Parannettu objektintunnistusmuisti käyttämällä jälkikoodausta toistuvaa transkraniaalista magneettistimulaatiota, osa 1

abstrakti

Tausta: Aivojen stimulaation tiedetään vaikuttavan kanonisiin reitteihin ja muistiin liittyviin proteiineihin. Aivojen stimulaation kyvystä parantaa muistia on kuitenkin ristiriitaisia ​​tuloksia, mikä saattaa johtua stimulaation ajoituksen vaihteluista.

Aivojen stimulaation ja muistin välillä on läheinen yhteys. Aivojen stimulaatio voi edistää aivojen neuronien toimintaa, mikä parantaa muistia ja kognitiivisia kykyjä.

Ensinnäkin aivojen stimulaatio voi edistää neuronien välistä yhteyttä. Aivoja stimuloimalla hermosolujen välinen viestintä ja yhteys tihenevät ja tehostuvat. Näistä yhteyksistä tulee vakaampia ja todellisempia, mikä tekee aivoista joustavampia, luovampia ja ajattelevampia. Nämä edut antavat sinulle etua oppimisessa ja elämässä.

Toiseksi aivojen stimulaatio voi vahvistaa muistia. Toistuva aivojen stimulaatio voi parantaa aivojen elinvoimaa ja terveyttä, mikä parantaa muistia. Aivojen terveyden ja muistin ja kognitiivisten toimintojen välillä on elintärkeä yhteys. Aivojen stimulaatio auttaa aivoja toipumaan, kasvamaan ja korjautumaan. Tällä tavoin meidän on helpompi oppia tietoa tai saada merkityksellistä tietoa elämästä ja pystymme paremmin pitämään ne tallessa ja muistuttamaan aivoissa.

Lisäksi aivostimulaatio voi myös edistää uuden tiedon oppimista ja soveltamista. Elämässä kohtaamme jatkuvasti erilaisia ​​ongelmia, joita emme tiedä miten käsitellä. Stimuloimalla aivoja usein voimme ymmärtää tämän monimutkaisen tiedon nopeammin ja tarkemmin, sopeutua siihen vähitellen, löytää tapoja käsitellä sitä ja selviytyä siitä paremmin, mikä tekee meistä kätevimpiä asioiden käsittelyssä.

Lyhyesti sanottuna, aivojen stimulaation avulla voimme olla joustavampia, luovempia ja ajattelevaisempia. Kohtaamme myös elämän ongelmat ja haasteet luottavaisemmin. Aivojen stimulaatio on hyvä tapa parantaa kognitiivisia kykyjämme, vahvistaa oppimista ja parantaa muistia. Pysykäämme aivoharjoitussuunnitelmassamme, säilyttäkäämme positiivinen asenne, olkaamme positiivisia, pyrkikäämme parempaan henkilökohtaiseen kehitykseen ja toteuttakaamme ihanteeemme. Voidaan nähdä, että meidän on parannettava muistia, ja Cistanche voi parantaa muistia merkittävästi, koska Cistanche voi myös säädellä välittäjäaineiden tasapainoa, kuten nostaa asetyylikoliinin ja kasvutekijöiden tasoa, jotka ovat erittäin tärkeitä muistille ja oppimiselle. Lisäksi Cistanche voi myös parantaa verenkiertoa ja edistää hapen toimitusta, mikä voi varmistaa, että aivot saavat riittävästi ravintoa ja energiaa, mikä parantaa aivojen elinvoimaa ja kestävyyttä.

Paranna työmuistia napsauttamalla Know

Hypoteesi: Oletimme, että toistuva transkraniaalinen magneettistimulaatio (rTMS), joka annettiin oppimistehtävän jälkeen ja ennen hakua, voisi auttaa parantamaan muistia. Menetelmät: Istutimme urospuolisille B6129SF2/J-hiirille (n ¼ 32) kallon kiinnityksen rTMS-kelojen kiinnittämiseksi että hiirille voitaisiin antaa johdonmukaista stimulaatiota frontaalialueelle niiden vapaasti liikkuessa.

Hiirille tehtiin sitten objektintunnistustestin näytteenottovaihe ja niille annettiin hoito þ3, þ24, þ48 tuntia testin jälkeen. Hoito koostui 10 minuutin 10 Hz rTMS-stimulaatiosta (TMS, n ¼ 10), valehoidosta (SHAM, n ¼ 11) tai kontrolliryhmästä, joka ei tehnyt käyttäytymistestiä tai saanut rTMS:ää (CONTROL n ¼ 11).

þ72 h hiirillä testattiin niiden tutkimista uusi vs. tuttu kohde. Tulokset: 72-h:ssa vain hiiret, jotka saivat rTMS:n, tutkivat uutta kohdetta paremmin kuin tuttu kohde.

Osoitamme lisäksi, että synaptisen GluR2:n edistäminen ja synaptisten yhteyksien ylläpitäminen peririnaalisessa aivokuoressa ja hippokampuksen CA1:ssä ovat tärkeitä tämän vaikutuksen kannalta.

Lisäksi löysimme todisteita siitä, että nämä muutokset liittyivät CAMKII- ja CREB-reitteihin hippokampuksen hermosoluissa.

Johtopäätös: Yhdistämällä rTMS:n tunnetut biologiset vaikutukset muistipolkuihin tarjoamme todisteita siitä, että rTMS parantaa muistia tehokkaasti, kun sitä annetaan konsolidointi- ja ylläpitovaiheiden aikana.

1. Johdanto

Ei-invasiivisen aivojen stimulaation tiedetään vaikuttavan muistiin osallistuviin kanonisiin reitteihin ja proteiineihin. Nykyisillä tutkimuksilla, joissa on tutkittu aivostimulaation, erityisesti toistuvan transkraniaalisen magneettisen stimulaation (rTMS) vaikutuksia muistiin, on kuitenkin saatu ristiriitaisia ​​tuloksia [1].

Syynä tähän voi olla stimulaation kohdistaminen eri aikoina muistin muodostuksen ja haun aikana [1]. Todisteet viittaavat siihen, että rTMS:n kohdistaminen koodauksen jälkeiseen tai konsolidointivaiheeseen voi osoittautua hyödylliseksi vakaan pitkäaikaisen muistin kehittämisessä [2]e4].

Konsolidaatio on vaihe, joka muuttaa lyhytaikaisen muistin pitkäkestoiseksi muistiksi (LTM). Prosessi on riippuvainen aikaspesifisestä proteiinisynteesistä, joka muuttaa uuden tiedon stabiileiksi synaptisiksi modifikaatioiksi, joilla on lisääntynyt postsynaptisten reseptoritiheys [5,6].

Tämän aika- ja aluespesifisen proteiinisynteesin tärkeys on osoitettu tutkimuksissa, jotka estävät denovon proteiinisynteesin. Esimerkiksi yksi tutkimus, joka esti proteiinisynteesin hippokampuksessa 3-h, mutta ei 6-h oppimistapahtuman jälkeen, heikensi rottien LTM-muistia mutta ei lyhytaikaista muistia[7].

Näistä proteiineista on tunnistettu useita tärkeitä signalointireittejä, jotka ovat lisääntyneitä ja tärkeitä tässä prosessissa.

Synapsissa on useita signalointireittejä, jotka signaloivat LTM:n tarvitsemaa reseptorin hermotusta ja selkärangan vakautta. Nämä aktivoituvat pitkäaikaisen potentiation (LTP) ärsyketapahtuman kautta, ja niitä usein tehostavat neurotrofiset tekijät, kuten aivoista peräisin oleva neurotrofinen tekijä (BDNF) [8].

BDNF on erityisen tärkeä luotaessa pitkäaikaisia ​​muistoja, koska BDNF:n synteesin estäminen tiettyinä ajankohtina seuraava oppiminen estää sen konsolidoinnin [5].

BDNF sitoutuu tyrosiinikinaasireseptoreihin (TrkB) ja voi käynnistää useita signalointireittejä, kuten mitogeenin aktivoiman proteiinikinaasin / solunulkoisen signaalin säätelemän kinaasin (ERK) tai fosfolipaasi Cg -reittejä. Nämä signalointireitit konvergoivat transkription säätelytekijän cyclicAMP-responsive element-binding protein (CREB) aktivoimiseksi.

Kalsiumaktivoidut proteiinit, kuten kalsium/kalmoduliiniriippuvainen proteiinikinaasi II (CAMKII), näyttelevät myös roolia CREB-aktivoidussa geenisäätelyssä[9e11], ja ne voivat myös suoraan välittää glutamatergisten AMPA-reseptorien synaptista ilmentymistä ja stabiloida synaptista rakennustelinettä [12e15] .

Yhdessä nämä signalointireitit johtavat shiftin-reseptorin ilmentymiseen ja translokaatioon, joka välittää lisääntynyttä aktivaatiota synapsissa, mikä auttaa stabiloimaan synapseja ja edistämään pitkittyneen LTP:n ylläpitoa [16]. Tärkeää on, että aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että on mahdollista parantaa muistin konsolidaatiota. näiden konsolidaatioreittien ajoittain uudelleenaktivoinnin kautta kokeellisissa olosuhteissa [17].

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet rTMS:n kyvyn vaikuttaa suoraan näihin spesifisiin reitteihin aivoissa. In vivo -tutkimukset ovat osoittaneet, että rTMS lisää BDNF-tasoja aivoissa [18e20]. Tarkemmin sanottuna in vitro rTMS johtaa Ca2þ:n lisääntymiseen neuroneissa, joka on CAMKII-reitin hallitseva signalointimolekyyli [18]. Lisääntynyt CAMKII- ja CREB-fosforylaatio havaittiin myös in vitro rTMS:n jälkeen [20,21].

rTMS vaikuttaa myös suoraan synaptisen reseptorin ilmentymiseen lisäämällä AMPA-reseptoritiheyttä [22e24] ja säätelemällä AMPA-reseptorin alayksiköitä Glutamaattireseptori 1 (GluR1) ja glutamaattireseptori 2 (GluR2) [25,26].

Siksi asrTMS aktivoi näitä polkuja, se olisi tehokkain muistin heikentäjä konsolidointivaiheen aikana. Tässä tutkimuksessa tarkasteltiin rTMS:n käyttöä muistin parantamiseen kohdistamalla muistin konsolidointi- ja ylläpitovaiheiden stimulaatio.

Oletimme, että oppimistehtävän jälkeen annettu rTMS voisi parantaa muistin suorituskykyä ja ennen hakua. Tämä olisi seurausta muistiin liittyvien polkujen säännöllisestä uudelleenaktivoitumisesta, joihin myös rTMS vaikuttaa.

Käyttämällä tietyn episodisen LTM:n eläinmallia osoitimme, että rTMS parantaa objektin muistia, kun se annettiin 72- tunnin sisällä koodauksen ja haun välillä, kun taas SHAM-hoitoa saaneet hiiret eivät säilyttäneet muistia.

Tätä vaikutusta tukivat muutokset peririnaalisen aivokuoren ja CA1:n synaptisissa yhteyksissä, CREB:n ja CAMKII:n kohonnut aktivaatio ja dynaaminen muutos AMPA-reseptorin alayksiköissä synapsissa.

2. Materiaali ja menetelmät

2.1. Eläimet

Käytimme tässä tutkimuksessa n¼ 33 urospuolista B6129SF2/J-hiirtä, jotka olivat iältään 2–4 kuukauden ikäisiä. Kaikki hiiret elivät 12-h valo/12-h pimeässä syklissä vapaan pääsyn kuivarehuun ja veteen. Kaikki eläinten hoito ja toimenpiteet olivat eläinsuojelulain mukaisia, ja ne olivat instituutioiden ohjeita ja VA Palo Alton eläintutkimuskomitean hyväksymiä.

2.2. Kierukkatukikirurgia

Jokaiselle hiirelle tehtiin leikkaus, jossa kiinnitettiin kelatuki, joka mahdollisti jatkuvan rTMS-stimulaation hereillä oleville eläimille. Yksityiskohtaisia ​​tietoja kirurgisesta toimenpiteestä löytyy julkaisusta Poh et al., 2018[27].

Lyhyesti sanottuna eläimet nukutettiin 3 % isofluraanilla ja pidettiin 2 %:ssa nenäkartiolla. Parranajon ja steriilialueen puhdistamisen jälkeen leikkausveitsen terällä tehtiin noin 10 mm:n pituinen sagitaalinen viilto.

Perosteum kaavittiin varovasti pois, ja esivalmistettu kelatuki kiinnitettiin bregmaan syanoakrylaatilla ja vahvistettiin hammassementillä. Haava ommeltiin sitten kelatuen ympärille.

2.3. Käyttäytyminen ja stimulaatiotoimenpiteet

Katso yleiskatsaus käyttäytymiseen ja stimulaatiomenettelyihin, katso kuva. 1a. Viiden päivän toipumisen jälkeen kelatukileikkauksesta, hiiriä totutettiin erilliseen stimulaatiohäkkiin ja kelatoimenpiteisiin kolmen päivän ajan.

Viimeisenä kelan totuttelupäivänä hiirille tehtiin avoin kenttätesti (OFT) 10-minuutin ajan, mikä toimi myös objektintunnistustestin (ORT) tottumisena. Seuraavana päivänä hiiret altistettiin ORT-näytteenottovaiheelle kahdella samalla esineellä 10 minuutin ajan. Esineet olivat samankokoisia, mutta erivärisiä ja -muotoisia. Nämä esineet sijoitettiin neliönmuotoisen testausareenan vastakkaisiin kulmiin.

Kolme tuntia myöhemmin teeset jaettiin satunnaisesti kahteen hoitoryhmään, TMS:ään, joka sai aktiivisen stimulaation 10-min 10 Hz rTMS:llä, ja SHAM:iin, joita käsiteltiin samalla tavalla, paitsi että kela oli kytketty pois päältä stimulaation aikana.

Sekä TMS- että SHAM-hiiriä hoidettiin uudelleen24- ja 48-h tutustumisen jälkeen. Viimeisenä päivänä (72-h tutustumisen jälkeen) hiiret altistettiin ORT-testivaiheelle 10-minuutiksi yhdellä tutulla esineellä ja yhdellä uudella esineellä.

Sen määrittämiseksi, oliko uuden kohteen tutkimus suurempi kuin tutun kohteen, laskemme erotteluindeksin (((uusi objektien tutkimus)-(tutun kohteen tutkimus))/((uusi objektien tutkimus)þ(tutun kohteen tutkimus))). Valitsimme 72-h, koska sekä aiemmat tutkimukset [28] että pilottitiedot (ei esitetty) osoittivat, että normaaleissa olosuhteissa hiiret eivät säilytä ORT-muistia tässä vaiheessa.

Sekä kohdetyypit että uuden esineen sijainti olivat tasapainossa ryhmien kesken. Totuttelua, näytteenottoa ja koetusistuntoa varten hiirille annettiin aina 30 minuuttia sopeutua koehuoneeseen ennen kokeita, ja esineet ja areena puhdistettiin 70-prosenttisella etanolilla jokaisen hiiren jälkeen.

Pelkän käyttäytymistehtävän vaikutusten tutkimiseksi otettiin mukaan myös ryhmä, jota kohdeltiin samalla tavalla kuin SHAM-hiiriä, paitsi että ne eivät tehneet ORT:tä.

Sen sijaan he altistettiin näytteenotto- ja koetusjaksolle, mutta ilman esineitä. Yksi TMS-ryhmän hiiri ei saavuttanut vaadittua kynnystä molempien objektien kokonaistutkimukselle 20-s näytteenottoistunnossa, joten se suljettiin pois tutkimuksesta. Tämä hiiri suljettiin pois myöhemmästä biokemiallisesta analyysistä.

Kaikki muut hiiret saavuttivat kriteerit sekä näytteenotto- että koetusistunnossa. Lukuun ottamatta yhtä hiirtä, lopulliset luvut koeryhmissä olivat TMS n ¼ 10, SHAM n ¼ 11 ja CONTROLn ¼ 11.

2.4. Western blot

Kolme tuntia koetusistunnon jälkeen hiiret tapettiin ketamiinin yliannostuksella, ja hippokampus ja etukuoren kudokset leikattiin nopeasti kuivajäälle ja säilytettiin 80 C:ssa.

Nämä näytteet homogenisoitiin 300 ml:lla jääkylmääSyn-Per Synaptic Protein Extraction Reagent -reagenssia (Thermo Scientific), jossa oli 1 x Protease Inhibitor Cocktail (Roche) ja 1 x Fosphatase Inhibitor Cocktail (Roche) tabletteja (per 10 ml), 5 sekunnin ajan.

Homogenaatteja sentrifugoitiin 1200 g:ssä 10 minuuttia solujätteen poistamiseksi. Supernatantti otettiin ja osa supernatantista jaettiin eriin täyden homogenaatin analysointia varten. Loput sentrifugoitiin 15,000 g:llä 20-minuuttia 4 C:ssa.

Synaptosomeja sisältävät pelletit suspendoitiin varovasti uudelleen Syn-Periin 1,5 ml/g kudosta synaptisen homogenaatin luomiseksi. Proteiinipitoisuuden määrittämiseen näytteessä käytettiin nanopisaraa.

Täyshomogenaatti ja synaptinen homogenaatti säilytettiin 80 °C:ssa analyysiin asti. Sekä Full- että Synaptic-homogenaatit laimennettiin 4 mg/ml jääkylmään PBS:ään ja sekoitettiin 1:4 proteiinilatauspuskurin (LiCor) ja 1:4000 merkaptoetanolin kanssa. Sitten niitä kuumennettiin 95 C:ssa 5-minun ajan ja ladattiin Mini PROTEAN TGX -geeleihin (Bio-Rad).

100 V:n elektroforeesilla erotuksen jälkeen proteiinit siirrettiin nitroselluloosablottauskalvolle (GE Healthcare Lifesciences). Kalvot pestiin SuperSignal WesternBlot Enhancer Antigen Pretreatment Solution -liuoksella (Thermo Scientific) ja suojattiin sitten estopuskurilla (Rockland) ja 1 % vuohenseerumilla 1- tunnin ajan.

Blokkaamisen jälkeen kalvoa inkuboitiin primääristen vasta-aineiden kanssa, jotka oli laimennettu SuperSignal Western BlotEnhancer Primary Antibody Diluent -aineella (Thermo Scientific) yön yli huoneenlämpötilassa.

Ensisijaiset käytetyt vasta-aineet olivat hiiren monoklonaalinen ERK 1/2 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology), kanin monoklonaalinen fosfo-p44/42 MAPK (pERK 1:1000, Cell SignalingTechnologies), hiiren monoklonaalinen CREB (1:500, kanin monoklonaalinen signaali). fosfo-CREB (S133) (pCREB1:500, Cell Signaling Technologies), kanin monoklonaalinen CAMKIIalpha (1:1000, Cell Signaling Technologies), hiiren monoklonaalinen fosfo-CAMKII (Thr286) (pCAMKII 1:10010, R10octrogenal00), 750, Santa Cruz Biotechnology), kanin monoklonaalinen fosfo-GluA1 (S845) (pGluR1 (845) 1:750, CellSignaling Technologies), kanin monoklonaalinen fosfo-GluA1 (S831) (pGluR1: 7831, Technologies) monoklonaalinen GluR2 (1:750, Invitrogen), kanin polyklonaalinen fosfo-GluR2(S880) (pGluR2 1:500, Invitrogen), hiiren monoklonaalinen TrkB (1:500, BD Transduction Laboratories) tai kanin polyklonaalinen T phos Tyr816) (pTrkB 1:500, EMD Millipore).

Kanin polyklonaalista Cofiliinia (1:2000, Sigma) käytettiin tavanomaiseen kuormituskontrolliin. TBS-Tweenissä huuhtelun jälkeen kalvoa inkuboitiin 1 tunti huoneenlämpötilassa vuohen anti-kani 800:ssa ja vuohen anti-hiiri 680:ssa (1:3000, LiCor).

Immunoblotti kuvattiin käyttämällä Odyssey Clx Infrared -kuvantamisjärjestelmää (LiCor) ja kaistan intensiteetin data-analyysi suoritettiin käyttämällä Image Studiota (LiCor).

2.5. Immunohistokemia

Kolme tuntia koetusistunnon jälkeen hiiret, jotka tapettiin ketamiinin yliannostuksella, perfusoitiin sitten sydämen läpi 50 ml:lla kylmää 1 M PBS:ää.
Aivot jälkifiksoitiin välittömästi 4-prosenttiseen paraformaldehydiliuokseen 4 °C:ssa ja siirrettiin 30-prosenttiseen sakkaroosiin PBS:ssä vähintään 48-h ennen kryosektiota 30 mm:n osiin. Vapaasti kelluvat leikkeet blokattiin ja läpäistiin 10 % vuohenaasin seerumilla 0,1 % Tritonissa 1 M PBS:ssä, sitten inkuboitiin 48-h kanin polyklonaalisen PSD95:n (1:300, Thermo Scientific) ja hiiren monoklonaalisen SV2A:n (1:300, Santa Cruzin biotekniikka).

Näitä leikkeitä inkuboitiin sitten 1-h sekundaaristen vasta-aineiden Alexa Fluor goat anti-rabbit 568 (1:500, Invitrogen) ja Alexa Fluorgoat anti-mouse 488 (1:500, Invitrogen) kanssa. Viipaleet pestiin sitten ydinvärillä DAPI (1:1000, Sigma), asennettu liukulevyille ja päällystetty Fluoromountilla (Thermo Scientific).

Värjäytymisen määrä määritettiin otsakuoressa (FC), dorsaalisessa CA1-hippokampuksessa, entorhinaalisessa aivokuoressa (EC) ja peririnaalisessa aivokuoressa (PC).

Z-pinotut kuvat otettiin BZ-X700-fluoresenssimikroskoopilla (Keyence) 40-kertaisella suurennuksella synaptisten pisteiden tunnistamiseksi koko siivussa. PDS95-pisteet, SV2A-pisteet ja kolokalisoidut (määritelty kahdeksi vierekkäiseksi tai päällekkäiseksi) laskettiin vähintään neljästä kuvasta jokaiselta alueelta ja kunkin hiiren tulosten keskiarvosta. Kolokalisoituneen %:n kvantifiointi suoritettiin laskemalla (päällekkäiset SV2A ja PSD95)/(yhteensä SV2A ja PSD95) puncta.

2.6. Tilastot

Kaikki tiedot täyttivät oletukset normaalista, joka arvioitiin tarkastelemalla laskettujen jäännösten vinoutta, kurtoosia ja Shapiro Wilk -arvoa, eikä varianssin homogeenisuuden rikkomuksia havaittu Levenen tilastolla arvioituna.

Käyttäytymistesteissä opiskelijoiden t-testejä käytettiin vertaamaan SHAM:ia TMS:ään, uusien ja tuttujen kohteiden tutkimiseen ryhmissä käytettiin Repeated Measures Two-Way ANOVAa.

Immunohistokemian ja Western blot -tulosten merkitys testattiin käyttämällä One-WayANOVAa. Kaikissa post-hoc-parivertailuissa käytettiin Tukey-säätöä, jonka merkitsevyys oli p < 0.05.

Jos varianssin homogeenisuutta rikottiin, merkitys määritettiin WelchTestillä ja sen jälkeen korjattiin Games-Howellilla, nämä tapaukset on merkitty tuloksiin. Kaikki tilastot tehtiin SPSS:llä (versio 22, IBM) ja kaaviot tuotettiin GraphPadilla (versio 7, Prism).

For more information:1950477648nn@gmail.com