Immuunivasteet allogeenisten verkkokalvon esisolujen peräkkäiselle binokulaariselle siirrolle lasiaiseen hiirillä

Abstrakti:

Ihmisen allogeenisten verkkokalvon progenitorisolujen (RPC) lasiaisensisäinen siirto on lupaava hoitona sokaisevan verkkokalvon rappeuman hoidossa. Aikaisempi työ on osoittanut, että hermoston progenitorit ovat hyvin siedettyjä allografteina yksittäisten injektioiden jälkeen; kuitenkin allogeenisten solujen peräkkäinen kuljetus lisää mahdollisen isännän herkistymisen riskiä ja sitä seuraavaa siirteiden immuunihyljintää. Nykyinen tutkimus suunniteltiin arvioimaan, indusoisivatko immuunivasteen allogeenisten RPC:iden toistuvat lasiaisensisäiset siirrot käyttämällä hiiren eläinmallia. Injektoimme hiiren verkkokalvon progenitorisoluja (gmRPC:t), jotka olivat alun perin peräisin luovuttajilta, joilla oli geneettinen tausta C57BL/6, BALB/c-vastaanottajahiiriin saadaksemme turvallisuustietoja siitä, mitä voidaan odottaa potilaiden toistuvan hoidon jälkeen allogeenisella ihmissolutuotteella. . Immuunivasteet gmRPC:ille olivat lieviä, ja ne koostuivat T-soluista, B-soluista, neutrofiileistä ja luonnollisista tappajasoluista, makrofagien ollessa selvästi hallitsevia. Toistuvilla gmRPC-annoksilla käsitellyt eläimet eivät osoittaneet merkkejä herkistymisestä, eikä myöskään immuunivälitteistä siirteiden tuhoutumista. Immunosuppressiivisten hoitojen puuttumisesta huolimatta allogeeniset gmRPC-siirteet säilyivät hengissä toistuvan annostelun jälkeen, mikä tuki alustavaa havaintoa, jonka mukaan allogeenisten RPC-solujen toistuva injektio lasiaiseen on siedettävä potilailla, joilla on retinitis pigmentosa.

cistanche-kasveja lisäävä immuunijärjestelmä

Napsauta tästä nähdäksesi Cistanche Enhance Immunity -tuotteet

【Kysy lisää】 Sähköposti:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Avainsanat: kantasolut; immuunitoleranssi; immuunipuolustus; siirteen hylkiminen; intravitreaalinen injektio

1. Esittely

Retinitis pigmentosa (RP) sisältää luokan geneettistä sauvakartion rappeumaa ja johtaa etenevään näön heikkenemiseen ja mahdolliseen sokeuteen. Suurimmassa osassa tapauksista ei ole olemassa todistettuja terapeuttisia toimenpiteitä näön säilyttämiseksi tai palauttamiseksi. yksi strategia tämän tyydyttämättömän lääketieteellisen tarpeen käsittelemiseksi on kuitenkin kantasolujen siirto. Tutkimusryhmämme on tutkinut viljeltyjen ihmisen verkkokalvon progenitorisolujen (RPC) intravitreaalista injektiota keinona puuttua RP:hen terapeuttisena tavoitteena vakauttaa taudin etenemistä tai ehkä kääntää taudin kulku. RPG:t voidaan saada epäkypsistä verkkokalvoista kudosluovutuksen kautta tai viime aikoina pluripotenteista solulinjoista. Eläinmalleilla tehdyt tutkimukset ovat osoittaneet, että nämä solut pystyvät pelastamaan fotoreseptorit rappeutumisesta silmään injektion jälkeen ja pystyvät myös erilaistumaan sauvavaloreseptoreiksi isäntäsilmässä. Eläintutkimuksista on saatu näyttöä siitä, että injektoiduista hRPC:istä voi tulla toimivia, integroituja fotoreseptoreita ja siten mahdollisesti stabiloida verkkokalvoa korvaamalla suoraan kuolevat solut. Siten injektoidut hRPC:t voivat hoitaa RP:tä sekä neurotrofisella tavalla että solujen korvausmekanismin kautta. Joka tapauksessa tämä solupohjainen lähestymistapa tarjoaa järkevän strategian potilaiden hoitoon, jotka kärsivät RP:stä ja mahdollisesti muista verkkokalvon sairauksista.

Toinen RPC:iden ja ehkä hermosolujen progenitorien suotuisa ominaisuus on suhteellinen toleranssi, joka on annettu näille soluille siirrettynä allografteina, erityisesti kun ne kuljetetaan paikkaan, jossa on immuunijärjestelmä, kuten verkkokalvolle [1,2]. Viimeaikaiset regeneratiivisen lääketieteen alalla tehdyt kliiniset tutkimukset raportoivat kuitenkin edelleen laajalle levinneistä ja merkittävistä tulehdukseen ja immuunihylkimisreaktioon liittyvistä haasteista [3,4], mukaan lukien silmään kohdistetut interventiot, kuten verkkokalvon geeniterapiat [5], kuten sekä jotkin, mutta eivät kaikki soluterapiat [6]. Vaikka verkkokalvon pigmenttiepiteelisolu (RPE) on paikallinen solutyyppi, se ei ole vapautettu hyljintäongelmista [7–9]; siksi vastaanottajien immuunisuppressio on tällä hetkellä vakiokäytäntö [10,11]. Ihmisen RPC:t sen sijaan näyttävät olevan huomattavan hyvin siedettyjä allografteina [6,12–16], vaikka tämä ei ulotu niiden käyttöön ksenografteina, joissa tarvitaan immuunisuppressiota [17]. Silmän allogeenisten RPC-solujen jatkuvan selviytymisen perusta sisältää todennäköisesti useita käytettyihin soluihin ja vastaanottajapaikkaan liittyviä tekijöitä [1, 8, 18, 19]. Aikaisemmissa virtaussytometriaa käyttävissä töissä olemme osoittaneet, että ihmisen hermoston progenitorit, sekä aivoista että verkkokalvosta peräisin olevat, ilmentävät luokan I, mutta eivät luokan II, pääasiallisen histokompatibiliteetti (MHC) antigeenejä [20,21]. Klassiseen siirteen hyljinnän mekanismiin kuuluu se, että CD4+-isäntälymfosyytit tunnistavat epäspesifisesti vieraat MHC-luokan II molekyylit [20–25]. Tällä tavalla luokan II molekyylien puuttuminen saattaa mahdollistaa siirrettyjen progenitorisolujen välttää tämän mekanismin välittämän immuunihyljinnän. Kuitenkaan intravitreaalisesti injektoitujen hRPC:iden näennäinen "immuuni etuoikeutettu" -status ei välttämättä ole ehdoton. Vaikka hiiren keskushermoston (CNS) progenitorit eivät ilmennä havaittavissa olevia luokan I tai luokan II MHC-molekyylejä lähtötasolla ja niillä on ilmeinen immuunioikeus allografteina [1, 2, 20], nämä solut voivat käydä läpi immuunihyljinnän tietyissä olosuhteissa. Tutkimukset ovat osoittaneet, että MHC-antigeenejä voidaan indusoida stimuloimalla keskushermoston esisoluja gamma-interferonilla (IFN) [1,26]. Keskushermoston progenitorit voidaan hylätä aiemmin siirretyn isännän herkistymisen jälkeen. Siksi keskushermoston progenitorisolut (mukaan lukien RPC:t) ilmentävät alloantigeenejä, jotka isännän immuunijärjestelmä havaitsee. Yhdessä tämä tarkoittaa, että siirrettyjen progenitorisolujen immuunioikeudellinen asema on väliaikainen ja alttiina modulaatiolle, esim. paikallisessa mikroympäristössä olevien sytokiinien vaikutuksesta, ja jotka voivat muuttua rappeutumisen, kuten RP:n, aikana. Kaikista näistä syistä immuunivastetta useille lasiaisensisäisille RPC-injektioille on vaikea ennustaa, ja se on tutkittava erityisesti.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Jos RPC-hoito osoittautuu kliinisesti onnistuneeksi RP:ssä, molempien silmien hoidossa on vahvat kannustimet tässä kahdenvälisessä sokaisussa. Ainakin turvallisuussyistä binokulaariset hoidot suoritettaisiin tyypillisesti peräkkäin siten, että kahden injektion välillä on merkittävä viive. On huomattava, että tämä allogeenisten solujen peräkkäinen jakelu saattaa johtaa isännän herkistymiseen vasteena ensimmäiselle injektiolle, mikä mahdollisesti laukaisee immuunihyljinnän vasteena toiselle injektiolle. Tämä voi johtaa siirteiden menettämiseen molemmissa silmissä. Aikaisemmat raportit, joissa tutkittiin yksittäistä subretinaalista hRPC-annostusta RP:ssä [27] tai uudelleenannostusta ihmisen hermoston progenitorien kanssa eläimillä [28, 29], sisälsivät immuunivastuksen. Siksi seuraava tutkimus suunniteltiin hiiren RPC:iden translaatiotutkimukseksi peräkkäisinä allografteina immuunikompetenssissa hiirikannassa, jolla on erilainen geneettinen tausta. Vaikka tämä työ ei sisältänyt ihmisen RPC-tuotteita, se tehtiin osana IND:n mahdollistavia tutkimuksia saadakseen eläintietoja turvallisuudesta eli siitä, olisiko immuunisuppressio tarpeen potilaille, jotka saavat toistuvia RPC-allograftihoitoja FDA:n rekisteröidyissä tutkimuksissa.

2. Tulokset

Kahdenvälisen RPC-injektion immunologisten seurausten tutkimiseksi allogeenisissa hiirissä gmRPC:t (C57BL/6 geneettinen tausta) injektoitiin lasiaisensisäisesti BALB/c:n vastaanottajien yhteen silmään ja toinen annos RPC:itä injektoitiin toiseen silmään 2 viikkoa myöhemmin. 2-viikon aikaväli valittiin riittäväksi, jotta ensimmäinen siirre voi aiheuttaa sekä synnynnäisiä että adaptiivisia immuunivasteita. Yksikään koe-eläimistä ei saanut mitään immuunivastetta heikentäviä lääkehoitoja, jotta luonnolliset fysiologiset immuunivasteet voitaisiin havaita.

2.1.Kliininen havainnointi ja oftalminen tutkimus ei paljastanut poikkeavuuksia

Koe-eläinten painot mitattiin jokaisen gmRPC-injektion aikana. Kaikki koe-eläimet osoittivat painonnousua ensimmäisen ja toisen injektion välillä, mikä vastasi yleistä hyvää terveyttä. Eläimet, jotka lopetettiin päivänä 14 ja päivänä 28 ± 1 toisen gmRPC-injektion jälkeen, tutkittiin kirurgisen mikroskoopin läpi. Suurimman osan tutkituista silmistä sekä anterioristen että posterioristen segmenttien arvioitiin olevan "normaalirajojen sisällä" (WNL). Ei merkkejä tulehduksesta tai muista näkyvistä poikkeavuuksista käsittelemättömissä, näennäisesti käsitellyissä ja gmRPC-käsitellyissä ryhmissä, mikä osoittaa, että gmRPC:n intravitreaalinen injektio ei aiheuttanut tällä menetelmällä havaittavia tulehdusreaktioita tai fyysisiä kudosvaurioita. Siirteen käsittävät soluklusterit olivat näkyvissä lasiaisessa sekä päivänä 14 että päivänä 28 ± 1 toisen gmRPC-injektion jälkeen (kuvio 1). Toistuva gmRPC-injektio ei indusoinut huomattavia muutoksia soluklusterien koossa, mikä on yhdenmukainen luovuttajasolujen jatkuvan eloonjäämisen kanssa. Karkea patologia arvioitiin myös terminaalisessa päätepisteessä, eikä laajentuneita silmämunaa (osoitus kasvaimen muodostumisesta) tai muita poikkeavuuksia havaittu.

Kuva 1. Siirretyt gmRPC:t visualisoituina in vivo silmänpohjakuvauksella kirurgisen mikroskoopin läpi (kaikki=vasen silmä, käyttöjärjestelmä). (A, B), valekäsitellyt eläimet (huijaus/huijaus, S/S); (C, D), kontrollieläimet, joilla oli valekäsitelty oikea silmä, jota seurasi gmRPC:llä käsitelty vasen silmä (huijaus/solu, S/C), ja eläimet, joiden molemmat silmät käsiteltiin peräkkäin gmRPC:illä (solu/solu, C/C). tarkkailtu ja kuvattu kirurgisen mikroskoopin läpi. Yläpaneeli (A, C, E) näyttää kuvia käyttöjärjestelmästä, joka on otettu päivänä 14 sekunnin injektion jälkeen; alempi paneeli (B, D, F) näyttää kuvia käyttöjärjestelmästä, joka on otettu päivänä 28 sekunnin injektion jälkeen. Allograftit nähtiin vaaleanvärisinä soluryppyinä (nuolet), jotka olivat näkyvissä soluinjektoidun vasemman silmän lasiaisessa (S/C, C/C) molemmissa ajankohtana (päivä 14: (C, D); ja päivä 28: () E, F)). Siirteitä lukuun ottamatta etu- ja takaosissa ei havaittu ilmeistä tulehdusta tai ylimääräistä poikkeavuutta tällä tavalla aksiaalisesti katsottuna.

2.2. Immunofluoresoiva merkintä osoitti immuunisoluja lasiaisessa

Immunofluoresoiva leimaus viidelle tärkeimmälle immuunisolutyypille (makrofagit, neutrofiilit, luonnolliset tappajasolut, T-solut ja B-solut) suoritettiin silmän kryosektioissa ja paljasti positiivisen immuunisolujen infiltraation silmässä gmRPC-injektion jälkeen (kuva 2A–F). T-soluja (CD3), B-soluja (CD45R), neutrofiilejä (Ly-6G) ja luonnollisia tappajasoluja (CD49b) esiintyi rajoitetusti silmissä, joihin oli injektoitu gmRPC:itä, kun taas aktivoituja makrofageja (Iba-1) ) olivat tärkeimmät immuunisolut, jotka reagoivat lasiaisensisäisiin siirteisiin. Käsittelemättömien ja näennäisesti käsiteltyjen eläinten vertailukelpoinen kudos ei osoittanut immuunisoluja silmän kryosektioissa, mikä viittaa siihen, että havaittu immuunisolujen infiltraatio oli vaste gmRPC-siirteille. Tämän havainnon mukaisesti immuunisolut sijaitsivat gmRPC-siirteitä ympäröivällä alueella tai itse gmRPC-klustereissa.

Kuva 2. Infiltroituneiden immuunisolujen immunoleimaus käsittelyryhmittäin. Immunofluoresoivat kuvat (A) kontrolliosista (pelkästään sekundaarinen vasta-aine), (B) anti-Iba-1 (aktivoitu makrofagi- ja mikrogliamarkkeri), (C) anti-Ly-6G (neutrofiilimarkkeri), (D) anti-CD49b (luonnollinen tappajasolumarkkeri), (E) vasta-aineet anti-CD3 (T-solumarkkeri) ja (F) anti-CD45R (B-solumerkkiaine) on esitetty kuvassa. Rajoitetut punaiset signaalit osoittavat positiivista vasta-aineleimausta leukosyyttimarkkereille, vihreät signaalit osoittavat gmRPC-siirteitä ja siniset signaalit osoittavat DAPI-ydinleimausta. Keltainen on signaalien epäspesifinen päällekkäisyys, mikä on ilmeisin fotoreseptorin ulkosegmenteissä, jotka osoittavat autofluoresenssia. Hoitoryhmät: hoitamattomat (UT), molemmat silmät hoitamattomat; S/S, molemmat silmät valekäsitelty (peräkkäin) vehikkelillä; S/C, oikeaan silmään injektoitu vehikkeli ja sen jälkeen vasen silmä 50,000 gmRPC:llä ja; C/C, molempiin silmiin injektoitu 50,{16}} gmRPC:tä (peräkkäin) aikataulun mukaan osiossa 4

Silmän kunkin immuunisolun huippumäärät vaihtelivat solutyypin mukaan (kuva 3A–E). Sitä vastoin kaksisuuntainen ANOVA ei paljastanut eroja immuunisolujen infiltraatiossa, kun verrattiin eläimiä, jotka saivat yksittäisiä gmRPC-injektioita (huijaus/solut) eläimiin, jotka saivat kahdenvälisiä injektioita (solut/solut). Näin tapahtui makrofagien (anti-Iba-1-värjäys) (kuva 3A), neutrofiilien (anti-Ly-6G-värjäys) (kuva 3B), luonnollisten tappajasolujen (CD49b-värjäys) ( Kuva 3C), T-solut (CD3-värjäys) (kuvio 3D) ja B-solut (CD45R-värjäys) (kuvio 3E).

2.3. ELISPOT ei näyttänyt antigeenin palautusvasteita

ELISPOT on tapa määrittää antigeenispesifinen IFN:ää tuottava T-soluaktivaatio. Forboli 12-myristaatti 13-asetaatti (PMA) oli positiivinen kontrolli, joka matki toista lähettiä, DAG:ta, aktivoimaan T-solureseptorireitin ja aiheuttaen puolestaan ​​T-solujen aktivoitumisen. Kuvassa 4A–D PMA-käsitellyt ryhmät osoittivat paljon korkeampia IFN-täplämääriä verrattuna kontrolliryhmiin, joissa oli pelkästään vastesoluja (eli lymfosyytit CLN:istä, pernasolut pernasta). Kun reagoivia soluja viljeltiin yhdessä C57BL/6-pernasolujen (B6 SPL) kanssa, päivän 14 näytteet olivat verrattavissa pelkkien vastaajasolujen ryhmiin, ja IFN-pistemäärät olivat vain hieman korkeammat, mikä osoitti T-soluaktivaation puuttumista (kuvio 4A, B).

Kuva 3. Immuunisolujen infiltraation kvantifiointi gmRPC-siirron jälkeen. Infiltroituneet immuunisolut visualisoitiin punaisina fluoresoivina signaaleina kuvantamiskentässä gmRPC-injektion jälkeen jokaisessa koetilanteessa, laskettiin käyttämällä ImageJ:tä ja piirrettiin pylväsdiagrammeihin. Tiedot Iba-1 (aktivoitu makrofagi- ja mikrogliamarkkeri) (A), anti-Ly-6G (neutrofiilimarkkeri) (B), anti-CD49b (luonnollinen tappajasolumerkki) (C), vasta-aineet anti-CD3 (T-solumarkkeri) (D) ja anti-CD45R (B-solumarkkeri) (E) esitettiin kuvassa. Kaksisuuntaisia ​​ANOVA-testejä käytettiin merkitsevyyden testaamiseen vale/solu- ja solu/soluryhmien välillä; p-arvot olivat: (A) p < {{10}.4492, (B) p < 0.9376, (C) p < 0.119{{18 }}, (D) p < 0,6411 ja (E) p < 0,7201 (mitkään eivät olleet merkitseviä).

Kun allogeenisiä luovuttajasoluja testattiin tällä määrityksellä, vatsaontelonsisäisesti gmRPC:tä injektoitujen eläinten vastaajasoluilla (IP-ryhmä) ei ollut antigeenin palautusvasteita, koska näytteet eivät osoittaneet enempää T-solujen aktivaatiota IFN-täplämäärillä verrattuna valeeläimiin, joita ei koskaan altistettu. gmRPC:t (huijaus/huijaus). Eivät myöskään eläimet, joille injektoitiin intravitreaalisesti gmRPC:itä, joko kerran (huijaus/solu) tai toistuvasti (solu/solu), eivät osoittaneet mitään antigeenin palautusvasteita. Yhdessä tapauksessa vasteet toistuvaan gmRPC-annostukseen näyttivät vaimeamilta (kuvio 4B). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että gmRPC:t osoittavat erittäin alhaista antigeenisyyttä. Huomaa, että C57BL/6-pernasolut täsmättiin gmRPC:iden geneettisen taustan kanssa. Yllättäen vaihtoehtoiset stimulaattorisolut, gmRPC:t, lisäsivät IFN-pistemäärää kaikissa koeryhmissä verrattuna negatiivisiin kontrolliryhmiin (kuva 4A–D). Mahdollinen selitys saattaa olla gmRPC:t, jotka aiheuttavat korkean taustan tässä määrityksessä. Tärkeää on, että käsittelemättömien, valekäsiteltyjen, yksittäisten gmRPC-injektioiden ja toistuvien gmRPC-injektioiden ryhmien välillä ei ollut eroa, mikä taas osoitti antigeenin palautusvasteiden puuttumisen.

Kuva 4. ELISPOT-kvantifiointi gmRPC-siirron jälkeen. ELISPOT-määritykset määritettiin seuraaviin ryhmiin: kontrolli, vain reagoivat solut (lymfosyytit tai pernasolut, jotka sisältävät koe-eläinten kohdunkaulan imusolmukkeista (CLN) tai pernasta (SPL) eristettyjä T-soluja; PMA, forbolilla {{1} käsitellyt vastesolut }myristaatti-13-asetaatti (PMA) ja Ca-ionofori; B6 SPL, reagoivat solut sekoitettuna C57BL/6-eläimistä eristettyjen pernasolujen kanssa; gmRPC:t, samat reagoivat solut sekoitettuna gmRPC:iden kanssa. (A), Vastaavat solut olivat pernasolut koe-eläimistä, jotka lopetettiin päivänä 14 toisen gmRPCs-injektion jälkeen. (B) Vastaavat solut olivat lymfosyytit koe-eläinten CLN:istä, jotka lopetettiin päivänä 14 toisen gmRPCs-injektion jälkeen. (C) Vastaavat solut olivat splenosyytit koe-eläimistä, jotka tapettiin päivänä 29 toisen gmRPCs-injektion jälkeen. (D) Vastaavat solut olivat lymfosyytit koe-eläinten CLN:istä, jotka tapettiin päivänä 29 toisen gmRPCs-injektion jälkeen. Kaksisuuntaisia ​​ANOVA-testejä käytettiin merkitsevyyden (*) testaamiseen vale/solu- ja solu/soluryhmien välillä; p-arvot olivat: (A) p < 0,5332, (B) p < 0.0001 (merkittävä), (C) p < 0,0207 ( merkitsevä) ja (D) p < 0,3355.

3. Keskustelu 

Kantasoluteknologiaa kohtaan on ollut huomattavaa kiinnostusta verkkokalvon rappeutumissairauksien hoitoon, ja ryhmämme on tutkinut allogeenisten hRPC:iden käyttöä RP:ssä. Tietojen keräämiseksi mahdollisista immuunivaikutuksista, kun useampi kuin yksi annos allogeenistä ihmisen RPC-tuotetta annetaan lasiaisensisäisellä injektiolla, suoritimme tämän eläintutkimuksen käyttämällä C57BL/6-taustasta peräisin olevia gmRPC:itä siirteinä ja BALB/c-hiiriä isäntinä. Näitä erilaisia ​​geneettisiä taustoja käytettiin mallintamaan peräkkäistä hoitoa allogeenisilla hRPC:illä ja antamaan alustavia turvallisuustietoja ennen ihmisillä testaamista.

Vasteiden täydelliseksi arvioimiseksi isäntäeläimet eivät saaneet mitään immunosuppressiivista hoitoa. Vertailimme yhden gmRPC-injektion synnyttämiä immuunivasteita peräkkäiseen kahdenväliseen annostukseen kuvatun injektioaikataulun mukaisesti. Silmätutkimukset eivät paljastaneet tulehdusta tai muita merkittäviä eroja eläinryhmien välillä, jotka saivat yhden annoksen gmRPC:tä tai 2 annosta gmRPC:tä, mikä viittaa siihen, että joko vastaanottajat eivät olleet herkistyneet ensimmäisillä gmRPC-hoidoilla tai herkistyminen oli hienovaraista. Immunoleimaustulokset paljastivat, että kaikki viisi tutkittua immuunisolutyyppiä, nimittäin T-solut (CD3), B-solut (CD45R), makrofagit (Iba-1), neutrofiilit (Ly-6G) ja luonnolliset tappajasolut ( CD49b), oli tunkeutunut silmään ja kohdistunut RPC-siirteisiin transplantaation jälkeen. Tästä huolimatta tämä infiltraatio oli suhteellisen kohtalaista, ja vaikka muita solutyyppejä oli havaittavissa, se koostui pääasiassa Iba-1-positiivisista makrofageista. Hyvin rajallinen määrä T-soluja, B-soluja, neutrofiilejä ja luonnollisia tappajasoluja oli läsnä. Mielenkiintoista on, että yksittäisten ja toistuvien RPC-siirteiden osoittama eloonjääminen oli yhtä suuri ilman siirteiden menetystä kummassakaan tapauksessa makrofagien läsnäolosta huolimatta. Kaiken kaikkiaan tämä viittaa siihen, että sekä synnynnäiset että adaptiiviset immuunivasteet geneettisesti erilaisille RPC:ille olivat kohtalaisia, vaikka immuunisuppressiota ei käytetty. Lisäksi ELISPOT-määritystulokset eivät osoittaneet antigeenin palautusvasteita gmRPC-käsitellyissä ryhmissä, mikä on yhdenmukainen sen väitteen kanssa, että T-soluilla ei ole tärkeää roolia C57BL/6-hiirten gmRPC-siirteiden hylkimisessä. Jälleen havaittiin gmRPC-siirteiden makrofagien tunkeutuminen, vaikka tähän ei liittynyt klassiseen immuunihyljintää koskevaan tyyppiin liittyvää merkittävää siirteen tuhoutumista [22–24].

Cistanche-edut miehille - vahvistavat immuunijärjestelmää

Yhdessä nämä havainnot paljastavat tilanteen, joka eroaa selvästi muissa kudoksissa havaituista laajalti tunnustetuista T- ja B-soluvälitteisistä allogeenisista transplantaatin hylkimismekanismeista. Useat tekijät voivat vaikuttaa tähän tilanteeseen. Toisaalta on olemassa käsitys silmästä "immuuni etuoikeutettuna" paikkana, vaikka lasiaisten ja sarveiskalvon ja verkkokalvon ominaisuuksien yhteistä on vähemmän tutkittu ja ehkä kiistanalaisempi. Toisaalta RPC:t itse näyttävät osoittavan vähentynyttä immunogeenisuutta allografteina verrattuna useammin tutkittuihin solutyyppeihin. Kuten olemme aiemmin osoittaneet, hiiren RPC:istä puuttuu MHC-luokan I ja luokan II antigeenien perusekspressio, vaikka ne ovat indusoitavissa sytokiinistimulaation avulla. Tämä MHC-ekspression puuttuminen saattaa edistää näiden solujen eloonjäämistä transplantaation jälkeen. Immuunisolujen läsnäolo siirreissä tukee kuitenkin käsitystä, jonka mukaan siirteen sietokyky ei ole passiivinen ja johtuu aktiivisesta immunosäätelyilmiöstä. Tässä on korostettava, että samanlainen immuunisolujen infiltraatio oli jo olemassa yksittäisten injektioiden jälkeen, eikä sitä pahentunut toistuva annostelu, mikä korostaa päätelmäämme, jonka mukaan siirteiden immuunisolujen infiltraatio, erityisesti makrofagien toimesta, ei ollut seurausta aikaisemmista isännän herkistyminen. Tämän kokeen parametrien sisällä toistuva annostelu ei näyttänyt heikentävän siirteen yleistä elinkelpoisuutta, mikä oli yhdenmukainen jatkuvan tehon mahdollisuuden kanssa terapeuttisissa yhteyksissä. Vaihtoehtoiset parametrit, kuten erilaiset injektioiden väliset intervallit, voivat joko lisätä tai vähentää immuunisolujen aktiivisuutta siinä määrin, että se olisi merkityksellistä kliinisen käytön kannalta. On epäselvää, pätevätkö infiltraattien solukomponentit, mukaan lukien makrofagien hallitsevuus, myös ihmisiin. Lisäksi näiden allograftien eloonjääminen ei välttämättä ole riippuvainen normaalista verkkokalvosta, jolla on terve veri-verkkokalvoeste. Tässä käytetyt BALB/c-vastaanottimet ovat albiinoja ja herkkiä valovaurioille [30]. Lisäksi jatkuva eloonjääminen on nähty toistuvasti aikaisemmissa töissä eri verkkokalvon rappeumamalleilla (esim. [31]).

Verrattuna siirteiden eloonjäämiseen, siirteiden sisällä olevien solujen elinkelpoisuus on monimutkaisempi tilanne. Keskushermoston progenitorisolujen tiedetään häviävän, mikä tapahtuu nopeasti transplantaation jälkeen, mikä johtuu todennäköisesti useista tekijöistä, mukaan lukien äkillinen kasvutekijän poistuminen. Kun dissosioituneet solut ovat asettuneet silmään, ne sulautuvat pallomaisiksi aggregaatteiksi, joiden keskukset näyttävät tarjoavan kasvulle alioptimaalisen mikroympäristön, ehkä johtuen verisuonituksen puutteesta ja ravinteiden diffuusion haasteista. Makrofagien näennäinen tropismi RPC-siirteille voisi olla epäspesifinen vaste näiden elottomien solujen läsnäololle siirteiden sisällä, jolloin makrofagit toimivat solujätteen sieppaajina. Vaihtoehtoisesti täysin elinkykyiset RPC:t voivat aktiivisesti vetää puoleensa makrofageja, esim. kemo-houkuttelevien sytokiinien ilmentymisen kautta, jolloin isäntäsolut kohtaisivat toissijaisesti elottomien luovuttajasolujen jätteet. Tärkeää on, että näissä erityisissä olosuhteissa havaitulla makrofagien infiltraatioasteella ei näytä olevan kielteisiä seurauksia siirteeseen tai isäntäverkkokalvoon, toisin kuin vasteet solujen allografteille ei-immuunikohteissa [4]. Lopuksi on syytä mainita, että vaikka tässä raportoidut tulokset rajoittuvat hiirimalliin, niillä voi olla vaikutuksia ihmisten työhön. Päinvastoin kuin hiiri, tiedämme, että viljellyt ihmisen RPC:t ilmentävät MHC-luokan I antigeenien voimakkaita tasoja lähtötasolla; siksi vertailu on tosin alustava. Siitä huolimatta on mielenkiintoista huomata, että kiinalaisen ryhmän [13] tekemät subretinaalisten hRPC-siirteiden kliiniset testaukset sekä ryhmämme intravitreaalinen hRPC-siirto ovat osoittaneet allograftien jatkuvan eloonjäämisen ei-immunosuppressoituneilla potilailla, joilla on RP (JC). -01, [32], julkaisematon data). Näin tapahtui myös molempien silmien peräkkäisen injektion jälkeen (JC-01 Extension, julkaisematon data), analogisesti tässä esitetyn työn kanssa. Lisäksi siirteen eloonjääminen havaittiin JC-02 [33] -seurantatutkimuksessa, jossa peräkkäisiä toistuvia annoksia annettiin samaan silmään [34]. Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että immuunisuppressio ei aina ole tarpeen hermoston progenitorisiirteen, etenkään silmään, yhteydessä, vaikka tämän ilmiön ja taustalla olevien säätelymekanismien rajat ovat vielä selvittämättä.

4. Materiaalit ja menetelmät

4.1. Soluviljely

Aikaisemmin karakterisoidut gmRPC:t [31] valittiin luovuttajasoluiksi tähän allogeeniseen tutkimukseen. Alun perin gmRPC:t eristettiin GFP-siirtogeenisistä C57BL/6-hiiristä, jotka oli geneettisesti muunnettu ekspressoimaan tehostettua vihreää fluoresoivaa proteiinia (GFP). GFP-proteiinin ilmentyminen gmRPC:issä oli kiinnostavaa, koska se mahdollistaa siirteiden visualisoinnin injektion jälkeen ilman lisäleimauksen tarvetta. Tässä tutkimuksessa gmRPC:t viljeltiin Advanced DMEM/F12:ssa, jota oli täydennetty N-2-lisäaineella (1:100, Life Technology, Carlsbad, CA, USA), Glutamax-1 (1:100, Life Technology) , Carlsbad, CA, USA) ja EGF (20 ng/ml, rekombinantti, Human, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) ja inkuboitiin 37 °C:ssa ja 5 % C02:ssa. Soluja pidettiin sekasuspensiossa/löyhästi kiinnittyneissä pesäkkeissä päällystämättömissä kudosviljelypulloissa. Solut siirrostettiin trypsinisoimalla TrypLE Select CTS:llä (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), joka oli laimennettu 1:5 PBS:ään yhden minuutin ajan ja neutraloitiin 10-kertaisella lisätyn trypsiinin tilavuudella. Solu-trypsiiniseosta sentrifugoitiin 140 g:llä 2 minuuttia huoneenlämpötilassa, supernatantti poistettiin ja solupelletti suspensoitiin uudelleen tuoreeseen väliaineeseen ennen kylvöä kudosviljelypulloihin halutussa pitoisuudessa. Solukonsentraatio ja elinkelpoisuus määritettiin trypaanisinivärjäyksellä; laskennat suoritettiin Countessilla (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) ja hemosytometrillä.

Lasisensisäisiä injektioita varten solupelletti suspensoitiin uudelleen pitoisuuteen 50 K solua/ul BSS PLUS®:iin. Solukonsentraatio ja elinkelpoisuus arvioitiin ennen injektiota ja sen jälkeen. Injektoitu annos oli 50 000 solua silmää ja injektiota kohti. Annos ja vehikkeli valittiin aikaisempien tutkimustemme perusteella.

4.2. Koeeläimet

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia mahdollisia allogeenisiä immuunivasteita, jotka aiheutuvat allogeenisten RPC:iden toistuvan intravitreaalisen injektion kautta. Vastaanottajaeläimet olivat BALB/c-hiiriä, jotka eroavat geneettisesti C57BL/6-hiiristä, joista gmRPC:t eristettiin. Vähintään kolmen eläimen käyttöä käsiteltyä koeryhmää kohden kutakin ajankohtaa kohti katsottiin tarpeelliseksi, jotta voidaan arvioida tilastollinen merkitsevyys ryhmien välillä suhteessa tulosmuuttujiin ja mahdollisiin eläinten menetykseen koejakson aikana. Lisäksi, kun otetaan huomioon monet lisätekijät, jotka mahdollisesti vaikuttavat kokeen tulokseen, kuten epäonnistunut soluinjektiomenettely tai mahdollinen hankautuminen eläintaistelun seurauksena, injektiotoimenpiteet suoritettiin viidelle eläimelle ryhmää kohden, jotta varmistettiin, että tilastollisen analyysin edellyttämät vähimmäismäärät täyttyvät.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Taulukko 1 esittää neljä eläinryhmää, jotka on valmistettu kullekin neljälle ajankohdalle (4, 7, 14 ja 28 päivää), jolloin histopatologian arvioinnit, mukaan lukien immunofluoresenssi, suoritettaisiin. Kaksi muuta eläinryhmää, joihin injektoitiin vatsaontelonsisäisesti 10ˆ6 gmRPC:tä, valmistettiin positiivisiksi kontrolleiksi kummallekin kahdelle ELISPOT-arvioinnin aikapisteelle (14 ja 28 päivää). Taulukossa 2 on yhteenveto kullekin ryhmälle suunnitelluista arvioinneista.

Taulukko 1. Koeryhmät.

Taulukko 2. Arvioinnin aikapisteet.

4.3. Intravitreaalinen injektio

GmRPC:t annettiin intravitreaalisella injektiolla. Nukutuksen jälkeen mydriasyyliä (1 % Tropicamidin oftalminen liuos) ja fenyyliefriiniä (2,5 % oftalminen liuos) laitettiin injektoitavan eläimen molempiin silmiin. Kun riittävä mydriaasi oli saavutettu, eläin sidottiin käsin ja eläimen päätä käännettiin injektoitavan silmän silmän akselin kohdistamiseksi kirurgisen mikroskoopin optiikkaan silmän takaosan (eli lasiaisen ja verkkokalvon) visualisoimiseksi. . Silmä ehdotettiin varovasti manuaalisesti painamalla silmäluomia ja insuliiniruiskussa olevaa 31G neulaa käytettiin varovasti lävistämään kovakalvon limbuksen vieressä nenän alemmassa neljänneksessä. Kiillotettu lasimikropipetin kärki, joka sisälsi luovuttajasoluja (tai vehikkelikontrollia), vietiin viillon läpi lasiaisen onteloon suoran visualisoinnin alaisena. Varottiin, ettei linssin tai takaosan rakenteiden eheys häiriinty. Solut tai vehikkelit yksinään injektoitiin 1 mikrolitran tilavuudessa. Usean hetken tauon jälkeen silmänsisäisen paineen tasapainottamiseksi pipetin kärki poistettiin vähitellen silmästä, kaikki suoran visualisoinnin alaisena. Kaikki silmänsisäinen verenvuoto havaittiin sekä sijainti. Injektion jälkeen eläin sijoitettiin puhtaaseen häkkiin, joka oli vuorattu tuoreella kertakäyttöisellä tyynyllä, joka oli suunnattu imukykyinen puoli ylöspäin/muovipuoli alaspäin, toipumaan. Toipumista helpotettiin käyttämällä lämmitystyynyä, ja eläimen kyky liikkua varmistui. Herätyksen jälkeen eläin siirrettiin leikkauksen jälkeiseen häkkiin, jolloin vettä oli vapaasti saatavilla. Eläimiä tarkkailtiin silmämääräisesti päivittäin leikkauksen jälkeen. Silmänsisäiseen injektioon liittyviä merkkejä havaittiin vähäisiä tai ei ollenkaan.

Toimenpiteen jälkeen eläimiä tarkkailtiin leikatun silmän hankausta, ryppyistä turkkia tai jatkuvaa letargiaa, jotka kaikki olivat perusteita välittömään eutanasiaan. Kaksi eläintä lopetettiin tappelussa saatujen haavojen vuoksi. Kaikki muut eläimet lopetettiin suunnitelluissa päätepisteissä. Eutanasia tehtiin CO2-hengityksellä.

4.4 Oftalminen tutkimus

A Leica Ultimate Red Reflex Surgical Microscope was used for ophthalmic examination and photography of experimental mice. Sedation was performed with a Ketamine Hydrochloride/Xylazine Hydrochloride mixture (50–100 mg/mL Ketamine, 5–10 mg/mL Xylazine) administered by intraperitoneal injection. After sedation, topical mydriatics (Tropicamide, Phenylephrine) were applied to the eye(s) to be imaged in 5 min intervals until adequate mydriasis was achieved, as determined via pupil diameter (>2,5 mm) ja vaste valostimulaatioon. Räpytyksen katoamisen kompensoimiseksi molempiin silmiin laitettiin paikallisesti hypromelloosiliuosta (Gonak) sarveiskalvon kuivumisen estämiseksi. Kuvausmenettelyä varten nukutetut eläimet asetettiin lämmitystyynylle ja asetettiin rintalastan makuuasentoon. Toimenpiteen päätyttyä anestesian osittainen kumoaminen saavutettiin antamalla atipametsolia (0,1–1 mg/kg) intraperitoneaalisella injektiolla.

4.5. Histopatologia

Eläinten immuunivasteet, jotka saivat kaksi peräkkäistä siirrettä (yksi kumpaankin silmään), arvioitiin molempien silmien histopatologialla päivänä 4, päivänä 7, päivänä 14 ja päivänä 28 ± 1 toisen silmän injektion jälkeen. Hiiret, joita käsiteltiin taulukon 1 mukaisesti, lopetettiin taulukossa 2 esitetyn aikataulun mukaisesti. Eläimet lopetettiin käyttämällä hiilidioksidiinhalaatiota. Sydänperfuusiot suoritettiin koe-eläimille 2 % paraformaldehydillä (PFA) fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS). Sitten kaikki silmämunat kerättiin ja niiden annettiin liota 2 % PFA/PBS:ssä 48 tuntia 4 °C:ssa. Kiinteät silmämunat käsiteltiin sakkaroosigradientin läpi (10 % sakkaroosia PBS:ssä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, 20 % sakkaroosia PBS:ssä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja 30 % sakkaroosia PBS:ssä 4 ◦C:ssa yön yli) ennen kuin ne upotettiin OCT-väliaine kryosektioon. Silmien kryosektiot (10 um) värjättiin Harrison-hematoksyliinillä ja eosiinilla (H&E) verkkokalvon mikroanatomian visualisoimiseksi ja injektoitujen luovuttajasolujen paikallistamiseksi.

gmRPC:llä käsitellyille ryhmille kryosektiot arvioitiin käyttämällä immunofluoresenssia GFP+ (luovuttaja) -soluille. Silmissä esiintyvien spesifisten immuunisolutyyppien tunnistaminen suoritettiin leimaamalla seuraavien spesifisillä primäärisillä vasta-aineilla: CD3 (T-lymfosyyttimarkkeri) [35], CD45R (B-lymfosyyttimarkkeri) [36], Iba-1 (aktivoitu makrofagi- ja mikrogliamarkkeri) [37], Ly-6G (neutrofiilimarkkeri) [38] ja CD49b (luonnollinen tappajasolumerkkiaine) [39]. Kryosektiot pestiin PBS:ssä kolme kertaa huoneenlämmössä ja blokattiin 0,03 % Triton X-100 ja 10 % normaalilla vuohen seerumilla PBS:ssä (NGS; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) 1h huoneenlämmössä. Rotan anti-hiiri CD3 (1:100 laimennus, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), rotan anti-hiiri CD45R (1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), kanin anti-hiiri Iba{{ 26}} (1:400 laimennus, Wako Chemicals, Richmond, VA, USA), rotan anti-hiiri Ly-6G (1:100 laimennus, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) ja rotan anti-hiiri -hiiren CD49b:tä (1:100 laimennus, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) levitettiin näytteille ja inkuboitiin yön yli 4 asteessa. Näytteet pestiin uudelleen PBS:ssä 3 kertaa huoneenlämpötilassa. Alexa-Fluor-konjugoituja sekundaarisia vasta-aineita (vuohen anti-rotta Alexa-Flour-568 ja vuohen anti-kanin Alexa-Flour-568, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) levitettiin näytteille 1 tunnin ajan. huonelämpötilassa. Kaikki näytteet pestiin sitten PBS:ssä vielä kolme kertaa huoneenlämpötilassa. Peitelasit asennettiin käyttämällä DAPI Fluoromount-G:tä (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA), ja objektilasien annettiin kuivua yön yli huoneenlämpötilassa.

4.6. ELISPOT- ja MLR-määritykset

RPC-spesifisiä muisti-T-soluja tarkkailtiin 2 ja 4 viikkoa ensimmäisen siirteen sijoittamisen jälkeen entsyymikytketyn immunosorbenttipisteen (ELISPOT) avulla. Koeryhmät muodostettiin taulukoissa 1 ja 2 esitetyllä tavalla kullekin ajankohdalle. ELISPOT-määritys vangitsee eritetyt proteiinit spesifiselle vasta-ainepäällysteiselle mikrolevylle, ja sitä voidaan käyttää muisti-T-soluaktivaation määrittämiseen havaitsemalla T-solu-IFN-erityksen. Kokeellinen lukema on mikrolevyllä olevien IFN-pisteiden lukumäärä. Läsnä olevien IFN-täplien määrä on osoitus aktivoituvien T-solujen lukumäärästä. Alloreaktiivisten T-solujen esiintymistiheys arvioitiin suorittamalla 48 tunnin sekaleukosyyttireaktio (MLR) 96-kuoppa Multiscreen-IP-levyillä (Millipore, Burlington, MA, USA). Respondersolut olivat lymfosyyttejä/pernasoluja, jotka sisälsivät T-soluja, jotka oli puhdistettu kohdunkaulan imusolmukkeista (CLN) ja koe-eläinten pernoista, ja stimulaattorisolut olivat alun perin C57BL/6-hiiristä peräisin olevia gmRPC:itä. ELISPOT-määritykset suoritettiin standardiprotokollan perusteella. 96-kuoppa Multiscreen-IP-levyt esikostutettiin 15 µl:lla 35-prosenttista etanolia kuoppaa kohti steriileissä olosuhteissa. Levyt pestiin steriilillä PBS:llä kolme kertaa ennen kuin 100 µl IFN-sieppausvasta-ainetta (klooni AN-18, eBioscience, San Diego, CA, USA) laimennettuna PBS:ään (2 µg/ml) levitettiin levyille. Levyjä inkuboitiin yön yli 4 asteessa ennen kuin MLR-määritykset suoritettiin levyillä. Sieppausvasta-aineella päällystetyt levyt pestiin kolme kertaa PBS:llä ja blokattiin sitten RPMI1640:llä 2 tunnin ajan 37 °C:ssa.

Kukin määrityslevy sisälsi seuraavat kontrollit: kuopat, joissa ei ollut soluja, kuopat, jotka sisälsivät solut ilman stimulaatiota, ja kuopat, jotka sisälsivät solut, jotka oli käsitelty forboli-{0}}myristaatti-13--asetaatilla (PMA) ja Ca-ionofori positiivisina kontrolleina. PMA-hoito toimii positiivisena kontrollina matkimalla toista lähettiä, DAG:ta, aktivoimaan T-solureseptorireitin ja aiheuttamaan puolestaan ​​T-soluaktivaatiota, jolloin Ca-ionofori helpottaa kalsiumionien pääsyä soluihin. Levyjä inkuboitiin 36 tuntia 37 °C:ssa ennen värireaktiota. Levyt pestiin PBS:llä, joka sisälsi {{10}}.01 % Tween 20 kuusi kertaa ja sitten 100 µl detektiovasta-ainetta (klooni R64A2, eBioscience, San Diego, CA, USA), laimennettuna PBS:ssä (0,5 ug/ml) lisättiin jokaiseen kuoppaan. Levyjä inkuboitiin 37 °C:ssa vielä 2 tuntia. Levyt pestiin jälleen 0,01 % Tween 20:llä PBS:ssä. 100 ui Streptavidin-AP:tä (1:1000 laimennus, Invitrogen) kuoppaa kohden lisättiin ja levyjä inkuboitiin 45 minuuttia huoneenlämpötilassa. Kaikki levyt pestiin jälleen kolme kertaa 0,01 % Tween 20:llä PBS:ssä ja pelkällä PBS:llä vielä kolme kertaa. Lopuksi kuhunkin kuoppaan lisättiin 100 ui BCIP/NBT:tä (Sigma Aldrich, München, Saksa) väritystä varten. Kaikki levyt pestiin perusteellisesti vesijohtovedellä ja kuivattiin ennen tietojen analysointia.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

5. Johtopäätökset

Tämä tutkimus osoittaa, että allogeenisten RPC:iden peräkkäiset binokulaariset siirteet lasiaiseen ei aiheuta klassista immuunihyljintää hiiressä. Vaikka tiedetäänkin, että näitä allogeenisiä histologisia tutkimuksia ei voitu suorittaa ihmisen RPC:n kliinisellä tuotteella, tiedot näyttävät olevan yhtäpitäviä kliinisen turvallisuustutkimuksen (jCyte, JC-01E, julkaisemattomat tiedot) tulosten kanssa, joissa potilailla, joilla on verkkokalvotulehdus. pigmentosa sai ei-samanaikaisia ​​kahdenvälisiä injektioita ilman immunosuppressiivisia hoitoja. Vaikka kahta tutkimusta on vaikea verrata suoraan, on huomionarvoista, että molempien kokonaistulokset osoittivat samankaltaisuutta allograftin eloonjäämisen suhteen.

Viitteet

1. Hori, J.; Ng, TF; Shatos, M.; Klassen, H.; Streilein, JW; Nuoret, MJ Neuraaliset progenitorisolut puuttuvat immunogeenisyydestä ja vastustavat tuhoutumista allografteina. Stem Cells 2003, 21, 405–416. [CrossRef] [PubMed]

2. Klassen, H.; Schwartz, PH; Ziaeian, B.; Nethercott, H.; Young, MJ; Bragadottir, R.; Tullis, GE; Warfvinge, K.; Narfstrom, K. Kehittyvistä kissan aivoista eristetyt hermoprekursorit osoittavat verkkokalvon integroitumista dystrofisen kissan verkkokalvoon siirron jälkeen. Vet. Ophthalmol. 2007, 10, 245–253. [CrossRef] [PubMed]

3. Salado-Manzano, C.; Perpina, U.; Straccia, M.; Molina-Ruiz, FJ; Cozzi, E.; Rosser, AE; Canals, JM Onko immunologinen vaste pullonkaula soluterapialle neurodegeneratiivisissa sairauksissa? Edessä. Solun neurosci. 2020, 14, 250. [CrossRef]

4. Petrus-Reurer, S.; Romano, M.; Howlett, S.; Jones, JL; Lombardi, G.; Saeb-Parsy, K. Immunologiset näkökohdat ja haasteet regeneratiivisille soluhoitoille. Commun. Biol. 2021, 4, 798. [CrossRef]

5. Bucher, K.; Rodriguez-Bocanegra, E.; Dauletbekov, D.; Fischer, MD Immuunivasteet verkkokalvon geeniterapiaan käyttämällä ade no assosioituneita virusvektoreita - Vaikutukset hoidon onnistumiseen ja turvallisuuteen. Prog. Retin. Eye Res. 2021, 83, 100915. [CrossRef]

6. Singh, MS; Park, SS; Albini, TA; Canto-Soler, MV; Klassen, H.; MacLaren, RE; Takahashi, M.; Nagiel, A.; Schwartz, SD; Bharti, K. Verkkokalvon kantasolujen siirto: turvallisuuden ja potentiaalin tasapainottaminen. Prog. Retin. Eye Res. 2020, 75, 100779. [CrossRef]

7. Kamao, H.; Mandai, M.; Okamoto, S.; Sakai, N.; Suga, A.; Sugita, S.; Kiryu, J.; Takahashi, M. Kliiniseen käyttöön tarkoitettujen ihmisen aiheuttamien pluripotenttien kantasoluista peräisin olevien verkkokalvon pigmenttiepiteelisolulevyjen karakterisointi. Stem Cell Rep. 2014, 2, 205–218. [CrossRef]

8. Sugita, S.; Kamao, H.; Iwasaki, Y.; Okamoto, S.; Hashiguchi, T.; Iseki, K.; Hayashi, N.; Mandai, M.; Takahashi, M. T-soluaktivaation estäminen verkkokalvon pigmenttiepiteelisoluilla, jotka ovat peräisin indusoiduista pluripotenteista kantasoluista. Tutki. Ophthalmol. Vis. Sci. 2015, 56, 1051–1062. [CrossRef]

9. McGill, TJ; Stoddard, J.; Renner, LM; Messaoudi, I.; Bharti, K.; Mitalipov, S.; Lauer, A.; Wilson, DJ; Neuringer, M. Allogeeninen iPSC-peräinen RPE-solusiirteen epäonnistuminen subretinaaliseen tilaan siirtämisen jälkeen ei-ihmiskädellisillä. Tutki. Ophthalmol. Vis. Sci. 2018, 59, 1374–1383. [CrossRef]

10. Sugita, S.; Mandai, M.; Kamao, H.; Takahashi, M. RPE-solusiirron immunologiset näkökohdat. Prog. Retin. Eye Res. 2021, 84, 100950. [CrossRef]

11. Nair, DSR; Thomas, BB kantasolupohjaiset hoitostrategiat verkkokalvon rappeuttavien sairauksien hoitoon. Curr. Stem Cell Res. Siellä. 2022, 17, 214–225. [CrossRef] [PubMed]

12. Martinez Velazquez, LA; Ballios, BG Seuraava sukupolvi molekyyli- ja soluterapiaa perinnöllisiin verkkokalvosairauksiin. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 11542. [CrossRef]

13. Liu, Y.; Chen, SJ; Li, SY; Qu, LH; Meng, XH; Wang, Y.; Xu, HW; Liang, ZQ; Yin, ZQ Ihmisen verkkokalvon esisolujen siirron pitkän aikavälin turvallisuus retinitis pigmentosa -potilailla. Stem Cell Res. Siellä. 2017, 8, 209. [CrossRef] [PubMed]

14. Wang, Y.; Tang, Z.; Gu, P. Stem / progenitor solu-pohjainen elinsiirto verkkokalvon rappeuma: Katsaus kliinisiä tutkimuksia. Cell Death Dis. 2020, 11, 793. [CrossRef] [PubMed]

15. German, OL; Vallese-Maurizi, H.; Soto, TB; Rotstein, NP; Politi, LE Verkkokalvon kantasolut, toiveet ja esteet. World J. Stem Cells 2021, 13, 1446–1479. [CrossRef]

16. Karamali, F.; Behtaj, S.; Babaei-Abraki, S.; Hadady, H.; Atefi, A.; Savoj, S.; Soroushzadeh, S.; Najafian, S.; Nasr Esfahani, MH; Klassen, H. Mahdolliset terapeuttiset strategiat fotoreseptorin rappeutumiseen: Polku näön palauttamiseen. J. Transl. Med. 2022, 20, 572. [CrossRef]

17. Semo, M.; Haamedi, N.; Stevanato, L.; Carter, D.; Brooke, G.; Young, M.; Coffey, P.; Sinden, J.; Patel, S.; Vugler, A. Ihmisen verkkokalvon progenitorisolujen tehokkuus ja turvallisuus. Käännös Vis. Sci. Technol. 2016, 5, 6. [CrossRef]

18. Mochizuki, M.; Sugita, S.; Kamoi, K. Silmän immunologinen homeostaasi. Prog. Retin. Eye Res. 2013, 33, 10–27. [CrossRef]

19. Yamasaki, S.; Sugita, S.; Horiuchi, M.; Masuda, T.; Fujii, S.; Makabe, K.; Kawasaki, A.; Hayashi, T.; Kuwahara, A.; Kishino, A.; et ai. Ihmisen ESC- ja iPSC-peräisten verkkokalvojen alhainen immunogeenisyys ja immunosuppressiiviset ominaisuudet. Stem Cell Rep. 2021, 16, 851–867. [CrossRef]

20. Klassen, H.; Schwartz, MR; Bailey, AH; Ihmisen ja hiiren multipotenttien hermosolujen esisolujen ilmentämiä nuoria MJ-pintamarkkereita ovat tetraspaniinit ja ei-proteiiniepitoopit. Neurosci. Lett. 2001, 312, 180–182. [CrossRef]

21. Klassen, H.; Ziaeian, B.; Kirov, II; Young, MJ; Schwartz, PH Verkkokalvon progenitorisolujen eristäminen kuolemanjälkeisestä ihmiskudoksesta ja vertailu autologisiin aivojen progenitoriin. J. Neurosci. Res. 2004, 77, 334–343. [CrossRef]

22. Ingulli, E. Solujen hylkimisen mekanismi transplantaatiossa. Pediatr. Nephrol. 2010, 25, 61–74. [CrossRef]

23. Issa, F.; Schiopu, A.; Wood, KJ T-solujen rooli siirteen hylkimisreaktiossa ja transplantaatiotoleranssissa. Asiantuntija pastori Clin. Immunol. 2010, 6, 155–169. [CrossRef] [PubMed]

24. Nasr, M.; Sigdel, T.; Sarwal, M. Advances in diagnostics for transplant hyljintä. Asiantuntija Rev. Mol. Diagn. 2016, 16, 1121–1132. [CrossRef] [PubMed]

25. Klassen, H.; Imfeld, KL; Ray, J.; Young, MJ; Gage, FH; Berman, MA Aikuisten hippokampuksen progenitorisolujen immunologiset ominaisuudet. Vis. Res. 2003, 43, 947–956. [CrossRef] [PubMed]

26. Weinger, JG; Weist, BM; Palmettu, WC; Klaus, SM; Walsh, CM; Lane, TE MHC:n yhteensopimattomuus johtaa hermosolujen kantasolujen hylkimiseen selkäytimen siirron jälkeen viruksen aiheuttaman demyelinaation mallissa. Stem Cells 2012, 30, 2584–2595. [CrossRef] [PubMed]

27. ReNeuron, L. First in Human Phase I/IIa, Open Label, Prospektiivinen tutkimus subretinaalisesti siirrettyjen ihmisen verkkokalvon esisolujen (hRPC) turvallisuudesta ja siedettävyydestä potilailla, joilla on Retinitis Pigmentosa (RP). Kliininen tutkimus nro NCT02464436. Saatavilla verkossa: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02464436 (käytetty 27. helmikuuta 2023).

28. Lu, B.; Lin, Y.; Tsai, Y.; Girman, S.; Adamus, G.; Jones, MK; Shelley, B.; Svendsen, CN; Wang, S. Ihmisen myöhempi hermoston esieläimen siirto rappeutuneeseen verkkokalvoon ei vaaranna siirteen alkuperäistä selviytymistä tai terapeuttista tehokkuutta. Käännös Vis. Sci. Technol. 2015, 4, 7. [CrossRef] [PubMed]

29. Jones, MK; Lu, B.; Girman, S.; Wang, S. Solupohjaiset terapeuttiset strategiat verkkokalvon rappeutumissairauksien korvaamiseen ja säilyttämiseen. Prog. Retin. Eye Res. 2017, 58, 1–27. [CrossRef] [PubMed]

30. Bell, BA; Kaul, C.; Bonilha, VL; Rayborn, ME; Shadrach, K.; Hollyfield, JG BALB/c-hiiri: Normaalin vivariumvalaistuksen vaikutus verkkokalvon patologiaan ikääntymisen aikana. Exp. Eye Res. 2015, 135, 192–205. [CrossRef]

31. Klassen, HJ; Ng, TF; Kurimoto, Y.; Kirov, I.; Shatos, M.; Coffey, P.; Young, MJ Multipotent verkkokalvon progenitorit ilmentävät kehitysmarkkereita, erilaistuvat verkkokalvon hermosoluiksi ja säilyttävät valon välittämän käyttäytymisen. Tutki. Ophthalmol. Vis. Sci. 2004, 45, 4167–4173. [CrossRef]

32. jCyte, Inc. Ihmisen verkkokalvon esisolujen (jCell) yksittäisen lasiaisensisäisen injektion turvallisuus Retinitis Pigmentosa -infektiossa. Kliininen tutkimus nro NCT02320812. Saatavilla verkossa: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02320812 (käytetty 24. helmikuuta 2023).

33. jCyte, Inc. Ihmisen verkkokalvon esisolujen lasiaisensisäisen injektion turvallisuus ja tehokkuus aikuisilla, joilla on Retinitis Pigmentosa. Kliininen tutkimus nro NCT03073733. Saatavilla verkossa: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03073733 (käytetty 24. helmikuuta 2023).

34. jCyte, Inc. Ihmisen verkkokalvon esisolujen (solujen) toistuvan lasiaisensisäisen injektion turvallisuus aikuisilla potilailla, joilla on Retinitis Pigmentosa. Kliininen tutkimus nro NCT04604899. Saatavilla verkossa: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04604899 (käytetty 24. helmikuuta 2023).

35. Oudejans, JJ; van der Valk, P. T-solu- ja NK-solukasvaimien immunohistokemiallinen luokittelu. J. Clin. Pathol. 2002, 55, 892. [CrossRef] [PubMed]

36. Tostanoski, LH; Chiu, YC; Gammon, JM; Simon, T.; Andorko, JI; Bromberg, JS; Jewell, CM Paikallisen imusolmukkeiden mikroympäristön uudelleenohjelmointi edistää systeemistä ja antigeenispesifistä toleranssia. Cell Rep. 2016, 16, 2940–2952. [CrossRef] [PubMed]

37. Jurga, AM; Paleczna, M.; Kuter, KZ Yleiskatsaus Differentiaalisen mikroglia-fenotyyppien yleisiin ja erotteleviin markkereihin. Edessä. Solun neurosci. 2020, 14, 198. [CrossRef] [PubMed]

38. Li, JC; Zou, XM; Yang, SF; Jin, JQ; Zhu, L.; Li, CJ; Yang, H.; Zhang, AG; Zhao, TQ; Chen, CY Neutrofiilien ekstrasellulaariset ansat osallistuvat syöpään liittyvän tromboosin kehittymiseen potilailla, joilla on mahasyöpä. World J. Gastroenterol. 2022, 28, 3132–3149. [CrossRef]

39. Kee, BL Development of Natural Killer Cells and ILC1. Encycl. Immunobiol. 2016, 1, 140–148.