Tulehdusta tunnistavat katalaasia jäljittelevät nanotsyymit lievittävät akuuttia munuaisvauriota kääntämällä paikallista oksidatiivista stressiä

Abstrakti

Taustaa:reaktiiviset happilajit (ROS)ja tulehduksen, joka on kriittinen tekijä kudosvaurioissa, tiedetään liittyvän useisiin sairauksiin. Munuaiset ovat herkkiä hypoksialle ja alttiita ROS:lle. Näin ollen noidankehä välilläoksidatiivinen stressija munuaisethypoksia vaikuttaa ratkaisevastietenemiseenkrooninen munuaissairausja lopuksi,loppuvaiheen munuaissairaus. Siten terapeuttisten aineiden kuljettaminen ROS-rikkaaseen tulehduskohtaan ja terapeuttisten aineiden vapauttaminen on toteuttamiskelpoinen ratkaisu.

Uusia yrttejä munuaissairauksiin

Tulokset: Kehitimme pidempään kiertävän, tulehduksen tunnistavan, ROS-puhdistuvan monipuolisen nanoalustan lataamalla vakaasti katalaasia jäljittelevää 1-dodekaanitiolistabiloitua Mn3O4:a (dMn)3O4) nanohiukkaset ROS-herkän nanomi-solut (PTC), jolloin tuloksena on ROS-herkkä nanotsyymi (PTC-M). Hydrofobinen dMn3O4nanohiukkasia ladattiin sisäänPTC-misellit estämään ennenaikaista vapautumista verenkierron aikana ja toimivat terapeuttisena aineena ROS-responsiivisenaladatun dMn:n vapautuminen3O4kun se saapui tulehduksen alueelle.

Avainsanat:Mn3O4-nanohiukkaset, nanotsyymit, tulehdus,Iskemia-reperfuusio, Munuainen

Tausta

Acute kidney injury (AKI) is the term that covers a broad spectrum of renal function deterioration ranging from small changes in serum creatinine level to conditions requiring renal replacement therapy [1]. The KDIGO (Kidney disease: improving global outcomes) guidelines define AKI as an increase in serum creatinine of either>0.3  mg/dL within 48  h,>1,5 kertaa lähtötilanteesta seitsemän päivän kuluessa tai virtsan määrän väheneminen<0.5 ml/kg/hour for six hours [1]. AKI is one of the rising global health problems that cause high morbidity and mortality and economic burden [2]. The incidence of AKI defined by the KDIGO guidelines was 21.6% in adults in in-hospital settings [3]. AKI may lead to several complications, including metabolic acidosis, hyperkalemia, uremia, volume overload, and damage to other organ systems, including death. Despite advances in medicine, mortality from AKI is still high. According to a meta-analysis of studies in in-hospital settings, AKI-associated mortality was reported to be 23.9% in adults [3]. The mortality rate of dialysis-requiring AKI patients exceeds 50% [4]. AKI increases the long-term risk of subsequent AKI, progressive chronic kidney disease (CKD), and end-stage renal disease (ESRD) [5]. Eventually, AKI increases socioeconomic and healthcare burdens. Nevertheless, there is no clear treatment for AKI to date. When AKI occurs, conservative treatments such as removing the causative factors, controlling water and electrolyte imbalances, performing renal replacement therapy, if necessary, and waiting for renal function to recover are applied.

Iskemia-reperfuusiovaurio (IRI)on elinvaurio, jonka aiheuttaa verenvirtauksen ohimenevä heikkeneminen tai pysähtyminen, jota seuraa reperfuusio, ja se voidaan kohdata useissa kliinisissä tilanteissa, kuten sokissa, sydäninfarktissa, iskeemisessä aivohalvauksessa, suuressa leikkauksessa ja elinsiirrossa. Munuaisten IRI on yksi johtavista AKI:n syistä, mikä johtaa nopeaan munuaisten toiminnan heikkenemiseen. Munuainen on elin, joka on erityisen herkkä iskeemisille vaurioille ja vahingoittuneet tubulaariset epiteelisolut heikentävät jätteiden erittymistä sekä veden, elektrolyyttien ja happo-emästasapainon hallintaa [6]. Munuaisten tubulussoluvaurion mekanismiin IRI:ssä tiedetään liittyvän reperfuusion aikana syntyneiden reaktiivisten happilajien (ROS) aiheuttamaa tulehdusta [6–8]. Siksi ROS-poistoa on yritetty soveltaa IRI:n hoitoon. Sen todellinen kliininen käyttö on kuitenkin ollut rajoitettua systeemisistä sivuvaikutuksista, joihin kuuluvat yliherkkyysreaktiot [9]. Antioksidanttien, kuten edaravonin, antamista on jo käytetty ROS:n poistamiseen IRI:ssä. Siihen liittyi kuitenkin useita sivuvaikutuksia, ja siksi on esitetty vaatimuksia uusille ja tehokkaille antioksidanteille, kuten nanotsyymeille (nanomateriaalit, joilla on luonnollista entsyymimäistä aktiivisuutta) [9–13]. Yao et ai. havaitsi, että Mn3O4 nan -partikkeleilla oli useita entsyymejä jäljitteleviä aktiivisuuksia, eli superoksididismutaasia ja katalaasia jäljitteleviä aktiivisuuksia sekä hydroksyyliradikaaleja poistavaa aktiivisuutta [11]. Osoitettiin, että Mn3O4:llä oli vahvempi ROS-puhdistuskyky kuin muilla entsyymeillä, kuten V2O5, CeO2, Co3O4, MnFe2O4 ja Fe3O4, ja se oli parempi kuin muilla mangaanioksidityypeillä (MnOx (MnO2, MnO ja Mn2O3).

Kuva 1 Kaaviokuva, joka esittää PTC-M:n valmistusta ja vaikutustapaa A PTC-M:n synteesi, B PTC-M:n vaikutusmekanismi (1) PTC-M:n suonensisäinen injektio (2) injektoitu PTC-M kiertää veressä ja kerääntyy tulehduskohtaan (3) PTC-M:n destabiloituminen tulehduskohdassa esiintyvän sisäisen ROS:n vuoksi (4) ladatun dMn 3O4:n vapautuminen tulehduskohtaan (5) vapautunut dMn3O4 katalysoi ROS-poistoa, mikä johtaa (6) tulehduksen, apoptoosin ja fibroosin vähentäminen (7) munuaisvaurion lievitys ja (8) munuaisten toiminnan paraneminen

Tulokset

dMn3O4-nanohiukkasten ja polymeerikonjugaattien synteesi ja karakterisointi

Te dMn3O4 NP:t syntetisoitiin käyttämällä yhteissaostusmenetelmää ja stabiloitiin käyttämällä 1-dodekaanitiolin tioliryhmiä (kuvio 2A). Kenttäemission transmissioelektronimikroskoopin (FE-TEM) analyysi osoitti, että dMn3O4 NP:iden keskimääräinen koko oli alle 2{{10}} nm (18.0±0,6 nm) (kuva 2B) ). Lisätiedosto 1: Kuvat S1A ja S1B esittävät kuvat ja kaavamaisen esityksen valmistetusta dMn3O4:stä. Energiadispersiivisen röntgenspektroskopian (EDS) tiedot osoittivat Mn:n läsnäolon Mn3O4:stä ja rikin ja hiilen läsnäolon SH-C12:sta (kuva 2C ja lisätiedosto 1: kuva S1C). Röntgenfotonispektroskopian (XPS) analyysitulokset kuvasivat Mn 2p:n XPS-spektrin, joka koostui kahdesta huipusta, jotka sijaitsivat 641,42 eV:lla ja 653,23 eV:lla, ja nämä piikit johtuivat vastaavasti Mn 2p3/2:sta ja Mn 2p1/2:sta (kuva 1). 2D ja lisätiedosto 1: Kuva S2). Energiarako näiden kahden piikin välillä oli 11,81 eV, mikä vastasi hyvin Mn3O4:n raportoitua kirjallisuutta. Kuvassa 2E esitetyssä dMn3O4 NP:n röntgenjauhediffraktiokuviossa (XRD) kaikki mitatut diffraktiohuiput sopivat hyvin hausmanniitti Mn3O4:n [ICDD: #001–1127] standardikuvioon, mikä vahvistaa niiden erittäin kiteisyyden. luonto. ROS-responsiivinen PTC-konjugaatti valmistettiin vaiheittaisilla kemiallisilla reaktioilla, joissa tioketaali (TK) -linkkeri, jossa on terminaalinen karboksylaattiryhmä, mitoitettiin ensin. TK-linkkerin karboksyyliryhmä konjugoitiin sitten metoksi-PEG-amiinin aminoryhmään (PEG-AM) käyttämällä EDC/NHS-reaktiota PEG-TK:n muodostamiseksi. Lopuksi PEG-TK:n toinen karboksyyliryhmä konjugoitiin jälleen stearamiinin aminoryhmään EDC/NHS-reaktion kautta [15]. ROS-responsiivinen PC-konjugaatti valmistettiin konjugoimalla steariinihappo PEG-AM:iin. PTC:n ja PC:n koostumus analysoitiin1H-ydinmagneettiresonanssi (NMR) -spektroskopialla (lisätiedosto 1: kuva S3). NMR-spektrit osoittivat tunnusomaisia ​​piikkejä arvoilla 8 0,83 ja 1,23 ppm, jotka vastaavat C18:n metyyli- ja metyleeniprotoneja. Piikki δ 3,6:ssa vastasi PEG:n O-CH2-CH2-. C18:n substituutioaste (DS %) PTC:ssä ja PC:ssä laskettiin vastaavasti 78 %:ksi ja 46 %:ksi.

PTC-M-entsyymin valmistus ja karakterisointi

ROS-herkät nanomisellit (PTC) ladattiin dMn3O4:llä, mikä johti PTC-M:ään. PTC:n dMn304-syöttösuhdetta (20 %) käytettiin PTC-M:n valmistukseen. Valmistettujen PTC:n ja PTC-M:n hydrodynaaminen halkaisija, zeta-potentiaali ja FE-TEM-kuvat on esitetty kuvassa 3A ja lisätiedostossa 1: kuva S4A. PTC:n FE-TEM-kuvat osoittivat pallomaisia ​​nanomisellejä, joilla oli tasainen hiukkaskoo. PTC-M:n hydrodynaaminen halkaisija kasvoi hieman dMn3O4:n lataamisen jälkeen johtuen dMn3O4:n pakkaamisesta hydrofobiseen tilaan, kun taas zeta-potentiaali pysyi negatiivisena molemmissa nanomiselleissä PEG-suojauksen vuoksi. PTC:n ja PTC-M:n FE-TEM-kuvissa näkyi tasaisesti jakautuneita hiukkasia. Lataussisältö ja kapselointitehokkuus laskettiin käyttäen massaspektrometristä analyysiä ja niiden laskettiin olevan 10 ± 3 % ja 17 ± 6 %, vastaavasti. dMn3O4:n läsnäolo näkyi PTC-M:n FE-TEM-kuvissa (kuvio 3A), mikä vahvistettiin edelleen PTC-M:n EDS-analyysillä, joka osoitti Mn:n Mn3O4:stä, rikkiä ja hiiltä SH-C12:sta ja hiiltä. , typpi ja happi PEG:stä (Lisätiedosto 1: Kuva S5). Suoritettiin termogravimetrinen (TGA) analyysi ja dMn3O4-kuormituksen laskettiin olevan 12 % (Lisätiedosto 1: Kuva S6B). ROS-herkät misellit, jotka oli ladattu dMn3O4:llä (PC-M), valmistettiin myös kontrolleiksi samalla menetelmällä.

TK-sidoksen roolin vahvistamiseksi PTC-M:n ROS-responsiivisessa destabiloitumisessa ja dMn3O4:n vapautumisessa PTC-M altistettiin ROS-olosuhteille lisäämällä H202:ta. Kontrollina käytimme ROS-herkkää PC-M:tä. Sekä PTC-M:llä että PC-M:llä oli pallomainen morfologia, jossa nanomiselleissä oli tiukasti pakattua dMn3O4:a, mutta H2O2-käsittelyn jälkeen PTC-M:n supra-kokoonpano vääristyi, mitä seurasi dMn3O4:n vapautuminen, joka sitten oli aggregoitu, kuten FE-TEM-kuvissa näkyy, kun taas PC-M osoitti vakaat rakenteet jopa H2O2:lle altistuksen jälkeen (kuva 3B ja lisätiedosto 1: kuva S4B). PTC-M:n ROS-herkkyys varmistettiin edelleen vertaamalla muutoksia hydrodynaamisessa halkaisijassa ja zeta-potentiaalissa PC-M:ään, kuten on esitetty lisätiedostossa 1: kuva S7. ROS-ei-herkän PC-M:n hydrodynaaminen halkaisija ja zeta-potentiaali eivät osoittaneet havaittavaa eroa H2O2:n lisäämisen jälkeen. Kuitenkin ROS-herkkä PTC-M osoitti pienentyneet hydrodynaamiset koot, luultavasti johtuen PEG-suojauksen poistamisesta TK:n rikkoutumisen kautta, mikä johti rakenteen epävakauteen. H2O2:n lisäämisen jälkeen zeta-potentiaali palasi negatiivisesta positiiviseksi varaukseksi, mikä saattoi johtua PEG:n poistosta ja höyrytyksestä. Tutkimme edelleen koon vaihtelua tarkistamalla stabiilisuutta ajan mittaan seuraamalla hydrodynaamisia halkaisijoita H2O2:n läsnä ollessa tai ilman (kuva 3C). H2O2:n lisäämisen jälkeen hydrodynaamiset halkaisijat pienenivät merkittävästi 10 sekunnissa ilman lisämuutoksia kuuteen päivään asti, kun taas PTC-M yksin osoitti stabiileja kokoja kokeen aikana, mikä viittaa PTC-M:n hyvään kolloidiseen stabiilisuuteen. Tarkastimme myös stabiilisuuden 10 % FBS:ssä ja havaitsimme, että PTC-M osoitti hyvää stabiilisuutta jopa 4 päivää (lisätiedosto 1: kuva S9). Hydroksidynaamiset halkaisijat ja zeta-potentiaalin vaihtelu vahvistettiin myös ROS-herkillä ja ei-herkillä tyhjillä nanomiselleillä (PTC ja PC) (Lisätiedosto 1: Kuva S8). Kaikki nämä vertailevat tutkimukset ROS:n läsnä ollessa tai ilman sitä osoittivat valmistettujen nanomoolien tai lopullisen dMn3O4 PTC-M -entsyymin stabiilisuuden ja ROS-herkkyyden.

Kuva 2 dMn3O4:n synteesi ja karakterisointi Kaavamainen esitys dMn3O4-synteesistä, B FE-TEM -kuvat, C EDS -analyysi, D XPS-spektri ja dMn3O4 NP:n E XRD -kuviot

Tarkastimme lisäksi lopullisen PTC-M-entsyymin H2O2-eliminaatioominaisuuden johtuen dMn3O4 NP-latauksesta. Tämä testattiin käyttämällä tereftaalihappoa (TA) tulevaisuuden senttimittarina. TA reagoi H2O2:n kanssa muodostaen 2-hydroksitereftaalihappoa, jonka fluoresoiva piikki oli 425 nm:ssä. dMn3O4 muuttaa H202:n vedeksi ja hapeksi ja siten fluoresenssiintensiteetti laskee, mikä vahvistaa katalaasiaktiivisuutta, kuten kuvassa 3D esitetään. Te PTC-M osoitti voimakasta laskua fluoresenssin intensiteetissä verrattuna tyhjään PTC-miselliin H202:n läsnä ollessa ajan myötä. PTC-M:n katalaasin kaltainen aktiivisuus oli myös pitoisuudesta riippuvaista, kuten on esitetty lisätiedostossa 1: kuva S10. PTC-M:n hapentuotantokykyä varmistettiin edelleen käyttämällä O2-spesifistä fluoresoivaa koetinta Ru(DDP) H2O2:n läsnä ollessa. Fluoresenssi kymmenessä Ru(DDP)-kaupungissa laskee O2:n läsnä ollessa, mikä viittaa O2:n tehokkaaseen tuotantoon. Kuten kuvasta 3E näkyy, Ru(DDP):n fluoresenssin intensiteetti laski H2O2:n läsnä ollessa PTC-M-ryhmässä, kun taas H2O2:n läsnäolo yksinään PTC-ryhmässä osoitti vain vähän fluoresenssin laskua (kuvio 3F). vahvistaen katalaasiaktiivisuuden, joka johtaa hapen tuotantoon PTC-M:ssä. Lopuksi vahvistimme PTC-M:n H2O2-eliminaatioominaisuuden käyttämällä happitunnistusmittaria. Kuten kuviossa 3G esitetään, PTC-M:n hapentuotanto lisääntyi alkuajan sisällä, mitä seurasi hidas kasvu, kun taas tyhjät misellit PTC eivät osoittaneet hapen tuotantoa. H2O2:n epäsuhtautuminen havaittiin happikuplien muodostumisena PTC-M-ryhmässä, kuten on esitetty lisätiedostossa 1: kuva S11A. Havaittiin myös, että PTC-M osoitti korkeampaa hapen tuotantoa verrattuna pelkkään dMn3O4:ään, luultavasti johtuen dMn3O4:n tiiviistä pakkauksesta PTC-M:ssä, mikä teki sen reaktiossa paremmin käytettävissä kuin vapaa dMn3O4 (Lisätiedosto 1: Kuva S11B). Vaikka nanomisellit olivat löystyneet H2O2-käsittelyn vuoksi, kuten FE-TEM:ssä on esitetty, dMn3O4 saattoi silti olla läsnä PTC-M:n sisällä, mikä johti korkeaan katalaasiaktiivisuuteen verrattuna vapaaseen dMn3O4:ään. Kaikki nämä tulokset yhdessä vahvistivat PTC-M:n ylivoimaisen katalaasia jäljittelevän aktiivisuuden.

Solujen elinkelpoisuus ja soluunotto in vitro

Vahvistaaksemme solun sisäänoton ja solunsisäisesti jakautuneen ROS-herkän-PTC:n ROS-herkän kaupungin ja hyötykuorman vapautumismallin vertasimme PTC:tä PC:hen in vitro -olosuhteisiin. Ensin tarkistimme valmistettujen PTC-, PC-, PTC-M- ja PC-M-solujen elinkelpoisuuden HK-2-soluissa WST-1-määrityksellä (Lisätiedosto 1: Kuva S12). Tyhjät misellit kokivat vähän solukuolemaa, mutta dMn3O4--latauksen jälkeen solujen elinkelpoisuus laski, mutta muutos ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Koska tyhjät misellit eivät olleet sytotoksisia, pieni vaihtelu solun elinkelpoisuudessa saattoi johtua pintaan adsorboituneesta dMn3O4:stä. PTC-M:n ja PC-M:n IC50-arvon määritettiin olevan 130,41 ja 247,17 ug/ml, vastaavasti (kuvio 4A). Nanomisellien solunsisäisen oton ja jakautumisen tutkimiseksi edelleen IR780:a käytettiin mallilääkkeenä ja valmistettiin IR780:lla ladattuja PTC-nanomisellejä, PTC-IR780, visualisoimaan IR780:n fluoresenssin intensiteetti käyttämällä hauskaa läsnäolomikroskopiaa (Evos FL Auto 2, Thermo Fisher Scientific). , USA) (kuvio 4B). Kontrolliryhmänä analysoimme myös ROS-ei-herkän PC-IR780:n ottoa. PC-IR780:een verrattuna PTC-IR780 osoitti suurempaa sisäänottoa HK-2-soluissa (Lisätiedosto 1: Kuva S13). Tarkka syy PTC-IR780:n lisääntyneeseen imeytymiseen ei-ROS-olosuhteissa ei ole selvä, mutta se voi johtua siitä, että PTC voi osoittaa lievää herkkyyttä normaalille ROS-tasolle soluviljelyolosuhteissa, mikä johtaa PEG-suojauksen poistoon, joka lähtee pinnalta. lataus hieman positiivinen. PC-IR780 osoitti samanlaista sisäänottokuviota riippumatta H2O2-hoidon tai hypoksian aiheuttamista ROS-olosuhteista johtuen ei-herkkyydestä, kun taas PTC-IR780 osoitti erilaisen jakautumiskuvion solujen sisällä, mikä saattoi johtua IR780:n lisääntyneestä vapautumisesta. solujen sisällä. Aiemmat solujen elinkelpoisuustiedot (Lisätiedosto 1: Kuva S11), jotka osoittavat lisääntyneen solukuoleman PTC-M:ssä, johtuisivat myös PTC:n lisääntyneestä soluunoton PC:hen verrattuna. IR780-jodidi on erittäin hydrofobinen väriaine, joka voi osoittaa suurta affiniteettia solukalvoa kohtaan ja näyttää erittäin kirkkaan signaalin ROS-altistuksesta riippumatta. Solujen sisäänotto analysoitiin edelleen tarkistamalla keskimääräinen fluoresenssin intensiteetti (MFI) fluoresenssiaktivoidun solulajittelun (FACS) analyysillä (kuvio 4C), joka tuki fluoresenssimikroskopialla saatuja tietoja. Kuten on esitetty, MFI oli korkein ROS-herkässä PTC IR780 -ryhmässä muihin ryhmiin verrattuna, mikä vahvistaa IR780:n lisääntyneen vapautumisen soluissa. Lisäksi Quan sidoi MFI:n eri ryhmistä (kuvio 4D), jotka tukivat mikroskooppitietoja, jotka viittaavat siihen, että PC-IR780:lla ei ollut merkittävää eroa solujen oton suhteen edes ROS-indusoiduissa olosuhteissa, kun taas PTC IR780 osoitti merkittävää solujen lisääntymistä. imeytymistä hoidettaessa ROS-indusoiduissa olosuhteissa. PTC:n soluunotto määritettiin myös tarkistamalla jäännös-Mn soluissa PTC-M:llä käsittelyn jälkeen. Kuten kuviossa 4E esitetään, PTC-M osoitti konsentraatiosta riippuvaa sisäänottoa HK-2-soluissa. Nämä tulokset tiivistävät siis nanomisellien tehostuneen sisäistyksen ja kiihtyneen vapautumisen solujen sisällä, mikä johtuu luultavasti nanomisellien ROS-välitteisestä purkamisesta.

Teimme in vitro -tutkimuksia HK-2-soluilla tutkiaksemme edelleen PTC-M:n vaikutuksia oksidatiivisiin stressiolosuhteisiin solutasolla. HK-2-soluja stimuloitiin H202:lla, edustavalla ROS:lla (kuvio 5A). H2O2 tehosti hemioksigenaasin (HO)-1 ilmentymistä, jota paransi PTC-M-yhteishoito (kuvio 5A). Te 2',7'-diklooridihydrofluoreseiinidiasetaatti (DCF DA) -määritys suoritettiin solunsisäisen ROS-muutoksen mallin tarkistamiseksi. H202:lla stimuloidut Te HK-2 -solut osoittivat suurta fluoresenssin intensiteettiä, mutta PTC-M:llä yhteiskäsittelyn jälkeen fluoresenssin intensiteetti väheni (kuvio 5B). Te BAX/BCL-2 -suhdetta nosti H2O2-käsittely, joka saatiin myös talteen PTC-M-yhteishoidolla, mikä osoittaa suojan apoptoosia vastaan ​​(kuva 5C). H2O2:lla käsitellyt HK-2-solut osoittivat merkittävää progressiivista lisääntymistä anneksiini V+/PI−-värjäytymisessä, jonka PTC-M esti (kuva 5D). H2O2--indusoitu ERK-, JNK- ja p38-fosforylaatio tukahdutettiin myös yhteiskäsittelyllä PTC-M:llä, vaikka fosforyloidun P38:n merkittävää vähenemistä ei havaittu (kuvio 5C). Nämä tiedot viittaavat siihen, että PTC-M tukahdutti ROS-indusoituja apoptoottisia prosesseja munuaisten tubulusepiteelisoluissa.