Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com

Chien-Liang Chao, Hsin-Wen Huang, Hui-Chi Huang, Hsin-Fan Chao, Shuen-Wen Yu, Muh-Hwan Su, Chao-Jih Wang ja Hang-Ching Lin

Abstrakti

Cistanche tubulosa vesipitoinen uute(CTE) on jo käytössä kasvitieteellisenä reseptilääkkeenä dementian hoidossa Kiinassa. Aiemmat tutkimuksemme raportoivat, että CTE:n fenyylietanoliglykosidit (Cistanche tubulosa vesipitoinen uute) on Alzheimerin taudin (AD) vastainen aktiivisuus estämällä amyloidipeptidin (A) aggregaatiota ja kerrostumista. Viimeaikaisissa tutkimuksissa katsottiin kuitenkin, että suolistobakteerit voivat metaboloida fenyylietanoidiglykosideja, koska kaikki analyysitulokset osoittivat, että fenyylietanoidiglykosidien hyötyosuus on erittäin alhainen. Tässä tutkimuksessa osoitamme, kuinka raudan kelataatiolla on ratkaiseva rooli A-aggregaatio- ja kerrostumisen estomekanismissa.fenyylietanoidiglykosiditCTE:stä(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute). Lisäksi osoitimme edelleen, että fenyylietanoidiglykosidit (1–3) voivat päästä aivoihin. Aktiivinen CTE(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute)komponenttien ja toimintamekanismien varmistus on suuri apu tuotteen laadunvalvonta- ja biosaatavuustutkimuksissa tulevaisuudessa. Samalla tarjoamme uuden analyysimenetelmän, joka on hyödyllinen fenyylietanoidiglykosidien (1–3) määrittämiseen kasveista, elintarvikkeista, verestä ja kudoksista kemialliseen sormenjälki- ja farmakokineettiseen tutkimukseen.

Avainsanat: Cistanche tubulosa; fenyylietanoidiglykosidit; Alzheimerin tauti; raudan kelaatti

Cistanche tubulosa

1. Esittely

Dementia on yksi yleisimmistä kroonisista ikääntymisen sairauksista. Vuonna 2015 World Alzheimer -raportti arvioi, että noin 46,8 miljoonaa ihmistä kärsi dementiasta, ja määrän odotetaan olevan 74,7 miljoonaa vuonna 2030 ja 131,5 miljoonaa vuonna 2050 [1]. Maailmanlaajuinen dementiaväestö kasvaa vuosi vuodelta ja tulee tulevaisuudessa käsistä. Maailmanlaajuiset terveydenhuoltomenot dementian hoitoon olivat lähes 604 miljardia Yhdysvaltain dollaria vuonna 2010 ja summan odotetaan olevan 1000 miljardia vuonna 2030 [2]. Dementiapotilailla on suurempi riski kuolla tapaturmaisesti [3] ja siksi he tarvitsevat enemmän lääketieteellistä hoitoa. Tämä on raskas taakka dementiapotilaiden omaishoitajille. Dementian vaikutukset hoitajiin, perheeseen ja yhteiskuntaan voivat aiheuttaa suurta fyysistä, psyykkistä, elämää ja taloudellista stressiä. Dementialla on kaksi päämuotoa, Alzheimerin tauti (AD) ja vaskulaarinen dementia [4,5]. AD on yleisin dementia ja se on peruuttamaton ja etenevä hermoston rappeuma [4–6]. AD oli kuudenneksi yleisin kuolinsyy Yhdysvalloissa vuonna 2015 [6].

Viimeaikaiset tutkimukset tukevat sitä, että amyloidipeptidin (A) (plakit) ja proteiini-tau-aggregaation indusoima neuronitoksisuus liittyy läheisesti AD-patogeneesiin. A:n ja tau-proteiinin kertyminen aivoihin voi johtaa hermosolujen vaurioitumiseen ja muistin menettämiseen [7]. Liukenemattomat A-oligomeerit aggregoituvat solunulkoisiin plakkeihin ja niiden on raportoitu johtavan synaptiseen toimintahäiriöön, hermosolujen toksisuuteen ja solukuolemaan [8]. Valitettavasti toistaiseksi ei ole saatavilla tehokasta hoitoa A:n ja taun proteiinin poistamiseksi tai A:n muodostumisen tai oligomeroitumisen estämiseksi ja peruuttamattoman hermosoluvaurion pysäyttämiseksi tai parantamiseksi. Nykyiset terapeuttiset aineet, kuten galantamiini ja donepetsiili, jotka ovat asetyylikoliiniesteraasin estäjiä, voivat vain väliaikaisesti parantaa muistin menetystä nostamalla välittäjäainetasoa. Vuonna 2012 mitkään kandidaattilääkkeet eivät kyenneet vähentämään A-vaikutusta suurissa AD-potilaiden kliinisissä tutkimuksissa [9]. Siksi tarvitaan pikaisesti tutkimusta uudesta hoidosta Alzheimerin taudin leviämisen ehkäisemiseksi. Metalli-ioneja pidettiin viime aikoina keskeisenä tekijänä, joka liittyy läheisesti A-aggregaatioon [10]. Mahdollisina lyijyyhdisteinä pidetyt metallikelaatit tarjoavat kokonaan uuden strategian anti-AD-lähestymistapalle [9,11–15].

Cistanche tubulosa (Schrenk) R. Wightin kuivattu varsi, Rou Cong Rong, korjataan laajalti Xinjiangin autiomaassa Kiinassa. Se on tärkeä perinteinen kiinalainen lääketiede, joka kuuluu Kiinan farmakopeassa indeksoituun kiinalaiseen lääketieteeseen ja jota on käytetty tuhansia vuosia fyysisen heikkouden, munuaisten vajaatoiminnan, hedelmättömyyden, unohduksen, impotenssin ja seniilin ummetuksen hoitoon [16,17].Cistanche tubulosa vesiuute(CTE) kapselit on hyväksytty kasvitieteelliseksi lääkkeeksi vaskulaarisen dementian hoitoon Kiinassa. Kliinisen tutkimuksen mukaan 18 potilaalla, joilla oli diagnosoitu lievä tai keskivaikea AD, CTE(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute)kapselit antoivat potilaille vakaamman muistitilan kuin asetyylikoliiniesteraasin estäjät [18]. Edellisessä tutkimuksessamme CTE(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute)vähensi amyloidipeptidin (A) kertymistä ja paransi muistin menetystä Alzheimerin taudin kaltaisissa rotissa [19]. Fenyylietanoidiglykosideja, ekinakosidia (1), akteosidiä (2) ja isoakteosidiä (3) pidetään CTE:n pääkomponentteina(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute)[20]. Yhdisteellä 1 on hermostoa suojaavaa vaikutusta 1-metyyli-4-fenyyli-1,2,3,6-tetrahydropyridiinin (MPTP) [21], 1-metyylin toksisuutta vastaan -4-fenyylipyridinium-ioni (MPP plus ) [22] ja 6-hydroksidopamiini (6-OHDA) [23]. Edellinen raporttimme osoitti, että 1 tukahdutti A:n oligomerisaatiota ja toksisuutta in vitro -tutkimuksessa ja esti A:n kertymistä parantaen heikentynyttä muistia ja kognitiivisia toimintahäiriöitä A-indusoiduilla rotilla [24]. Yhdisteet 2 ja 3 lisäsivät A:n hajoamista ja vähensivät A-oligomerisaatiota in vitro [25]. Yhdiste 3 vähensi A:n kertymistä A-indusoiduissa rotissa [25]. Näiden tutkimusten perusteella C. tubulosa on jo osoittanut, että sillä on potentiaalia hoitaa AD:ta. CTE(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute)liittyy läheisesti anti-A-aggregaatioon ja kerrostumaan [24,25]. Ymmärtääksesi CTE:tä paremmin(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute)mekanismin vuoksi meillä on oltava kätevä ja tehokas menetelmä aktiivisen komponentin sekä aivokudosnäytteiden sisällön tunnistamiseksi. Useimmat tutkimukset suunniteltiin ekinakosidin, akteosidin ja isoakteosidin kvantitatiiviseen määrittämiseen yrteistä tai elintarvikkeista korkean suorituskyvyn nestekromatografialla (HPLC) [26–28], mutta vain kaksi tutkimusta oli tarkoitettu seerumista tai kudoksiin [29, 30]. Ei kuitenkaan ole raporttia 1–3:n samanaikaisesta analyysistä aivokudoksissa CTE:n jälkeen(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute)oraalinen anto. Lisäksi viimeaikaisista tutkimuksista on edelleen epäselvää, onko CTE(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute)aktiiviset komponentit tai niiden aineenvaihduntatuotteet läpäisivät onnistuneesti veri-aivoesteen ja vaikuttivat aivohermosoluihin. Siksi tämä tutkimus tarjoaa edistyneen ja herkän menetelmän, jossa on vakuuttavia todisteita, jotka havainnollistavat selvästi CTE:n taustalla olevaa mekanismia.(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute)A-aggregaatiota ja laskeumaa vastaan.

Cistanche tubulosa vesipitoinen uute

2. Tulokset

2.1. Kolmen pääyhdisteen eristäminen ja tunnistaminen (1–3)

Kuivatut C. tubulosan varret uutettiin 75-prosenttisella EtOH:lla huoneenlämpötilassa. Kondensoitu 75-prosenttinen EtOH-uute altistettiin hartsi- ja C18-pylväskromatografialle, jolloin saatiin kolme pääyhdistettä, ekinakosidi (1), akteosidi (2) ja isoakteosidi (3). Niiden rakenteet selvitettiin analysoimalla NMR-spektroskopiaa (Nuclear Magnetic Resonance) ja ESI-MS-analyysiä (sähkösumutusionisaatiomassa) ja vertaamalla kirjallisuuden tietoihin [31–33] (kuva 1, lisämateriaalit, kuvat S3–S11).

2.2. CTE:n fenyylietanoidiglykosidien (1–3) pitoisuusmääritys(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute)

Määritysmenetelmä validoitiin fenyylietanoidiglykosidien analyysiä varten. Yhdisteet 1-3 (5.{3}} mg) punnittiin tarkasti ja sekoitettiin 5 0-prosenttiseen metanoliin (40 ml). Seoksia sonikoitiin 5 minuuttia. Kolmen fenyylietanoidiglykosidin (1–3) standardiliuosta sekoitettiin standardikantaliuokseksi (100 µg/ml). Standardivarastoliuosta käytettiin viiden eri pitoisuuden (5, 10, 25, 50 ja 100 ug/ml) valmistukseen osoitettuja liuoksia, vastaavasti, laimentamalla sarjatilavuuksilla 50-prosenttista metanolia. Fenyylietanoidiglykosidien (1–3) käyrät määritettiin käyttämällä ultra-performance-nestekromatografiaa (UPLC) 5–100 µg/ml, ja ne olivat vastaavasti lineaarisia (1, r2=0.9999; 2, r{{25}). },9999; 3, r2=0.9998). Päivänsisäinen ja päivän välinen tarkkuus [prosentti RSD (suhteellinen standardipoikkeama) oli 0,1–1,8 prosenttia] ja tarkkuus (95,6–104,2 prosenttia) oli UPLC:n hyväksymä 1–3. UPLC määritti CTE:n 1, 2 ja 3(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute)pitoisuudet ovat 254, 38 ja 41 mg/g, vastaavasti (kuva S2)

2.3. UPLC/MS/MS-validointi

Fenyylietanoidiglykosidit (1–3) sekoitettiin ja niihin lisättiin rotan aivokudoshomogenaattia ja analysoitiin käyttämällä Ultra performance nestekromatografia-tandem-massaspektrometria (UPLC/MS/MS) kiinteän faasin uutolla. Havaitsemisen alaraja (LLOQ) 1–3 oli 0,2 ng/ml. Fenyylietanoidiglykosidien saanto lisäsi aivokudoshomogenaatilla (10 ng/ml) 91,39 prosenttia 1:lle, 89,54 prosenttia 2:lle ja 96,81 prosenttia 3:lle (kuvio 2).

2.4. AD:n kaltaisten rotan aivokudosten analyysi

14 päivän CTE:n jälkeen(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute)suun kautta (200 mg/kg/vrk), AD:n kaltaiset rotan aivokudokset kerättiin ja jaettiin kahteen osaan, hippokampukseen ja striatumiin, ja molemmat homogenisoitiin [19]. Koska kunkin rotan hippokampus- ja aivojuoviohomogenaatit olivat liian niukkoja ladattavaksi kiinteän faasin uuttoon ja liiallisten kokeellisten virheiden välttämiseksi, neljän yksittäisen rotan hippokampus- ja aivojuoviohomogenaatit sekoitettiin analysoituun näytteeseen UPLC/MS/MS-analyysiä varten. kiinteäfaasiuuttomenetelmä (kuvio 3A, B). Fenyylietanoliglykosideja (1–3) havaittiin hippokampuksessa (kuva 3A) ja aivojuoviossa (kuva 3B). Tyhjissä aivokudoksissa ei ollut merkittävää huippua (kuvio 3C). Hippokampuksessa ekinakosidipitoisuus oli 11,97 ± {{20}},34 ng/ml, akteosidipitoisuus 1,25 ± 0,16 ng/ml ja isoakteosidipitoisuus 1,38 ± 0,08 ng/ ml. Striatumissa ekinakosidipitoisuus oli 22,60 ± 1,69 ng/ml, akteosidipitoisuus 2,03 ± 0,61 ng/ml ja isoakteosidipitoisuus 4,90 ± 0,64 ng/ml. Kuten kuvasta 4 näkyy, CTE(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute)kulkisi veri-aivoesteen läpi aivotursossa ja aivojuoviossa havaittavissa olevien merkittävien määrien 1–3 mukaan. 1:n pitoisuus on paljon suurempi kuin 2 ja 3 CTE:ssä(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute)UPLC-analyysillä (kuva S2). Siksi on järkevää havaita, että 1 on korkein aivokudoksessa suun CTE:n jälkeen(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute)hallinto. Molecules 2019, 24, x VERTAISARVONTA 4 / 12 2.4. AD:n kaltaisten rotan aivokudosten analyysi 14 päivän CTE:n jälkeen(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute)suun kautta (200 mg/kg/vrk), AD:n kaltaiset rotan aivokudokset kerättiin ja jaettiin kahteen osaan, hippokampukseen ja striatumiin, ja molemmat homogenisoitiin [19]. Koska kunkin rotan hippokampus- ja aivojuoviohomogenaatit olivat liian niukkoja ladattavaksi kiinteän faasin uuttoon ja liiallisten kokeellisten virheiden välttämiseksi, neljän yksittäisen rotan hippokampus- ja aivojuoviohomogenaatit sekoitettiin analysoituun näytteeseen UPLC/MS/MS-analyysiä varten. kiinteäfaasiuuttomenetelmä (kuvio 3A, B). Fenyylietanoliglykosideja (1–3) havaittiin hippokampuksessa (kuva 3A) ja aivojuoviossa (kuva 3B). Tyhjissä aivokudoksissa ei ollut merkittävää huippua (kuvio 3C). Hippokampuksessa ekinakosidipitoisuus oli 11,97 ± {{20}},34 ng/ml, akteosidipitoisuus 1,25 ± 0,16 ng/ml ja isoakteosidipitoisuus 1,38 ± 0,08 ng/ ml. Striatumissa ekinakosidipitoisuus oli 22,60 ± 1,69 ng/ml, akteosidipitoisuus 2,03 ± 0,61 ng/ml ja isoakteosidipitoisuus 4,90 ± 0,64 ng/ml. Kuten kuvasta 4 näkyy, CTE(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute)kulkisi veri-aivoesteen läpi aivotursossa ja aivojuoviossa havaittavissa olevien merkittävien määrien 1–3 mukaan. 1:n pitoisuus on paljon suurempi kuin 2 ja 3 CTE:ssä(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute)UPLC-analyysillä. Siksi on järkevää havaita, että 1 on korkein aivokudoksessa suun CTE:n jälkeen(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute)järjestelmänvalvoja.

2.5. Fenyylietanoidiglykosidien (1–3) metallikelatointiaktiivisuus

Kirjallisuudessa vapaiden yhdisteiden ja niiden metallikompleksin määritys suoritettiin HPLC:llä [34,35]. Kelatointiaktiivisuuden mitta analysoitiin UPLC:llä tässä tutkimuksessa. Kunkin fenyylietanoidiglykosidin (1–3) 50 µg/ml liuokset lisättiin 10 µg/ml liuokseen, jossa oli kuparia (Cu), kalsiumia (Ca), magnesiumia (Mg), sinkkiä (Zn), rautaa (Fe) tai rotan seerumia. Jokainen yhdiste kunkin metalliliuoksen tai seerumin kanssa analysoitiin UPLC:llä. Fenyylietanoidiglykosidit (1–3) osoittivat metallikelatointiaktiivisuutta raudan ja seerumin kanssa (kuva 5, lisämateriaalit kuva S1). Molekyylit 2019, 24, x VERTAISARVONTA 5 12 näytteestä AD:n kaltaisista rotista CTE:n jälkeen(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute)suun kautta (200 mg/kg, po) [1 (tR= 4.19 min), 2 (tR= 5.13 min) ja 3 (tR= 5.68 min)] . (c) Tyhjä aivokudos. Kuva 4. Fenyylietanoidiglykosidit (1–3) oli havaittavissa rotan aivokudoksissa [19] käyttämällä UPLC/MS/MS:ää. Tiedot edustivat keskiarvoa ± SD, n=3 kullekin ryhmälle. 2.5. Fenyylietanoidiglykosidien (1-3) metallikelatointiaktiivisuus. Kirjallisuudessa vapaiden yhdisteiden ja niiden metallikompleksin määritys suoritettiin HPLC:llä [34,35]. Kelatointiaktiivisuuden mitta analysoitiin UPLC:llä tässä tutkimuksessa. Kunkin fenyylietanoidiglykosidin (1–3) 50 ug/ml liuokset lisättiin 10 ug/ml liuokseen, jossa oli kuparia (Cu), kalsiumia (Ca), magnesiumia (Mg), sinkkiä (Zn), rautaa (Fe) tai rotan seerumia. Jokainen yhdiste kunkin metalliliuoksen tai seerumin kanssa analysoitiin UPLC:llä. Fenyylietanoidiglykosidit (1-3)

2.6. Ekinakosidin (1) analyysi rotan seerumissa in vivo

Ekinakosidin jakautumisen ymmärtämiseksi rotan seerumissa seerumi kerättiin ensimmäisestä ajasta 720 minuuttiin ekinakosidin (1) oraalisen annon jälkeen (100 mg/kg) ja seerumi kerättiin ensimmäisestä ajasta 720 minuuttiin ekinakosidin jälkeen. (1) oraalinen antaminen (100 mg/kg) ja analysoitu UPLC:llä. Kuvio 6 esitti ekinakosidin konsentraatio-aikaprofiilit rotan seerumissa.

3. Keskustelu

Dementia, erityisesti AD, on peruuttamaton ikääntyminen ja krooninen sairaus, joka johtaa Gordionin kysymyksiin. Tämä ylitsepääsemätön sairaus johtaa vakaviin taloudellisiin ongelmiin, joilla on valtava ja kasvava taloudellinen taakka. Maailmanlaajuisesti AD-tutkijat ponnistelevat paljon tutkiakseen uusia AD-lääkkeitä, mutta epäonnistuivat useissa suurissa kliinisissä tutkimuksissa, jotka kohdistuivat A:hen vuonna 2012 [9]. Lukuun ottamatta suoraa A:n kohdistumista, metalli-ionien homeostaasia aivoissa pidetään keskeisenä syynä A-aggregaatioon ja kerrostumaan, joka johtaa AD:n muodostumiseen [9,10]. Siksi metalli-ioneilla on olennainen rooli AD:n patogeneesissä, ja metallikelatointihypoteesista on tullut tärkeä tutkimussuunta [9,13–15].

Aikaisempien tutkimustemme [18,19,24,25] mukaan CTE(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute)osoitti mahdollista dementiaa ehkäisevää aktiivisuutta. Jopa ihmisillä tehdyissä kliinisissä tutkimuksissa yhden vuoden CTE-hoidon jälkeen(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute)kapseleita kohtalaisille AD-potilaille, Alzheimerin taudin arviointiasteikon kognitiivinen alaasteikko (ADAS-cog) ei osoita merkittävää heikkenemistä verrattuna ennen hoitoa [18]. CTE(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute)piti ADAS-cog-pisteet AD-potilaiden vakaana, mutta muut reseptilääkkeet eivät. Ainoa vaihtoehto AD-hoitoon lisensoiduista reseptilääkkeistä on asetyylikoliiniesteraasi-inhibiittorit (AChEI), kuten donepetsiili ja galantamiini, jotka parantavat AD-oireita lyhyellä aikavälillä, mutta heikkenemistä tapahtuu vuoden hoidon jälkeen [36]. Kliinisten tutkimusten perusteella CTE(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute)on mahdollisuus olla mahdollinen hoitokeino anti-AD-aineen kehittämiselle. Aiempien raporttiemme [24,25] perusteella ekinakosidi (1), akteosidi (2) ja isoakteosidi (3) suojaavat hermosoluja A:n aiheuttamilta vaurioilta, vähentäisivät A:n oligomerisaatiota in vitro ja parantaisivat merkittävästi A:n aiheuttamaa kognitiivista toimintahäiriötä. in vivo. In vitro -tutkimus osoitti, että aktiiviset annokset 1–3 olivat jopa 50 ug/ml [24,25]. Aiemmissa tutkimuksissa kuitenkin katsottiin, että 1:n ja 2:n oraalinen biologinen hyötyosuus oli erittäin alhainen (0,83 prosenttia yhdelle ja 0,12 prosenttia 2:lle) rotilla [29,30]. Yhdistettä 1 ei voitu edes tunnistaa ihmisen seerumista oraalisen echinacea-tabletin antamisen jälkeen [37]. Nykyiset tutkimukset osoittavat, että 1–3:lla oli huono kalvon läpäisevyys ja imeytyminen suolistosoluissa [38] ja suurin osa yhdestä metaboloituisi maha-suolikanavassa [39]. Yhdisteen 2 pitoisuus rotan seerumissa oli vain noin 4,5 ug/ml 15 minuutin laskimonsisäisen injektion jälkeen annoksella 10 mg/kg akteosidia [30]. Tämä tutkimus osoittaa kuitenkin, että rotan aivokudosten hippokampuksessa ja striatumissa havaittaisiin 1–3 CTE:n jälkeen.(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute)suun kautta (kuvat 3 ja 4). Lisäksi kuvio 6 osoitti, että yhdisteen 1 pitoisuus rotan seerumissa nousi noin 5 kertaa 15 minuutista 720 minuuttiin yhdisteen 1 oraalisen antamisen jälkeen (100 mg/kg). Harkitsimme CTE:n fenyylietanoliglykosideja(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute)läpäisivät veri-aivoesteen ja CTE:n välillä olisi kelatointivaikutusta(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute)ja metalli. Kelatointi on palautuva kemiallinen reaktio. Rauta on välttämätön alkuaine seerumissa ja aivoissa [10,40]. Kuvio 5 osoittaa, että kolmella fenyylietanoidiglykosidilla olisi metallikelatoiva vaikutus raudan ja seerumin kanssa. Rauta ja seerumi muuttavat ilmeisesti kolmen fenyylietanoidiglykosidin huippuretentioaika-aluetta. Raudan kelatoituminen voi olla ratkaiseva syy, joka johtaa siihen, että fenyylietanoidiglykosidien erittäin alhainen biologinen hyötyosuus tunnistetaan väärin. Siksi metallin kelatointiaktiivisuus tulee ottaa huomioon kolmen CTE:n veriseerumi- ja aivoanalyysissä(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute)fenyylietanoidiglykosidit todellisen biologisen hyötyosuuden ja farmakokinetiikan palauttamiseksi. Lisäksi tulokset osoittivat, että kolme fenyylietanoidiglykosidia (1–3) läpäisi veri-aivoesteen ja saapui aivokudoksiin kehon verenkierron kautta. Tämä tutkimus kehitti nopeimman ja herkimmän menetelmän 1–3-analyysiin käyttämällä UPLC/MS/MS-tekniikkaa ja tarjosi vahvaa näyttöä siitä, että fenyylietanoliglykosidit (1–3) ovat CTE:n tärkeimmät bioaktiiviset ainesosat.(Cistanche tubulosa vesipitoinen uute).

Cistanche tubulosa -uute

4. Materiaalit ja menetelmät

4.1. Kasvimateriaali

C. tubulosan varret kerättiin toukokuussa 2016 Hangzhousta Kiinasta. Kasvin tunnisti Dr. Lin HC:n tositenäytteet (nro 20016CT) on talletettu Sinphar Tian-LiPharmaceutical Co., Ltd.:hen Hangzhoussa Kiinassa.

4.2. Eristäminen ja puhdistaminen

Kuivattu C. tubulosa varsi jauhettiin jauheeksi ja uutettiin sitten viisi kertaa 75-prosenttisella EtOH:lla. Liuottimen alennetussa paineessa haihduttamisen jälkeen raakauutteelle suoritettiin Macroporousresin AB-8 -pylväskromatografia H2O/EtOH-gradienttiliuotinjärjestelmillä. 20 prosentista EtOH:sta 100 prosenttiin EtOH:a. Ohutkerroskromatografian mukaan kerättiin neljä fraktiota (Fr.1-Fr.4) lisäerotusta varten. Fr. 2:lle suoritettiin preparatiivinen korkean erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC) COSMOSIL® 5C18-AR-II-kolonnilla (250 mm × 20 mm id, 5 um) käyttämällä 18-prosenttista asetonitriiliä liikkuvana faasijärjestelmänä. Vastaava nopeus oli 15 ml/min. Kolme suurta kiinnostavaa huippua kerättiin valikoivasti. Fraktiot, jotka sisälsivät kohdeyhdisteitä, tiivistettiin edelleen kuiviin ja tuottivat 1, 2 ja 3 vastaavasti.

4.3. Kokeellinen analyysi

1H- ja 13C NMR-spektrit saatiin käyttämällä Bruker Avance DRX 500 MHz spektrometrejä (Billerica, MA, USA) tetrametyylisilaanin (TMS) kanssa sisäisenä standardina. Preparatiivinen HPLC suoritettiin käyttämällä käänteisfaasikolonnia (Cosmosil C18-AR-II kolonni, 250 mm × 20 mm id; NacalaiTesque, Inc., Kyoto, Japani) Shimadzu LC-6AD -sarjalla. Prominence HPLC UV-Visdetectors -laitteisto (Kioto, Japani).

Ekinakosidi (1):valkoinen jauhe; ESI-MS m/z: 785 [M - H]-; 1H NMR (CD3OD, 5{43}} MHz): 8 1.{67}}7 (1H, d, J=6,2 Hz, Rha-H{{1{79}}} }), 2,79 (2H, t, J=5,2 Hz, H-7), 3,56 (1 H, m, Ha{{20}}), 3,79 (1H, m, H-30), 3,91 (1H, m, Hb-8), 4,29 (1H, d, J=7,7, Glc-H-1), 4,38 (1H, d, J=7,9 Hz, H-10), 5.00 (1H, t, J=9,6 Hz, H-40), 5,17 (1H, d, J=1,5 Hz, Rha-H-1), 6,27 (1 H, d, J=15,9 Hz, H-800), 6,58 (1H, dd, J=8,1,2,0 Hz, H-6), 6,67 (1H, d, J=8,1 Hz, H-5), 6,70 (1H, d, J=2,0 Hz, H-2), 6,77 (1 H, d, J=8,2 Hz, H{ {86}}), 6,94 (1H, dd, J=8,3, 2,0 Hz, H-600), 7,05 (1 H, d, J=2,0 Hz, H{ {100}} ), 8 7,59 (1H, d, J=15,9 Hz, H{106}}); 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz): 8 18,5 (Rha-C{114}}), 36,6 (C{114}}), 62,6 (Glc-C-6), 69,4 (C{{ 124}}), 70,5 (C-40), 70,6 (Rha-C-5), 71,5 (Glc-C-4), 72,0 (Rha-C-3) 72,3 (C-8), 72,4 (Rha-C-2), 73,8 (Rha-C-4), 74,7 (C-50), 75,1 (Glc-C) -2), 76,1 (C-20), 77,8 (Glc-C-5), 77,9 (Glc-C-3), 81,7 (C-30) , 103,1 (Rha-C-1), 104,2 (C-10), 104,7 (Glc-C-1), 114,7 (C-200), 115,3 (C{{ 188}}), 116,3 (C-500), 116,5 (C-2), 117,1 (C-5), 121,3 (C-6), 123,3 (C{{ 203}}), 127,6 (C-100), 131,5 (C-1), 144,7 (C-3), 146,1 (C-4), 146,9 (C{{ 218}} ), 148,2 (C-700 ), 149,8 (C-300 ), 168,5 (C-900 ) (Kuva S3–S5)

Akteosidi (2):valkoinen jauhe; ESI-MS m/z: 623 [M - H]-; 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): 8 0,94(3H, d, J =5,9 Hz, H{{1{{ 156}}}}), 2,68 (2H, m, H-7), 4,33 (1H, d, J=7,8 Hz, H{{20}}), 4,70 (1H, t, J=9,0 Hz, H-400), 5,01 (1 H, s, H-1000), 6,18 (1 H, d, J=15 0,9 Hz, H-80), 6,48 (1H, dd, J=7,9, 1,4 Hz, H-6), 6,62 (1H, d, J=7 0,1 Hz, H{50}}), 6,73 (1H, d, J=2,0 Hz, H-2), 6,75 (1H, d, J=7,9 Hz) , H-50), 6,97 (1H, d, J=8,1 Hz, H-60), 7,01 (1H, s, H{72}}), 7,44 (1H) , d, J=15,8 Hz, H-70); 13C NMR: (DMSO-d6, 125 MHz): 8 18,2 (C{85}}), 35,1 (C{88}}), 60,8 (C{91}}), 68,8 (C{94}). } ), 69,2 (C-400), 70,3 (C-3000), 70,3 (C-8), 70,4 (C-2000), 70,6 (C{109} }), 71,7 (C-500), 74,5 (C-200), 79,2 (C-300), 101,3 (C-1000), 102,3 (C{{124} }), 113,6 (C-80), 114,7 (C-20), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50), 116,3 (C{{139}). }), 119,6 (C-6), 121,5 (C-60), 125,6 (C-10), 129,2 (C-1), 143,6 (C{{154}). }), 145,0 (C-3), 145,0 (C-30), 145,6 (C-70), 148,5 (C-40), 165,7 (C{169}). } ) (Kuvat S6–S8).

Iso-akteosidi (3):valkoinen jauhe; ESI-MS m/z: 623 [M - H]-; 1H NMR (DMSO-d6, 5{19}}{35}} MHz): 8 1.{150}}7 (3H, d, J=6,1 Hz, H{{10} }), 2,65 (2H, m, H-7), 4,35 (1H, d, J=10,0 Hz, H-100), 5,10 (1H, s, H{{ 24}}), 6,27 (1 H, d, J=15,9 Hz, H-80), 6,45 (1 H, dd, J=8,0, 1,8 Hz, H{{ 38}}), 6,58 (1H, d, J=8,8 Hz, H-5), 6,73 (1 H, d, J=1,6 Hz, H{{50} }), 6,74 (1H, d, J=8,1 Hz, H-50), 6,94 (1 H, d, J=8,2 Hz, H{62}}) 7,04 (1H, s, H{66}}), 7,46 (1H, d, J=15,8 Hz, H{72}}); 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): 8 17,9 (C{79}}), 35,2 (C{82}}), 63,5 (C{85}}), 68,2 (C{88}} ), 70,4 (C-400), 70,6 (C-3000), 71,7 (C-8), 72,1 (C-2000), 73,7 (C{103}} ), 74,1 (C-500), 74,5 (C-200), 80,9(C-300), 100,7 (C-1000), 102,7 (C-100 ), 113,9 (C-20), 114,9 (C-80), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50), 116,3 (C-2 ), 119,6 (C-6), 121,5 (C-60), 125,5 (C-10), 129,2 (C-1), 143,5 (C-4 ), 145,0 (C-3), 145,3 (C-30), 145,6 (C-70), 148,5 (C-40), 165,6 (C-90 ) (Kuvat S9–S11).

4.4 Cistanche Tubulosa -vesiuutteen (CTE) valmistus

Cistanche tubulosa -jauheen varsi uutettiin kahdesti refluksoimalla veden kanssa 1,5 tuntia, ja uuteliuos suodatettiin. SuodatettuCistanche tubulosavesipitoinen uute(CTE) säilytettiin 4 ◦C:ssa ennen käyttöä.

5. Johtopäätökset

Tämä tutkimus osoitti, että 1–3 on CTE:n aktiivinen komponentti anti-AD-aktiivisuuden kannalta. Rautakelaatiosta on tullut uusi konsepti suunniteltaessa uuden sukupolven lääkkeitä AD:n hoitoon [41]. CTE on mahdollinen kasvitieteellinen anti-AD kiinalainen lääke, joka kohdistuu raudan kelaation aiheuttamaan A-aggregaatioon ja kerrostumaan. Lisäksi osoitimme edelleen, että 1–3 pääsisi aivoihin veri-aivoesteen (BBB) ​​kautta. CTE:n aktiiviset komponentit ja taustalla olevien mekanismien vahvistus auttavat suuresti laadunvalvontaa ja tuotetutkimusten biosaatavuutta tulevaisuudessa. Samalla esitelty edistynyt ja tehokas analyysimenetelmä on hyödyllinen määrittämään 1–3 kasveista, elintarvikkeista, verestä ja aivokudoksesta kemialliseen sormenjälki- ja farmakokineettiseen tutkimukseen.

Viitteet

1. Wu, YT; Beiser, AS; Breteler, MMB; Fratiglioni, L.; Helmer, C.; Hendrie, HC; Honda, H.; Ikram, MA; Langa, KM; Lobo, A.; et ai. Dementian muuttuva esiintyvyys ja ilmaantuvuus ajan myötä – nykyinen näyttö. Nat. Rev. Neurol. 2017, 13, 327–339. [CrossRef]

2. Robinson, L.; Tang, E.; Taylor, JP Dementia: Oikea-aikainen diagnoosi ja varhainen puuttuminen. BMJ 2015, 350, h3029. [CrossRef]

3. Mitchell, R.; Draper, B.; Harvey, L.; Brodaty, H.; Close, J. Selviytyminen ja ominaisuudet vanhusten, joilla on tai ei ole dementiaa ja jotka joutuvat sairaalaan tahallisen itsensä vahingoittamisen vuoksi. Int. J. Geriatr. Psych. 2017, 32, 892–900. [CrossRef] [PubMed]

4. Ott, A.; Breteler, MM; van Harskamp, ​​F.; Claus, JJ; van der Cammen, TJ; Grobbee, DE; Hofman, A. Alzheimerin taudin ja vaskulaarisen dementian esiintyvyys: yhteys koulutukseen. Rotterdamin tutkimus. BMJ 1995, 310, 970–973. [CrossRef]

5. Kalaria, RN; Maestre, GE; Arizaga, R.; Friedland, RP; Galasko, D.; Hall, K.; Luchsinger, JA; Ogunniyi, A.; Perry, EK; Potocnik, F.; et ai. Alzheimerin tauti ja verisuonidementia kehitysmaissa: esiintyvyys, hoito ja riskitekijät. Lansetti. Neurol. 2008, 7, 812–826. [CrossRef]

6. 2018 Alzheimerin taudin tosiasiat ja luvut. Alzheimerin dementti. 2018, 14, 367–429. [CrossRef]

7. Hardy, J.; Selkoe, DJ Alzheimerin taudin amyloidihypoteesi: Edistyminen ja ongelmat matkalla kohti terapiaa. Tiede 2002, 297, 353–356. [CrossRef]

8. Querfurth, HW; LaFerla, FM Alzheimerin tauti. N. Engl. J. Med. 2010, 362, 329–344. [CrossRef]

9. Ayton, S.; Lei, P.; Bush, AI Metallostaasi Alzheimerin taudissa. Vapaa Radic. Biol. Med. 2013, 62, 76–89. [CrossRef]

10. Kim, AC; Lim, S.; Kim, YK Metalli-ionivaikutukset A- ja Tau-aggregaatioon. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 128. [CrossRef]

11. Robert, A.; Liu, Y.; Nguyen, M.; Meunier, B. Kuparin ja raudan homeostaasin säätely metallikelaattoreilla: mahdollinen kemoterapia Alzheimerin taudille. A. Chem. Res. 2015, 48, 1332–1339. [CrossRef] [PubMed]

12. Opare, SKA; Rauk, A. Kupari (I) kelaatit Alzheimerin taudin. J. Phys. Chem. B 2017, 121, 11304–11310. [CrossRef] [PubMed]

13. Santos, MA; Chand, K.; Chaves, S. Viimeaikainen edistys monitoimisissa metallikelaattoreissa mahdollisina Alzheimerin taudin lääkkeinä. Coord. Chem. Rev. 2016, 327–328, 287–303. [CrossRef]

14. D'Acunto, CW; Kaplanek, R.; Gbelcova, H.; Kajik, Z.; Briza, T.; Vasina, L.; Havlik, M.; Ruml, T.; Kral, V. Metallomiikka Alzheimerin taudin hoitoon: Uuden sukupolven kelaattoreiden käyttö, joissa yhdistyvät metallikationin sitomis- ja kuljetusominaisuudet. euroa J. Med. Chem. 2018, 150, 140–155. [CrossRef] [PubMed]

15. Wang, X.; Wang, X.; Guo, Z. Metalliin liittyvä terapia: nouseva strategia Alzheimerin taudin torjuntaan. Coord. Chem. Rev. 2018, 362, 72–84. [CrossRef]

16. Shao, ML; Ma, XW; Wu, Z.; Yu, WM; Chen, XN Kiinan farmakopea; Chemical and Industrial Kustantaja: Peking, Kiina, 2005; s. 90.

17. Li, Z.; Lin, H.; Gu, L.; Gao, J.; Tzeng, C.-M. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): Yksi perinteisen kiinalaisen lääketieteen parhaista farmaseuttisista lahjoista. Edessä. Pharmacol. 2016, 7, 41. [CrossRef] [PubMed]

18. Guo, Q.; Zhou, Y.; Wang, CJ; Huang, YM; Lee, YT; Su, MH; Lu, J. Avoin, ei-plasebokontrolloitu tutkimus Cistanche tubulosa glykosidikapseleilla (memo regain (R)) kohtalaisen Alzheimerin taudin hoitoon. Olen. J. Alzheimer's Dis. Muut Demen. 2013, 28, 363–370. [CrossRef]

19. Wu, CR; Lin, HC; Su, MH Cistanche tubulosan vesipitoisten uutteiden kääntäminen käyttäytymispuutteista Alzheimerin taudin kaltaisessa rottamallissa: Merkitys amyloidin kerrostumisen ja keskushermoston toiminnan kannalta. BMC-täydennys. Altern. Med. 2014, 14, 202. [CrossRef]

20. Wang, YM; Zhang, SJ; Luo, GA; Hu, YN; Hu, JP; Liu, L.; Zhu, Y.; Wang, HJ Fenyylietanoidiglykosidien analyysi Cistanchis-herbauutteessa LC/ESI-MS/MS:llä. Acta Pharm. Sinic. 2000, 35, 839–842.

21. Geng, XC; Tian, ​​XF; Tu, PF; Pu, XP Ekinakosidin neuroprotektiiviset vaikutukset Parkinsonin taudin hiiren MPTP-mallissa. euroa J. Pharmacol. 2007, 564, 66–74. [CrossRef]

22. Zhao, Q.; Yang, X.; Cai, D.; Joo, L.; Hou, Y.; Zhang, L.; Cheng, J.; Shen, Y.; Wang, K.; Bai, Y. Echinacoside suojaa MPP(plus)-indusoitua hermosolujen apoptoosia vastaan ​​ROS/ATF3/CHOP-reitin säätelyn kautta. Neurosci. Sonni. 2016, 32, 349–362. [CrossRef] [PubMed]

23. Wang, YH; Xuan, ZH; Tian, ​​S.; Toisaalta GH Echinacoside suojaa 6-hydroksididopamiinin aiheuttamalta mitokondrioiden toimintahäiriöltä ja tulehdusvasteilta PC12-soluissa vähentämällä ROS-tuotantoa. Evid. Perustuu täydennys. Vaihtoehto. Med. 2015, 2015, 189239. [CrossRef] [PubMed]

24. Shiao, YJ; Su, MH; Lin, HC; Wu, CR Echinacoside parantaa amyloidi-beeta-peptidien aiheuttamaa muistin heikkenemistä ja kolinergistä puutetta estämällä amyloidin kertymistä ja toksikologiaa. Ruokatoiminto. 2017, 8, 2283–2294. [CrossRef] [PubMed]

25. Shiao, YJ; Su, MH; Lin, HC; Wu, CR Akteosidi ja isoakteosidi suojaavat amyloidi-beeta-peptidin aiheuttamalta sytotoksisuudelta, kognitiivisilta vajavuuksilta ja neurokemiallisilta häiriöiltä in vitro ja in vivo. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18. [CrossRef]