytosoliksi) voisi olla NAC:n mahdollinen pelastusmekanismi DC661-sytotoksisuutta tai yleisempää lysosomaalista vauriota vastaan ​​muissa sairaustilanteissa, joissa NAC on osoittautunut hyödylliseksi terapeuttisesti (35). . NAC ei ainoastaan ​​kääntänyt DC661-indusoitua LLP:tä ja LMP:tä, vaan myös immunogeenisen solukuolemamarkkerin kalretikuliinin pintaekspressiota. CALR-proteiinin solupinnan ilmentyminen vaadittiin DC661--pohjaisten pernasolujen indusoiman tehostuneen T-soluvälitteisen sytotoksisuuden vuoksi, mikä osoittaa, että lysosomaalinen esto tuottaa tietyn muodon solun sisäisestä immunogeenisuudesta.

Vaikka aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että lysosomaalinen esto voi tehostaa immuunitarkastuspisteen eston kasvainten vastaista aktiivisuutta vakiintuneissa kyljessä olevissa kasvaimissa (9, 31), tutkimuksemme on tietojemme mukaan ensimmäinen, joka on osoittanut rokotteen kaltaisen vaikutuksen MC38-kasvaimiin, mutta ei B16-kasvaimiin. kasvainsoluja, jotka on esikäsitelty DC661:llä ennen implantaatiota. Tämä osoittaa, että lysosomaalinen solukuolema voi indusoida solun sisäisen immunogeenisyyden, mutta nämä muutokset eivät itsessään ole riittävän todennäköisiä kääntämään "immuunikylmän" kasvaimen mikroympäristön "immuunikuuman" kasvaimen mikroympäristöksi. Aiemmat tutkimuksemme "immuunikylmien" kasvainten mikroympäristömalleilla B16 ja BRafCA PtenloxP Tyr: CreERT2:n geneettisesti muokatuilla hiirimalleilla (31) osoittivat, että systeeminen lysosomaalinen esto aiheutti vaikutuksia kasvaimeen liittyviin makrofageihin ja myeloidisoluista peräisin oleviin suppressorisoluihin, jotka olivat riittäviä tehostamaan immunoterapian tehosta. Voi olla niin, että solun sisäisellä immunogeenisyydellä on myös rooli näissä immuunikylmäkasvaimissa, jotka tulevat herkemmiksi ICD:lle lysosomaalisen eston jälkeen. Kontrolloidussa laboratorioympäristössä havaittu lysosomaalisen eston rokotteen kaltainen vaikutus saattaa siirtyä klinikalle tai ei, mutta se voi selittää, miksi joillakin potilailla, joita hoidettiin dabrafenibillä, trametinibillä ja HCQ:lla aiemmin hoidetussa BRAF-mutanttimelanoomassa, oli niin syvä ja kestävä. reagoivat tähän hoito-ohjelmaan (32). Lisätutkimuksia tarvitaan ymmärtämään, kuinka PPT1:n esto tuottaa lysosomaalista ROS:ää ja lipidiperoksidaatiota. PPT1-riippuvainen V-ATPaasin ja lysosomaalisen happamoitumisen säätely ei ole riittävä selitys, koska bafilomysiini estää lysosomaalista happamoitumista, mutta ei tuota LMP:tä (tietoja ei näytetä). Näiden löydösten vaikutukset viittaavat siihen, että lysosomaaliset estäjät, jotka lisäävät kasvainsolujen luontaista immunogeenisuutta, voidaan rationaalisesti yhdistää hoitoihin, jotka tehostavat T-solujen aktivaatiota tai tunkeutumista kasvaimen mikroympäristöön, mikä saattaa tuottaa synergistisiä vaikutuksia.

Kuva 5. N-asetyylikysteiini estää DC661--indusoitua solukuolemaa. (A)

menetelmät

Soluviljely. Ihmisen A375P (CRL-3224), RKO (CRL-2577), DLD-1 (CCL- 221), MIA PaCa-2 (CRL-1420) ), A549 (CRM-CCL-185) ja hiiren B16F10 (CRL-6475) solulinjat ostettiin ATCC:ltä. Ihmisen A375 (CRL-1619, ATCC), WM35, WM793 ja hiiren YUMM1.7 (WT, Gsdme EV ja Gsdme KO1 ja KO2) linjat hankittiin talon sisällä. Hiiren MC38- ja CT26-solut toimitti Andy Minn, Pennsylvanian yliopisto. FL5.12- ja IL-3-riippuvaiset Bax−/−Bak−/− (Bax/Bak DKO) primaariset luuydinsolut saatiin Kathryn E. Welleniltä, ​​Pennsylvanian yliopistosta. Ihmisen Panc-1 (CRL-1469, ATCC) -solulinjan toimitti Ben Z. Stanger, Pennsylvanian yliopisto. Hiiren YUMMER 1.7 -solulinja saatiin Xiaowei (George) Xu:lta, University of Pennsylvania. Kaikki solulinjat testattiin Mycoplasman varalta kahdesti vuodessa Pennsylvanian yliopiston ydinlaitoksissa ja todennettiin Wistar Institute Genomics -ytimen lyhyellä tandem-toistosormenjäljellä. A375P-, RKO-, DLD-1-, A549-, CT26-, FL5.12- ja Bax/ Bak DKO -solulinjoja viljeltiin RPMI 1640:ssä (Invitrogen, 11875); A375-, MIA PaCa-2-, Panc-1-, B16F10- ja MC38-solulinjoja viljeltiin DMEM:ssä (Invitrogen, 11995); ja YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV ja Gsdme KO1 ja KO2) soluja (15) viljeltiin DMEM/F12 50/50:ssä (Corning, 10-092-CV). Viljelyalustaa täydennettiin 10 %:lla naudan sikiön seerumia (12306C, MilliporeSigma) ja 1x antibioottisella antimykoottiliuoksella (Gibco, 15140-122). FL5.12- ja Bax/Bak DKO-solulinjoja ylläpidettiin täydellisissä RPMI-elatusaineissa, joita oli täydennetty 50 µM -merkaptoetanolilla (Life Technologies, 21985-023), 10 mM HEPES:llä (H3537, MilliporeSigma) ja 0,35 ng/ml ja 3 ng:lla. /mL IL-3, vastaavasti. YUMMER1.7- ja YUMM1.7-solulinjoja (WT, Gsdme EV ja Gsdme KO) ylläpidettiin täydellisessä elatusaineessa, jota oli täydennetty 1 × MEM NEAA:lla (Gibco, 11140-050). WM35- ja WM793-soluja viljeltiin MCDB-elatusaineessa 153 (MilliporeSigma, M7403), joka sisälsi 10 % FBS:ää 1 × Leibovitz L-15 -elatusaineessa (Corning, 10-045-CV), 7,5 % w/v natriumbikarbonaattia ( Corning, 25-035-CI), 1 x antibioottinen antimykoottinen liuos (Gibco, 15140-122) ja 5 ug/ml insuliinia (MilliporeSigma, I0516). Soluja kasvatettiin 37 asteessa 5 % C02:n läsnä ollessa. Kemikaalit ja reagenssit. Ostettuja kemikaaleja olivat HCQ-sulfaatti (Spectrum Chemicals, 747-36-4) ja DC661 (Selleckchem, S8808). Fluo-4, AM (Thermo Fisher Scientific, F14201) käytettiin solujen värjäämiseen kalsiumilla valmistajan ohjeiden mukaisesti. Luettelo vasta-aineista ja estäjistä on lisätaulukossa 1 ja lisätaulukossa 2.

Kuva 6. NAC kääntää LLP:n MFSD12-riippuvaisella tavalla. (A–C)

Proteiinin uutto ja digestio nestekromatografiaa varten – tandem-massaspektrometria-analyysi proteomiikkaa varten. {{0}},7 × 106 A375P-melanoomasolua viljeltiin 60 mm:n viljelymaljoissa. Soluja käsiteltiin DMSO:lla (kontrolli), DC661:llä (3 μM), HCQ:lla (10 μM) tai HCQ:lla (3{{70}} μM) 24 tunnin ajan noin 5{{ 112}}% yhtymä. Jäädytetyt solupelletit hajotettiin liuoksella 50 mM Tris, pH 7,4, 1 % SDS, 15{152}} mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,15 mM PMSF, 1 ug/ml pepstatiinia, ja 1 ug/ml leupeptiiniä. Kirkastetut lysaatit (10 ug kukin) elektroforeesittiin 0,5 cm bis-tris-geeliin, minkä jälkeen kiinnitettiin ja värjättiin kolloidisella Coomassiella. Jokainen 0,5 cm:n geelirata leikattiin, poistettiin värjäys, pelkistettiin tris(2-karboksietyyli)fosfiinilla, alkyloitiin jodiasetamidilla ja digestoitiin trypsiinillä, kuten aiemmin on kuvattu (36). Digestit (1 ug) analysoitiin nestekromatografialla - tandem-massaspektrometrialla (LC-MS/MS) Q-Exactive Plus -massaspektrometrillä (Thermo Fisher Scientific) nanoAQUITY UPLC:n (Waters) mukaisesti. Analyyttinen erotus suoritettiin 1,7 μm × 250 mm Peptide BEH C18 -kolonnilla (Waters, 186003546) käyttämällä 245-minuuttigradienttia 0,1 % muurahaishappoa vedessä (liikkuva faasi A) ja asetonitriili (liikkuva faasi B) seuraavasti: : 5 % – 30 % B 225 minuutin aikana, 30 % – 80 % B 5 minuutin aikana, 15-minuutti pito 80 % B:ssä ja paluu alkutilaan. Täydet MS-spektrit saatiin 70,000 resoluutiolla, skannausalueella 400–2,000 m/z, automaattisen vahvistuksen säätökohteen ollessa 3 × 106 ionia ja maksimiruiskutusajalla 50 millisekuntia. Tiedoista riippuvaiset MS2-spektrit hankittiin 20 eniten esiintyvältä ionilta 17 500:n resoluutiolla, eristysleveydellä 1,5 m/z, automaattisen vahvistuksen säätötavoitteen ollessa 5 × 104 ionia ja maksimiruiskutusajalla 50 millisekuntia. Peptidien yhteensopivuus asetettiin suositeltavaksi, ja osoittamattomat ja kertavaraukselliset ionit hylättiin (37). Raaka MS-data analysoitiin MaxQuant 1.6.5.0:lla (https:// maxquant.net/perseus/) Uniprot-ihmissekvenssitietokannan (saatavilla 10.10.2019) ja yleisen kontaminanttitietokannan kanssa, mukaan lukien trypsiini, keratiinit, naudan proteiinit, ja mykoplasma (38). Haussa käytettiin tryptisen peptidin spesifisyyttä, jossa oli enintään 2 puuttuvaa pilkkomista, kysteiinin kiinteää modifikaatiota (karbamidometylaatio) ja muuttuvaa metioniinin hapetusta tai N-terminaalista asetylaatiota (39). Peptideille ja proteiineille käytettiin 1 % FDR:n rajaa. Match juoksujen välillä oli käytössä; proteiinien määrä määritettiin käyttämällä leimatonta kvantifiointia (40). Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä Perseus 1.6.2.3:a (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Proteiinit vaadittiin tunnistamaan vähintään kolmella ainutlaatuisella peptidillä ja niillä oli kolme kelvollista arvoa (ei-nolla-kvantitaatio) näyteryhmän sisällä, ja kontaminantit ja käänteisproteiinit suodatettiin tietojoukosta. Puuttuvat arvot laskettiin normaalijakaumasta. Olosuhteiden parivertailu suoritettiin proteiinitasolla käyttämällä 2-pyrstöstä Studentin t-testiä permutaatiopohjaisella FDR:llä s0=0.1 ja 250 satunnaistuksilla. Merkittävät muutokset määriteltiin FDR-arvoiksi alle 5 % ja absoluuttiseksi kertaiseksi muutokseksi, joka oli suurempi kuin 1,5 tai 2,0, kuten on määritelty. Lyso-IP. A375P-solut infektoitiin pLJC5-Tmem192-3xHA-lentiviruksella ja valikoitiin käyttämällä 1 mg/ml puromysiiniä (MilliporeSigma, P4512). Noin 3 x 106 HA-merkittyä A375P-solua käsiteltiin joko 10 mM NAC:lla tai vesivehikkelikontrollilla 24 tunnin ajan aiemmin kuvatuissa viljelyolosuhteissa. Käsittelyn jälkeen solut pestiin PBS:ssä, kerättiin 0,5 ml:aan kylmää KPBS:ää ja homogenisoitiin varovasti käyttämällä 20 vetoa 2 ml:n Dounce-homogenisaattorissa. Noin 2,5 % homogenaatista varattiin kokosolulysaattianalyysiin, ja loput sentrifugoitiin 3,{120}}g 2 minuuttia 4 asteessa solukalvojätteen poistamiseksi. Homogenaattisupernatantti siirrettiin sitten puhtaaseen 1,5 ml:n putkeen ja inkuboitiin 50 µl:n anti-HA-helmien (Pierce, 88836) tai anti-DDK/Flag-helmien (OriGene, TA150042) kanssa 15 minuuttia 4 asteessa. Näytteet saostettiin sitten asettamalla putket DynaMagiin (Thermo Fisher Scientific, 12321D) ja keinutettiin kevyesti 2 minuuttia huoneenlämpötilassa. Supernatantti varattiin sitoutumattoman fraktioanalyysiin. IP pestiin 3 kertaa KPBS:llä, joka sisälsi 8 ​​mM CaCl2:a. Lyso-IP uutettiin 80-prosenttiseen MeOH:iin metabolomiikkaanalyysiä varten. Lipidiuutto ja analyysi käyttämällä LC-MS/MS:ää globaalille lipidomille. Melanooma A375P -soluja kylvettiin 60 mm:n maljoille 0,7 x 106 solua maljaa kohti. Kun solut olivat noin 50 % konfluenssissa, niitä käsiteltiin DMSO:lla (kontrolli), DC661:llä (3 µM) tai HCQ:lla (30 µM) 24 tunnin ajan. Solut pestiin 2 kertaa HBSS:llä, kaavittiin jääkylmään metanoliin ja siirrettiin lasiputkiin lipidiuuttoa varten kloroformilla/metanolilla/0,88 % NaCl:lla (2:1:1), joka sisälsi EquiSPLASHin sisäisen lipidistandardin (Avanti Polar Lipids). Näytteitä vorteksoitiin ja sitten sonikoitiin vesihauteessa 5 minuuttia jäillä. Kun oli sentrifugoitu 500 g:llä 15 minuuttia 40 asteessa, alempi faasi siirrettiin toiseen lasiputkeen. Ylempi faasi uutettiin uudelleen käyttämällä synteettistä alempaa faasia. Sonikoinnin ja sentrifugoinnin jälkeen alempi faasi yhdistettiin ensimmäisen alemman faasin kokoelmaan. Näytteet kuivattiin typen alla, suspendoitiin uudelleen 10 % kloroformiin/90 % metanoliin ja siirrettiin lasisiin LTQ-pulloihin. Lipidinäytteet analysoitiin Thermo Fisher Scientific QExactive HF-X -massaspektrometrillä ja Vanquish Horizon UHPLC -järjestelmällä. Analyyttisessä erotuksessa käytettiin Accucore C30 -kolonnia (2,1 mm × 150 mm, Thermo Fisher Scientific), jossa oli 50:50 asetonitriili/vesi ja 88:10:2 isopropanoli/asetonitriili/vesi, joista jokainen sisälsi 5 mM ammoniumformiaattia ja 0,1 % muurahaishappoa. LC-MS/MS-tiedot hankittiin erikseen positiivisissa ja negatiivisissa polariteeteissa seuraavilla laiteparametreilla: MS1-skannaus 120, 000 resoluutio; tiedoista riippuvainen MS2 20 yleisimmän ionin joukossa 15,000 resoluutiolla; 0,4 m/z eristysleveys; ja porrastettu normalisoitu törmäysenergia 20:30:40 (43).

Kuva 7. N-asetyylikysteiini estää DC661--indusoitua kalretikuliinin pintaekspressiota. (ILMOITUS)

Lipidit tunnistettiin ja kvantitoitiin käyttämällä LipidSearch 4.2:ta (Thermo Fisher Scientific). Tunnistetut lipidilajit suodatettiin odotettujen additiotuotteiden ja luokkaan perustuvan tunnistusluokan mukaan. Huippualueet normalisoitiin tuettujen luokkien EquiSPLASH-standardien mukaisesti ja normalisoitiin edelleen kunkin näytteen kokonaispinta-alan perusteella solujen lukumäärän vaihtelun korjaamiseksi. Tilastollinen analyysi suoritettiin log-muunnetuille tiedoille käyttämällä Perseus 1.6.2.3:a (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Metaboliitin uuttaminen ja analyysi käyttäen LC-MS/MS:ää metabalonille. Polaariset metaboliitit uutettiin kokonaisista soluista, Lyso-IP:hen sitoutumattomista fraktioista ja Lyso-IP:hen sitoutuneista näytteistä käyttämällä 80% metanolia ja säilytettiin -8{{30}} asteessa ennen nestekromatografiaa. – massaspektrometria (LC-MS) analyysi. Uutteet analysoitiin LC-MS:llä käyttämällä Thermo Scientific Q-Exactive HF-X -massaspektrometriä HESI II -koettimella Thermo Vanquish Horizon UHPLC -järjestelmän mukaisesti. LC-erotus suoritettiin käyttämällä ZIC-HILIC-kolonnia (2,1 mm × 150 mm, hiukkaskoko 5 μm, EMD Millipore), jossa oli ZIC-HILIC-suojakolonni (2,1 mm × 20 mm, EMD Millipore), jota pidettiin 45 asteessa virtausnopeudella 0,2 ml/min. Kromatografia suoritettiin happamissa olosuhteissa tioliryhmien reaktiivisuuden vähentämiseksi. Liikkuva faasi A oli vesi ja B asetonitriili, jotka molemmat sisälsivät 0,1 % muurahaishappoa. LC-gradientti oli 85 % B 2 minuutin ajan, 85 % B - 20 % B 15 minuutin aikana, 20 % B - 85 % B 0,1 minuutin ajan ja 85 % B 8,9 minuutin ajan. Automaattinen näytteenottolaite pidettiin 4 asteessa ja 4 µl kutakin näytettä injektoitiin analyysiä kohti. Käytettiin seuraavia MS-parametreja: vaippakaasun virtausnopeus, 40 AU; apukaasun virtausnopeus, 10 AU; pyyhkäisykaasun virtausnopeus, 2 AU; lisäkaasulämmittimen lämpötila, 350 astetta; suihkujännite, 3,75 kV positiivisessa tilassa ja 3,5 kV negatiivisessa tilassa; kapillaarilämpötila, 375 astetta; ja suppilon RF-taso, 40 %. Kaikki näytteet analysoitiin täydellä MS:llä napaisuuden vaihdolla. Täydelliset MS-skannaukset saatiin 65–975 m/z 120,000 resoluutiolla automaattisella vahvistuksen säätötavoitteella 1 × 106 ionia ja maksimiruiskeajalla 100 millisekuntia. Raakadata analysoitiin käyttämällä TraceFinder 4.1:tä (Thermo Fisher Scientific). Kohteena olevat metaboliitit tunnistettiin tarkan massan ja retentioajan perusteella niiden ensisijaisessa polaarisessa analyyttisten standardien perusteella. Huippujen ilmaisussa käytettiin ICIS-algoritmia tasoituksella 1. Suhteellinen kvantifiointi suoritettiin käyttämällä integroitua piikin pinta-alaa, ja nämä arvot korjattiin kokonaismääräksi näytettä kohti (määritelty piikin kokonaispinta-alaksi). PPT1-CRISPR/Cas9-muokkaus. A375P PPT1-ei-kohde- ja KO-solut valmistettiin aiemmin kuvatulla tavalla (44). pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) oli lahja Feng Zhangilta (Addgene-plasmidi, 48139). Ohjaus-RNA-oligot (IDT) pariutettiin, fosforyloitiin ja ligoitiin sitten BbsI-digestoituun ja defosforyloituun pX459-plasmidiin Zhang-laboratorion protokollien mukaisesti, jotka ovat saatavilla Addgenen kautta. Ligoidut plasmidit transformoitiin Stbl3-soluihin (Invitrogen). Plasmidivalmisteiden sekvensointi vahvisti haluttujen ohjaus-RNA-sekvenssien läsnäolon. A375P-solut transfektoitiin käyttämällä Lipofectamine 3000:a (Invitrogen, L3000015), minkä jälkeen valittiin puromysiini. Tutkijamääritykset vahvistivat PPT1-geenin muokkauksen CRISPR/Cas9:llä, ja PPT1-knockdown vahvistettiin Western blottauksella PPT1-vasta-aineella (Origene). Ohjaus-RNA-oligojen sekvenssit ovat seuraavat: ei-kohde-ohjain-RNA eteenpäin (CACCGTAGCGAACGTGTCCGGCGT), ei-kohde-opas-RNA-käänteinen (AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC), ihmisen PPT1-ohjaus-RNA 1 eteenpäin (CACCGTTTGGACTCCTCGATGCCC), ihmisen PPT1-opastus-RNA-opas (AAACGATCCAG1) 3 eteenpäin (CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC) ja ihmisen PPT1-opas RNA 3 käänteinen (AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC). Tässä artikkelissa käytetyt yksittäisistä soluista kasvatetut kloonit sisältävät seuraavat: klooni C8 on ihmisen opas 1 ja klooni B5 on ihmisen opas 3. Immunoblottaus. Miljoona solua maljattiin 10 cm:n maljalle, ja käsittelyt annettiin seuraavana päivänä; solut kerättiin kaapimalla. Kokosolulysaatit valmistettiin käyttämällä SDS-lyysipuskuria. Proteiinipitoisuus mitattiin käyttämällä Pierce BCA Protein Assay Kit -sarjaa (Thermo Fisher Scientific, 23225). SDS-PAGE:ssa käytettiin 30–50 ug proteiinia ja se siirrettiin PVDF-kalvolle (Bio-Rad, 1620177). Kalvo blokattiin käyttämällä 5 % BSA:ta tai 5 % rasvatonta maitoa optimoitujen olosuhteiden mukaisesti ja inkuboitiin primaarisen vasta-aineen kanssa yön yli 4 °C:ssa. PVDF-kalvot pestiin 1 x TBS-T:llä (Cell Signaling Technology Inc., CS-9997) ja inkuboitiin 1 tunti huoneenlämpötilassa lajispesifisen HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa. Tämän jälkeen kalvot pestiin ja kehitettiin käyttämällä Pierce ECL Western Blotting -substraattia (Thermo Fisher Scientific, 32106) ja autoradiografiafilmejä (Lab Scientific Inc., XAR ALF 1318). Pyroptoositutkimuksia varten proteiinilysaatit erotettiin SDS-PAGE:lla ja siirrettiin PVDF-kalvoille. 5-prosenttisessa BSA:ssa eston jälkeen PVDF-kalvoja inkuboitiin osoitettujen primääristen vasta-aineiden kanssa yön yli 4 °C:ssa, pestiin PBS/Tween-seoksessa ja inkuboitiin peroksidaasiin kytkettyjen sekundaaristen vasta-aineiden kanssa. Immunoreaktiivisuus havaittiin käyttämällä HRP-konjugoituja sekundaarisia vasta-aineita (CalBioTech), kemiluminesenssisubstraattia (Thermo Fisher Scientific) ja ChemicDoc MP -kuvausjärjestelmää (Bio-Rad). Supernatanttia sisältäviä kokeita varten soluja viljeltiin FBS-vapaassa alustassa SDS-PAGE:n vääristymisen välttämiseksi. Solusupernatantit kerättiin ja sentrifugoitiin 10 minuuttia 500 g:ssä 4 asteessa solujätteen poistamiseksi. Tuloksena saadut supernatantit konsentroitiin 10x käyttäen Amicon Ultra 10K:ta (MilliporeSigma) sentrifugoimalla 30 minuuttia 4 500 g:ssä 4 asteessa. Konsentraatit sekoitettiin näytepuskurin kanssa ja analysoitiin Western blot -menetelmällä edellä kuvatulla tavalla. Proteiinigeelivärjäys suoritettiin käyttämällä Ponceau-punavärjäystä. LMP- ja katepsiini L -aktiivisuusmääritys. Ihmisen pEGFP-hGal3-plasmidi oli lahja Tamotsu Yoshimorilta (Addgene-plasmidi, 73080), ja sitä käytettiin A375P-Galectin{139}} -linjan luomiseen. pEGFP-C1-kontrolliplasmidivektorin runko ostettiin (novo prolabs, V012024). Plasmidit transfektoitiin (1 ug/ml) A375P-soluihin käyttämällä Lipofectamine 2000:ta (Invitrogen, 11668019) valmistajan protokollan mukaisesti; transfektoidut solut valikoitiin stabiilisti käyttämällä G418:aa (Gibco, 10131035). LMP:lle laskettiin yhteensä 25 A375P-galektiini-3 puncta-positiivista solua useissa kuvakentissä. Punktapositiivisten solujen prosenttiosuus laskettiin kussakin kentässä erikseen ja jokaiselle ryhmälle laskettiin keskimääräinen prosenttiosuus. Magic Red Cathepsin L -määrityssarjaa (Abcam, ab270774) käytettiin valmistajan protokollan mukaisesti. Solut kuvattiin Zeiss Axio Observer 7 käänteisellä mikroskoopilla. Magic Red -raaka integroitu intensiteetti laskettiin käyttämällä Fiji - ImageJ -ohjelmistoa (NIH). MTT (3-[4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli]-2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi) solujen elinkelpoisuusmääritys. 2 000 solua maljattiin kolmena rinnakkaisena 96-kuoppalevyn jokaiseen kuoppaan, ja 3-päivän MTT-määritykset suoritettiin käyttämällä Cell Viability Kit -sarjaa (Roche, 11465007001) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Inhibiittoriesikäsittelyä annettiin 1 tunti, mitä seurasi solujen yhteiskäsittely inhibiittoreilla DC661:n kanssa tai ilman. IC50:n laskemiseen käytettiin epälineaarista regressiomenetelmää (käyrän sovitus).

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Napsauta tästä nähdäksesi Cistanche Enhance Immunity -tuotteet

【Kysy lisää】 Sähköposti:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Pesäkkeiden muodostusmääritys. 2,000 solua kuoppaa kohti kylvettiin 6-kuoppalevylle ja käsiteltiin seuraavana päivänä; soluja pidettiin hoidon alla yhteensä 8 päivää. Kuhunkin kuoppaan muodostuneet pesäkkeet pestiin PBS:llä, kiinnitettiin kylmällä metanolilla -20 asteessa 20 minuuttia ja värjättiin kristallivioletilla 0,5 % vesiliuoksella (V5265; MilliporeSigma).

Trypaaninsinisen väriaineen poissulkemismääritys. Reaktioseos trypaanisinistä määritystä varten valmistettiin sekoittamalla 1 osa 0,4 % trypaanisinistä (25- 900-CI, Corning) ja 1 osa laimennettuja solunäytteitä. Seosta inkuboitiin 1 minuutti ja solut laskettiin Cellometer Visionilla (Nexcelom, Vision-310-0208).

Kuva 8. DC661--indusoitu kalretikuliinin pintaekspressio käynnistää T-solut kasvainsoluja vastaan. (A)

Kuva 9. DC661-käsiteltyjen solujen siirrostus tuottaa kasvaimen hyljinnän tietyissä yhteyksissä. (A)

VAHTO-LPO. LLP:tä tutkittiin käyttämällä fluoresoivaa koetinta FOAMLPO. FOAM-LPO syntetisoitiin aiemmin kuvatulla tavalla (26). Soluja viljeltiin 8-kuoppaisella μSlide-levyllä (ibid, 80807) ja käsiteltiin estäjillä ja DC661:n kanssa tai ilman. Soluja inkuboitiin väliaineen kanssa, joka sisälsi FOAM-LPO:ta (1 M) 5 % C02:ta ja 95 % ilmaa sisältävässä ilmakehässä 5 minuuttia 37 °C:ssa. Solut pestiin kahdesti väliaineella ja sitten soluja tarkkailtiin mikroskoopilla (Zeiss Axio Observer 7 käänteinen mikroskooppi) fluoresenssin siirtymisen havaitsemiseksi 586 nm:stä 512 nm:iin vasteena LLP:lle. qRT-PCR ja alukkeet. A375P (3 x 105 uM) soluja viljeltiin 60 mm:n maljoissa ja niitä käsiteltiin DMSO:lla tai DC661:llä (3 µM) 24 tunnin ajan. Kokonais-RNA eristettiin RNA-eristyspakkauksella (QIAGEN, 74134) valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA syntetisoitiin käyttämällä iScript Reverse Transcriptase -pakkausta, jossa oli 500 ng puhdistettua RNA:ta valmistajan protokollan mukaisesti (Thermo Scientific, K1642). QPCR-reaktio asetettiin käyttämällä SYBR Green PCR Master Mixiä (BioRad, 1725121), joka sisälsi 1 µl cDNA:ta. Kaikki mittaukset suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja BACTINia käytettiin sisäisenä standardina ΔCT-laskelmissa. Geeniekspressioanalyysi tehtiin seuraavilla alukkeilla: PTGS2/COX-2 eteenpäin (CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG), PTGS2/COX-2 taaksepäin (GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA), CARS eteenpäin (CTGGACTACTCCAGCAACACCA), CARS taaksepäin (CHACAGTAGAGATGTC). (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC), CHAC1 taaksepäin (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG), BACTIN eteenpäin (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT) ja BACTIN taaksepäin (CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC).

siRNA-transfektio. Geneettiset knockdown-tutkimukset ihmisen ULK1:lle, ATG7:lle, TAX1BP1:lle, BNIP3:lle, PPT1:lle ja MFSD12:lle suoritettiin A375P-solulinjoissa. Geneettiset inhibitiotutkimukset hiiren Ppt1:lle ja Calretikuliinille suoritettiin MC38-soluissa. Ei-kohde siRNA (sc{{10}}), ihmisen ULK1 (sc-44182), ATG7 (sc-41447), TAX1BP1/T6BP (sc-106831), BNIP3 (sc{{20}}), PPT1/CLN1 (sc-105216), MFSD12 (sc-97888), hiiren Ppt1/Cln1 (sc-142398) ja kalretikuliini /Calregulin (sc-29895) siRNA:t ostettiin Santa Cruz Biotechnologylta. Nämä siRNA:t koostuvat 3–5 kohdespesifisen siRNA:n pooleista. Virtaussytometria. Ferroptoosin induktio mitattiin käyttämällä C11- BODIPY:tä (BODIPY 581/591 C11, Thermo Fisher Scientific, D3861). A375P-solut kylvettiin 6-kuoppalevylle ja käsiteltiin DMSO:lla, ferrostatiinilla{{40}} (10 μM), huulikorksstatiinilla-1 (2 μM), elastiinilla (5 μM) ), DC661 (3 μM) tai yhdistelmä 24 tunnin ajan. Solut kerättiin sentrifugoimalla 300 g:ssä 5 minuuttia. Solut suspendoitiin uudelleen 500 µl:aan 1X HBSS:ää (Corning, 21-023-CV), joka sisälsi 1 µM C11-BODIPY:tä, ja inkuboitiin 37 asteessa 15 minuuttia. Solut pelletoitiin ja suspendoitiin uudelleen 500 µl:aan 1X HBSS:ää, ja fluoresenssin intensiteetti mitattiin BD LSRII -sytometrillä käyttäen 530/30 Blue (University of Pennsylvania Flow Core Facility). Kalretikuliinin solupinnan ilmentymisen kvantitointi immunogeenistä solukuolemaa varten suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu (45) virtaussytometrialla. B16F10- tai MC38-soluja viljeltiin ja käsiteltiin NAC:lla (10 mM) tai DC661:llä (3 µM) 24 tunnin ajan. MC38-soluja käsiteltiin siPptl:llä tai siNT:llä 48 tunnin ajan 10 mM NAC:n läsnä ollessa tai poissa ollessa 24 tunnin ajan. Solut värjättiin CALR-vasta-aineella (Cell Signaling Technology, 12238), Alexa Fluor 647 vuohen anti-kanin toisella vasta-aineella (Invitrogen) ja propidiumjodidilla (PI) (Biolegend, 421301). Värjätty näytteet otettiin BD LSRII -virtaussytometrillä käyttäen 710/50 Blue ja 670/30 Red PI- ja CALR-fluoresenssin sieppaamiseksi, vastaavasti (Pennsylvanian yliopiston Flow Core -laitos), ja analyysi rajoitettiin CALR-positiivisiin ja PI-negatiivisiin soluihin. välttääkseen vääriä positiivisia tapahtumia. T-solujen esikäsittely ja sytotoksisuuden prosenttiosuus. B16- tai MC38-kasvainsoluja (5 x 104) viljeltiin ja käsiteltiin NAC:lla (10 mM) tai DC661:llä (1 µM tai 3 µM), vastaavasti, 24 tunnin ajan. Calrin geneettistä estoa varten MC38-soluja käsiteltiin Calr siRNA:lla tai nontarget siRNA:lla (siNT) 48 tunnin ajan, minkä jälkeen niitä käsiteltiin joko DMSO:lla tai 3 µM DC661:llä 24 tunnin ajan. Sitten pernasoluja viljeltiin DC661:n kanssa B16- tai MC38-solujen kanssa tai ilman niitä IL-2:n (5 IU/ml) läsnä ollessa ja niitä viljeltiin yhdessä 72 tuntia. Esikäsittely vahvistettiin supernatantin IFN-ELISA:lla (Biolegend, 430815). Pohjustettuja pernasoluja viljeltiin sitten vastaviljeltyjen B16- tai MC38-solujen kanssa kohde-efektori-suhteilla (B16 tai MC38 pernasoluihin) 1:20 ja 1:50 B16- ja MC38-soluille, vastaavasti. B16- tai MC38-solukuolemaan liittyvä LDH:n vapautuminen ja sitten prosenttiosuus sytotoksisuudesta mitattiin valmistajan protokollan mukaisesti (MilliporeSigma, 4744926001) (31). Kasvainten vastaiset rokotusmääritykset ja kemoterapiatutkimukset vakiintuneilla syöpämalleilla. Kuudesta kahdeksaan viikon ikäiset naaraspuoliset WT C57BL/6-hiiret, NOD/SCID- ja BALB/c-hiiret hankittiin The Jackson Laboratorysta. Kasvainten vastaisia ​​rokotuskokeita varten WT B16F10-, MC38- ja CT26-soluja käsiteltiin DC661:llä (3 µM) 36 tunnin ajan 175 cm2:n pulloissa. Sitten supernatantit ja irrotetut solut kerättiin 50 ml:n haukkaputkeen. Solut sentrifugoitiin ja pestiin jääkylmällä PBS:llä. Rokotusta varten 150 µl solususpensiota injektoitiin ihonalaisesti immunokompetenttien C57BL/6-hiirten, immuunipuutosten NOD/SCID-hiirten (1,8 × 104 B16F10-solua, 1,5 × 106 MC38-solua per hiiri) vasempaan kylkeen (BALB3/0c) × 106 CT26-solua per hiiri). Jäädytetyt, sulatetut solut, jotka oli suspendoitu uudelleen PBS:ään, injektoitiin negatiivisena kontrollina. Viikkoa myöhemmin samantyyppisiä eläviä syöpäsoluja (3 × 104 B16F10-solua, 2 × 105 MC38-solua tai 5 × 105 CT26-solua hiirtä kohden) injektoitiin vastaava tilavuus Matrigeliä (Corning, 354248) oikeaan kylkeen. rokotetuista hiiristä. Kasvaimet mitattiin käyttämällä elektronisia jarrusatureita, ja tilavuus laskettiin L × W2 × 0,5. Kasvaimen kasvua seurattiin säännöllisesti seuraavien päivien ajan, ja kasvainten puuttumista pidettiin osoituksena tehokkaasta kasvainten vastaisesta rokotuksesta. DC661-MC38-rokotustutkimukset toistettiin NOD/SCID-hiirillä. Tilastot. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin käyttämällä Studentin paritonta, 2-tailed t-testiä, kun verrattiin kahta ryhmää. 1-ANOVA-testiä käytettiin, kun verrattiin enemmän kuin kahta ryhmää. Nollahypoteesi hylättiin merkittävästi, jos P-arvo oli alle 0,05. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM. Opintojen hyväksyntä. Kaikki eläinkokeet suoritettiin Pennsylvanian yliopiston Institutional Animal Care and Use Committeen hyväksymien protokollien mukaisesti.

Kiinan yrtti cistanche kasvi-Antitumor

Viitteet

1. Zeh HJ, et ai. Satunnaistettu vaiheen II preoperatiivinen tutkimus autofagian estämisestä suuriannoksisella hydroksiklorokiinilla ja gemsitabiinilla / Nab-paklitakselilla haimasyöpäpotilailla. Clin Cancer Res. 2020;26(13):3126–3134.

2. Rebecca VW, et ai. PPT1 edistää kasvaimen kasvua ja on klorokiinijohdannaisten molekyylikohde syövässä. Cancer Discov. 2019;9(2):220–229.

3. Brun S, et ai. GNS561, uusi autofagian estäjä, joka on aktiivinen syövän kantasoluja vastaan ​​hepatosellulaarisessa karsinoomassa ja paksusuolensyövän maksametastaaseissa. J Syöpä. 2021;12(18):5432–5438.

4. Brun S, et ai. GNS561, kliinisen vaiheen PPT1-estäjä, on tehokas hepatosellulaarista karsinoomaa vastaan ​​moduloimalla lysosomaalisia toimintoja. Autofagia. 2022;18(3):678–694.

5. Oberle C, et ai. Lysosomaalisen kalvon permeabilisaatio ja katepsiinin vapautuminen on Bax/Bak-riippuvainen, vahvistava tapahtuma fibroblastien ja monosyyttien apoptoosista. Solukuoleman ero. 2010;17(7):1167–1178.

6. Boya P, Kroemer G. Lysosomaalisen kalvon läpäisy solukuolemassa. Onkogeeni. 2008;27(50):6434–6451.

7. Rebecca VW, et ai. Yhtenäinen lähestymistapa lysosomin hajoaviin ja kasvua signaloiviin rooleihin kohdistamiseen. Cancer Discov. 2017;7(11):1266–1283.

8. Tang R, et ai. Ferroptoosi, nekroptoosi ja pyroptoosi syövän vastaisessa immuniteetissa. J Hematol Oncol. 2020;13(1):110.

9. Yamamoto K, et ai. Autofagia edistää haimasyövän immuunijärjestelmää hajottamalla MHCI:tä. Luonto. 2020;581(7806):100–105.

10. Deng J, et ai. ULK1-inhibitio voittaa vaarantuneen antigeeniesityksen ja palauttaa kasvaintenvastaisen immuniteetin LKB1-mutanttikeuhkosyövässä. Nat Syöpä. 2021;2(5):503–514.

11. Lazarou M, et ai. Ubikitiinikinaasi PINK1 värvää autofagiareseptoreita indusoimaan mitofagiaa. Luonto. 2015;524(7565):309–314.

12. Choi YB, et ai. TAX1BP1 hillitsee viruksen aiheuttamaa apoptoosia helpottamalla mitokondriaalisen sovittimen MAVS:n kutinavälitteistä hajoamista. Mol Cell Biol. 2017;37(1):e00422-16.

13. Rikka S, et ai. Bnip3 heikentää mitokondrioiden bioenergetiikkaa ja stimuloi mitokondrioiden kiertoa. Solukuoleman ero. 2011;18(4):721–731.

14. Leu JI, et ai. Mekaaninen perusta heikentyneelle ferroptoosille soluissa, jotka ekspressoivat p53:n afrikkalaiskeskistä S47-varianttia. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(17):8390–8396.

15. Erkes DA, et ai. Mutantti-BRAF- ja MEK-inhibiittorit säätelevät kasvaimen immuuni-mikroympäristöä pyroptoosin kautta. Cancer Discov. 2020;10(2):254–269.

16. Serrano-Puebla A, Boya P. Lysosomaalisen kalvon läpäisy solukuolemassa: uusia todisteita ja vaikutuksia terveyteen ja sairauksiin. Ann NY Acad Sci. 2016; 1371(1):30–44.

17. Thirusangu P, et ai. Kinakriinin aiheuttama autofagia munasarjasyövässä laukaisee katepsiini-L-välitteisen lysosomaalisen / mitokondrion kalvon läpäisevyyden ja solukuoleman. Syövät (Basel). 2021;13(9):2004.

18. Michallet MC, et ai. Katepsiiniriippuvainen apoptoosi, jonka laukaisee T-lymfosyyttien supraoptimaalinen aktivaatio: mahdollinen suuren annoksen sietomekanismi. J Immunol. 2004;172(9):5405–5414.

19. Mondal A, et ai. Ppt1--puutos häiritsee lysosomaalista Ca++-homeostaasia ja myötävaikuttaa patogeneesiin CLN1-sairauden hiirimallissa. J Peri Metab Dis. 2022;45(3):635–656. 20. Engel KM, et ai. Fosfolipaasit ja reaktiiviset happilajit ovat peräisin lipidibiomarkkereista terveillä ja sairailla ihmisillä ja eläimillä – painopisteenä lysofosfatidyylikoliini. Front Physiol. 2021;12:732319.

21. Fu R, et ai. N-asetyylikysteiinin tehokkuus Niemann-Pickin taudin, tyypin C1, hiirimallien fenotyyppisessä suppressiossa. Hum Mol Genet. 2013;22(17):3508–3523.

22. Boz Z, et ai. N-asetyylikysteiini estää olantsapiinin aiheuttamaa oksidatiivista stressiä mHypoA-59 hypotalamuksen hermosoluissa. Sci Rep. 2020;10(1):19185.

23. Khare S, et ai. ASS1 ja ASL estävät kasvua selväsoluisessa munuaissolukarsinoomassa muuttuneen typen aineenvaihdunnan kautta. Cancer Metab. 2021;9(1):40.

24. Gęgotek A, et ai. Askorbiinihapon suojaavan vaikutuksen vertailu redoksi- ja endokannabinoidijärjestelmien vuorovaikutuksiin in vitro -viljeltyissä ihmisen ihon fibroblasteissa, jotka altistettiin UV-säteilylle ja vetyperoksidille. Arch Dermatol Res. 2017;309(4):285–303.

25. De Raedt T, et ai. Syöpäsolujen haavoittuvuuksien hyödyntäminen yhdistelmähoidon kehittämiseksi rasin aiheuttamiin kasvaimiin. Syöpäsolu. 2011;20(3):400–413.

26. Zhang X, et ai. Lipidiperoksidoitumisen seuranta vaahtosoluissa lysosomeihin kohdistettavalla ja ratiometrisellä koettimella. Anal Chem. 2015;87(16):8292–8300.

27. Wei CY, et ai. Bioinformatiikkaan perustuva analyysi paljastaa kohonneen MFSD12:n solujen lisääntymisen avainpromoottorina ja mahdollisena terapeuttisena kohteena melanoomassa. Onkogeeni. 2019;38(11):1876–1891.

28. Aldini G, et ai. N-asetyylikysteiini antioksidanttina ja disulfidia rikkovana aineena: syyt miksi. Free Radic Res. 2018;52(7):751–762. 29. Abu-Remaileh M, et ai. Lysosomaalinen metabolomiikka paljastaa V-ATPaasi- ja mTOR-riippuvaisen lysosomeista peräisin olevan aminohappovirran säätelyn. Tiede. 2017;358(6364):807–813.

30. Zhou J, et ai. Immunogeeninen solukuolema syöpähoidossa: nykyiset ja nousevat indusoijat. J Cell Mol Med. 2019;23(8):4854–4865. 31. Sharma G, et ai. PPT1:n esto lisää anti-PD-1-vasta-aineen kasvainvastaista aktiivisuutta melanoomassa. JCI Insight. 2020;5(17):e133225.

32. Mehnert JM, et ai. BAMM (BRAF-autofagia ja MEK-inhibitio melanoomassa): vaiheen I/II tutkimus dabrafenibistä, trametinibistä ja hydroksiklorokiinista edenneessä BRAFV600-mutanttimelanoomassa. Clin Cancer Res. 2022;28(6):1098–1106. 33. Loi M, et ai. Makroautofagiaproteiinit säätelevät MHC-luokan I tasoja dendriittisoluissa ja muokkaavat antiviraalisia CD8(+)-T-soluvasteita. Cell Rep. 2016;15(5):1076–1087.

34. Jouandin P, et ai. Lysosomaalinen kysteiinin mobilisaatio muokkaa TORC1:n ja kudoskasvun vastetta paastoon. Tiede. 2022;375(6582):eabc4203.

35. Schwalfenberg GK. N-asetyylikysteiini: katsaus kliinisestä hyödyllisyydestä (vanha lääke uusilla temppuilla). J Nutr Metab. 2021; 2021: 9949453.

36. Beer LA, et ai. Kohdunulkoisen raskauden seerumin biomarkkereiden systemaattinen löytäminen käyttämällä 3-D-proteiinin profilointia yhdistettynä leimattoman kvantifiointiin. J Proteome Res. 2011;10(3):1126–1138. 37. Goldman AR, et ai. Ensisijainen vaikutus ARID1A-mutatoidun munasarjakirkassolukarsinooman proteomiin on mevalonaattireitin vaimeneminen transkription jälkeisellä tasolla. Mol Cell Proteomics. 2016;15(11):3348–3360.

38. Cox J, Mann M. MaxQuant mahdollistaa korkeat peptidien tunnistusnopeudet, yksilölliset ppb-alueen massatarkkuudet ja proteomin laajuisen proteiinien kvantifioinnin. Nat Biotechnol. 2008;26(12):1367–1372.

39. Cox J, et ai. Andromeda: MaxQuant-ympäristöön integroitu peptidihakukone. J Proteome Res. 2011;10(4):1794–1805.

40. Cox J, et ai. Tarkka proteominlaajuinen leimaton kvantifiointi viivästetyn normalisoinnin ja maksimaalisen peptidisuhteen uuton avulla, jota kutsutaan nimellä MaxLFQ. Mol Cell Proteomics. 2014;13(9):2513–2526.

41. Tyanova S, et ai. Perseus-laskentaalusta (prote)omics-datan kattavaan analysointiin. Nat Methods. 2016;13(9):731–740.

42. Tyanova S, Cox J. Perseus: bioinformatiikka-alusta proteomiikan tietojen integroivaan analysointiin syöpätutkimuksessa. Menetelmät Mol Biol. 2018; 1711:133–148.

43. Alicea GM, et ai. Muutokset ikääntyneiden fibroblastien lipidiaineenvaihdunnassa aiheuttavat iästä riippuvaisen melanoomasoluresistenssin kohdistetulle hoidolle rasvahappojen kuljettajan FATP2:n kautta. Cancer Discov. 2020;10(9):1282–1295.

44. Ran FA, et ai. Genomitekniikka CRISPR-Cas9-järjestelmän avulla. Nat Protoc. 2013;8(11):2281–2308.

45. Liu P, et ai. Immunogeeniseen solukuolemaan liittyvän kalretikuliinialtistuksen kvantifiointi. Menetelmät Enzymol. 2020; 632:1–13.